DEPARTAMENTO DE PROTECCION VEGETAL

MICROBIOLOGÍA ANIMAL
Ciclo I – 2013
Lic. Rosmery Erroa
APENDICE

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Papa Glucosado Agar.

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento y recuento de hongos y levaduras en muestras

clínicas, alimentos, cosméticos y otros materiales.

Fundamento
Tanto la glucosa (o Dextrosa) presente como la infusión de papa favorecen el desarrollo
exuberante de hongos y levaduras, mientras que el desarrollo bacteriano es inhibido con el
agregado de ácido tartárico luego de la esterilización hasta alcanzar un pH: 3.5 ± 0.2. Una vez
agregado el ácido no se puede recalentar ya que el agar se hidroliza.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Infusión de papa 4.0 Disolver 39 g de polvo en un litro de agua
Glucosa 20.0 destilada.
Dejar reposa
0x5 minutos. Calentar hasta ebullición con
agitación continua.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Agar 15.0 Si se desea ajustar el pH a 3.5 agregar
aproximadamente 14 ml de una solución
estéril de ácido tartárico al 10 %, cuando
el agar se encuentra entre 45-50 ºC.
pH final: 5.6 ± 0.2

Siembra
- Técnica De Pour Plate: sembrar 0.1 o 1 ml y agregar 15 ml del Papa Glucosado Agar fundido y
enfriado a 45-50 ºC
- En superficie: por estriado

Incubación
En aerobiosis, a 22-25 ºC ó 30-32 ºC según el método seguido, durante 5 días o mayor tiempo.

Resultados

Microorganismos Crecimiento
Aspergillus niger Bueno
Candida albicans Bueno
Sacharomyces cerevisiae Bueno

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro ligeramente opalescente.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I – 2013

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Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Nutritivo Caldo

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de microorganismos con
escasos requerimientos nutricionales.

Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros
materiales de importancia sanitaria.

Fundamento
Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono
y nitrógeno necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. Puede ser utilizado además, como
pre enriquecimiento en la búsqueda de Salmonella spp. A partir de alimentos, ya que permite
recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Emplear 8 g de polvo por litro de agua
destilada.
Si es necesario, calentar hasta disolver.
Extracto de carne 3.0
Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-
121°C durante 15 minutos.
pH final: 6.9 ± 0.2

Siembra
Por inoculación directa de la muestra o del microorganismo en estudio.

Incubación
En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

Resultados
Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en
medios sólidos apropiados y realizar la identificación bioquímica.

Microorganismos Crecimiento
P. mirabilis * ATCC 43071 Bueno
E. coli ATCC 25922 Bueno
S. aureus ATCC 25923 Bueno
S. epidermidis ATCC 14990 Bueno
S. typhimurium ATCC 14028 Bueno
P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro.

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Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

*American Type Culture Collection

Mac Conkey Agar.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas,
de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del
color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales
biliares.

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona 17.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua
Pluripeptona 3.0 destilada.
Lactosa 10.0 Reposar 5 minutos y mezclar hasta
Mezcla de sales biliares 1.5 uniformar.
Cloruro de sodio 5.0 Calentar suavemente y hervir 1 a 2
Agar 13.5 minutos hasta disolver.
Rojo neutro 0.03 Esterilizar en autoclave a 121°C durante
Cristal violeta 0.001 15 minutos.
pH final: 7.1 ± 0.2
Siembra
- Sembrar en superficie.
- Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml
de medio de cultivo fundido y enfriado a 45 – 50 ºC.

Incubación
Durante 18-48 horas, a 35 – 37 ºC, en atmósfera aeróbica

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Resultados

Microorganismos Colonias
Escherichia coli ATCC 25922 Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Rosadas mucosas
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Incoloras, transparentes
Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras, transparentes
Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras, transparentes
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Diminutas, incoloras, opacas

Características del medio

Medio preparado: rojo púrpura

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10 – 35 ºC.
Medio preparado: a 2 – 8 ºC.

TCBS Medio

Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras
especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados.

También es conocido como Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo
para Vibrios.

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de levadura, la peptona de carne y la tripteína aportan nutrientes
para el desarrollo bacteriano. Es este, el medio selectivo más adecuado para el aislamiento de las
especies de Vibrio, e inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Esta inhibición se basa en las
altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH fuertemente alcalino. La
degradación de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para
las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas que producen ácido a partir de este azúcar.
Esto es debido al viraje del color de los indicadores de pH azul de timol y azul de bromotimol, del
color azul al amarillo en medio ácido. Es importante tener en cuenta, que la proporción de sacarosa
en el medio está equilibrada de forma tal que no inhiba el crecimiento bacteriano por exceso de
ácido.

El cloruro de sodio favorece el crecimiento de microorganismos. El tiosulfato de sodio aporta azufre

y junto con el citrato férrico permiten la detección de producción de ácido sulfhídrico.
Aumentando la concentración de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubación,
pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria.

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 Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Extracto de levadura 5.0
Peptona de carne 5.0
Tripteína 5.0 Suspender 89 g del polvo en un litro de
Citrato de sodio 10.0 agua destilada.
Tiosulfato de sodio 10.0
Calentar hasta ebullición y hervir de 1 a 2
Bilis de buey 8.0
minutos.
Sacarosa 20.0
Cloruro de sodio 10.0 NO AUTOCLAVAR.
Citrato férrico 1.0
Azul de bromotimol 0.04 Distribuir en placas de Petri estériles.
Azul de timol 0.04
Agar 15.0
pH final: 8.6 ± 0.2

Siembra
1- Materiales clínicos:
a. Materia fecal: suspender 1 gramo de heces o el contenido del hisopo en 10 ml de
Agua Peptonada Alcalina e incubar de 6 a 8 horas a 35-37°C, en aerobiosis.
b. Materiales provenientes de infecciones extraintestinales: no es necesario realizar
enriquecimiento previo en Agua Peptonada Alcalina.
2- Agua: Filtrar de 1 a 10 litros (el volumen deseado) de agua con membrana de
0.22µ.Colocar la membrana en un recipiente conteniendo Agua Peptonada Alcalina e
incubar de 6 a 8 horas a 35-37°C, en aerobiosis.
3- Alimentos: Licuar 25 g de la muestra con 225 ml de Agua Peptonada Alcalina (B02-159-
05, B02-159-06) e incubar de de 6 a 8 horas a 35-37°C, en aerobiosis.

En todos los casos sembrar una alícuota del caldo de enriquecimiento en la superficie
de una placa de TCBS, por estriado, para el aislamiento de colonias.

Incubación
En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35 – 37 °C.

Resultados

Características de las
Microorganismo Crecimiento
colonias
Amarillas de 2-3 mm de
Vibrio cholerae Bueno
diámetro, de borde traslúcido
Centro verde azulado, borde
V. parahaemolyticus Bueno
traslúcido
V. alginolyticus Bueno Amarillas grandes
Aeromonas spp. Inhibido --
E. coli Inhibido --

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I – 2013

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Características del medio
Medio preparado: verde azulado.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 – 35 ºC.
Medio preparado: a 2 – 8 ºC.

Tripteina Soya Agar o Tripticasa soya

Medio utilizado para propósitos generales, favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad
de microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos. El agregado de sangre, permite
el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes y la
observación de reacciones de hemólisis. También, este medio de cultivo, puede utilizarse como
medio base para preparar el medio agar chocolate.

Fundamento
La tripteína y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en péptidos, aminoácidos libres, bases
púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta también carbohidratos que
estimulan el crecimiento de muchos microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico.

Adicionado con 5-10% sangre, se logra un medio enriquecido y adecuado para observar reacciones
de hemólisis.

Cuando se prepara como agar chocolate, es útil para el cultivo de Neisseria spp., Haemophilus
influenzae y microorganismos exigentes similares. Incubado en forma anaerobia, permite el
crecimiento de Clostridium spp. y anaerobios NO esporulados. Es un medio adecuado para cultivar
y mantener cepas de Aeromonas, y aumentando el porcentaje de cloruro de sodio, para mantener
cepas de algunos Vibrios (excepto V. cholerae).

Fórmula (en gramos por litro)

Tripteína 15.0
Peptona de soya 5.0
Cloruro de sodio 5.0
Agar 15.0
pH final: 7.3 ± 0.2

Instrucciones
Disolver 40 g de polvo deshidratado por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos.
Calentar suavemente agitando y hervir durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y
esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 118-121°C.

Preparación de la placa de Agar Sangre: añadir en forma aséptica un 5% de sangre estéril

desfibrinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a 45°C.

Preparación de Agar Chocolate: después de añadir la sangre y agitando frecuentemente se

mantiene el medio de cultivo a 80°C por 10 minutos hasta que adquiera un color pardo
chocolatado.

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Siembra
Por inoculación directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo.
Incubación
Las condiciones de temperatura, tiempo y atmósfera de incubación, serán acuerdo al material a
estudiar.

Resultados

Microorganismos Crecimiento Hemólisis

E. coli ATCC 25922 Abundante --
S. aureus ATCC 25923 Abundante Beta
S. pyogenes ATCC 19615 Abundante Beta
S. pneumoniae ATCC 6305 Abundante Alfa
S. pneumoniae ATCC 49619 Abundante Alfa

Características del medio

Medio preparado: ámbar.
Medio preparado con 5% de sangre: rojo cereza.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 – 35 ºC.
Medio preparado: a 2 – 8 ºC.

Tripteina Soya Caldo o Tripticasa soya

Medio adecuado para el desarrollo de microorganismos exigentes.

Fundamento
La tripteína y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en péptidos, aminoácidos libres, bases
púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta carbohidratos que
estimulan el crecimiento de muchos microorganismos.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El fosfato dipotásico otorga capacidad buffer y la
glucosa es la fuente de energía.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Tripteína 17.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua
Peptona de soya 3.0 destilada.
Cloruro de sodio 5.0 Mezclar y calentar hasta disolver.
Fosfato dipotásico 2.5 Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-
Glucosa 2.5 121°C durante 15 minutos.
pH final: 7.3 ± 0.2

Siembra
Inocular directamente el material en estudio.

Incubación
Las condiciones de temperatura, tiempo y atmósfera de incubación, serán acuerdo al material a
estudiar.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I – 2013

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Resultados

Microorganismos Crecimiento
S. aureus ATCC 25923 Bueno
S. epidermidis ATCC 14990 Bueno
S. pyogenes ATCC 19615 Bueno
S. pneumoniae ATCC 6305 Bueno
S. pneumoniae ATCC 49619 Bueno

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 – 35 ºC.
Medio preparado: a 2 – 8 ºC.

Cary Blair Medio de Transporte.

Medio recomendado para la recolección, transporte y conservación de muestras aptas para estudios
microbiológicos. Es especialmente útil para la búsqueda de Vibrio spp. a partir de muestras fecales
y rectales.

Fundamento
El primer medio utilizado para el transporte de muestras para estudios microbiológicos fue el medio
de Stuart. En 1964 Cary y Blair describieron un nuevo medio para el transporte de muestras
fecales. Tenía un bajo contenido de nutrientes, un bajo potencial de oxidoreducción y un alto pH.
En los estudios de Cary y cols., Salmonella y Shigella fueron recuperadas luego de 45 días de
inoculación. Otros autores han demostrado la eficacia de ese medio de transporte para estudios
microbiológicos en gastroenteritis. El medio de transporte Cary – Blair, es semisólido debido a la
baja concentración de agar. Tiene un mínimo aporte de nutrientes que permite la recuperación de
los microorganismos sin que haya replicación. El tioglicolato de sodio se incluye para proveer un
bajo potencial redox; y el pH relativamente alto minimiza la destrucción bacteriana por
acidificación.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Tioglicolato de sodio 1.5 Suspender 12,6 g del polvo en 991 ml de
Fosfato disódico 1.1 agua destilada.
Cloruro de sodio 5.0 Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar.
Calentar agitando frecuentemente y hervir 1
minuto hasta disolver.
Enfriar a 50°C y agregar 9 ml de una sol. de
Agar 5.0 CaCl2 al 1% preparada recientemente. Ajustar
el pH si es necesario.
Distribuir y esterilizar 15 minutos a vapor
fluente.
pH final: 8.4 ± 0.2

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I – 2013

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Siembra
1-Utilizando un hisopo estéril, recolectar la muestra según la metodología apropiada para ensayos
microbiológicos.

2-Colocar el hisopo en el tercio superior del medio de cultivo. Si una parte de la varilla sobresale,
cortarla e inmediatamente tapar el tubo. Enviar lo más pronto posible al laboratorio para su
procesamiento, dentro de las 4-6 horas de recolectada la muestra.

Incubación
Mantener a temperatura ambiente durante su envío al laboratorio.

Resultados
Los tubos con medio de transporte se subcultivan en medios sólidos apropiados según la muestra y
el microorganismo que se quiera aislar. Luego de la incubación, debe haber escasa o nula
reducción de la viabilidad de los microorganismos.

Microorganismos Crecimiento
S. flexneri ATCC 12022 +
Salmonella typhimurium ATCC 14028 +
Vibrio cholerae +

Control Negativo Resultado

Medio sin inocular Sin cambio

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro. Puede presentar escasa opalescencia.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 – 35 ºC.
Medio preparado: a 2 – 8 ºC.

Stuart Medio de Transporte

Medio destinado a la recolección, transporte y preservación de muestras clínicas aptas para

exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener la viabilidad de gonococos y de otros
microorganismos de difícil desarrollo.

Fundamento
Medio semisólido, no nutritivo. Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido
y es útil para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de metileno, que es el
indicador de oxido reducción. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos
durante su envío al laboratorio. Cooper encontró que usando hisopos impregnados con carbón
bacteriológico se recuperan en forma exitosa numerosos patógenos entéricos y respiratorios.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I – 2013

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 Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Tioglicolato de sodio 0.9 Suspender 14,1 g del polvo por litro de agua destilada.
Glicerofosfato de sodio 10.0 Reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta disolución
Cloruro de calcio 0.1 total.
Distribuir en tubos con cierre a rosca (para evitar
Azul de metileno 0.002
oxidación) llenándolos hasta 2/3 del tubo.
Agar 3.0 Esterilizar 15 minutos a 121ºC.
Dejar solidificar en posición vertical.
pH final: 7.4 ± 0.2

Siembra

1. Utilizando un hisopo estéril, recolectar la muestra según la metodología apropiada para

ensayos microbiológicos.
2. Colocar el hisopo en el tercio superior del medio de cultivo. Si una parte de la varilla
sobresale, cortarla e inmediatamente tapar el tubo. Rotular, y enviar lo más pronto posible
al laboratorio para su procesamiento, dentro de las 8 horas de recolectada la muestra. Se
recomienda que las muestras transportadas se cultiven sin demora luego de ser recibidas
en el laboratorio.

Incubación
Mantener los hisopos a temperatura ambiente durante su envío al laboratorio.

Resultados
Los tubos con medio de transporte se subcultivan en medios sólidos apropiados según la muestra y
el microorganismo que se quiera aislar. Luego de la incubación, debe haber escasa o nula
reducción de la viabilidad de los microorganismos. Entre los microorganismos que han sido
transportados con escasa o nula reducción de la viabilidad en el medio transporte de Stuart dentro
de un período de 8 horas figuran:
Microorganismos Crecimiento
N. gonorrhoeae ATCC 49226 +
S. pneumoniae ATCC 6305 +
H. influenzae tipo B +
S. pyogenes ATCC 19615 +

Control Negativo Resultado

Medio sin inocular Sin cambio

Los microorganismos más resistentes pueden permanecer viables durante períodos mayores a 72
horas.

Características del medio

Medio preparado: ligeramente opalescente con tonalidad azul dependiendo del grado de oxidación.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 – 35 ºC.
Medio preparado: a 2 – 8 ºC.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I – 2013

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