MINISTERIO DE AGRICULTURA

Instituto Nacional de Innovación Agraria

TÉCNICA DE PRODUCCIÓN
DE SEMILLA GENÉTICA Y BÁSICA
DE AJO (Allium sativum L.)
LIBRE DE VIRUS
 MINISTERIO DE AGRICULTURA

INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA - INIA

Estación Experimental Agraria Donoso - Huaral

Programa Nacional de Investigación en Hortalizas

TÉCNICA DE PRODUCCIÓN
DE SEMILLA GENÉTICA Y BÁSICA
DE AJO (Allium sativum L.)
LIBRE DE VIRUS
Ing. M.Sc. Julio Olivera Soto

Serie Lima - Perú

Folleto N° 6 - 09 Agosto, 2009
C INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA - INIA

DIRECCIÓN DE EXTENSIÓN AGRARIA

Diagramación e Impresión:
Unidad de Medios y Comunicación Técnica

Primera Edición:
Agosto, 2009
Tiraje : 500 ejemplares

Av. La Molina N° 1981, Lima 12 Casilla N° 2791 - Lima 1

Telefax: 3495631 / 3492600 - Anexo 248

Prohibida la reproducción total o parcial sin autorización

Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú Nº: 2009- 10873
 PRESENTACIÓN

Como parte de las actividades de investigación del Programa Nacional de

Investigación en Hortalizas (PNI-H), está considerada la generación de
tecnologías varietales y de manejo, por ello a través del Subproyecto
Tecnología de Producción de Semilla, se llevó a cabo el experimento de
producción de semilla genética de ajo, empleándose técnicas de
producción de semilla como la termoterapia y la micropropagación en el
proceso de obtención de plantas libres de virus en ajo. La presente
publicación describe la técnica de producción de semilla genética y básica
de ajo (Allium sativum L. ) libre de virus la cual permite incrementar el
rendimiento de 8,0 t/ha a 25,0 t/ha (rendimiento potencial).

Coordinación del
Programa Nacional de Investigación en Hortalizas.
 CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................7

2. VIROSIS DEL AJO ............................................................................8

3. TÉCNICA DE PRODUCCIÓN DE SEMILLA DE

CALIDAD DE AJO ...........................................................................10

3.1 Tratamiento de termoterapia ....................................................10

3.2 Desinfección del explante .........................................................11

3.3 Medio de cultivo ........................................................................12

3.4 Fase de inicio ............................................................................16

3.5 Fase de multiplicación ..............................................................17

3.6 Bulbificación (formación de microbulbillos) ..............................18

3.7 Obtención de minibulbillos ........................................................19

4. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................22
 1. INTRODUCCIÓN

El ajo (Allium sativum L), es una especie de reproducción agámica, este

tipo de reproducción vegetativa ocasiona que las enfermedades que lo
afectan se transmitan de generación en generación a través de los
bulbos.

En nuestro país se siembran alrededor de 8 000 hectáreas de ajo,

tanto de los ajos blancos como de los morados. Las principales zonas
productoras del país son Arequipa, Cajamarca y Lima. El rendimiento
promedio a nivel nacional es de 8,0 t/ha (Oficina de Información Agraria,
OIA - MINAG), el cual es bajo teniendo en cuenta que el potencial
llega hasta las 25 t/ha.

El bajo rendimiento se debe principalmente a la mala calidad de

semilla que usan los agricultores, provenientes de sus propios campos
o de mercados locales, debido a que estos bulbos usados como
semilla cada campaña transmiten enfermedades causadas por virus,
hongos y nemátodos.

El uso de semilla de ajo libre de virus permite incrementar

considerablemente el rendimiento, hasta en un 100 % en campos de
producción de agricultores y en 150 % en parcelas experimentales. Esto
debido a que los bulbos de ajo obtenidos bajo la técnica de
producción de semilla genética - básica producen plantas vigorosas, libre
de virus y otros patógenos. Para un plan de producción de semilla
de ajo es imprescindible el uso de material libre de virus como
punto de partida tal que nos permita iniciar la producción de bulbos
semilla de ajo para iniciar un plan de producción comercial para
exportación o para el intercambio de germoplasma a nivel
internacional, que exige el empleo de semilla certificada libre de
patógenos.
8 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

2. VIROSIS DEL AJO

Son diversos los virus que afectan al ajo y en algunos casos forman
un complejo que produce la enfermedad del mosaico del ajo debido
a que presentan un mosaico en las hojas y son causantes de la
disminución del tamaño de los bulbos y por ende de la disminución
del rendimiento. La transmisión de los virus de una planta sana a una
enferma se produce por insectos vectores y se propaga por el uso de
semilla vegetativa infectada.

Hojas de ajo sano y ajo con virus

Los virus detectados en ajo y en otras especies de la familia Alliaceae,

son transmitidos principalmente por áfidos: tenemos dentro del grupo
de los Potyvirus al Onion yellow dwarf virus (OYDV) y el Leek yellow
stripe virus (LYSV) y en el grupo de los Carlavirus al Shallot latent
virus (SLV) y el Garlic common latent virus (GCLV) (Conci, 2 000),
generalmente este grupo de virus causa el “mosaico del ajo”, que
presenta síntomas de mosaicos tenues y acentuados, así como rayas
cloróticas en las hojas. Aunque a veces no hay coincidencia en la
Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus 9

identificación de los virus que causan el “mosaico del ajo”, con ayuda
de técnicas moleculares actualmente se está identificando a nivel
mundial los virus que causan esta enfermedad.

La técnica más utilizada para detectar virus en ajo que actualmente se

emplea es ELISA (enzyme - linked immunosorbent assay) o técnica
inmunoenzimática. Estos test son relativamente de bajo costo y
permite analizar muestras en protocolos simples de tejido meristemático
o de cualquier otro tejido de interés para detectar la presencia de
virus, siempre y cuando se cuente con los antisueros específicos para
cada virus.

Los antisueros de alta especificidad se pueden obtener para los virus

aislados de un conjunto de virus que afectan este cultivo. Dentro de
los Potyviridae, el LYSV es uno de los comunes y que con mayor
frecuencia se encuentra en los diferentes clones en diferentes latitudes
(Salomón, 2002).

Partículas virales de GCLV

10 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

3. TÉCNICA DE PRODUCCIÓN DE SEMILLA DE CALIDAD EN AJO

3.1 Tratamiento de termoterapia

La termoterapia es una técnica que se aplica con la micropropagación
en los procesos de obtención de plantas libres de virus, no
solamente en ajo, sino en otras especies como fresa, camote,
caña de azúcar, papa, entre otros.

El tratamiento térmico de los bulbos de ajo detiene el desarrollo

de los virus en los tejidos adyacentes al meristema. El tratamiento
más recomendable es el que se realiza en una cámara de
termoterapia. Inicialmente se coloca los dientes de ajo en sustrato
desinfectado en bandejas en la cámara de termoterapia a 36º C –
38º C durante 30 a 40 días.

Con estas temperaturas la multiplicación de los virus en las

células vegetales se reduce o en algunos casos completamente se
detiene, al mismo tiempo las células meristemáticas de la planta
continúan dividiéndose e incrementando aunque mas lento. Una
de las explicaciones del funcionamiento de esta técnica es la
competencia entre las células del huésped que se encuentran en
proceso de rápida división y las partículas del virus por lugares
de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas lo cual puede llevar a
un cambio en el balance entre la síntesis y degradación de las
partículas del virus. Otra explicación es que el ácido nucleico del
virus, portador de su información genética, está protegido del
ataque de enzimas degradantes por una cubierta compuesta de
muchas subunidades de proteína. A altas temperaturas, la unión
entre estas subunidades se vuelve más débil, se pueden producir
aberturas temporales y permitir el ataque de las nucleasas, lo
que inactiva al virus y disminuye la concentración del mismo
(Panta, Golmirzaie, 1997).
Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus 11

Este tratamiento no elimina completamente los virus en las

plantas, pero un gran porcentaje de dientes estarán libres de
virus. Depende también de los cultivares que se está tratando, ya
que la respuesta no es la misma y en algunos cultivares se
puede obtener mayor porcentaje de plantas libres de virus como
para el caso del LYSV.

Tratamiento de termoterapia de bulbos de ajo en incubadora

3.2 Desinfección del explante

Después del tratamiento de termoterapia, los dientes se pelan; se
cortan tratando de darles una forma rectangular y se lavan con
abundante agua de caño y jabón, luego se enjuagan 3 veces
con agua destilada. Enseguida se lleva el material a la cámara de
flujo laminar, para trabajar en condiciones asépticas y evitar la
contaminación. Las yemas se lavan con etanol al 70 % durante 30
segundos y a continuación se sumergen en hipoclorito de sodio
al 2% durante 12 minutos, para luego enjuagarlas bien con agua
destilada esterilizada en autoclave.
12 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

Seleccionar, desgranar y pelar los dientes de ajo (remoción de cutícula)

|
Eliminar la parte
superior de los
dientes.
|

Lavar con agua

y jabón.

|
Cortar los dientes en
forma rectangular

3.3 Medio de cultivo

El medio de cultivo a utilizarse puede ser el medio de cultivo LS

(Linsmaier y Skoog, 1965) modificado o el medio MS (Murashige y
Skoog, 1962) modificado, también el medio MS original funciona
en algunos cultivares. En este caso se presenta el medio de
cultivo modificado que se utiliza con cultivares de ajo blanco. Los
macronutrientes son modificaciones del MS, los micronutrientes
son originales del MS y las vitaminas son del medio LS.
Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus 13

Medio de Cultivo para Ajo Murashige & Skoog y

Linsmaier & Skoog (LS) Modificados (MMA)

Concentración
Sales Fórmula mg/l
Nitrato de potasio KNO3 5 700,00
Fosfato de amonio NH4 H2 PO4 150,00
Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O 370,00
Cloruro de calcio CaCl2.2H2O 440,00
Fosfato de sodio NaH2PO4 255,00
Loduro de potasio KI 0,83
Cloruro de cobalto CoCl.6H2O 0,025
Sulfato de manganeso MnSO4.4H2O 22,30
Sulfato de zinc ZnSO4.7H2O 8,60
Sulfato cúprico CuSO4.5H2O 0,025
Acido bórico H3BO3 6,20
Molibdato de sodio Na2 MoO4.2H2O 0,25
EDTA disódico Na2 EDTA 37,30
Sulfato ferroso Fe SO4.7H2O 27,80
Mio - inositol 100,00
Tiamina 0,4

El pH del medio de cultivo es de 5,6 y se debe medir luego de

haber agregado sacarosa al 3%, luego se agrega agar al 0,8%
como solidificante. El medio de cultivo preparado se esteriliza en
autoclave durante 20 minutos a 121°C y 1,2 kg /cm2. Se dispensa
en tubos de prueba para la fase de iniciación y en cajas de
polipropileno con tapas mas conocidas como “magentas” o frascos
de vidrio para la fase de multiplicación y de enraizamiento,
dispensando 40 ml de medio de cultivo por recipiente.
14 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

Se preparan soluciones madres o stock de acuerdo a las

necesidades del laboratorio y a modo de graficarlo mostramos
las siguientes soluciones:

Concentración de las soluciones stock del medio de cultivo MMA

Solución Stock de Macronutrientes:

mg/l 20X (en g) Diluir en: Agregar:
KNO3 5 700 114,0
NH4H2PO4 150 3,0
MgSO4.7H2O 370 7,4 2 litros de 100 ml
CaCl2.2H2O 440 8,8 agua por litro de MS
NaH2PO4* 255 5,1
Solución Stock de Micronutrientes:
mg/l 50X (en g) Diluir en: Agregar:
KI 0,83 0,0415
H3BO3 6,3 0,315
MnSO4.4H2O 22,3 1,115 250 ml 5 ml
ZnSO4.7H2O 8,6 0,43 de agua por litro de MS
CuSO4.5H2O 0,025 0,00125
CoCl.6H2O 0,025 0,00125
Na2MoO4.2H2O 0,25 0,0125
Solución Stock de Hierro:
mg/l 50X (en g) Diluir en: Agregar:
Na2EDTA 37,3 1 865 250 ml 5 ml
FeSO4.7H2O 27,8 1 390 de agua por litro de MS
Solución Stock de Vitaminas:
mg/l 50X (en g) Diluir en: Agregar:
Mio-inositol 100,0 5,00 250 ml 5 ml
Tiamina 0,1 0,005 de agua por litro de MS

* Se puede preparar por separado el fosfato de sodio para que no se precipite la solución madre.
Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus 15

Los reguladores de crecimiento son fundamentales para inducir el

desarrollo de un determinado órgano en la microplanta, estos
pueden actuar solos o en combinación, en diferentes concen-
traciones. La disolución de los reguladores de crecimiento y la
concentración µM que se usan en la preparación de los medios
de cultivo para fresa y ajo se muestra en el siguiente cuadro:

Reguladores de crecimiento usados en la

micropropagación de ajo (concentración en µM)

Ácido Bencil Ácido Iso

Regulador de crecimiento Indol Amino Naftaleno Pentanil
Butírico Purina Acético Adenina
IBA BAP ANA 2IP

Peso molecular 203,2 225,3 186,2 203,2

Disolvente Etanol 1N NaOH 1N NaOH 1N NaOH

1N NaOH

Diluyente H2O H2O H2O H2O

T° almacenamiento polvo 2 - 8°C T. A. T.A. 0°C

T° almacenamiento líquido 0°C 2 - 8°C 2 - 8°C 0°C

Equivalente a 0,1 ppm 0,49 0,44 0,54 0,49

Equivalente a 0,5 ppm 2,46 2,22 2,69 2,46

Esterilización CA / F CA / F CA CA / F

Concentración de trabajo 0,1 – 10,0 0,1 – 5,0 0,1 – 10,0 1,0 – 30,0
(mg/l)

T. A.: Temperatura de ambiente

CA: Coautoclavable
F: Esterilización por filtración
16 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

3.4 Fase de inicio

En esta fase se lleva a cabo la disección o corte del meristema.
El meristema es el punto de crecimiento activo del brote del
diente y está compuesto por el domo meristemático y un
primordio foliar. El ajo debe estar con 2/3 de brotación como
mínimo para poder utilizar este material para la siembra. Se
separan las capas envolventes hasta llegar a los primordios
foliares que cubren el domo meristemático. Luego se procede a
hacer la disección del meristema (domo meristemático y un
primordio foliar envolvente) con ayuda de pinzas y bisturí.

PRIMORDIO FOLIAR
DOMO MERISTEMÁTICO
Meristema de ajo visto a través de
un microscopio estereoscópico.

Regeneración de microplantas
de ajo a partir de meristemas.
Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus 17

En esta fase el empleo del medio LS ha sido ampliamente usado

y la combinación de auxinas y citoquininas induce la formación
de brotes adventicios basales (George, 1996). Para la regeneración
del tejido meristemático y la formación de las microplantas se
adiciona al medio de cultivo MS los reguladores de crecimiento
BAP 0,5 mg/l y ANA 0.1 mg/l (Olivera, 1997).

La regeneración del meristema se logra en 8 a 10 semanas

dependiendo del cultivar y en ese lapso se llega a formar la
microplanta de 5 a 6 cm de longitud.

3.5 Fase de multiplicación

Cuando las microplantas de ajo se han regenerado a partir del
meristema se procede a trasplantarlas a un medio de cultivo de
multiplicación. Se siembran las microplantas en magentas (cajas de
polipropileno) o en frascos de vidrios con tapas de papel aluminio.
El medio de cultivo en esta fase es recomendable que sea el
medio modificado para ajo (MMA), a diferencia del medio de
cultivo para la fase de inicio que es mas adecuado con el MS.

Formación de macollos en microplantas División de macollos para incremento y

de ajo en medio de cultivo de multiplicación. siembra de brotes en nuevo medio de
multiplicación.
18 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

Se siembra de 4 a 6 brotes por envase, dependiendo de la

capacidad del mismo y de la respuesta a los reguladores de
crecimiento. Después de la formación de un macollo este a su vez
se subdivide para así continuar la propagación.

El regulador de crecimiento que se puede usar en esta fase para

el caso de ajo “Arequipeño” y “Napurí” es el 2lP en concentración
de 6 a 10 ppm según sea la respuesta de macollamiento de las
microplantas, y para el caso de otros cultivares se usa BAP 2,0
ppm en combinación con ANA 2,0 ppm.

Durante la fase de inicio o la fase de multiplicación se puede

presentar un desarrollo anormal de las microplantas que se
denomina “vitrificación”; esta anormalidad se produce por la
excesiva absorción de humedad de los brotes al estar en contacto
con el medio de cultivo por causa de separación excesiva de los
macollos.

3.6 Bulbificación (formación de microbulbillos)

Luego de la fase de multiplicación se separan los brotes y se

siembran en medio de cultivo de bulbificación, donde se induce
la formación de microbulbillos mediante el estrés osmótico. Para
esto es necesario agregar sacarosa en concentraciones elevadas
para generar el estrés en la microplanta que van de 8 a 12%
según se vea mejor respuesta del cultivar en inducir la formación
de los microbulbillos.

Este material obtenido conforma la semilla genética y luego de

extraerlo de los envases se deja secar y se almacena en un lugar
fresco y ventilado. Inicialmente puede tener raíces y hojas largas al
Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus 19

ser sacados de los frascos o tubos, pero es conveniente

eliminarlos cuando se secan, antes del almacenamiento.

Microbulbillos formados ‘in vitro’ extraídos Secado de microbulbillos en placas

de sus contenedores. Petri en medio ambiente.

3.7 Obtención de minibulbillos

Después que los microbulbillos se producen en laboratorio y
culmina el periodo de dormancia, en 3 ó 4 meses promedio, se
siembran en bandejas de almácigo con sustrato desinfectado de
musgo y perlita, se coloca en invernadero para que broten y se
formen las plántulas.

Siembra de microbulbillos de ajo Crecimiento de plántulas de ajo

en bandejas de almácigo con sustrato en bandejas a partir de microbulbillos.
a base de musgo.
20 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

En condiciones de temperaturas menores de 20 ºC se desarrollan

los minibulbillos; este material se considera la semilla pre-básica
(primera generación). Al final del periodo vegetativo los
minibulbillos se extraen de las bandejas cuando ya se observa
que las hojas se están secando y se dejan secar en espacios
sombreados y ventilados.

La siguiente campaña se sembrará este material después del

periodo de dormancia en el invernadero en camas bajas para
que formen nuevamente una segunda generación de minibulbillos,
que será la semilla básica.

|
Desarrollo de plantas de
ajo para formación de
minibulbillos.

Cosecha de minibulbillos después }

de secado de plantas.
Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus 21

Los minibulbillos obtenidos en los invernaderos se consideran

semilla básica hasta que alcanzan la madurez fisiológica y
desarrollan del tamaño de un bulbo normal de ajo obtenido en
campo.

Minibulbillos de ajo primera

generación a la izquierda y
minibulbillos segunda
generación a la derecha
después de cosecha y
secado.

Después de la cosecha se deja secar y luego se almacena en un

ambiente sombreado y fresco a temperatura de medio ambiente,
de preferencia en bolsas de papel para evitar el daño por
lepidópteros.
Luego de pasado el periodo de dormancia de 5 meses promedio
ya se puede instalar en campo para producción de semilla.
22 Técnica de Producción de Semilla Genética y Básica de Ajo Libre de Virus

4. BIBLIOGRAFÍA

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In practice. Ed. Exegetics Ltd. England. Pag. 1187.

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Plantarum. V 18. p. 100 - 127.

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Physiologia Plantarum. V 15. p. 473 – 497.

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de semilla de papa. En: Producción de Tubérculos
- semillas de papa. Manual de Capacitación. CIP.
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advances. CABI Publishing. Pag 317.

8. PROGRAMA NACIONAL DE INVESTIGACIÓN EN HORTALIZAS 2008.

Expediente Técnico del Cultivar de Ajo INIA - 104 -
Blanco Huaralino. Pág. 133.