Artículo Original

Legionelosis Nosocomial, un Problema de Contaminación

Ambiental Biológica Emergente, pero Controlable
Nosocomial legionellosis, a problem of emerging biological pollution, but controllable

Ana María Salazar Bugueño1, María Teresa Ulloa Flores2, Leonor Jofré Morales3, Roberto Olivares Castillo4, Gloria Ruiz Rosello5,
Irene Jemenao Pacheco6, Gerardo Ehrenhaus Vásquez7
1. Ing. Tecnólogo Médico con Mención en Radiología y Física Médica. UCH Ingeniero en Prevención de Riesgos y Medio Ambiente, UTM Candidato a
Doctorado en Gestión Ambiental y Ordenamiento Territorial. U. de Barcelona. Magíster en Salud Pública. Universidad de Chile. Licenciado en Salud
Ocupacional. Universidad de Chile.
2. T.M. M.CS. Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina. Universidad de Chile.
3. Pediatra infectóloga, Rama de Infectología Sociedad Chilena de Pediatría Laboratorio de Microbiología ISP de Chile. H. Clínico Universidad de Chile.
4. Hospital Clínico Universidad de Chile.
5. E.U. Enfermera, Universidad de Chile, Diplomado en Infecciones Intrahospitalarias Universidad Mayor. H. Clínico Universidad de Chile.
6. E.U. Hospital Clínico Universidad de Chile.
7. Hospital Clínico Universidad de Chile

RESUMEN ABSTRACT
La legionelosis está ampliamente reconocida en países desarrollados. Legionellosis is widely recognized in developed countries. In Chile,
En Chile, actualmente existen las condiciones socio-económicas, there are currently the socio-economic, cultural and environmental
culturales y ambientales que favorecen su desarrollo. Sin embargo, factors that favor its development. However, there is no systematic
no existe un estudio sistemático que permita evidenciar la presencia study to assess the environmental and clinical presence of Legionella
ambiental y clínica de Legionella, fundamentalmente por la deficien- mainly by deficiency of microbiological diagnostic elements.
cia de elementos de diagnóstico microbiológico. The objective of this study was to implement a diagnostic laboratory
El objetivo de este estudio fue implementar un laboratorio de diag- of Legionella, detect and quantify the presence of environmental
nóstico de Legionella, detectar y cuantificar la presencia de Legionella Legionella. The techniques were implemented: Cultivation of Legionella
ambiental. Las técnicas implementadas fueron: Cultivo de Legionella from environmental water sources (ISO 11731/1998). Technique used
de fuentes de agua ambiental (Norma ISO 11731/1998). Técnica que for investigation of Legionella in hospital water sources. We imple-
se utilizó para la investigación de Legionella en fuentes de agua mented further cultivation of Legionella urinary antigen for diagnosis
hospitalaria. Se implementó, además, cultivo y antígeno urinario de of patients with pneumonia and Polymerase Chain Reaction (PCR) for
Legionella para diagnóstico de pacientes con neumonía y Reacción the identification of multiple genus and species of Legionella pneumo-
de Polimerasa en Cadena (PCR) múltiple para la identificación de phila. It also managed to implement a molecular typing system based
género y especie de Legionella pneumophila. Se logró además imple- on the gene that allowed mip compare strains isolated from various
mentar un sistema de tipificación molecular basado en el gen mip environments.
que permitió comparar cepas aisladas de diversos ambientes. It was evidenced for the first time in Chile environmental isolates of
Se evidenció por primera vez en Chile aislamientos de Legionella Legionella pneumophila.
pneumophila ambiental.
Key words: Legionella pneumophila, Legionella pneumo-
(Salazar A, Ulloa M, Jofré L, Olivares R, Ruiz G, Jemenao I, Ehrenhaus G, nia, nosocomial.
2012. Legionelosis Nosocomial, un Problema de Contaminación
Ambiental Biológica Emergente, pero Controlable. Cienc Trab. Oct-Dic;
14 [45]: 216-227).

Palabras claves: Legionella pneumophila, legionelosis,

neumonía, nosocomial.

INTRODUCCIÓN
En 1976 se produce el brote que dio a conocer al mundo científico
la Legionella pneumophila.1 Previamente, en 1968 se había produ-
Correspondencia / Correspondence cido un brote de infección respiratoria, sin neumonía ni falleci-
Ana María Salazar B. mientos, en un edificio del Oakland County Health Department de
Av. Independencia 1027 Pontiac (Michigan) que afectó al 95% de las personas que trabajan
Santiago, Chile
en él.2 El impacto mediático y el tiempo que el Center for Diseases
Tel.: 56 2 29786300
Control (CDC) dedicaron a su estudio fueron mucho menores. En
e-mail: [email protected]
Recibido: 25 de Octubre 2012 / Aceptado: 02 Diciembre 2012
1976 la enfermedad incide en excombatientes legionarios alojados

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en el hotel Bellevue-Stratford de Filadelfia; afectó aproximada- y conductos de aire acondicionado pueden aspirar y distribuir
mente a 221 individuos y fallecieron 34 de ellos.3 aerosoles procedentes de torres de refrigeración o de condensa-
Desde el brote de Filadelfia hasta la década del 90, la enfermedad dores de evaporación, situados en zonas próximas.17 Las bañeras
del legionario ha sido causa, relativamente frecuente, de brotes de de hidromasaje y las saunas pueden ser un buen amplificador del
neumonía en la comunidad4-8, en hoteles, y en hospitales.9 microorganismo y también un eficaz diseminador al producir
aerosoles. Los aerosoles procedentes de fuentes ornamentales
Legionella: hábitat también pueden transmitir la infección. Los humidificadores
La Legionella es una bacteria ambiental; su hábitat natural o también pueden arrastrar partículas microbianas si el agua usada
reservorio primario son las aguas superficiales, como lagos y ríos. para llenar el depósito está colonizada por Legionella. Los nebuli-
Se encuentra plantónicamente en bajas concentraciones, al inte- zadores producen aerosoles con partículas de tamaño uniforme, y
rior de protozoos o formando parte de biofilm.10,11 No se ha pueden diseminar Legionella si el agua usada está colonizada.
aislado desde fuentes de agua salada. La dificultad para obtener el También han sido implicados otros equipos de terapia respiratoria,
crecimiento de Legionella en medios de cultivo, contrasta con su como las bolsas de uso manual para la resucitación y los respira-
ubicuidad en el medio acuático natural. La Legionella obtiene dores de presión positiva intermitente. Ninguno de los dos cuenta
nutrientes en su hábitat natural aportados por otros microorga- con depósito de agua; sin embargo, el agua usada para limpiar los
nismos, como amebas, protozoos ciliados y otros. En el caso de tubos y componentes puede haber producido la colonización de
los sistemas artificiales como cañerías, acumuladores e interiores algún elemento.
de las torres de refrigeración, se encuentra formando parte de las
biopelículas que recubren las superficies. Las amebas y otros Tabla 1.
Equipos de riesgo para Legionella..
protozoos se consideran hospedadores naturales y amplificadores
a) Instalaciones con mayor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella:
de Legionella spp.12,13
i) Torres de refrigeración y condensadores evaporativos.
Las especies del género Legionella crecen bien a temperatura entre
ii) Sistemas de agua caliente sanitaria con acumulador y circuito de retorno.
20 y 50ºC y su temperatura óptima de desarrollo fluctúa entre 35
iii) Sistemas de agua climatizada con agitación constante y recirculación a través de
y 38ºC. Estas temperaturas son frecuentes en las instalaciones y
chorros de alta velocidad o la inyección de aire (spas, jacuzzis, piscinas, vasos o ba-
dispositivos, que en los últimos años han tenido una amplia
ñeras terapéuticas, bañeras de hidromasaje, tratamientos con chorros a presión,
expansión en la sociedad. Por debajo de 20ºC permanece latente, y otras).
muere por encima de los 60ºC. Entre los factores que favorecen su iv) Centrales humidificadoras industriales.
desarrollo y multiplicación, además de la temperatura del agua, se
b) Instalaciones con menor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella:
encuentra: la presencia de materia orgánica e inorgánica, presencia
i) Sistemas de instalación interior de agua fría de consumo humano (tuberías, depó-
de otros microorganismos, presencia de biofilm (el cual le permite sitos, aljibes), cisternas o depósitos móviles y agua caliente sanitaria sin circuito de
protegerse de los agentes biocidas), y el estancamiento del agua, retorno.
que le proporciona el tiempo necesario para replicarse.14 ii) Equipos de enfriamiento evaporativo que pulvericen agua.
La Legionella es resistente a la cloración normal de los sistemas de iii) Humectadores.
agua; así, desde su nicho natural en las aguas superficiales y a iv) Fuentes ornamentales.
través de la red de distribución pública puede pasar a colonizar los v) Sistemas de riego por aspersión en el medio urbano.
sistemas de suministro de agua de la población, e incorporarse a vi) Sistemas de agua contra incendios.
los circuitos de agua sanitaria fría y caliente y depósitos de edifi- vii) Elementos de refrigeración por aerosolización, al aire libre.
cios y viviendas, que pueden convertirse en reservorios secunda- viii) Otros aparatos que acumulen agua y puedan producir aerosoles.
rios en los cuales sobrevive y se amplifica.15 c) Instalaciones de riesgo en terapia respiratoria:
i) Equipos de terapia respiratoria.
Transmisión de Legionella al hombre ii) Respiradores.
La transmisión de Legionella al hombre está asociada a diversos iii) Nebulizadores.
sistemas que utilizan agua y que son capaces de producir aerosoles iv) Otros equipos médicos en contacto con las vías respiratorias.
(Tabla 1).16 Entre los sistemas más reconocidos están las torres de
refrigeración y condensadores de evaporación. Esta vía de disemi-
nación tiene especial importancia en los brotes de Legionelosis Legionelosis
comunitaria y en los casos esporádicos. En las torres de refrigera- Se reconocen dos formas clínico-epidemiológicas de la infec-
ción se puede producir una gran amplificación de Legionella y una ción por Legionella: la fiebre de Pontiac (forma no neumónica), la
notable producción de aerosoles contaminados, si el manteni- cual es clínicamente similar a la influenza (flu-like), no está
miento y la limpieza son insuficientes, en especial en aquellas que asociada a neumonía, es auto-limitada, generalmente los pacientes
funcionan de manera discontinua o irregular y mantienen agua se restablecen espontáneamente entre 3-5 días sin tratamiento. La
estancada durante largos períodos de tiempo. La diseminación literatura señala que podría ser una reacción al antígeno inhalado
puede ser muy elevada al poner en marcha una torre que ha estado y no a la acción de las bacterias propiamente tal.
inactiva durante semanas y no se ha limpiado antes de entrar en La otra forma es la neumonía por Legionella pneumophila; se
servicio. caracteriza por un período de incubación de 2 a 10 días, y algunos
En general, los aerosoles de las torres de refrigeración pueden síntomas más frecuentes que presentan los pacientes son: vómitos,
transmitir la infección dentro de un área geográfica limitada de diarrea, dolor abdominal, compromiso de conciencia, cefalea,
unos 200 m., pero en determinadas circunstancias, como vientos y fiebre alta, tos no productiva, escalofríos, hemoptisis en 1/3 de los
corrientes de aire favorables, los aerosoles transportadores de pacientes, falla renal, frecuente hiponatremia e hipofosfatemia,
Legionella pueden alcanzar de 1,6 a 3,2 kms. Además, los sistemas mialgia, anorexia. La radiografía de tórax frecuentemente incluye

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la imagen típica de neumonía con un rápido progreso a infiltrado Control de Legionella

inflamatorio, con compromiso básicamente en los lóbulos basales Dado que Legionella es ubicua en las fuentes de agua, el control se
y derrame pleural, en un 25% de los pacientes se observan absce- ha centrado en medidas que tienden a reducir la carga bacteriana
sos.18 a través de medidas y normativa para el manejo de estos sistemas.
Epidemiológicamente, los casos de Legionelosis se caracterizan En Europa (especialmente en España), EE.UU. y Australia existen
porque: se presenta con mayor frecuencia en hombres que en numerosas normativas.24-31 Estas, en general, se relacionan con el
mujeres. Se presentan con mayor prevalencia en los meses cálidos. diseño de instalaciones adecuadas y el mantenimiento correcto de
Las personas más susceptibles son: personas mayores de 50 años. las mismas. Uno de los puntos críticos es el uso de desinfectantes,
Fumadores (tabaquismo), con deficiencia inmunológica. Enfermos ya sea puntual o continuo para mantener bajos niveles de la
de diabetes, cáncer y enfermedades pulmonares. bacteria.
Desde el punto de vista epidemiológico, la Legionella se presenta Si bien es cierto que la Legionelosis está ampliamente reconocida
como casos aislados o brotes, a su vez estos pueden ser de la en países desarrollados, en Chile, actualmente, existen las condi-
comunidad, nosocomiales o legionelosis del viajero. Los brotes de ciones socio-económicas, culturales y ambientales que favorecen
legionelosis son muy publicitados por la prensa. Son más su desarrollo. Sin embargo, no existe un estudio sistemático que
frecuentes en el verano y a inicios de otoño, pero los casos permita evidenciar la presencia ambiental y clínica de Legionella,
aislados pueden ocurrir durante todo el año. La letalidad fluctúa fundamentalmente por la deficiencia de elementos de diagnóstico
de 5 a 30%. Se debe sospechar de legionelosis en los casos de microbiológico; por lo tanto, este estudio constituye el primer paso
neumonía vinculados a datos epidemiológicos como: un viaje para llevarnos en el futuro, a adoptar medidas de prevención
reciente, hospitalización, asistencia a reuniones e inmunosupre- primaria que, si bien es cierto no erradican totalmente los casos,
sión, entre otros. La bacteria muere rápidamente. ayudarán a evitar brotes de magnitud.
Legionelosis nosocomial: es un caso que pasa los 10 días ante-
riores a la fecha de inicio de síntomas en un hospital. Los hospi-
tales en general disponen de redes de agua sanitaria complejas y
además torres de refrigeración. A pesar que ambos sistemas se han OBJETIVOS
asociado con Legionelosis, en los últimos años la mayoría de los
casos esporádicos o epidémicos se han relacionado con el agua Objetivo general
sanitaria, ya que la mayoría de ellas está colonizada con la • Implementar técnicas de laboratorio tradicionales y moleculares
bacteria, entre un 12 a 85% .19-21 para el estudio de Legionella ambiental.
Por otra parte, en el hospital se concentra población susceptible a
este con diferentes grados de inmunosupresión, como transplan- Objetivos específicos
tados, SIDA, tratamiento prolongado con corticoides, mayores de • Implementar técnicas de laboratorio de microbiología para el
65 años, enfermedades crónicas de base, especialmente pulmonar, estudio de Legionella ambiental.
diabetes, insuficiencia cardiaca; y, a nivel pediátrico, recién • Implementar técnicas de laboratorio de microbiología para el
nacidos conectados a ventilación mecánica e inmunosuprimidos.22,23 estudio de Legionella clínica
Esto que aumenta la posibilidad de presentación de formas graves • Implementar una técnica de Reacción en Cadena de la
y mortalidad elevada y, en general, mayor costo asociado en el Polimerasa (PCR) múltiple: para la identificación de género y
manejo. Los pacientes hospitalizados son además más susceptibles especie de Legionella pneumophila.
a infecciones debidas a serogrupos distintos de Legionella pneu- • Detectar y cuantificar Legionella intrahospitalaria.
mophila serogrupo 1 y otras especies como L. micdadei, L. boze- • Tipificar Molecularmente Cepas Clínicas y Ambientales de
manii y L. dumoffii.23 Legionella pneumophila.

Figura1.
Equipo de filtración en línea (Millipore modelo Microfyl), con membrana de poro de 0,45 um (Millipore).

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METODOLOGÍA Identificación presuntiva:

Toda colonia sospechosa fue traspasada a agar BCYE sin antibióticos
Implementación de técnicas de laboratorio de microbio- y en Agar sangre, para evaluar su dependencia a la cisteína. Si la
logía para el estudio de Legionella ambiental colonia crece sólo en BCYE y no crece en agar sangre, se consideró
El cultivo de Legionella de fuentes de agua ambiental se realizó posible Legionella y se procedió a la identificación.
según la Norma ISO 11731/1998.32 Para la implementación de esta
técnica se recurrió a tomar muestras de aguas de torres de refrige- Identificación confirmatoria:
ración. La cepa sospechosa, con dependencia de L-cisteína, fue identificada
El procedimiento de muestreo y ensayo de Legionella pneumo- de forma definitiva mediante serología.
phila, consistió en:
Toma de la muestra: Las muestras se recogieron en frascos estériles Serología mediante técnica de Aglutinación con partículas de látex
con cierre hermético y embalajes adecuados para evitar roturas (kit Legionella Oxoid):
durante el transporte, protegidas de la luz y a temperatura En una tarjeta de reacción de Látex (6 círculos), se coloca una gota
ambiente. Cada muestra se acompañó de una hoja de registro de de buffer de reacción en 5 de los 6 círculos. En cada uno de los
su toma. círculos se agrega un reactivo correspondiente a: reactivo para
Torre de refrigeración: se procedió a: Legionella pneumophila sg. 1, Legionella pneumophila sg. 2-14,
• Recoger agua de la parte baja de la torre, y restos de lodo o Legionella spp, control positivo y control negativo. La colonia sospe-
materia orgánica. chosa se emulsiona en cada círculo con los reactivos correspon-
• Rascar posibles incrustaciones de la pared. dientes. Se mezcla por agitación durante dos minutos y se observa la
• Tomar un 1 litro de muestra. presencia de aglutinación.

Concentración de las muestras de agua Recuento de Legionella

Las muestras fueron concentradas mediante filtración. Se utilizó Cálculo de la concentración de Legionella spp: Se obtuvo el recuento
un equipo de filtración en línea (Millipore modelo Microfyl), con de Legionella spp en UFC/ml, a partir del cultivo primario en GVPC
membrana de poro de 0,45 um (Millipore). (Figura 1). aplicando la siguiente fórmula:
Nº de colonias en la placa x volumen del concentrado (ml) Volumen
Cultivo de la muestra inoculado en la siembra (ml) x Volumen filtrado (ml).
De la muestra tratada con ácido, tratada con calor y sin tratar se Para obtener el recuento en UFC/l (Norma ISO 11731/1998), se debe
sembraron 100 ul en agar GVPC (Polimixina B Vancomicina, multiplicar el recuento en UFC/ml por 1000.
Glicina y Anisomicina. Oxoid, UK), diseminando con rastrillo para Determinación sensibilidad analítica del proceso de filtración: Se deter-
recuento de colonias. Se incubó en aerobiosis a 35°C. minó la sensibilidad analítica del proceso de filtración, la cual corres-
En este medio, Legionella puede crecer a partir de las 48 hrs. de ponde como la mínima cantidad de Legionella que puede ser detectada,
incubación. Se emite un informe de cultivo negativo después de desde el concentrado de agua obtenido posteriormente una vez reali-
revisión periódica, hasta 10 días de incubación a 37°C. zado el proceso de filtración y cultivo explicitado anteriormente.

Detección de Legionella Implementar técnicas de laboratorio de microbiología para

A las 48 horas de incubación, se revisaron las placas de GVPC, el estudio de Legionella clínica.
bajo lupa estereoscópica, en busca de colonias sospechosas con Cultivo de Legionella desde muestras clínicas de pacientes con
características de Legionella. neumonía.
Características de la colonia. Color: azulado o verdoso. Tamaño: Las muestras para el cultivo de Legionella correspondieron a mues-
pequeña a mediana. Forma: convexa. Textura: esmerilada (aspecto tras de expectoración contaminadas con Legionella pneumophila
de “vidrio molido”). Adherencia de la colonia. Iridiscencia. ATCC 33152. Las muestras se disgregaron mediante agitación con
Autofluorescencia. vortex, y luego una porción fue sometida a tratamiento ácido, otra
Características microscópicas. (Figura 2) Tinción de Gram. Bacilos porción a tratamiento con calor y una tercera porción permaneció sin
Gram (-) finos y polimorfos. tratamiento.
• Tratamiento ácido: En un vial de vidrio estéril tapa rosca se coloca
Figura 2.
Tinción de Gram de una cepa de Legionella pneumophila. 100x. Lab. MTU. 100 μl de muestra, se le agrega 900 μl de buffer ácido y se incuba
a T° ambiente 5 minutos.
• Tratamiento por calor: Se depositaron 200 ul de la muestra, en un
tubo Eppendorff de 0.5 m Legionella. Se sometió a 50 °C por 30
minutos en un Termociclador (Thermo. Minicycler, modelo
PTC-150).
• Sin tratamiento: una tercera porción de la muestra se mantiene sin
tratar.

Siembra
• Se sembró 200 μl de la muestra tratada con ácido en agar BCYE
(reactivos Oxoid,UK) y agar GVPC (reactivos Oxoid, UK).
• Se sembró 200 μl de la muestra tratada con calor en agar BCYE
(reactivos Oxoid, UK) y agar GVPC (reactivos Oxoid, UK).

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• Se sembró 200 ul directamente de la muestra sin tratar en agar - Lp-mip-PT69 (5'-GCA TTG GTG CCG ATT TGG) y Lp-mip-PT70
BCYE (reactivos Oxoid, UK) y agar GVPC (reactivos Oxoid, UK). (5'-G[CT]T TTG CCA TCA AAT CTT TCT GAA).
La siembra se realizó depositando la muestra en cada placa de agar La Mezcla de reacción para PCR 1 x PCR buffer 10 x 5 μl MgCl 25
BCYE y GVPC, se espera que seque y se disemina para obtener mM6 μl Mezcla dNTP 2,5 mM1 μl Cebador JFP1 μl 1 μl Cebador
colonias aisladas, se incuba a 35-37 °C en estufa de cultivo en JRP Cebador PT 691 μl Cebador PT 701 μl Enzima Taq polimerasa
atmósfera húmeda (solución no saturada de Sulfato de cobre 0.2 μl (1U) Muestra DNA 1 μl H20 bidestilada 34.8 μl Volumen
pentahidratado más agua destilada). Total50 μl.
Las placas se incuban en atmósfera húmeda a 36 °C durante 10
días y son examinadas al partir de los dos días y luego diaria- Programa de amplificación: Termociclador (Thermo Minicycler,
mente, bajo la lupa para buscar colonias sospechosas. modelo PTC-150) 1 ciclo a 95 ºC por 5 min. 40 ciclos de:
Denaturación 95 ºC por 30 seg. “Anniling” 54 °C x 30 seg
Control de calidad Extensión 74 °C x 60 seg 1 ciclo final de 74 ºC por 10 min.
• La implementación de las técnicas de aislamiento, identificación
de Legionella, se realizaron con la cepa Legionella pneumophila Visualización de las Secuencias Amplificadas
serogrupo 1 ATCC 33152. Electroforesis en gel de agarosa 1,5%. 18 μl del producto de la
• Para el cultivo de Legionella se implementaron los siguientes amplificación fueron mezclados con 5 μl de buffer de carga 6 x
medios de cultivo Agar BCYE con y sin cisteína, agar GVPC, (Gibco Bethesda Research Laboratorios) y se cargaron en los poci-
agar sangre. Las placas se prepararon en nuestro laboratorio llos de geles de agarosa al 1,5% en buffer TAE 1x con bromuro de
semanalmente y se realizó control de calidad (prueba de esteri- etidio (5 μl por 100 μl de agarosa), se sometieron a electroforesis a
lidad y desempeño con la cepa de referencia Legionella pneumo- 100 volts por 30 minutos en cámara de electroforesis horizontal
phila serogrupo 1 ATCC 33152). (Labnet modelo Minigel Migration Tank, Gel X). El tamaño de las
secuencias amplificadas fue estimado por comparación con un
Detección de antígeno urinario DNA “ladder” de 100 bp (Gibco Bethesda Research Laboratories)
Para la implementación del antígeno urinario para Legionella se corridos en condiciones similares.
prepararon orinas contaminadas con la cepa de referencia Los genes fueron observados en transluminador (Espectroline,
Legionella pneumophila serogrupo 1 ATCC 33152. En todos los modelo TVC-312R) y fotografiados en el sistema de captura Kodak
casos se procesó la orina hirviéndola durante 5 minutos y centri- (Sistema EDAS 290, software Kodak 1D 3.6). Figura 3.
fugándola a 3.000 rpm durante 15 minutos. La determinación se
realizó según las instrucciones del fabricante. Figura 3.
Electroforesis de PCR de secuencias amplificadas de Legionella (género, 386
Implementación de una Reacción en Cadena de la bp y especie de Legionela pneumophila. 285bp). Carril 1 DNA ladder 100 bp,
carril 2 y 3 Legionella pneumophila ATCC 33152, carril 4 y 5 Legionella Torre
Polimerasa (PCR) múltiple: para la identificación de
de enfriamiento, carril 6 PCR múltiple de Legionella Torre de enfriamiento.
género y especie de Legionella pneumophila
La implementación de esta técnica se realizó con la cepa Legionella
pneumophila serogrupo 1 ATCC 33152 adquirida en EE.UU. y una
colección de otras Legionella spp cepas cedidas gentilmente por el
Dr. Osuna y el Dr. Mendoza Granada España y cepas de Legionella
aisladas en nuestro laboratorio de agua de torres de refrigeración.

Preparación del ADN blanco

A partir de colonias de Legionella pneumophila serogrupo 1 ATCC
33152 cultivadas ON y otras especies de Legionella spp, se preparó
una suspensión de 200 ul de la cepa en agua bidestilada estéril, a
una concentración de 1x 108 ufc/ml (Mc. Farland 0,5. Densimat
bioMerieux), posteriormente:
• Se calentó a 100 °C por 10 minutos en termociclador.
• Se centrifugó a 130000 rpm y se utilizó el sobrenadarte como
ADN blanco.

Identificación de género Legionella

• Se amplificó un segmento de 386-bp del gen 16S rRNA (base 451
a 837) de Legionella pneumophila ATCC 33152, los cebadores Determinación de la especificidad analítica
usados fueron los descritos por Jonas y cols. (33). Para verificar la especificidad de la amplificación de la técnica de
• Forward JFP (5'-AGG GTT GAT AGG TTA AGA GC) localizado PCR con los cebadores para género Legionella y especie Legionella
en la posición 451 a 470 y Reverse JRP (5'-CCA ACA GCT AGT pneumophila, se realizaron pruebas de PCR con otras especies del
TGA CAT CG) complementario a la posición 836 a 817. género Legionella (proporcionadas gentilmente por la empresa
VIRCELL SA, España) y otras especies bacterianas agentes etiológicos
Identificación de especie Legionella pneumophila de neumonias (provenientes del cepario de nuestro laboratorio).
Se amplificó un segmento de ADN que codifica para una región de Las bacterias ensayadas fueron: Legionella pneumophila serogrupo 1
185 bp del gen mip de Legionella pneumophila ATCC 33152, los ATCC 33152, Legionella lomgbeachae, Legionella micdadei, Legionella
cebadores usados fueron descritos por Wellinghausen N y cols.34 jordanis, Legionella germanii, Legionella guillermondii, Legionella

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dumofii, Mycoplasma pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Tabla 3.

Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus Lugares de muestreo durante 2006. Fuentes de agua interior del Hospital.
influenzae.
N° Servicio Lugar y Tipo de Muestra
1 Lab. Clínico Subterráneo. Ducha personal Lab. Micro
Vigilancia ambiental intrahospitalaria de Legionella 2 Lab. Clínico Subterráneo. Agua Llave Lavamanos Lab. Micro
Se investigó la presencia de Legionella pneumophila, y su hospe- 3 Lab. Clínico Subterráneo. Ducha Emergencia
dero natural Acanthamoeba spp en el Hospital Clínico J.J. Aguirre 4 Lab. Terapia Celular Subterráneo. Agua Destilada Estanque Plástico
de la Universidad de Chile. 5 Unidad de Fórmulas Subterráneo Sala preparación Mamaderas
Enterales y Lácteas Agua llave
Plan de muestreo ambiental 6 Unidad Preparación de Subterráneo. Agua Estéril
Se elaboró un plan de muestreo ambiental considerando los puntos Productos Farmacéuticos
críticos del sistema de aguas sanitarias intrahospitalaria fría y UPFE
caliente, y torres de refrigeración del Hospital Clínico de la 7 Sala Lavado Vajillas Subterráneo. Llave Alimentación
Universidad de Chile. Se consideraron pautas internacionales. 8 Unidad de Preparados Subterráneo. Farmacia
Oncológicos
Para estimar el número de muestras a tomar se consideró el
9 Lab. Terapia Celular Estanque Agua Destilada (contra muestra 4)
número de camas del hospital, que es de 605, y, según las normas
10 Medicina Física Subterráneo Agua Piscina Hidromasaje (grande)
internacionales, para hospitales de 500 camas se utiliza un mínimo 11 Medicina Física Subterráneo Agua Piscina Hidromasaje (Manos)
de 20 muestras. 12 Medicina Física Subterráneo Agua Piscina Hidromasaje (Pies)
Los puntos de donde se recolectaron las muestras consideran los 13 Medicina Física Subterráneo Agua Hidrocolector
equipos de riesgo según las normas internacionales. Cualquier (preparación Compresas)
fuente de agua que es aerosolizada debe ser considerada como una 14 Pediatría 4° Piso: Lavamanos Pediatría Interna Sala E511
potencial forma de transmisión de Legionella pneumophila. Según 15 Pediatría 4° Piso: Ventilador Mecánico
el U.S. Department of Health and Human Services de Centers for 16 Pediatría 4° Piso: Humidificador
Disease Control and Prevention, los lugares apropiados para tomar 17 Pediatría 4° Piso: Agua Mamaderas
muestras en establecimientos de cuidados de la salud, y que 18 Pediatría 4° Piso: Ducha Baño Personal
estaban disponibles para este estudio, son: lugares de salida del 19 Odontología 1er Piso: Bidón Agua Destilada Equipo
20 Odontología 1er Piso: Agua Destilada Equipo Odontología 500 cc
agua —especialmente aquellos cerca o en las salas de pacientes—:
21 Odontología Manguera Equipo Odontología 600 cc
grifos o duchas —y humidificadores— para oxígeno, agua usada
22 Odontología Vaso Paciente Equipo Odontología
para equipos de terapias respiratorias.30 23 Odontología Equipo Ultrasonido 320 cc
24 Odontología Lavamanos
Muestras microbiológicas 25 Oftalmología Sala Procedimientos
Se estudió un total de 109 muestras de fuentes de sistemas de agua 26 Oftalmología Sala Revelado Lavamanos
fría, sistema centralizado de agua caliente y de equipos de terapia 27 Oftalmología Sala Cirugía Menor Lavamanos
del Hospital Clínico José Joaquín Aguirre. 48 muestras durante 28 Oftalmología Sala Enfermería Hospitalizados
2005-2006 HCUCH y 61 muestras de junio a noviembre del año Oftalmología Lavamanos
2008. Se recolectaron muestras del hospital en tres oportuni- 29 Oftalmología Agua Bidestilada Sala Enfermería
dades. 30 Calderas Caldera alimentación cocina
Se tomaron en julio 2005 14 muestras correspondientes a las 31 Calderas Caldera calefacción central
fuentes de agua externas del hospital, tanto los estanques de agua 32 Calderas Estanque agua caliente centralizada
33 Calderas Caldera esterilización
en la azotea de las distintas áreas del hospital y los reservorios a
34 Calderas Boiler Medicina física
nivel del suelo. Tabla 2. Durante el 2006 se muestreó las fuentes de
agua en interior del hospital, se recolectaron 34 muestras en
diversos servicios ubicados en distintos pisos del Hospital (Tabla 3). Durante el año 2007 no se pudo continuar el estudio por razones
ajenas a nuestra voluntad. Finalmente durante el 2008 se estu-
Tabla 2. diaron 61 muestras en total, 31 muestras de junio a agosto 2008 y
Lugares de muestreo durante 2005. Estanques de agua del Hospital. 30 muestras durante el período septiembre-noviembre 2008 (Tabla
N° Servicio Lugar y Tipo de Muestra 4). De cada piso del hospital se eligió un servicio y se tomaron 5 a
1 Exterior Sala Bombas E1 Despiche 8 muestras en él.
2 Exterior Sala Bombas E2 Despiche Cada muestra consistió en un litro de agua y la detección de
3 Exterior Sala Bombas Despiche D1 Legionella pneumophila se realizó según la norma ISO 11731/1998
4 Exterior Sala Bombas Despiche D2
tal como se describió anteriormente.
5 Exterior Terraza Estanque B
6 Exterior Terraza Estanque CB
7 Exterior Terraza Sector D Tipificación Molecular de Cepas Clínicas y Ambientales
8 Exterior Terraza Estanque Sector E de Legionella pneumophila
9 Exterior Terraza Sector E La tipificación de las cepas aisladas se realizó gracias a la implemen-
10 Exterior Sistema de Rebalsa Sector A tación de una técnica PCR- secuenciación que reemplaza las dos
11 Exterior Estanque General Sector AB técnicas propuestas en el proyecto original. En la actualidad corres-
12 Exterior Estanque Grande Sector A ponde a una de las dos técnicas de referencia en EWGLI (European
13 Exterior Estanque Agua Fría Sector DE Working Group for Legionella Infections).35 Por esta razón en este
14 Exterior Estanque General Subsuelo Sector AB estudio se implementó esta técnica en nuestro laboratorio.

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Tabla 4. Tabla 5.
Lugares de muestreo durante 2008. Fuentes de agua interior del Hospital Cepas tipificadas en base al gen mip.
Detección de Legionella pneumophila. Número de Muestra Clasificación Cepa
5º piso, sector E: Pediatría 2º piso, sector D: Intermedio clínico 2 Ambiental TD
E509 UTI, lavamanos, agua fría D205, humidificador cama 1 3 Paciente P. S. L
E511 Intermedio, lavamanos agua fría D205, lavamanos agua fría 4 Control Legionella longbeache
Baño pacientes, ducha agua caliente D205, lavamanos agua caliente 8 Paciente P2HR
Baño pacientes, ducha agua fría Sala lavado de materiales, lavamanos 9 Control Legionella pneumophila ATCC 33152
E509, humidificador cama 3 Baño enfermera, lavamanos agua fría 10 Control Legionella micdadei
4º piso, sector B: Gastroenterología Baño enfermera, lavamanos agua caliente 11 Paciente P3JD
B405, lavamanos agua fría 1er piso, todos los sectores: Lavamanos de 12 Ambiental M4
Lava-chatas fría los baños 15 Control Legionella bonzemani
Baño pacientes B406, lavamanos agua Baño pacientes damas sector A 17 Control Legionella jordanis
caliente Baño público damas sector B 18 Control Legionella micdadei
Baño paciente B406, lavamanos agua fría Baño damas personal de cobranza sector C 22 Ambiental M2
Baño pacientes B406, ducha agua fría Baño público varones sector D, agua fría 19 Paciente P5LG
Baño pacientes B406, ducha agua caliente Baño visitas damas sector D 20 Control Streptococcus pneumoniae
B407, humidificador cama 1 Baño público damas sector D 21 Control Haemophilus Influenzae
3 piso, sector B: Traumatología Baño público mixto sector E, agua caliente
Baño pacientes B359, lavamanos agua Baño público mixto sector E, agua fría Partidores: Se diseñaron 3 pares de partidores dirigidos contra
caliente sitios de unión ribosomal o ORF y el sitio PPiasa del gen mip para
Baño pacientes B359, lavamanos agua fría amplificar productos de 661 a 715 pb. Estos partidores requieren
Baño pacientes B359, ducha agua fría redundancia para considerar la variación del tercer sitio del
Baño pacientes B359, ducha agua caliente codón.
Lava-chatas caliente De los 3 pares de partidores que fueron utilizados, 2 fueron dise-
ñados para la amplificación y uno para la secuenciación (Tabla 6).
Este esquema de clasificación se basa en la amplificación por PCR
Tabla 6.
y secuenciación del gen mip de aproximadamente 700 pares de
Partidores utilizados en el esquema de tipificación del gen mip.
bases (Figura 4), que permite discriminar entre especies y, lo más *( ): Sitios con mezclas de bases en la secuencia de los partidores usando
relevante, intraespecies. nomenclatura IUB.
En el presente estudio se implementó el uso del gen mip para desa-
Nombre Secuencia
rrollar un esquema de tipificación basado en la secuenciación de
Legmip_f 5’-GGG (AG)AT T(ACG)T TTA TGA AGA TGA (AG)A(CT) TGG-3´
distintas cepas de Legionella obtenidas de pacientes y del ambiente.
5’-GGG RAT TVT TTA TGA AGA TGA RAY
TGG -3´
Cepas de Legionella tipificadas Legmip_r 5’-TC(AG) TT(ATCG) GG(ATG) CC(ATG) AT(ATCG) GG(ATCG)*
Las cepas señaladas en la Tabla 5 fueron tipificadas, correspon- CC(ATG) CC- 3´
dientes a cepas ambientales, cepas clínicas y cepas control. Dentro 5’-TCR TTN GGD CCD ATN GGN CCD CC -
de éstas últimas, se utilizaron cepas de referencia de Legionella 3´
pneumophila y de otras especies para controlar el esquema de Legmip_fs 5’-TTT ATG AAG ATG A(AG)A (CT)TG GTC (AG)CT GC-3´
clasificación. También se usaron cepas de otras especies bacte- 5’-TTT ATG AAG ATG ARA YTG GTC RCT
rianas que codifican análogos de mip, capaces de causar cuadros GC-3´
similares, para verificar la especificad de la PCR.

PCR del gen mip Mezcal PCR 1X: Buffer 10 mM5 ul; MgCl2 1.5 mM 3 μl; dDNTP
Extracción de DNA: La extracción de DNA se realizó a partir de las 200 μM 1 μl; Partidores 20 pmol 1 μl; DNA100 ng1 Taq DNA
cepas que fueron sembradas en Agar GVPC por 48 horas, las cuales Polimerasa 2 U0.4
fueron diluidas en agua dd, hasta alcanzar una densidad de Mc
Farland 0.5 y hervidas a 100 °C por 15 minutos. Luego fueron Condiciones de la Amplificación: Predenaturación 96 ºC x 3`, 35
centrifugadas a 3 minutos por 13.000 R.P.M. El DNA blanco fue ciclos de Denaturación 94 ºC x 1`, Alineamiento 58 ºC x 2` y
obtenido del sobrenadante. Elongación 72 ºC x 2`. Extensión Final 72 ºCx 5`.

Figura 4.
Contexto genómico del gen mip

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Análisis de los productos de PCR: 15 μl del volumen total de reac- En el año 2008, se estudió un total de 61 muestras de distintos
ción de PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa 2% servicios del hospital durante dos periodos y no se encontró
marcado con 1 μg/ml con bromuro de etidio y fotografiado bajo luz presencia de Legionella, ni su hospedero natural Acanthamoebas
ultravioleta. en ninguna de ellas.

Purificación de los productos de PCR: Los productos de amplifica- Tipificación Molecular de Cepas Clínicas y Ambientales
ción de PCR fueron purificados usando PCR purification KIT (Clean de Legionella pneumophila
Up, Wizard) de acuerdo al protocolo señalado por el fabricante. A partir del protocolo previamente descrito para la PCR del gen mip
de Legionella, la Figura 4 muestra los resultados obtenidos.
Secuenciación de los productos de PCR: Los productos amplifi-
Figura 4.
cados de PCR fueron secuenciados usando directamente el primer
Electroforesis de producto de PCR de algunas de las muestras clínicas y
forward Legmip_fs por el método de Sanger con el kit Big Dye ambientales para el gen mip.
Terminator Cycle Sequencing Reaction 1.1 (Applied Biosystems) en
un secuenciador automático (ABI 310; Applied Biosystems).

Análisis de las secuencias: Este esquema de clasificación basado

en la secuenciación fue descrito por primera vez por el Dr. Rod
Ratcliff, de Infectious Disease Laboratories, Institute of Medical and
Veterinary Science, Adelaide, Australia. Las secuencias obtenidas
fueron comparadas con la base de datos del gen mip, el cual
contiene un completo set disponible de secuencias con control de
calidad.
Se realizaron “closet matches” comparando los resultado de las
secuencias de DNA del gen mip obtenidos en el laboratorio con la
base de datos disponibles en www.ewgli.org.

RESULTADOS
El desarrollo de esta investigación permitió la Implementación de
técnicas de laboratorio de microbiología para el estudio de
Legionella ambiental según la norma lnternacional, la cual fue 1. Lader 100 bp.
utilizada para el logro del objetivo de vigilancia de Legionella 2. H2O dd.
intrahospitalaria. 3. Legionella pneumophila ATCC
Se implementaron las técnicas tradicionales de microbiología, para 4. S. L (Cepa paciente)
el estudio de Legionella clínica: cultivo, detección de antígeno 5. M4 (Cepa ambiental)
urinario par diagnóstico de sospecha clínica de legionelosis. 6. S. pneumoniae
Se Implementó una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa 7. J. D (cepa paciente)
(PCR) múltiple: para la identificación de género y especie de 8. H. influenzae
Legionella pneumophila con buena especificidad y sensibilidad 9. T.D (Cepa ambiental)
utilizada en el logro del objetivo4. Una vez secuenciados los productos positivos de PCR se realizaron
alineamientos de las secuencias de las distintas cepas en estudio con
Vigilancia de Legionella intrahospitalaria las secuencias de referencia. Figura 5.
Se investigó la presencia de Legionella pneumophila, y su hospe- Posteriormente se obtuvieron árboles filogenéticos con cada una de
dero natural Acanthamoeba spp en el Hospital Clínico J. J. Aguirre las secuencias en estudio. Figura 6.
de la Universidad de Chile. A continuación se realizaron nuevos alineamientos de las secuencias
Se estudió un total de 14 muestras de estanques de agua y 34 mues- de las cepas en estudio con las secuencias similares de la base de
tras de distintos servicios del hospital durante 2005 y 2006, encon- datos de Legionella y se obtuvo el porcentaje de similitud de cada
trándose presencia de Legionella en 3 muestras y Acanthomoeba spp una de las secuencias. Figura 7.
en 4 muestras. Tabla 7. Finalmente se presentan en la Tabla 8 los resultados de la tipificación
Las muestras de agua positivas para Legionella se encontraron en de todas las cepas estudiadas.
recuentos que no constituyen riesgo para la población. Esta metodología nos permitió tipificar distintas cepas del género
Legionella obtenidas de muestras de pacientes y ambientales, de
acuerdo a este esquema de clasificación. Para ello, en cada cepa se
Tabla 7.
obtuvo la secuencia del gen mip por PCR y secuenciación y se iden-
Resultados de Legionella y Acanthomoeba en 48 muestras de agua estu-
diadas durante 2005-2006. tificó a nivel de cepa a través del porcentaje de identidad obtenido
Legionella Acanthomoeba
del alineamiento con las secuencias de referencia disponibles en la
Muestras Positivas 3 6
base de datos de Legionella (www.ewgli.org.). El PCR es específico
para la especie ya que no se obtuvieron productos amplificados con
Muestras Negativas 45 42
cepas de otros géneros.
Total 48 48

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Figura 5.
Alineamiento de una de la secuencia de P1 (userseq., primeras 60 bases).

0 10 20 30 40 50 |---------|---------|---------|------
---|---------|--------- Legionella pneumophila_Phil1
TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATT
Legionella beliardensis TTAAGCAGTGACATGGATAAATTATCTTACAGTATTGGTGCTGATT-
TAGGACGAAATTTT Legionella waltersii CTTGCTACTGACAATGATAAATTATCATACAGT-
ATTGGTGCGGATTTAGGTAAAAACTTC Legionella rowbothamii TTAGTTACAGATAAAGA-
CAAATTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGGAAAAATTTT Legionella longbeachae_sg1
CTTACTACGGACAAAGATAAATTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT
Legionella adelaidensis TTAACCACTGAAATGGATAAATTGTCTTATAGCATAGGTACA-
GATTTGGGCAAAAATTTT Legionella londiniensis CTGGATAGCGATATTGATAAGCTTTCG-
TACAGCATTGGCATTGATCTTGGAAAAAATTTT Legionella oakridgensis TTAACTACG-
GACACAGACAAGCTGTCTTACAGTATTGGTATTGATCTTGGCAAAAATTTT Legionella
jamestowniensis TTAAATAGCGACATGGATAAACTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGG-
TAAAAATTTT Legionella feeleii_sg1 TTAAATAGTGACATGGATAAGTTGTCTTATAGCAT-
TGGCGCTGATTTAGGTAAGAATTTT Legionella maceachernii TTGGCTACAGACACA-
GAAAAACTTTCTTACAGTATTGGCGCTGATTTAGGTAAGAATTTT Legionella rubrilucens
TTAAACACCGATATTGACAAGTTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGCAAAAACTTT
Legionella birminghamensis CTCTCTACTGACATGGATAAATTATCCTACAGTATTGGCGCT-
GATTTGGGTAAAAATTTC Legionella wadsworthii CTTGTTACGGATAAGGATAAATTATCT-
TACAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTC Legionella bozemanii_sg1 CTTGTTACGGA-
TAAAGATAAATTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGGAAAAACTTC Legionella steigerwaltii
CTTGTTACGGATAAAGATAAGTTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTC
Legionella moravica TTACCTACAGACAAAGATAAATTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATT-
TAGGAAAGAATTTC Legionella spiritensis_sg1 TTAAATACGGATACCGATAAATTGTCT-
TATAGTATTGGGGCTGATTTAGGTAAAAACTTC Legionella brunensis TTAAATAGTGACAT-
GGATAAGCTGTCTTACAGTATTGGCGCTGATTTAGGTAAAAACTTT Legionella israelensis
TTGAATACGGATGTAGAAAAATTATCCTACAGTATTGGAGCTGATCTTGGTAAAAATTTC
Legionella lansingensis TTAAATAGCGACACGGATAAGCTGTCTTATAGTATCGGTGCTGACT-
TGGGTAAAAATTTT Legionella gratiana CTTGCTACAGACAAAGATAAGTTATCTTATAG-
TATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT Legionella nautarum TTATCTACTGATACGGA-
TAAGCTGTCTTACAGCATCGGAGCGGATTTAGGTAAGAACTTC Legionella shakespearei
TTACCTACAGACAAAGATAAATTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAATTTCLegionellacincinnatiensis
CTTACTACGGACAAAGATAAATTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT Le-
gionellagresilensisTTAAGCAGTGACATGGACAAACTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGACGGAATTTT
Legionella pneumophila_892076 TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAG-
CATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT Legionella pneumophila_sg_7 TTAGCTA-
C A G A C A A G G ATA A G T T G T C T TATA G C AT T G G T G C C G AT T T G G G G A A G A AT T T T
Legionella pneumophila_Knox TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGT-
GCCGATTTGGGGAAGAATTTT Legionella pneumophila_sg_8 TTAGCTACAGACAAGGA-
TAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT userseq. TTAGC-
TACMGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT

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Figura 6. Tabla 8.
Árbol filogenético análisis de neighbour-joining para el alineamiento Resultados de los alineamientos de las distintas cepas de Legionella en
de la secuencia de P1. estudio en base al gen mip.
L. pneumophila_Phil-1 Número Clasificación Nombre Clasificación según Ewgli % identidad
L. pneumophila_69-2076 de Muestras
userseq
2 Ambiental T D LEGIONELLA
L. pneumophila_Knox
L. pneumophila_sg-7 pneumophila_sg7 99.63
L. pneumophila_sg-8 3 Paciente P.S. L LEGIONELLA
L. moravica pneumophila_91-033 99.64
L. shakespearei
L. waltersii 4 Control LEGIONELLA LEGIONELLA
L. rowbothamii longbeache longbeachae_sg1 95.32
L. longbeachae_sg-1 8 Paciente P.H.R LEGIONELLA
L. cincinnatiensis
L. gratiana
pneumophila_Knox 99.27
L. wadsworthii 9 Control Legionella LEGIONELLA
L. bozemanii_sg1 pneumophila pneumophila_Phil-1 99.82
L. steigerwaltii
ATCC
L. adelaidensis
L.londiniensis 10 Control Legionella LEGIONELLA
L.oakridgensis micdadei longbeachae_sg1 100
L. israelensis 11 Paciente P.J.D. LEGIONELLA
L. beliardensis
L.gresilensis pneumophila_Phil-1 99.82
L. birminghamensis 12 Ambiental M4 LEGIONELLA
L. jamestowniensis pneumophila_Phil-1 99.82
L.brunensis
L. lansingensis
15 Control Legionella LEGIONELLA
L. feeleii_sg1 Bozemanni bozemanii sg1 74.55
L. maceachernii 17 Control Legionella LEGIONELLA
L.nautarum
jordanis jordanis 99.64
L. rubrilucens
L.spiritensis_sg8 18 Control Legionella LEGIONELLA
0,01 micdadei micdadei 99.13
22 Ambiental M2 LEGIONELLA
Figura 7. pneumophila_Phil-1 95.80
Alineamiento de las secuencias más similares a la secuencia de P. J. D. 19 Paciente P.L.G L. pneumophila_Phil-1 90.13
(userq., primeros 60 nucleótidos). 20 Control S. pneumoniae - -
0 10 20 30 40 50 |---------|---------|---------|------ 21 Control H. Influenzae - -
---|---------|--------- LEGIONELLAgratiana
CTTGCTACAGACAAAGATAAGTTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT
LEGIONELLAshakespearei TTACCTACAGACAAAGATAAATTGTCTTACAGTATTGGT- mostrando este esquema así su capacidad de discriminar entre
GCTGATTTAGGAAAAAATTTC LEGIONELLAmoravica TTACCTACAGACAAAGATAAAT-
TGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAGAATTTC LEGIONELLApneumophila_sg_8 especies de Legionella.
TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT En definitiva, el esquema de secuenciación basado en el gen mip
LEGIONELLApneumophila_sg_7 TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAG-
CATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT LEGIONELLApneumophila_Knox TTAGC- para Legionella nos permitió realizar exitosamente la clasificación
TACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT de cepas tanto clínicas como ambientales. Este esquema de clasifi-
LEGIONELLApneumophila_Phil1 TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCAT-
TGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT LEGIONELLApneumophila_892076 TTAGCTACA- cación es técnicamente simple para laboratorios con capacidad y
GACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT userseq equipamiento adecuado y permitió clasificar especie del género
Legionella hasta nivel de cepas y subtipo.
Se determinó que todas las cepas pertenecen a la especie Legionella La técnica utilizada para evaluar la presencia de Legionella pneu-
pneumophila, tipificándose exitosamente tanto cepas clínicas como mophila en las fuentes de agua detecta esta bacteria a concentra-
ambientales. Entre las cepas clínicas se confirmó la especie Legionella ciones mayores a 100 UFC/l. Por otro lado, los resultados para la
pneumophila, dentro de las cuales dos cepas fueron subtipificadas presencia de Legionella pneumophila dan una señal alentadora en
como Legionella pneumophila philadelphia 1, una cepa como cuanto a la calidad de las aguas del hospital y a la baja o mínima
Legionella pneumophila knox y otra cepa como Legionella pneumo- posibilidad para quienes asisten y se atienden en él de contraer
phila 91-033. legionelosis nosocomial.
Entre las cepas ambientales, se confirmó la especie Legionella
pneumophila y una de ellas fue subtipificada como cepa de Discusión
Legionella pneumophila serogrupo 7 y dos cepas fueron subtipifi- Numerosas publicaciones han documentado que los pacientes con
cadas como Legionella pneumophila philadelphia 1. legionelosis nosocomial han sido infectados a través de aerosoles,
Las cepas control fueron coincidentes con los resultados esperados, generados principalmente por duchas, equipos de terapia respira-
excepto para una cepa, la cual dio como resultado una Legionella toria, equipos de hidroterapia, humidificadores de aire ambiental,
longbeachae serogrupo1 con un 100% de identidad, cuando la entre otros.
cepa estaba identificada previamente como una Legionella En este contexto, los hospitales merecen la mayor preocupación
micdadei. Este ensayo fue realizado en duplicado para confirmar para minimizar los riesgos de infecciones asociadas a las condi-
el resultado. Sospechamos que existió un error de rotulación, ciones ambientales. Así, aunque la legionelosis es una infección

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respiratoria, las medidas de control se relacionan directamente con países en que las neumonías por este agente causal tienen impor-
la calidad del agua dado que corresponde a su reservorio. tancia significativa.
A pesar de que existe numerosa legislación y normativa sobre el La implementación de técnicas de laboratorio tradicional y molecular
tema en el extranjero, aún persisten numerosas controversias. Sin nos permitió abordar, por primera vez en Chile, el diagnóstico de
embargo, existe consenso en que legionelosis es una infección Legionella tanto ambiental como clínico. Se ha puesto a punto una
prevenible. técnica de reacción de polimerasa en cadena múltiple, que permite
Una de las estrategias preventivas corresponde a la prevención tipificar simultáneamente las cepas a nivel de género y especie
primaria, en la cual el hospital basa su vigilancia en el diagnóstico
cuidadoso de todos los casos de neumonía nosocomial y/o en el El desarrollo de este estudio permitió logros en diversos ámbitos:
cultivo rutinario de muestras de agua de sus instalaciones. Los 1. Prevención salud laboral: Desarrollar metodologías de preven-
cultivos de rutina han emergido como una estrategia efectiva para ción y erradicación sencillas y eficaces.
la prevención de enfermedad de legionellosis intrahospitalaria. 2. Clínico: Mejorar la sospecha diagnóstica de neumonía.
Por otro lado, si la colonización del agua con Legionella es regis- 3. Microbiológico: La implementación de técnicas de laboratorio
trada, aumenta el índice de sospecha clínica como causa de permitirá abordar el diagnóstico de Legionella y complementar
neumonía nosocomial por este agente, aumentando la vigilancia el diagnóstico etiológico.
clínica. Aunque el CDC recomienda realizar cultivo ambiental sólo El estudio realizado en dos periodos de tiempo en diversas fuentes
en caso de la presencia de al menos dos casos de legionellosis de agua intrahospitalaria del Hospital Clínico José Joaquín Aguirre
nosocomial, varios estudios han documentado que cuando las permitió evidenciar Legionella pneumophila solo en 3 de 109
fuentes de agua están colonizadas existe una mayor probabilidad muestras estudiadas y, además, en recuento muy bajo que no es
de que se presentes casos y/o brotes de Legionella. Además, argu- considerado de riesgo, y sólo en el primer periodo; en el segundo
mentan que en aquellos hospitales en los cuales no se investiga la periodo estudiado, correspondiente al 2008, no se detectó
colonización de legionellosis intrahospitalaria probablemente se Legionella. Sin embargo, se sabe que la portación de estos micro-
den casos de neumonía nosocomial, que son atribuidas a otros organismos es dinámica y justifica revisar o implementar un
agentes o quedan sin causa etiológica conocida. Así en Pittsburgh sistema de control de tratamiento de las aguas intrahospitalarias.
PA: Allegheny County y Maryland USA, Cataluña en España, En los últimos años, Chile ha comenzado la construcción de edificios
Francia y Dinamarca se ha adoptado la rutina de cultivo ambiental inteligentes y la implementación de sistemas tanto de agua sanitaria
de legionellosis. Complementada además con la vigilancia médica caliente como de acondicionamiento de aire centralizados en los
activa de casos de legionellosis nosocomial y un buen laboratorio edificios antiguos. Lo que incorpora por esta razón un agente de
con técnicas microbiológicas apropiadas, permiten un mejor cono- riesgo biológico ocupacional, desconociéndose la magnitud real de su
cimiento del problema. Legionella se encuentra en nuestro medio, exposición; por lo tanto, lograr su cuantificación y determinar el
estudios inmunológicos realizados en Santiago en adultos y en posible impacto de ésta en un área determinada servirá de base para
niños han revelado cifras de seroprevalencia similares a las de enfrentar el potencial riesgo de este agente en otros ámbitos.

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