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Universidad Politécnica de Tlaxcala

Ingeniería en Biotecnología

Diseño de metodología para la detección de


virus infectivos en plantas de jitomate
(Solanum Licopersycum)
Participantes:

Juan Cuapio Flores


[email protected]
Guillermo Cruz Nicolas
[email protected]
Luis Alberto Santiago Santiago
[email protected]

31 de mayo del 2023

Resumen
La producción de tomate (Solanum Lycopersicum) a nivel mundial ha experimentado en las últimas
décadas un incremento constante de numerosas plagas y enfermedades, algunas de las principales
causas del incremento y desarrollo de las enfermedades víricas son el monocultivo, el intercambio
de material vegetal entre distintos países y la implementación de invernaderos.

El objetivo de este proyecto de investigación fue desarrollar una metodología para la detección de
virus en plantas de jitomate, con el fin de que fuera rentable y comercial, la primera tarea fue
implementar un método establecido para la extracción del ADN vegetal y por medio de una PCR
detectar la presencia de los virus más comunes en plantas de jitomate como virus rugoso, virus del
bronceado, virus de la marchites manchada, etc.

Planteamiento del problema

En los cultivos hortícolas, las enfermedades constituyen uno de los factores de mayor riesgo para
su producción, por lo que resulta importante protegerlos del ataque de diferentes patógenos. En los
últimos años, las enfermedades causadas por virus han ocasionado fuertes pérdidas económicas en
la producción de diferentes cultivos de tomate (Solanum Lycopersicum). (Rico, 2002)

Estas pérdidas son variables año con año, y han estado en función de las condiciones climáticas,
manejo del cultivo, control químico y cultural de insectos y malezas llegando en algunos casos a
alcanzar pérdidas del 100% (Vidales y Alcantar, 1989).

Es por eso el desarrollo de una metodología de detección de enfermedades víricas que ayuden a
prevenir futuras siembras, es decir por medio de la identificación a través de una técnica de
laboratorio, que permita implementar diferentes medidas de manejo y control, el diagnóstico
correcto del agente viral es relevante porque determinara en gran medida el éxito de las alternativas
para su control. (Rico, Moreno et.al. 2004)

Existen diferentes metodologías que por sí solas son consideradas como herramienta suficiente para
la identificación de un virus, tal es el caso de la inmunoserología (Cruz, Frías, 1997), la prueba de
inmunoadsorción con enzimas ligadas o ELISA ha resultado específica y útil para detectar virus en
las plantas.
Las técnicas mencionas no son tan comerciales y no todos los campesinos tienen la oportunidad de
realizar una prueba de laboratorio como estas, por eso el objetivo general es diseñar una
metodología para le detección de virus que esté al alcance de todos los campesinos y puedan
disminuir sus pérdidas con una detección a tiempo.

Justificación
A nivel mundial, China ocupa el primer lugar dentro de los principales productores de jitomate con
más de 41 millones de toneladas, seguido de Estados Unidos, India y Egipto. México ocupa el
décimo puesto con cerca de 3 millones de toneladas, y se ubica en el tercer lugar dentro de las
especies de mayor importancia económica después de la caña de azúcar y maíz (FAO, 2010).

Siendo de las especies más importantes a nivel económico, laboral y nutricional el foco del interés
se enciende puesto que para preservar las cifras es necesario tener un control de los cultivos, por
eso la detección de virus son importantes en los sistemas agrícolas de producción en México, dado
que pueden reducir hasta el 100 % de la calidad y producción de los cultivos, sobre todo cuando la
planta es infectada en etapas tempranas de su desarrollo (Ley y Garcia, 1998 citado por Urias
1999).

Dentro de los criterios para la identificación de virus se encuentran la caracterización de síntomas


que inducen en el hospedante, la inoculación de plantas indicadoras, pruebas serológicas y de
bilogía molecular y la microscopía electrónica (Pérez, et al., 2004).

La identificación de los virus por sintomatología no es confiable debido a que dichos síntomas se
pueden confundir con desórdenes nutrimentales o por daños causados por herbicidas u otros
patógenos. Las técnicas más eficientes y confiables son las serológicas como ELISA y las de
biología moléculas como PCR y RT-PCR (Robles et al., 2010).

Objetivo general

Al diseñar una metodología para detectar virus que sea accesible para todas aquellas micro,
medianas empresas dedicadas al cultivo de jitomate se alcanzaran los resultados fijados por el
agricultor, haciendo referencia a que el objetivo final es tener una cosecha sana y completa, es decir
sin enfermedades víricas, por hongos, etc.

De esta manera al detectar los virus a tiempo se evitaron pérdidas económicas y se redujeron
mermas por enfermedad dando como resultado las ganancias esperadas.

El tiempo de detección del virus es desde las primeras semanas de la plántula de esta manera se
garantizó el crecimiento en condiciones sanas.

Objetivo General: Diseñar una metodología para detectar virus infectivos en plantas de jitomate

Objetivos específicos

Se determino mediante el protocolo de extracción de ADN vegetal propuesto por Keb- Llanes y por
medio de la técnica de PCR si existían virus en una planta de jitomate para descartar enfermedades
que afecten el crecimiento y cultivo futuro de todo el sembradío.
Se propuso una metodología de detección al alcance de los agricultores que ayudara a que todos los
agricultores tengan el control de sus cultivos hortícolas para no fracasar en la cosecha de tal
manera que la pérdida económica sea nula y así asegurar futuras siembras.

Objetivos Específicos:

1. Buscar métodos comerciales para detección de virus que infectan jitomate.


2. Alinear secuencias genéticas de virus infectivos de plantas de jitomate.
3. Diseñar iniciadores de PCR para la detección de virus infectivos de jitomate.
4. Ampliar por PCR secuencias de virus infectivos de plantas de jitomate.

Análisis del contexto CIBA

En las últimas décadas la biotecnología ha sido una de las áreas de mayor crecimiento e impacto
científico, contribuyendo principalmente en los sectores como salud, agrícola, pecuario, medio
ambiente, industrial, etc.

Su utilidad y aplicación en lo farmacéutico, la producción y procesado de alimentos, la industria


química y la remediación de ecosistemas, entre otros, ha permitido las técnicas de genoma de
diversos organismos, incluyendo la del ser humano, el arroz y un gran número de microorganismos
y la identificación más rápida de sus funciones, creado un nuevo paradigma en las aplicaciones
biotecnológicas ¡, que van desde el diseño más efectivo de medicinas, plamtas con mayor
productividad y mejor calidad alimentaria, hasta el desarrollo de nanotecnologías que antes eran
imposibles de concebir (Bolívar, 2003).

El CIBA fue creado en el 2003, dedicado a la generación y aplicación del conocimiento en el área
de la biotecnología, que ofrece estudios de posgrado en biotecnología aplicada y productiva,
desarrolla investigación, forma doctores y maestros en ciencias de la mayor calidad, capaces de
utilizar las teorías del conocimiento para innovar y transferir tecnología que contribuya al
crecimiento económico del país.

Desarrollo

La extracción de ADN genómico es uno de los pasos más importantes en estudios de ingeniería
genética de plantas, por esta razón es relevante el desarrollo y manejo de protocolos optimizados
que permitan la extracción de forma rápida, económica y confiable.

Diseño de metodología para la detección de virus infectivos en plantas de jitomate (solanum


licopersycum)

Palabras Clave: virus patógenos de jitomate, PCR virus jitomate, virus infecta jitomate

Protocolo de extracción de ADN de jitomate (solanum licopersycum)


Materiales y métodos.

Soluciones.

Tris 1M pH 7.5-9.5 (PM=121.14)

1. Disolver 1.21 gr de Tris con agua desionizada aforando hasta 10ml

Cloruro de sodio (NaCl) 5M (PM= 58. 44)

1. 5.84 gr de cloruro de sodio

EDTA:

Solución ya lista para utilizar

Buffer T.E.:

1. Añadir en tubo falcón, 300µL de solución Tris a 10mM y 60 µL de solución EDTA a


1mM, aforando a 30 ml.

Buffer A. 15 ml

1. Añadir CTAB al 2% (0.3gr) a un tubo falcón más solución Tris a 100mM (1500µL),
solución EDTA a 20mM (600µL), solución NaCl a 1.4mM (4.2µL), solución PVP al
4%, solución βME a 10mM (150µL), aforando a 15 ml.

Buffer B. 45 ml

1. Añadir a un tubo falcón solución Tris a 100mM (4500µL), solución EDTA a 50mM
(4500µL), solución de NaCl a 100mM (900µL), solución βME a 10mM (450µL), aforar
hasta 45ml.

Buffer lisis 20 ml

1. Añadir en tubo falcón 12ml de Acetato de potasio, 5.7 ml de Agua y 2.3ml de ácido
acético glacial.

SDS al 20% (w/v)

1. Mezclar 1gr de SDS en 5 ml de agua.

A. Protocolo de aislamiento de ADN vegetal propuesto por (Keb-Llanes y


col.,2002)
1. Moler 0.350 g de tejido de hoja con nitrógeno líquido en mortero pre-enfriado a -20°C
hasta obtener un polvo fino. Transferir la muestra con una espátula a tubo eppendorf de
2ml. Agregar 300 µl de Buffer A, 900 µl de Buffer B y 100 µl de SDS. (Agitar entre una
aplicación y otra)
2. Agitar en vortex e incubar en baño maría a 65 °C por 10 min. (agitar cada 2 min)
3. Añadir 410 µl de Buffer de lisis frio. Centrifugar a 12000 rpm por 15 minutos. (En
centrifuga refrigerada a 4 °C.)
4. Transferir el sobrenadante a tubo limpio (aprox. 800 µl), agregar 540 µl de isopropanol frio
a cada tubo, mezclar e incubar a -20 °C (Durante 20 min.)
5. Centrifugar a 10000 rpm durante 10 min. Descarta el sobrenadante, vertiendo con cuidado.
Lavar el pellet obtenido con 500 µl de etanol al 70%. Centrifugar de nuevo y dejar secar el
pellet para que se evapore el etanol.
6. Resuspender el pellet en 500 µl de Buffer T.E. y añadir 60 µl de acetato de sodio 3M (pH
5.2) y 360 µl de isopropanol frío. (Mezclar e incubar a -20 °C por 20 min)
7. Centrifugar a 10000 rpm durante 10 min. Repetir los pasos 5 a 7 dos veces. Lavar con 500
µl de etanol al 70% y volver a centrifugar. (dejar secar hasta que se evapore todo el
alcohol)
8. Resuspender el pellet en 100 µl de T.E.

Protocolo de aislamiento de ARN vegetal.

1. Pulverizar 100mg de tejidos secos con nitrógeno líquido, colocarlos en tubos eppendorf de
1.5 ml.
2. Agregar 750µL de Buffer de extracción y 750 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1),
agitar en el vortex las muestras.
3. Centrifugar las muestras a 12 800 rpm por 2 min a temperatura ambiente (25°C), recuperar
el sobrenadante y transferirlo a tubos nuevos.
4. Adicionar a volumen igual de Fenol cloroformo alcohol isoamílico (1:1)
5. Centrifugar a 12 800 rpm por 2 min a temperatura ambiente (repetir este paso hasta
observar una fase clara.
6. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos y adicionar 10% del volumen recuperado de
acetato de sodio y 2.5 volúmenes de etanol absoluto, mezclar e incubar a -20 °C por una
hora.
7. Lavar con etanol al 70 %, y enseguida centrifugar a 12 800 rpm por 10 min (4 °C)
8. Lavar las muestras con etanol absoluto, decantar y dejar secar a temperatura ambiente
9. Resuspender la pastilla obtenida en agua destilada libre de RNAsas.
B. Determinación de la concentración de fenoles por el método Folín, mediante una
curva de calibración.

Los alimentos de origen vegetal presentes en la dieta, de acuerdo a estudios epidemiológicas


realizados pueden ejercer un efecto protector contra algunas enfermedades tales como el cáncer,
trastornos cardiovasculares y cerebrovasculares. Esta propiedad se debe a la presencia de
compuestos bioactivos con capacidad antioxidante como la vitamina C, E, β-caroteno, y una
mezcla compleja de compuestos fenólicos. La actividad antioxidante, consecuencia de la presencia
y estructura química de os polifenoles, crea interés en los posibles efectos beneficiosos para la
salud de los alimentos y bebidas ricos en polifenoles.

Los antioxidantes protegen el organismo de los radicales libres, moléculas altamente reactivas que
pueden dañar el organismo a nivel celular. Este daño es producido por los radicales libres puede
aumentar el riesgo al desarrollo de cáncer, enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades
degenerativas. Los antioxidantes desactivan los radicales libres, minimizando el daño y
protegiendo el organismo de este tipo de enfermedades.

Materiales y métodos

Se realizo un primer ensayo con una muestra de ácido gálico a diferentes concentraciones partiendo
desde 0.1 mg/1 ml hasta 0.0031 mg/1ml, siendo un total de 6 concentraciones para obtener la
curva. Cada concentración se dividió por mitad llegando así hasta la concentración de 0.0031 mg/
1ml.
Posteriormente se elaboró una receta para medir en el espectro la absorbancia a una longitud de
onda de 760nm, conteniendo; Folín, muestra de ácido gálico NaCO3 y agua destilada.

Protocolo para la cuantificación de fenoles con Folin-C

1. En un vial de 2ml agregar 100 µL de Folin-C y 500 µL de muestra de ácido gálico a


concentración (0.0125/1ml). Vorteax para mejor reacción
2. Dejar reaccionar de 20 a 30 minutos antes de agregar el carbonato de sodio.
3. Después de haber pasado el tiempo agregar 100µL de NaCO 3 al 25% seguido de 1300 µL
de agua destilada. Dejar durante al menos 30 minutos que se lleve a cabo la reacción.
4. Leer en el espectro después de haber pasado el tiempo.

Después de realizar la medición en el espectro con las diferentes concentraciones se toma como
punto de referencia la concentración de 0.0125 mg/ 1 ml, debido a que arrojo una absorbancia de
0.293 a una longitud de onda de 760nm, teniendo en cuenta que el espectro entre más se aproxime
al 1 el dato será menos exacto.
Las muestras con las que se trabajaron para medir la concentración de fenoles fueron; frijol,
garbanzo, alverjón, lenteja, trigo, nopal, sábila y medio MRS. Cada una de ellas fue media por
triplicado y al final de la medición se sacó una media, esto con el fin de tener un dato más concreto.

Las muestras tuvieron 2 etapas de reacción antes de ser leídas, la primera entre el reactivo FOLIL y
la muestra por leer (alguna de las 8), en un rango de 10 minutos como mínimo y máximo 20, la
segunda después de agregar el carbonato de sodio y el agua destilada en un rango de 20 minutos
como mínimo, máximo 30. Después de haber pasado las 2 etapas de reacción se procede a la
lectura en el espectro a una longitud de onda de 760nm, cada 1 de las muestras fue leida a en 3
distintas concentraciones. (Tabla 1)

TABLA1. Cuantificación de fenoles en distintas concentraciones

Sustrato Sábila Frijol Alverjón Garbanzo Lenteja Trigo MRS


Muestra 0.258 1.538 1.108 0.721 1.807 0.228 X
100%
Muestra 0.173 0.762 0.461 0.407 0.941 0.115 X
50%
Muestra 0.096 0.399 0.162 0.255 0.516 0.057 1.448
25%
Después de la medición en el espectro el sustrato con mayor cantidad de fenoles es la lenteja
después de MRS puesto que es rico en proteína por las distintas fuentes que tiene, por lo tanto, la
lenteja en las 3 concentraciones presenta mayor cantidad de compuestos fenólicos.

C. Actividad antioxidante con la presencia de una bacteria láctica

El siguiente experimento consta en medir la misma reacción antioxidante, pero con la diferencia
que había presente una bacteria láctica T1, para esto se cultivaron las bacterias en un medio rico en
proteína debido a que es el mejor medio para estas bacterias. (Tabla 2)

Tabla 2. cuantificación de fenoles con la presencia de BAL

Sustrato Sábila Nopal MRS Frijol Alverjón Garbanzo Lenteja Trigo


M1 0.059 0.15 0.966 0.178 0.104 0.084 0.173 0.109
M2 0.058 0.146 0.965 0.205 0.111 0.090 0.178 0.111
M3 0.087 0.151 0.920 0.189 0.104 0.080 0.168 0.104
Media 0.068 0.149 0.950 0.191 0.106 0.085 0.173 0.108

D. Electroforesis en gel de agarosa.

Las pruebas se realizaron con 3 proteínas cargadas por duplicado en una concentración de gel de
agarosa al 2 % y a una concentración de 4% mezclada con buffer comercial, a las muestras se le
agrego buffer de tinción (lisozima, albumina, y MRS) se utilizó un buffer de suspensión para la
corrida de proteínas. Se corrió a temperatura constante y a un tiempo de 4 horas.
Después de la separación por electroforesis, las bandas de proteínas se visualizan normalmente con
colorantes de gel, las tinciones de gel de proteínas reaccionan selectivamente con las proteínas para
producir un gel teñido. Las tinciones de gel de proteínas se seleccionan normalmente en función del
tamaño inicial de la muestra, el método de detección deseado y los requisitos de compatibilidad
para el análisis posterior.

El gel fue teñido con azul brillante de Coomassie, puesto que este es utilizado para teñir proteínas
en geles de agarosa a través de interacciones electrostáticas con los grupos amino y carboxilo de las
proteínas. El gel se sumergió durante 30 minutos para que este penetre y se fije a las proteínas y así
libremente desteñir con agua destilada varias veces hasta que se aprecien las bandas de la corrida.

Los resultados de aprecian en orden de izquierda a derecha, estando en el primer pozo Albumina en
el segundo pozo Lisozima y en el tercer pozo MRS dejando un pozo vacío para darle espacio al
duplicado de las muestras.
Los geles en las distintas concentraciones están partidos a la mitad de esa manera la corrida, fue
optimizada y más rápida, en el lado izquierdo esta la concentración de 2% y del lado derecho esta
la concentración de 4%. De esta manera podemos observar que en el gel con concentración más
alta fue más complejo que las proteínas hicieran un barrido estable, mientras que en el gel con
concentración de 2% fue más sencillo que las proteínas viajaran.

Después de varias lavadas con agua destilada y dejarlo que se destiña, se puede apreciar un mejor
barrido de las distintas proteínas que se corrieron, para una mejor visión de del barrido se
recomienda utilizar un transiluminador, cuenta con una cámara y una lampara que ayudara a
revelar con un software el barrido de las proteínas.

E. Reactivación y cultivo de bacterias lácticas (T1 y K1)

Las bacterias fueron reactivadas y propagadas en los distintos medios líquidos (alverjón, garbanzo,
frijol, lenteja, trigo, sábila, nopal y medio MRS) se dejaron durante 24 horas a condiciones óptimas
asegurando el crecimiento, que fue cuantificado haciendo conteo en placa. Para ello se hizo vertido
en placas y se sembraron las bacterias T1, se dejaron incubar por 48 horas y se procedió a hacer el
conteo.

Para tener un conteo más exacto con relación al crecimiento se hicieron 6 diluciones (10 -6) y al
final se cuantificaron las UFC mediante el conteo en placa, haciendo el conteo se determinó que
medio de los seleccionados es el más adaptable y favorable para el crecimiento de esta bacteria.

Grafica de barras para determinar el mejor medio para K1.

En conclusión, el mejor medio para el crecimiento de esta bacteria es el frijol, puesto que después
del conteo y comprobado con una gráfica de barras haciendo referencia a las diluciones que se
realizaron el frijol es donde existen mayor UFC de bacterias lácticas K1.

Posteriormente se realizó el mismo experimento, pero con otra especie de bacteria láctica K1, en
los mismos medios seleccionados, se anexan las tablas de resultados a continuación haciendo la
comparación entre las 2 especies de bacterias con graficas de barras para tener mejor visión de
resultados.

Preparación de medio MRS

Medio de cultivo apropiado para el aislamiento y recuento de lactobacilos y otras bacterias ácido-
lácticas a partir de muestras clínicas y alimentos (especialmente productos lácteos).

La proteasa peptona, el extracto de carne, el extracto de levadura y la glucosa constituyen la fuente


nutritiva ya que aportan nitrógeno, carbono, vitaminas y minerales. El monoleato de sorbitan, las
sales de sodio, manganeso proveen cofactores para el crecimiento bacteriano y pueden inhibir el
desarrollo de algunos microorganismos. El citrato de amonio actúa como agente inhibitorio del
crecimiento de bacterias Gram negativas. El agar es el agente solidificante.

Siembra de bacterias lácticas en medio MRS

La siembra se realizó en condiciones estériles para evitar microorganismos no deseados en el


medio, las bacterias fueron reactivadas 24 horas antes en los distintos medios y después se
sembraron vertiendo 100µL en cada caja Petri, haciendo disoluciones hasta 10 -6, los resultados
fueron los mostrados a continuación.

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