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PERÚ Ministerio Instituto Nacional

de Agricultura de Innovación Agraria

Micropropagación del Papayo

(Carica papaya L.) Libre de Virus
 MINISTERIO DE AGRICULTURA

INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA - INIA

ESTACIÓN EXPERIMENTAL AGRARIA DONOSO - HUARAL

MICROPROPAGACIÓN DEL PAPAYO

(Carica papaya L.) LIBRE DE VIRUS

Ing. M.Sc. Julio Olivera Soto

Serie Lima - Perú

Folleto Nº 12 - 09 Diciembre, 2009
 INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA - INIA

DIRECCIÓN DE INVESTIGACIÓN AGRARIA

DIRECCIÓN DE EXTENSIÓN AGRARIA

Diagramación e Impresión:
Unidad de Medios y Comunicación Técnica

Primera Edición:
Diciembre, 2009
Tiraje : 500 ejemplares

Av. La Molina N° 1981, Lima 12 Casilla N° 2791 - Lima 1

Telefax: 3495631 / 3492600 - Anexo 248

Prohibida la reproducción total o parcial sin autorización

Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú Nº: 2009 - 15683
 CONTENIDO

Pág.

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 5

2. VIROSIS DEL PAPAYO .................................................................................................. 6

3. MICROPROPAGACIÓN .................................................................................................. 7

3.1 Medio de cultivo.................................................................................................. 7

3.1.1 Composición del medio de cultivo................................................. 8

3.1.2 Preparación del medio de cultivo ................................................... 9

3.2 Fase de inicio......................................................................................................... 9

3.2.1 Desinfección de explantes................................................................... 9

3.2.2 Condiciones de incubación ................................................................. 10

3.2.3 Siembra del meristema ......................................................................... 10

3.3 Fase de multiplicación....................................................................................... 12

3.4 Fase de enraizamiento....................................................................................... 13

4. ACLIMATACIÓN .............................................................................................................. 16

5. DIAGRAMA DE FLUJO DE LAS FASES DE MICROPROPAGACIÓN

DEL PAPAYO.................................................................................................................... 18

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................... 19
 1. INTRODUCCIÓN

El papayo (Carica papaya L.), es una especie semiperenne, dioica, de

reproducción sexual. Se presentan plantas femeninas y masculinas, siendo las
primeras las de interés comercial, por la mayor producción de frutos. También
es común encontrar plantas con flores de ambos sexos.

La superficie cosechada de papayo en nuestro país al 2008 es de alrededor de

11 000 hectáreas, localizadas principalmente en la región selva, concentrándose
la mayor área en el departamento de Ucayali, siendo uno de los cultivos de
mayor importancia económica en esta zona. El rendimiento promedio a nivel
nacional es de 14,2 t/ha y en Ucayali 18,3 t/ha según la OIA-MINAG.

El bajo rendimiento de esta especie se debe principalmente a que es afectada

por virus que disminuyen drásticamente su rendimiento, muchas veces
destruyendo plantaciones y también debido a que no se cuenta con
variedades resistentes al virus. Como consecuencia se produce la disminución
del rendimiento y baja calidad de los frutos obtenidos. Esta fruta tiene fuerte
demanda por su alto contenido en vitaminas A, B1, B2, B3, C, además de un
alto contenido de hierro.

Contar con un protocolo de micropropagación en papayo permite disponer de

una importante alternativa de propagación y facilita su uso en trabajos de
mejoramiento genético con fines de regeneración de material in vitro, debido
principalmente al vigor que presentan las plantas de papayo que están libre de
virus y otros patógenos. Para establecer un plan de producción de semilla de
papayo es imprescindible el uso de material libre de virus para instalación de
plantas madres en los viveros.

En esta publicación se recopila los resultados de investigación realizados

en el laboratorio de biotecnología de la Estación Experimental Agraria
Donoso - Huaral del Instituto Nacional de Innovación Agraria - INIA, durante los
años 2004 - 2006, como parte del proyecto de papayo financiado por
FONTAGRO “Desarrollo tecnológico para procesos de innovación con pequeños
productores”, ejecutado por especialistas del INIA, empleando la variedad
PTM-331, que fue obtenida por el IIAP y seleccionada para este trabajo por sus
buenas características de fruto y alto rendimiento.
6 Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus

2. VIROSIS DEL PAPAYO

El virus de la mancha anillada del papayo (Papayo Ring Spot Virus, PRSV)
familia de los potyvirus, es el virus que más afecta a este cultivo a nivel
mundial y está presente en nuestro país. Es muy destructivo y no hay forma
de controlarlo una vez que ataca una plantación. También afecta especies de
las familias: Caricaceae, Cucurbitaceae y Chenopodiaceae. La transmisión se
realiza en forma no persistente a través de vectores que son diferentes
especies de áfidos, afectando a plantas de cualquier edad.

El control de la virosis se ha intentado con roguing, prácticas culturales,

cruzamientos para obtener variedades tolerantes y protección cruzada, sin que
se haya obtenido un control efectivo. Aunque se han desarrollado variedades
de papaya transgénicas resistentes a este virus, como el caso de “Rainbow” y
“Sun Up” en Estados Unidos, estas no están permitidas para su comerciali-
zación en nuestro país de acuerdo a la legislación vigente.

El cultivo de meristemas y la micro-

propagación de plantas libres de
virus permiten propagar material
sano, el cual debe ser chequeado
para la certificación correspondiente.
La técnica más utilizada para
detectar virus que actualmente se
emplea es ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay) o técnica Foto 1. Particulas virales del virus de la mancha
anillada del papayo (PRSV).
inmunoenzimática. Estos test son
relativamente de bajo costo y per-
mite analizar muestras en protocolos
simples de tejido meristemático o de
cualquier otro tejido de interés para
detectar la presencia de virus. Los
antisueros de alta especificidad se
pueden obtener para los virus que
afectan este cultivo, principalmente
para el PRSV. Foto 2. Hojas de papayo de planta infectada con el
virus de la mancha anillada (PRSV).
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus 7

3. MICROPROPAGACIÓN

La micropropagación se presenta como una alternativa para la propagación

masiva de plantas madres de sanidad comprobada. Esta técnica se viene
empleando en muchos cultivos, principalmente los de reproducción vegetativa,
que por tener este tipo de reproducción transmiten enfermedades causadas
por virus y otros patógenos de generación en generación.

Para el caso concreto del papayo, se han realizado diferentes trabajos de

investigación a nivel mundial para estandarizar una técnica de micropropa-
gación rápida y eficiente. Los resultados son muy variados, se han empleado
diferentes explantes y diferentes variedades, que han determinado que se
emplee distintos medios de cultivo y concentraciones de reguladores de
crecimiento en cada fase de propagación.

3.1 Medio de cultivo

En trabajos anteriores realizados en micropropagación de papayo se han

empleado diferentes medios de cultivo, entre ellos el MS o de Murashige y
Skoog (Murashige, 1962) completo y a mitad de concentración, MS con
otras vitaminas y otras variaciones. Por lo tanto, el medio de cultivo MS
es el que se utilizó en este trabajo. Las modificaciones del medio de
cultivo MS, se hicieron en el contenido de vitaminas, modificadas sin
glicina. Se diferencia del medio formulado por Linsmaier y Skoog en 1965,
conocido como LS, que lleva solo tiamina en concentración de 0,4 ppm.
También se diferencia del medio formulado por Murashige y Tucker en
1969, que contiene tiamina 10 ppm, ácido nicotínico 5 ppm y piridoxina 10
ppm. En todos los casos la concentración de mio-inositol de 100 ppm no
varía.

Es importante mencionar que también hay trabajos de investigación en la

obtención de embriones somáticos como alternativa de propagación, para
lo cual se ha utilizado contenedores de inmersión temporal denominados
RITA®, en la cual se ha utilizado el medio líquido MS, pero con resultados
limitados. Se optó por el método de micropropagación en sustrato semi-
sólido por ser el más estandarizado y por ser el más utilizado actualmente
8 Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus

en diferentes países como Estados Unidos para la obtención de plantas

genéticamente modificadas de papayo y en trabajos de mejoramiento
genético.

3.1.1 Composición del medio de cultivo

La solución stock empleada se preparó de acuerdo a la formulación

siguiente:

Cuadro 1. Medio de cultivo Murashige & Skoog (MS) Modificado

Concentración
Sales Fórmula
mg/l
Nitrato de Potasio KNO3 1 900,00
Nitrato de Amonio NH4NO3 1 650,00
Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O 370,00
Cloruro de calcio CaCl2.2H2O 440,00
Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 170,00
Cloruro de potasio KI 0,83
Cloruro de cobalto CoCl.6H2O 0,025
Sulfato de manganeso MnSO4.4H2O 22,30
Sulfato de zinc ZnSO4.7H2O 8,60
Sulfato cúprico CuSO4.5H2O 0,025
Acido bórico H3BO3 6,20
Molibdato de sodio Na2MoO4.2H2O 0,25
EDTA disódico Na2EDTA 37,30
Sulfato ferroso FeSO4.7H2O 27,80
Mio - inositol 100,00
Tiamina 0,4
Ácido nicotínico 0,5
Piridoxina 0,5

Los reguladores de crecimiento se agregaron de acuerdo a la fase

de desarrollo de las microplantas. Se debe tener en cuenta que la
respuesta de los diferentes cultivares a las combinaciones de
reguladores de crecimiento y sus diferentes concentraciones es
variada y puede cambiar aún al realizarse más subcultivos.
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus 9

3.1.2 Preparación del medio de cultivo

El pH del medio de cultivo puede oscilar de 5,6 a 5,7 y se debe

medir luego de haber agregado sacarosa al 3%. Seguidamente se
agrega agar al 0,8 % como solidificante, pero también funciona la
vermiculita como medio de soporte, como se verá en la fase de
enraizamiento. El medio de cultivo preparado se esteriliza en
autoclave durante 20 minutos a 121°C y 1,1 kg/cm2. Se dispensa en
tubos de ensayo de 100 x 25 mm para la fase de inicio y en cajas
de polipropileno con tapas de policarbonato, mas conocidas como
“magentas” o en frascos de vidrio para la fase de multiplicación y
de enraizamiento, con alícuotas de 40 ml de medio de cultivo por
recipiente.

3.2 Fase de inicio

3.2.1 Desinfección de explantes

Los explantes utilizados fueron yemas tomadas de plántulas germi-

nadas de papayo a partir de semilla botánica en condiciones de
invernaderos, sembradas en bandejas de germinación con sustrato a
base de musgo durante 20 días. Se optó por este método, debido a
que cuando se obtuvo yemas de plantas de campo, la contaminación
con microorganismos externos y endofíticos es elevada, lo que
corroboran diferentes trabajos de investigación. En esta fase
realizada en condiciones de laboratorio de la EEA Donoso Huaral,
después de seleccionar el ma-
terial en invernadero, las yemas
(foto 3) se separaron de las
plántulas germinadas. Se lleva-
ron a laboratorio y se lavaron
con abundante agua de caño y
jabón y luego se enjuagaron
3 veces con agua destilada.
Luego se llevó el material a la
cámara de flujo laminar, para
trabajar en condiciones asépti-
cas y así evitar contaminación. Foto 3. Yema axilar de planta de papayo.
10 Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus

Las yemas se lavaron con etanol al 70 % durante 30 segundos y

luego se sumergieron en hipoclorito de sodio al 2 % + 1 gota de
Tween - 20 durante 10 minutos, seguidamente se enjuagaron bien
tres veces con agua destilada esterilizada en autoclave. No se
requiere agregar antioxidante por que las yemas se mantienen sin
fenolización hasta que se siembran.

3.2.2 Condiciones de incubación

Las microplantas regeneradas a partir de meristemos deben perma-

necer en condiciones artificiales de incubación (foto 4) con
temperatura promedio de
25 ºC, que puede fluctuar
de 23 ºC a 27 ºC, el foto-
periodo puede variar de
12 a 16 horas luz y la
luminosidad se incrementa
gradualmente con el
desarrollo de las microplan-
tas hasta alcanzar 3000 lux.
Foto 4. Cámara de incubación del laboratorio
de cultivo de tejidos

3.2.3 Siembra del meristema

Con ayuda del microscopio estereoscó-

pico se elimina los primordios foliares
(foto 5) y finalmente se deja el meristema
con dos primordios foliares (foto 6).
Luego se procede a hacer la disección
del tejido meristemático con ayuda del
Foto 5. Apice caulinar de papayo.
bisturí y se siembra en un tubo de
prueba. Se coloca en la cámara de
incubación hasta la regeneración. La
temperatura promedio indicada para esta
fase es de 25 ºC. La intensidad de luz se
aumenta gradualmente con el desarrollo
de las microplantas, a pesar de que la
fenolización es prácticamente nula. Foto 6. Meristema de papayo.
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus 11

En esta fase el empleo del medio MS ha sido ampliamente usado

con la combinación de auxinas y citoquininas que induce la
formación de brotes laterales. En ensayos en el laboratorio de
biotecnología de la EEA Donoso se probó diferentes combinaciones
de reguladores, siendo los mejores resultados de regeneración
cuando se suplementó el medio de cultivo con ANA (ácido naftaleno
acético) 0,03 ppm + BAP (bencil amino purina) 0,1 ppm. La
regeneración del meristema se logra en 8 a 10 semanas
dependiendo del cultivar y en ese lapso se llega a formar la
microplanta de 0,5 a 1, 5 cm de longitud (foto 7 y 8).

Foto 7. Regeneración de meristema de papayo en

medio de cultivo semisólido.

Foto 8. Microplantas de papayo en fase de inicio en medio

de cultivo MS modificado.
12 Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus

3.3 Fase de multiplicación

Después de que las microplantas de papayo se han regenerado a partir

del meristema se pasan a un medio de cultivo de multiplicación. Se
siembran las microplantas en magentas (cajas de polipropileno) (foto 9) ó
en frascos de vidrios (foto 10) con tapas de papel aluminio. Se siembra de
4 a 6 brotes por envase, dependiendo de la capacidad del mismo.

Foto 9. Microplantas de papayo 'PTM-331' instaladas en medio de

cultivo de multiplicaciòn.

Foto 10. Microplantas de papayo en fase de multiplicación con

brotes múltiples.
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus 13

El medio de cultivo que se utilizó es el medio MS, modificado en

contenido de vitaminas y adicionado con reguladores de crecimiento del
grupo de las citoquininas. La respuesta a la adición de reguladores de
crecimiento es variada y en parte depende del cultivar que se está
propagando. En promedio para el cv. 'PTM-331' se obtuvo 4 - 5 brotes por
microplantas por subcultivo en 6 semanas promedio, observándose una
tendencia a disminuir el número de brotes cuando se incrementa el
número de subcultivos.

En general para diferentes cultivares en esta fase de multiplicación se logró

un mayor número de brotes (foto 10) cuando se adicionó al medio de
cultivo MS, BAP 0,2 ppm + KIN 0,1 ppm. Los parámetros de multiplicación
se mantienen sin diferencia significativa en el segundo subcultivo si los
brotes son grandes.

También se probó otras combinaciones de reguladores de crecimiento que

muestran que a medida que se eleva la concentración de los mismos se
induce la formación de callo (tejido no diferenciado) y deformación de
hojas. Después de algunos subcultivos la tendencia es a formar brotes
mas reducidos de tamaño en longitud y área foliar. Es necesario, en
algunos casos pasar por una etapa de elongación, para lo cual, se debe
pasar los brotes a un medio de cultivo de elongación conteniendo ácido
giberélico en concentraciones de 0,5 a 1,0 ppm, durante un periodo de 20
a 30 días.

Durante la fase de inicio o la fase de multiplicación se presentó algunas

veces un desarrollo anormal de las microplantas que se denomina
“vitrificación”. Esta anormalidad se produce por la excesiva absorción de
humedad de las microplantas al estar en contacto con el medio de cultivo.
Las hojas se alargan en desproporción y presentan una apariencia
traslucida y empiezan a necrosarse y posteriormente muere el brote. Las
microplantas que presentaron esta anomalía fueron descartadas.

3.4 Fase de enraizamiento

Culminada la fase de multiplicación se separaron los brotes y se sembraron

en medio de cultivo de enraizamiento, para inducir la formación del
sistema radicular. Esta fase conjuntamente con la aclimatación son críticas
14 Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus

para el establecimiento de las plántulas. Se ha utilizado diferentes auxinas

para inducir el enraizamiento, tales como el Ácido Indol Butírico (AIB),
Ácido Naftaleno Acético (ANA) y otros, sin embargo se observa que en
algunos casos el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento también
genera sistema radicular.

Es necesario cambiar la concentración de reguladores de crecimiento en el

medio de cultivo para inducir la formación de raíces. Para el cv. “PTM-331”
en medio de cultivo MS semisólido se adicionó AIB de 1,0 a 2,0 ppm (foto
11). La formación de raíces fue menor que en vermiculita, observandose
raíces gruesas y callo en la base.

Foto 11. Microplantas de

papayo en medio de cultivo
MS semisólido de
enraizamiento.

Foto 12. Esterilización por

filtración de solución de
AIB para enraizamiento de
papayo.
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus 15

Para la fase de enraizamiento se puede emplear el medio de cultivo

solidificado con agar o se puede emplear el medio líquido y usando como
soporte vermiculita. Para este último se debe introducir las microplantas
en una solución de AIB de 1 a 2 ‰, esterilizada por filtración (foto 12),
durante algunos segundos (foto 13) y luego sembrarlas en una magenta
conteniendo vermiculita y medio de cultivo líquido (foto 14). En el medio
de cultivo con agar las raíces son más gruesas, pero son menores en
longitud y en menor cantidad. En cambio, en vermiculita las raíces
primarias que proliferan tienen abundantes raicillas, lo que influye en el
vigor y color de las hojas.

Foto 13. Inmersión de microplantas

en ácido indol butírico.

Foto 14. Siembra de microplantas

en sustrato de vermiculita.

El uso de la vermiculita también facilita la limpieza de las raíces al

momento de extraer las microplantas de los contenedores en que se
mantuvieron en la cámara de incubación. La formación del sistema
radicular se logra en 8 semanas promedio en ambos casos.
16 Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus

4. ACLIMATACIÓN

Las microplantas de papayo enraizadas, se extrajeron del medio de cultivo de

condiciones asépticas (foto 15). Se lavaron bien las raíces y luego se
sembraron en bandejas de almácigo o en bolsas de plástico negras
conteniendo sustrato pasteurizado (foto 16). Se puede utilizar como una
alternativa sustrato comercial a base de turba de musgo sphagnum mezclado
con vermiculita y yeso agrícola “Premix 3”, (foto 17). También se puede usar
como sustrato fibra de coco de textura fina “Golden mix”. De no contar con
estos sustratos comerciales, se puede probar con musgo de altura ó humus
mezclado con arena de río, previamente lavado para evitar problemas de
presencia de sales.

Foto 15. Proliferación de raíces en

sustrato de vermiculita.

Foto 16. Plántula enraizada en

vermiculita lista para aclimatación.
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus 17

Al final del periodo de aclimatación, que puede durar entre 20 a 40 días, ó en

menor tiempo en época de calor, las plántulas se encuentran listas (foto 18)
para ser trasladadas a terreno definitivo.

Foto 17. Plántulas de papayo en sustrato de aclimatación.

Foto 18. Plántulas de papayo aclimatadas en invernadero.

 18
5. DIAGRAMA DE FLUJO DE LAS FASES DE MICROPROPAGACIÓN DEL PAPAYO

10 Semanas 6 Semanas 4 Semanas 6 Semanas 5 Semanas

SELECCIÓN DE
EXPLANTE FASE DE ENRAIZAMIENTO
MULTIPLICACIÓN ELONGACIÓN EN MEDIO DE
CULTIVO LÍQUIDO
DESINFECCIÓN

ACLIMATACIÓN
FASE DE INICIO SUBCULTIVO

ENRAIZAMIENTO
FASE DE EN MEDIO DE
MULTIPLICACIÓN CULTIVO SEMISÓLIDO
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus
Micropropagación del papayo (Carica papaya L.) libre de virus 19

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana (IIAP). p. 40.

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en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Roca, W. M. Mroginski, L.
A. (Eds.). Cali, Colombia. p. xii, 970.

3. GEORGE E. F. 1996. Plant propagation by tissue culture. Part 2. In practice. Ed.

Exegetics Ltd. England. p. 1022 1025.

4. INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA DE LAS PLANTAS. 1998. Propagación y

mejora de plantas por biotecnología. Perez Ponce, J. N. (Ed.). Santa
Clara, Cuba. p. 400.

5. LINSMAIER E. M. & SKOOG F. 1965. Organic growth factor requirements of

tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. V 18. P. 100 127.

6. MINISTERIO DE AGRICULTURA. 2007. Anuario de Estadísticas Agropecuarias.

Dirección General de Información Agraria. Lima Perú. p. 201.

7. MURASHIGE T. & SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. V 15. p.
473 497.