Final JCF310523
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Ingeniería en Biotecnología
Resumen
La producción de tomate (Solanum Lycopersicum) a nivel mundial ha experimentado en las últimas
décadas un incremento constante de numerosas plagas y enfermedades, algunas de las principales
causas del incremento y desarrollo de las enfermedades víricas son el monocultivo, el intercambio
de material vegetal entre distintos países y la implementación de invernaderos.
El objetivo de este proyecto de investigación fue desarrollar una metodología para la detección de
virus en plantas de jitomate, con el fin de que fuera rentable y comercial, la primera tarea fue
implementar un método establecido para la extracción del ADN vegetal y por medio de una PCR
detectar la presencia de los virus más comunes en plantas de jitomate como virus rugoso, virus del
bronceado, virus de la marchites manchada, etc.
En los cultivos hortícolas, las enfermedades constituyen uno de los factores de mayor riesgo para
su producción, por lo que resulta importante protegerlos del ataque de diferentes patógenos. En los
últimos años, las enfermedades causadas por virus han ocasionado fuertes pérdidas económicas en
la producción de diferentes cultivos de tomate (Solanum Lycopersicum). (Rico, 2002)
Estas pérdidas son variables año con año, y han estado en función de las condiciones climáticas,
manejo del cultivo, control químico y cultural de insectos y malezas llegando en algunos casos a
alcanzar pérdidas del 100% (Vidales y Alcantar, 1989).
Es por eso el desarrollo de una metodología de detección de enfermedades víricas que ayuden a
prevenir futuras siembras, es decir por medio de la identificación a través de una técnica de
laboratorio, que permita implementar diferentes medidas de manejo y control, el diagnóstico
correcto del agente viral es relevante porque determinara en gran medida el éxito de las alternativas
para su control. (Rico, Moreno et.al. 2004)
Existen diferentes metodologías que por sí solas son consideradas como herramienta suficiente para
la identificación de un virus, tal es el caso de la inmunoserología (Cruz, Frías, 1997), la prueba de
inmunoadsorción con enzimas ligadas o ELISA ha resultado específica y útil para detectar virus en
las plantas.
Las técnicas mencionas no son tan comerciales y no todos los campesinos tienen la oportunidad de
realizar una prueba de laboratorio como estas, por eso el objetivo general es diseñar una
metodología para le detección de virus que esté al alcance de todos los campesinos y puedan
disminuir sus pérdidas con una detección a tiempo.
Justificación
A nivel mundial, China ocupa el primer lugar dentro de los principales productores de jitomate con
más de 41 millones de toneladas, seguido de Estados Unidos, India y Egipto. México ocupa el
décimo puesto con cerca de 3 millones de toneladas, y se ubica en el tercer lugar dentro de las
especies de mayor importancia económica después de la caña de azúcar y maíz (FAO, 2010).
Siendo de las especies más importantes a nivel económico, laboral y nutricional el foco del interés
se enciende puesto que para preservar las cifras es necesario tener un control de los cultivos, por
eso la detección de virus son importantes en los sistemas agrícolas de producción en México, dado
que pueden reducir hasta el 100 % de la calidad y producción de los cultivos, sobre todo cuando la
planta es infectada en etapas tempranas de su desarrollo (Ley y Garcia, 1998 citado por Urias
1999).
La identificación de los virus por sintomatología no es confiable debido a que dichos síntomas se
pueden confundir con desórdenes nutrimentales o por daños causados por herbicidas u otros
patógenos. Las técnicas más eficientes y confiables son las serológicas como ELISA y las de
biología moléculas como PCR y RT-PCR (Robles et al., 2010).
Objetivo general
Al diseñar una metodología para detectar virus que sea accesible para todas aquellas micro,
medianas empresas dedicadas al cultivo de jitomate se alcanzaran los resultados fijados por el
agricultor, haciendo referencia a que el objetivo final es tener una cosecha sana y completa, es decir
sin enfermedades víricas, por hongos, etc.
De esta manera al detectar los virus a tiempo se evitaron pérdidas económicas y se redujeron
mermas por enfermedad dando como resultado las ganancias esperadas.
El tiempo de detección del virus es desde las primeras semanas de la plántula de esta manera se
garantizó el crecimiento en condiciones sanas.
Objetivo General: Diseñar una metodología para detectar virus infectivos en plantas de jitomate
Objetivos específicos
Se determino mediante el protocolo de extracción de ADN vegetal propuesto por Keb- Llanes y por
medio de la técnica de PCR si existían virus en una planta de jitomate para descartar enfermedades
que afecten el crecimiento y cultivo futuro de todo el sembradío.
Se propuso una metodología de detección al alcance de los agricultores que ayudara a que todos los
agricultores tengan el control de sus cultivos hortícolas para no fracasar en la cosecha de tal
manera que la pérdida económica sea nula y así asegurar futuras siembras.
Objetivos Específicos:
En las últimas décadas la biotecnología ha sido una de las áreas de mayor crecimiento e impacto
científico, contribuyendo principalmente en los sectores como salud, agrícola, pecuario, medio
ambiente, industrial, etc.
El CIBA fue creado en el 2003, dedicado a la generación y aplicación del conocimiento en el área
de la biotecnología, que ofrece estudios de posgrado en biotecnología aplicada y productiva,
desarrolla investigación, forma doctores y maestros en ciencias de la mayor calidad, capaces de
utilizar las teorías del conocimiento para innovar y transferir tecnología que contribuya al
crecimiento económico del país.
Desarrollo
La extracción de ADN genómico es uno de los pasos más importantes en estudios de ingeniería
genética de plantas, por esta razón es relevante el desarrollo y manejo de protocolos optimizados
que permitan la extracción de forma rápida, económica y confiable.
Palabras Clave: virus patógenos de jitomate, PCR virus jitomate, virus infecta jitomate
Soluciones.
EDTA:
Buffer T.E.:
Buffer A. 15 ml
1. Añadir CTAB al 2% (0.3gr) a un tubo falcón más solución Tris a 100mM (1500µL),
solución EDTA a 20mM (600µL), solución NaCl a 1.4mM (4.2µL), solución PVP al
4%, solución βME a 10mM (150µL), aforando a 15 ml.
Buffer B. 45 ml
1. Añadir a un tubo falcón solución Tris a 100mM (4500µL), solución EDTA a 50mM
(4500µL), solución de NaCl a 100mM (900µL), solución βME a 10mM (450µL), aforar
hasta 45ml.
Buffer lisis 20 ml
1. Añadir en tubo falcón 12ml de Acetato de potasio, 5.7 ml de Agua y 2.3ml de ácido
acético glacial.
1. Pulverizar 100mg de tejidos secos con nitrógeno líquido, colocarlos en tubos eppendorf de
1.5 ml.
2. Agregar 750µL de Buffer de extracción y 750 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1),
agitar en el vortex las muestras.
3. Centrifugar las muestras a 12 800 rpm por 2 min a temperatura ambiente (25°C), recuperar
el sobrenadante y transferirlo a tubos nuevos.
4. Adicionar a volumen igual de Fenol cloroformo alcohol isoamílico (1:1)
5. Centrifugar a 12 800 rpm por 2 min a temperatura ambiente (repetir este paso hasta
observar una fase clara.
6. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos y adicionar 10% del volumen recuperado de
acetato de sodio y 2.5 volúmenes de etanol absoluto, mezclar e incubar a -20 °C por una
hora.
7. Lavar con etanol al 70 %, y enseguida centrifugar a 12 800 rpm por 10 min (4 °C)
8. Lavar las muestras con etanol absoluto, decantar y dejar secar a temperatura ambiente
9. Resuspender la pastilla obtenida en agua destilada libre de RNAsas.
B. Determinación de la concentración de fenoles por el método Folín, mediante una
curva de calibración.
Los antioxidantes protegen el organismo de los radicales libres, moléculas altamente reactivas que
pueden dañar el organismo a nivel celular. Este daño es producido por los radicales libres puede
aumentar el riesgo al desarrollo de cáncer, enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades
degenerativas. Los antioxidantes desactivan los radicales libres, minimizando el daño y
protegiendo el organismo de este tipo de enfermedades.
Materiales y métodos
Se realizo un primer ensayo con una muestra de ácido gálico a diferentes concentraciones partiendo
desde 0.1 mg/1 ml hasta 0.0031 mg/1ml, siendo un total de 6 concentraciones para obtener la
curva. Cada concentración se dividió por mitad llegando así hasta la concentración de 0.0031 mg/
1ml.
Posteriormente se elaboró una receta para medir en el espectro la absorbancia a una longitud de
onda de 760nm, conteniendo; Folín, muestra de ácido gálico NaCO3 y agua destilada.
Después de realizar la medición en el espectro con las diferentes concentraciones se toma como
punto de referencia la concentración de 0.0125 mg/ 1 ml, debido a que arrojo una absorbancia de
0.293 a una longitud de onda de 760nm, teniendo en cuenta que el espectro entre más se aproxime
al 1 el dato será menos exacto.
Las muestras con las que se trabajaron para medir la concentración de fenoles fueron; frijol,
garbanzo, alverjón, lenteja, trigo, nopal, sábila y medio MRS. Cada una de ellas fue media por
triplicado y al final de la medición se sacó una media, esto con el fin de tener un dato más concreto.
Las muestras tuvieron 2 etapas de reacción antes de ser leídas, la primera entre el reactivo FOLIL y
la muestra por leer (alguna de las 8), en un rango de 10 minutos como mínimo y máximo 20, la
segunda después de agregar el carbonato de sodio y el agua destilada en un rango de 20 minutos
como mínimo, máximo 30. Después de haber pasado las 2 etapas de reacción se procede a la
lectura en el espectro a una longitud de onda de 760nm, cada 1 de las muestras fue leida a en 3
distintas concentraciones. (Tabla 1)
El siguiente experimento consta en medir la misma reacción antioxidante, pero con la diferencia
que había presente una bacteria láctica T1, para esto se cultivaron las bacterias en un medio rico en
proteína debido a que es el mejor medio para estas bacterias. (Tabla 2)
Las pruebas se realizaron con 3 proteínas cargadas por duplicado en una concentración de gel de
agarosa al 2 % y a una concentración de 4% mezclada con buffer comercial, a las muestras se le
agrego buffer de tinción (lisozima, albumina, y MRS) se utilizó un buffer de suspensión para la
corrida de proteínas. Se corrió a temperatura constante y a un tiempo de 4 horas.
Después de la separación por electroforesis, las bandas de proteínas se visualizan normalmente con
colorantes de gel, las tinciones de gel de proteínas reaccionan selectivamente con las proteínas para
producir un gel teñido. Las tinciones de gel de proteínas se seleccionan normalmente en función del
tamaño inicial de la muestra, el método de detección deseado y los requisitos de compatibilidad
para el análisis posterior.
El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie, puesto que este es utilizado para teñir proteínas
en geles de agarosa a través de interacciones electrostáticas con los grupos amino y carboxilo de las
proteínas. El gel se sumergió durante 30 minutos para que este penetre y se fije a las proteínas y así
libremente desteñir con agua destilada varias veces hasta que se aprecien las bandas de la corrida.
Los resultados de aprecian en orden de izquierda a derecha, estando en el primer pozo Albumina en
el segundo pozo Lisozima y en el tercer pozo MRS dejando un pozo vacío para darle espacio al
duplicado de las muestras.
Los geles en las distintas concentraciones están partidos a la mitad de esa manera la corrida, fue
optimizada y más rápida, en el lado izquierdo esta la concentración de 2% y del lado derecho esta
la concentración de 4%. De esta manera podemos observar que en el gel con concentración más
alta fue más complejo que las proteínas hicieran un barrido estable, mientras que en el gel con
concentración de 2% fue más sencillo que las proteínas viajaran.
Después de varias lavadas con agua destilada y dejarlo que se destiña, se puede apreciar un mejor
barrido de las distintas proteínas que se corrieron, para una mejor visión de del barrido se
recomienda utilizar un transiluminador, cuenta con una cámara y una lampara que ayudara a
revelar con un software el barrido de las proteínas.
Las bacterias fueron reactivadas y propagadas en los distintos medios líquidos (alverjón, garbanzo,
frijol, lenteja, trigo, sábila, nopal y medio MRS) se dejaron durante 24 horas a condiciones óptimas
asegurando el crecimiento, que fue cuantificado haciendo conteo en placa. Para ello se hizo vertido
en placas y se sembraron las bacterias T1, se dejaron incubar por 48 horas y se procedió a hacer el
conteo.
Para tener un conteo más exacto con relación al crecimiento se hicieron 6 diluciones (10 -6) y al
final se cuantificaron las UFC mediante el conteo en placa, haciendo el conteo se determinó que
medio de los seleccionados es el más adaptable y favorable para el crecimiento de esta bacteria.
En conclusión, el mejor medio para el crecimiento de esta bacteria es el frijol, puesto que después
del conteo y comprobado con una gráfica de barras haciendo referencia a las diluciones que se
realizaron el frijol es donde existen mayor UFC de bacterias lácticas K1.
Posteriormente se realizó el mismo experimento, pero con otra especie de bacteria láctica K1, en
los mismos medios seleccionados, se anexan las tablas de resultados a continuación haciendo la
comparación entre las 2 especies de bacterias con graficas de barras para tener mejor visión de
resultados.
Medio de cultivo apropiado para el aislamiento y recuento de lactobacilos y otras bacterias ácido-
lácticas a partir de muestras clínicas y alimentos (especialmente productos lácteos).
Bibliografía
S. L., Wood, J., &Hicks, J. B. (1983). A plant DNA minipreparation.Version II.Plant Molecular
Biology Reporter,1, 19–21.
https://doi.org/10.1007/BF02712670Del
M. T. Vázquez Galicia (2004). Proceso de institucionalización del CIBA Tlaxcala IPN Benemérita
Universidad Autónoma de Puebla, 10-11
Proceso de institucionalización del CIBA IPN Tlaxcala (buap.mx)
Pérez Moreno, Rico Jaramillo (2004) vol. 22, núm. 2, identificación de virus fitopatógenos en
cultivos hortícolas de importancia económica en el estado de Guanajuato, México. Sociedad
Mexicana de Fitopatología 187-197
Redalyc.Identificación de Virus Fitopatógenos en Cultivos Hortícolas de Importancia Económica
en el Estado de Guanajuato, México
M. Pérez Rojas (2013). Virus asociados al cultivo de jitomate en el estado de Morelos. Institución
de enseñanza e investigación en ciencias agrícolas Montecillo, Texcoco, Edo. De México. 1-3
Perez_Rojas_M _MC_Fitopatologia_2013.pdf (colpos.mx)
Nolasco García, Marín León, (2020). Métodos de identificación del virus de la fruta rugosa marrón
del tomate (ToBRFV) en México. Volumen 31. Universidad de Costa Rica 839-841.
http://www.revistas.ucr.ac.cr/index.php/agromeso
Stephen L. Dellaporta Jonathan Wood, James B. Hicks (1983). A plant DNA Minipreparation:
Version II. Volumen 1, cold Spring Harbar Laboratory Cold spring harbar, NY. Plant Molecular
Biology Reporter.
Dellaporta_DNA_Extraction.2014.08.20.pdf