UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO

División de Ciencias Forestales

MAESTRIA EN CIENCIAS EN CIENCIAS FORESTALES

CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA DE Pouteria glomerata, UNA

PLANTA UTILIZADA PARA EL TRATAMIENTO DE LA DIABETES.

TESIS

QUE COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS EN CIENCIAS FORESTALES

PRESENTA:
Raquel Contreras Corona

COMITÉ ASESOR:
Dra. Amparo Borja de la Rosa
Dr. Benito Reyes Trejo
Dra. Diana Guerra Ramírez

Chapingo, Texcoco, Estado de México

Enero 2016

1
Tesis realizada por Raquel Contreras Corona bajo la dirección del Comité Asesor
indicado, aprobada por el mismo y aceptada como requisito parcial para obtener el
grado de:

MAESTRO EN CIENCIAS EN CIENCIAS FORESTALES

DIRECTOR::
DRA. AMPARO BORJA DE LA ROSA

CODIRECTOR: DR. BENITO REYES TREJO

ASESOR: DRA. DIANA GUERRA RAMÍREZ

ii
 RECONOCIMIENTO

Al DR. BENITO REYES TREJO por su participación directa en la identificación de los

metabolitos secundarios aislados, así como por su dirección y apoyo durante toda la parte
experimental del proyecto, además de brindarme la oportunidad de poder trabajar a su lado
y conocer el fantástico mundo de la fitoquímica.

iii
 AGRADECIMIENTO

A la Universidad Autónoma Chapingo, mi alma mater, que por segunda vez me brindó la
oportunidad de adquirir nuevos conocimiento y obtener el grado de Maestro en Ciencias.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada para

realizar los estudios de Postgrado.

Al Dr. Benito Reyes Trejo, por haber confiado en mí y poner este trabajo en mis manos al
cual le debo mi grado. Por el tiempo dedicado a la dirección, revisión, correcciones y
sugerencias para una mejor presentación.

A la Dra. Amparo Borja de la Rosa, por el tiempo dedicado a la revisión, observaciones y

recomendaciones del presente trabajo, así como su apoyo para la obtención de los recursos
económicos para la investigación.

A la Dra. Diana Guerra Ramírez, por las clases tan geniales de fitoquímica que fueron de
gran ayuda para la parte experimental del proyecto, así como por el tiempo dedicado a la
revisión, observaciones y recomendaciones del presente trabajo.

A la M.C. Ernestina Cedillo Portugal y el Ing. José María Cunill Flores por el tiempo
empleado para la identificación botánica de la especie estudiada.

Al personal del Laboratorio de Productos Naturales por haber confiado y permitido el uso
de las instalaciones para realizar este proyecto. Por su apoyo y consejos en la
cromatografía y por los buenos ratos.

Al Programa Institucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del

Pacífico, por haberme permitido conocer a dos magníficos estudiantes; Fabiola y Anatalio,
muchas gracias por su entusiasmo y trabajo aportado a esta investigación, les deseo lo
mejor de lo mejor, son unos ángeles que llegaron justo a tiempo.

iv
 DEDICATORIA

A mi padre León Contreras Cano †, porque sé que con tu maravillosa luz me cuidas y
guías para ser una buena persona, siempre estas estas en mi pensamiento.

A mi madre Ana E. Corona Otero, lo logramos de nuevo mami, este trabajo es de las
dos, trabajare muy duro porque cada día te sientas orgullosa de mí.

Ana Lilia, León y Belén, porque son los mejores hermanos que me pudieron tocar,
porque siempre nos apoyamos y nos cuidamos, sin duda alguna somos un gran equipo,
los quiero demasiado.

A Bety y mis inteligentes sobrinos Isaac y Arturo, todo mi apoyo, tienen un gran cerebro
para aprovechar.

A la niña de mi corazón Ana Zazil, pequeña cada día me sorprendes con tus éxitos, estoy
segura que tendrás un gran futuro, lucha por tus sueños, recuerda que no existen
imposibles.

A mis amigos, que son la familia que escogí: Irmita, Dani, Gaby, Lalo, Viridiana, Tomas,
Sr. Suarez, que han estado a mi lado en los buenos y malos momentos, ¡VAMOS A
CELEBRAR!

A todos mis compañeros de la maestría, por los agradables momentos que pasamos.

Do not stop believing!

v
 DATOS BIOGRÁFICOS

Raquel Contreras Corona nació en Puebla, Puebla, el 21 de agosto de 1988. Sus estudios
de nivel básico, los realizó en la misma ciudad. Estudio el nivel medio superior en la
preparatoria “Lic. Benito Juárez García” de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
La licenciatura la realizo en la Universidad Autónoma Chapingo, egresó de la carrera de
Ingeniero Forestal Industrial en el año 2011.

Después de obtener el título profesional, apoyó por un corto tiempo como asistente te
investigación con el Dr. Marcos Miguel Gonzales Peña, en la División de Ciencias
Forestales de la UACh, posteriormente trabajó en el aserradero “Maderas Libertre” en el
Estado de México durante 10 meses. Estudio el posgrado en la Universidad Autónoma
Chapingo en el Programa de Maestría en Ciencias en Ciencias Forestales de enero de 2014
a diciembre de 2015.

vi
 CONTENIDO

PÁGINA

ÍNDICE DE CUADROS ...................................................................................................... ix

ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ x

RESUMEN ........................................................................................................................ xii

ABSTRACT ...................................................................................................................... xii

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 3

2.1. Objetivo general .................................................................................................. 3

2.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 3

3. REVISION DE LITERATURA...................................................................................... 4

3.1. Plantas medicinales para el control de la diabetes............................................... 5

3.2. Métodos de extracción y descripción de compuestos orgánicos de las plantas ... 7

3.3. Descripción botánica de Pouteria glomerata subsp. glomerata ............................ 8

4. MATERIALES Y METODOS ..................................................................................... 12

4.1. Material vegetal ................................................................................................. 12

4.2. Preparación de extractos ................................................................................... 12

4.3. Análisis de extractos de hojas de P. glomerata, por Cromatografía en columna 14

4.3.1. Análisis del extracto de hexano .................................................................. 14

vii
 4.3.2. Análisis del extracto de diclorometano ........................................................ 15

4.3.3. Análisis del extracto de metanol ................................................................. 15

4.4. Análisis de fracciones y sustancias puras .......................................................... 16

5. RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................................. 18

5.1. Identificación botánica ....................................................................................... 18

5.2. Rendimiento de los extractos ............................................................................. 18

5.3. Análisis del extracto de cloruro de metileno de P. glomerata subsp. glomerata . 18

5.4. Análisis del extracto metanólico de hojas de P. glomerata subsp. glomerata..... 20

5.5. Análisis del extracto de hexano de hojas de P. glomerata subsp. glomerata ..... 21

5.5.1. Aislamiento e identificación del escualeno .................................................. 23

5.5.2. Aislamiento e identificación de los acetatos de β-lupeol y de β-amirina ...... 28

5.5.3. Aislamiento e identificación de espinasterol................................................ 37

6. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 43

7. RECOMENDACIONES ............................................................................................. 44

8. LITERATURA CITADA ............................................................................................. 45

viii
 ÍNDICE DE CUADROS

CUADRO PÁGINA

1 Fracciones del extracto de diclorometano de hojas de P. glomerata subsp. glomerata. 19

2.- Fracciones del extracto de metanol de hojas de P. glomerata subsp. glomerata ........ 20

3 Fracciones del extracto de hexano de hojas de P. glomerata subsp. glomerata ........... 21

ix
 ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA PÁGINA

1 Metabolitos secundarios aislados de Pouteria glomerata .............................................. xiii

2.- Pouteria glomerata (Miquel) Radlkofer subsp.subsp. glomerata. ................................ 11

3.- Preparación de extractos ............................................................................................ 13

4 Preparación de la columna cromatográfica ................................................................... 15

5 Análisis de las fracciones por cromatografía de capa delgada (ccd) ............................. 16

6.- Equipo de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ...................................................... 17

7 Análisis cromatográfico del extracto de hexano de Tzocohuite ..................................... 22

8 .- Espectro de RMN de 1H de escualeno en CDCl3 ....................................................... 24

9.- Espectro de RMN de 13C del escualeno ...................................................................... 25

10 Espectro DEPT del escualeno .................................................................................... 26

11 .- Espectro de RMN de 1H del acetato de β-lupeol ...................................................... 30

12.- Espectro de RMN de 13C del acetato de β-lupeol ...................................................... 31

13 Espectro de RMN de 1H del acetato de β-amirina ....................................................... 33

14.- Espectro de RMN de 13C del acetato de β-amirina .................................................. 34

15.- Espectro DEPT del acetato de β-amirina .................................................................. 35

16.- Espectro de RMN de 1H del espinasterol .................................................................. 39

x
17.- Ampliación de los espectros de RMN de 1H del estigmasterol y ergosta-7,22-dien-3β-
ol...................................................................................................................................... 40

18.- Espectro de RMN de 13C del espinasterol ................................................................. 41

19.- Espectro DEPT del espinasterol ............................................................................... 42

xi
 RESUMEN

Pouteria glomerata (Miquel) Radkofer subsp. glomerata, es un árbol comúnmente conocido

como Tzocohuite. En la Huasteca Hidalguense, México, se utiliza para el tratamiento de
diversas enfermedades como diabetes, nervios, purificación de la sangre y tosferina. El
estudio fitoquímico de las hojas de P. glomerata permitió el aislamiento e identificación de
(Figura 1): escualeno (1) acetato de β-lupeol (2), acetato de β-amirina (3), y espinasterol
(4). Esta es la primera contribución al estudio fitoquímico de esta especie. Las estructuras
moleculares fueron establecidas por métodos físicos y espectroscópicos de Resonancia
Magnética Nuclear de hidrógeno (RMN 1H y carbono 13 (RMN 13C). Los resultados de este
estudio corroboran el uso de esta especie para el tratamiento de la diabetes, ya que el
escualeno, y los derivados acetilados de β-lupeol y β-amirina, son metabolitos secundarios
previamente evaluados como hipoglucemiantes.

Palabras clave: Pouteria glomerata, acetato de β-amirina, acetato de β-lupeol, escualeno,

espinasterol, Tzocohuite.

ABSTRACT

Pouteria glomerata (Miquel) Radkofer subsp.. glomerata, commonly known as Tzocohite is

a plant used at Huasteca Hidalguense, Mexico for the treatment of diabetes, nervousness,
blood purification and whooping cough. Phytochemical study of leaves of P. glomerata
underwent the isolation and identification of the compounds (Picture 1): β-lupeol and β-
amyrin acetates (2, 3) together with squalene (1), and spinasterol (4). This is the first time
that phytochemical composition of this tree is established. The molecular structures were
established by means of physical and spectroscopic methods including 1H and 13C Nuclear
Magnetic Resonance. The results of this study demonstrate the use of this specie for
diabetes treatment, in fact that squalene, and the acetylated derivatives of β-lupeol and β-
amyrin are secondary metabolites evaluated previously as hypoglycemic.

Keywords: Pouteria glomerata, -amyrin acetate, -lupeol acetate, spinasterol, squalene,

Tzocohuite.
xii
 1 2

3 4

Figura 1 Metabolitos secundarios aislados de Pouteria glomerata

xiii
 1. INTRODUCCIÓN

Las plantas medicinales y aromáticas han sido durante siglos la base de la fitoterapia,
constituyendo todavía la única medicina disponible para determinados grupos étnicos, y
una medicina de elección cada vez más revalorizada para otros. Muchas de estas especies
son endémicas y la recolección indiscriminada está conduciendo a que muchas de ellas se
encuentren amenazadas. La gran diversidad vegetal y la amplia riqueza cultural de México
han favorecido el aprovechamiento de las plantas con fines medicinales desde épocas
prehispánicas. Este patrimonio cultural se ha transmitido de generación en generación, de
manera que algunas costumbres subsisten y son ejercidas de manera cotidiana, tanto en
áreas rurales como urbanas (García de Alba et al., 2012).

Pouteria glomerata (Miquel) Radlkofer subsp. glomerata (Sapotaceae) es un árbol medicinal

de la Huasteca Hidalguense popularmente llamada “Tzocohuite”, sus hojas y corteza se
utilizan para preparar una infusión que se recomienda tomar como agua de tiempo para el
control de la diabetes y nervios, así como, purificar la sangre y contrarresta la tosferina
(Andrade-Cetto y Heinrich, 2005).

La diabetes es una enfermedad que afecta cada vez más a la población mundial, acorde
con la Organización Mundial de la Salud, se pronostica que para el 2030 habrá 6 millones
de personas con esta enfermedad. El panorama en México no es nada favorable, ya que
tan solo en el 2001 los servicios de salud reportaron que la diabetes fue la primera causa
de mortandad (Andrade-Cetto y Heinrich, 2005). En México la diabetes mellitus es
comúnmente tratada con extractos herbales, existe una variedad de plantas con
compuestos antidiabéticos los cuales han sido aislados de ellas y han tenido un uso
potencial; alcaloides, flavonoides, terpenos, e incluso péptidos han sido empleados para
este fin. Se estima que en México hay cerca de 306 especies que son usadas popularmente
en el tratamiento de la diabetes (Andrade-Cetto y Heinrich, 2005).

El género Pouteria ha sido poco estudiado, sin embargo, se ha reportado que algunas
especies tienen actividades biológicas, tales como, antioxidante, anti-inflamatoria,
antibacterial, antifungica e hipoglucemica. De los estudios fitoquímicos del género Pouteria
sp. se han aislado triterpenos, hidrocarburos, alcoholes, ácidos y esteres. Algunos de los

1
triterpenos aislados de estas especies, se han probado in vitro y/o in vivo contra la diabetes
y los resultados han sido favorables (Silva et al., 2008).

El propósito de este estudio es analizar la composición de los extractos (hexano,

diclorometano y metanol) de las hojas del “Tzocohuite”, y relacionar la presencia de sus
metabolitos secundarios con el tratamiento de la diabetes.

2
 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general

Analizar los extractos de las hojas de Pouteria glomerata subsp. glomerata mediante
técnicas cromatográficas y espectroscópicas para determinar los metabolitos secundarios
con actividad biológica

2.2. Objetivos específicos

 Comprobar la identidad botánica de los especímenes colectados de

Tzocohuite mediante el uso de claves taxonómicas
 Obtener extractos de las hojas de P. glomerata usando disolventes de diferente
polaridad ara separar y aislar metabolitos secundarios con actividad biológica.
 Identificar la estructura molecular de los metabolitos secundarios aislados de
las hojas de P. glomerata de acuerdo a sus propiedades físicas y
espectroscópicas.

3
 3. REVISIÓN DE LITERATURA

Los Productos Forestales No Maderables (PFNM), son todos aquellos productos y servicios
vegetales y animales, excluida la madera rolliza comercial y la madera par energía,
derivados de los bosques y otras tierras forestadas y de árboles fuera del bosque (Tapia y
Reyes, 2008). De la Peña e Illsley (2010), clasifican a los PFNM en siete categorías de uso:
alimentos y bebidas, medicina tradicional, instrumentos rituales, especias, insumos
industriales, artesanías, y ornamentales. Los PFNM contribuyen a los medios de vida,
incluyendo a la seguridad alimentaria, la salud, el bienestar y los ingresos. En muchas
partes del mundo estos recursos son indispensables para los habitantes más pobres,
quienes constituyen los actores principales en la extracción de los PFNM, pudiendo
constituir su única fuente de ingresos (Tapia y Reyes, 2008). En el ámbito de la salud los
PFNM han ocupado un lugar importante, actualmente el 30% de los fármacos utilizados en
medicina proceden del reino vegetal, y hay una tendencia notable a elevar esta cifra, debido
al constante descubrimiento de nuevos principios activos de origen botánico (Villarreal et
al., 2014). Debido a lo anterior cada día se presta más atención al uso de las plantas
medicinales de forma que la Etnobotánica, la Fitoterapia y la Fitoquímica están tomando un
auge inesperado, tanto en la práctica de la medicina complementaria como en el ámbito
académico. La Organización Mundial de la Salud reporta que el 80% de la población
mundial, utiliza las plantas como principal remedio medicinal (García et al., 2009).

La OMS definió en 1978 el concepto de planta medicinal como cualquier planta que en uno
o más de sus órganos contiene sustancias que pueden ser utilizadas con finalidad
terapéutica o que son precursores para la semisíntesis químico-farmacéutica (Cañigueral
et al., 2003). México posee una rica tradición en el empleo de las plantas medicinales entre
sus varias prácticas populares. Se calcula que la flora medicinal mexicana contiene entre 3
000 y 5 000 plantas que tiene potencial terapéutico. Increíblemente, aproximadamente el
1% de las plantas medicinales han sido estudiadas a fondo en sus propiedades (Esquivel
et al., 2012).

García de Alba et al., (2012) reportaron que las enfermedades más comunes por la que la
gente busca la cura con plantas medicinales en orden decreciente son: infecciones
respiratorias agudas altas, enfermedades infecciosas intestinales, infección de vías

4
urinarias, ulceras, gastritis y duodenitis, hipertensión arterial, diabetes mellitus, otitis media
aguda, asma y estado asmático, accidentes (de trafico de vehículo de motor). En cuanto a
las plantas que son más utilizadas son: gordolobo, eucalipto, hierbabuena, manzanilla,
nopal, árnica, guarumbo, verbena, sauco amarillo, epazote, sábila, ruda y romero (Esquivel
et al., 2012). Dentro de las plantas medicinales poco conocidas se encuentra el Tzocohuite
(Pouteria glomerata subsp. glomerata). Es un árbol que pertenece a la familia Sapotacea;
Espinosa (1985) en su estudio de plantas medicinales en la Huasteca Hidalguense,
menciona que las hojas de este árbol son utilizadas para preparar te, éste tiene efectos
sobre enfermedades como diabetes, nervios, purificación de la sangre y contrarresta la
tosferina.

3.1. Plantas medicinales para el control de la diabetes

La Diabetes Mellitus (DM) es un grupo heterogéneo de trastornos del sistema endocrino,

que se caracteriza por un deterioro en la capacidad para metabolizar carbohidratos y
grasas, lo que origina un aumento en la concentración de glucosa (hiperglucemia) y lípidos
(hiperlipidemia). La anormalidad en el metabolismo se debe a la secreción inadecuada de
insulina o a la ineficiencia de la disponible. De acuerdo a la Asociación Americana de
Diabetes, la diabetes se clasifica principalmente en: diabetes tipo 1 o insulinodependiente,
diabetes tipo 2 quien no utiliza insulina y diabetes gestacional, de todos los casos
diagnosticados de 90 a 95% son de diabetes tipo 2 (Saucedo et al., 2006). La diabetes se
está convirtiendo en una epidemia y por lo tanto en un reto para la salud global.
Estimaciones de la OMS indican que a nivel mundial, de 1995 a la fecha casi se ha triplicado
el número de personas que viven con diabetes, con cifra actual estimada en más de 347
millones de personas con diabetes. La Federación Internacional de Diabetes reporta que
China, India, Estados Unidos, Brasil, Rusia y México, son los países con mayor número de
diabéticos (Hernández et al., 2013). En México, alrededor del 10% de la población padece
de diabetes mellitus, se presenta con mayor frecuencia en adultos mayores y en personas
obesas, por lo que se ha convertido en la principal causa de muerte con el 12% del total de
defunciones. Sin duda la diabetes es quizá el mayor reto que enfrenta el sistema de salud
mexicano en términos de atención médica y salud pública (Esquivel et al., 2012).

5
Actualmente se buscan y ensayan diversas estrategias médicas para el tratamiento de la
diabetes mediante una combinación de la dieta, educación, ejercicio físico, inmunoterapia,
incluso trasplantes pancreáticos; es importante mencionar que las investigaciones están
orientadas a la obtención de nueva drogas hipoglucemiantes. Sin embargo, debido a las
limitaciones económicas, la mayoría de los mexicanos no tienen acceso a los modernos
esquemas de tratamiento, surgiendo entonces la fitoterapia o medicina natural como
alternativa con igual efectividad (Esquivel et al., 2012). El uso de plantas medicinales como
parte de la medicina alternativa complementaria (MAC) ha tenido un notable incremento en
la cultura occidental y es ampliamente usada de manera regular y significativa en
proporciones variables en Europa y Estados Unidos. En México el uso de plantas como
principal modalidad de la Medicina Alternativa Complementaria es más significativa y es
muy clara la tendencia de su aceptación en hospitales y unidades de atención medica del
Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). Los datos preliminares muestran que
pacientes diabéticos y los que padecen de colelitiasis utilizan MAC 87.5% y 83%
respectivamente y en menor proporción 63% los que padecen obesidad (Miranda et al.,
2005).

Para México se tiene documentado 400 tratamientos naturales con plantas para la diabetes
mellitus, pero solo un pequeño número de estos han recibido evaluación científica y médica
para probar su eficacia (Miranda et al., 2005). Se han registrado alrededor de 306 plantas
de 235 géneros y 93 familias que son usadas como agentes hipoglucémicos. Las familias
que aparecen con mayor frecuencia son: Asteraceae (47 sp.), Fabaceae (27), Cactaceae
(16), Solanaceae y Euphorbiaceae (10). Y Lamiaceae (9) (Andrade y Heinrich, 2005). Los
efectos hipoglucémicos de algunas plantas usadas como remedio antidiabéticos se han
confirmado en las poblaciones rurales que las usan, y los mecanismos de la actividad
hipoglucémica de estas plantas se ha comenzado a estudiar. Estos remedios son efectivos,
producen efectos secundarios mínimos o no los producen y son de bajo costo comparados
con los agentes hipoglucémicos sintéticos orales (García et al., 2009).

Dentro de las plantas más recomendadas para el manejo de la diabetes están: el nopal
(Opuntia joconostle), Cecropia obtusifolia conocida comúnmente como Guarumbo o
Chancarro, Guazuma ulmifolia comúnmente llamada Guácima, Guácimo o Cualote,
Parmentiera aculeata cuyo nombre común es Cuajilote y la tronadora (Tecoma stans)
(Esquivel et al., 2012). En Alemania existen dos productos para el tratamiento de diabetes,
6
elaborados con plantas medicinales de México: Hando, que está elaborado con Nopal
(Opuntia sp.), fabricado por Hando Austria y Sucontral, suya formula tiene Coplachi
(Hintonia sp.) elaborado por Harrass Pharma, Munich. En este contexto es importante
recordad que una medicina moderna la metformina es un derivado de un producto natural,
la galegina o guanidina, aislada de Galega officinalis L., esta planta fue utilizada durante el
periodo medieval para el control de las personas diabéticas (Andrade-Cetto y Heinrich,
2005)

El ácido kaurico es un potente compuesto hipoglucémico, éste ha sido aislado del “zoapatle”
(Montanoa tomentosa), se ha evaluado y los resultados muestran que es más potente que
la glibenclamida, una droga administrada en pacientes con diabetes tipo 2 (Villa et al.,
2011). Como se puede apreciar, las plantas son, han sido y serán un recurso indispensable
en el descubrimiento de nuevos fármacos, por lo tanto la Red Mexicana de Plantas
Medicinales y Aromáticas (REDMEXPLAM), fomenta proyectos comunitarios a pequeña
escala bajo el concepto de conservación ecológica, manejo sustentable y comercio justo
(Juárez et al., 2013).

3.2. Métodos de extracción y descripción de compuestos orgánicos de las plantas

A pesar de los siglos de tradición, la fitoterapia-del friego phyton (planta), tratamiento de las
enfermedades por plantas frescas, secas o sus extractos- ha evolucionado y ha ganado
prestigio y eficacia, sobre todo en los últimos tiempos, acercándose cada vez más a las
normas y usos que exige la medicina moderna (Carballo et al., 2005). Los medicamentos
fitoterapéuticos están constituidos exclusivamente por ingredientes activos de origen
vegetal usualmente no definidos químicamente, formulados bajo la forma farmacéutica más
adecuada para su administración, lo que implica que para la elaboración de medicamentos
fitoterapéuticos se pueden emplear principalmente: a) drogas vegetales que por lo general
se presentan en forma molida o pulverizada, b) productos obtenidos por extracción o c) en
algunos casos particulares, principios activos purificados (Cañigueral et al., 2003).

La extracción de los principios activos por medio de la fitoquímica se basa en conceptos

básicos de la polaridad de las moléculas. De acuerdo a los mismos, se han desarrollado
técnicas analíticas de separación, que facilita la obtención de perfiles químicos detallados,
lo que a su vez permite la identificación y el aislamiento de moléculas bioactivas con mayor

7
rapidez y precisión (Villa et al., 2011). Habitualmente se utilizan procedimientos
cromatográficos especializados que permiten el aislamiento y purificación de los
compuestos presentes en las plantas. Dentro de estos, destacan en orden creciente de
complejidad la cromatografía de capa delgada (TLC), de alta presión de líquidos (HPLC),
de gases (GC) y liquida de ultra-resolución (UPLC). Más adelante los compuestos las
estructuras de los compuestos aislados y purificados se elucidan usando para ello técnicas
espectroscópicas convencionales como son la resonancia magnética nuclear (RMN) o la
cristalografía de rayo X (Villa et al., 2011; Villareal et al., 2014). La información anterior es
necesaria para llevar a cabo estudios clínicos controlados donde se pueda establecer, en
función de la dosis, la actividad y seguridad del medicamento herbolario estandarizado. El
concurso de otras disciplinas de frontera como la biología molecular, la biotecnología, la
fisiología molecular y la biología de sistemas entre otras, está permitiendo elucidar los
mecanismos de acción de los fármacos vegetales, establecer las rutas metabólicas de
síntesis y diseñar procedimientos para lograr la producción controlada de los principios
activos (Villareal et al., 2014).

3.3. Descripción botánica de Pouteria glomerata subsp. glomerata

El Tzocouite (Pouteria glomerata subsp. glomerata) antes Pouteria hypoglauca (Espinosa,

1985), es un árbol que pertenece a la familia Sapotaceae. Esta familia comprende 54
géneros y cerca de 1175 especies, de las que alrededor de 400 se encuentran en la región
neotropical, unas 350 en África y otras tantas en Asia tropical. Prosperan principalmente en
bosques húmedos, pero algunos géneros como Sideroxylon y Argania se extienden a
regiones áridas y semiáridas. En México se encuentra 5 géneros y 38 especies distribuidas
por lo general en bosques húmedos y pocos en regiones áridas o semiáridas (Instituto de
Biología, 2008; Carranza, 2005). Esta familia tiene importancia económica ya que algunos
géneros como Chrysophyllum, Manilkara y Pouteria se cultivan por sus frutos comestibles,
látex, y su madera durable y pesada, a su vez la goma de mascar natural se obtiene de
Manilkara zapota (L.) van Royen (Azurdia, 2006; Carranza 2005). El género Pouteria
comprende árboles o arbustos, constituidos por 188 especies en el neotrópico y alrededor
de 150 especies en Asia tropical y la región del Pacífico. En México existen 10 especies
(Pennington 1990): Pouteria belizensis (Standley) Cronquist, P campaechiana (Kunth)
Baehni, P. durlandii (Standley) Baehni, P. glomerata (Miquel) Radlkofer, P. reticulata

8
(Engler) Eyma, P. rhynchocarpa Pennington, P. sapota (Jacquin) H.E. Moore y Stearn,
P. squamosa Cronquist, P. torta (Martius) Radlkofer, y P. viridis (Pittier) Cronquist.

Pouteria glomerata (Miquel) Radlkofer, Sitzungsber. Math.-Phys. Cl. Königl. Bayer. Akad.
Wiss. München 12: 333. 1882. Lucuma glomerata Miquel, Fl. Bras. 7: 81. 1863. (Standley y
Williams 1967). Está ubicada en un conjunto de árboles monoicos o dioicos, hasta 30 m, el
fuste acostillado; corteza interna con látex. Hojas 6-20(-24) × 2.7-6(-8.5) cm, agrupadas en
el ápice, dispuestas en espiral. Flores 2-10, unisexuales, en fascículos axilares y por debajo
de las hojas. Fruto 2.5-9 cm, frecuentemente más ancho que largo, globoso o deprimido
globoso, o muy irregular y nodoso, la superficie rugosa o lisa, glabra o con algo de
indumento casposo residual cerca de la base, la base y el ápice truncados. Semillas 1-
numerosas, 2-4.5 cm, anchamente elipsoidales (cuando solitarias) o plano convexas.

P. glomerata que se distribuye desde México hasta Paraguay y Argentina. Se reconocen

dos variedades: Pouteria glomerata subsp. glomerata y Pouteria glomerata subsp.. stylosa
(Pierre) T.D. Penn.

Pouteria glomerata (Miquel) Radlkofer subsp. glomerata, (Figura 2) nombrado

comúnmente como Tzocohuite (Huasteca Hidalguense), algunos otros nombres comunes
fuera de la zona de estudio son chicozapote, socovite, tilapo, y/o zapote prieto (Carranza
2005), es un árbol de estatura media, a veces hasta 20 m de alto, copa baja y ancha, con
un diámetro hasta 45 cm, ramas jóvenes densamente poblados por hojas, densamente
cerosas. Hojas pecioladas (6-12 mm de largo) oblongas u oblanceolado-oblongo de 8 a 22
cm de largo y de 2.5 a 5 cm de ancho, el ápice comúnmente obtuso, base aguda a más o
menos redondeada, envés diminuta y finamente blanquizco-pubérulo, los pelos adpresos,
por lo común formando una delgada película, en ocasiones casi glabro con la edad. Flores
fasciculadas en la axila foliar, subséciles; 5 sépalos en general elípticos de 3 mm de largo,
obtusos o redondeados, en el ápice densamente pubescentes; corola de 2 mm de largo,
glabra, los lóbulos son más anchos que largos, generalmente redondeados o truncados en
el ápice, estambres ovados de la mitad de largo que los lóbulos de la corola; ovario
densamente pubescente; fruto oval-globoso, alrededor de 7 cm de largo por 5 cm de ancho,
suave, glabro de piel delgada y dura; semillas alrededor de 4, normalmente blancas y
tersas, de 4 cm de largo por 2 cm de ancho, con la cicatriz hilar de forma elíptico lineal, de
2.5 cm de largo (Standley y Williams 1967). El Tzocohuite se distribuye desde la vertiente
9
del Golfo en la porción central de México (San Luis Potosí, Querétaro, Hidalgo, Puebla,
Veracruz, y Yucatán); Centroamérica y Sudamérica (Paraguay, Argentina y Brasil)
(Carranza, 2005).

10
Figura 2.- Pouteria glomerata (Miquel) Radlkofer subsp.subsp. glomerata. A. rama con
fruto; B. sección de una rama con inflorescencias; C. flor; D. flor desprovista de un sépalo
y de la corola, mostrando el gineceo; E. corola abierta mostrando estambres (Fuente:
Carranza 2005)

11
 4. MATERIALES Y METODOS

La etapa experimental de este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Productos

Naturales de la Universidad Autónoma Chapingo.

4.1. Material vegetal

Se colectó corteza, hojas, flores y frutos de P. glomerata subsp. glomerata en Tehuatlan,

Municipio de Huejutla en el Estado de Hidalgo. Las hojas y la corteza fueron secadas a la
sombra. Los frutos y las semillas se secaron en una estufa de temperatura controlada
(aprox. 70°C).

La identificación de los especímenes colectados fue hecha por la M.C. Ernestina Cedillo
Portugal y el Ing. José María Cunill Flores en el Herbario-Hortorio Jorge Espinoza Salas
(JES), del área de Biología del Departamento de Preparatoria Agrícola, de la Universidad
Autónoma Chapingo, corroborando en el Herbario Nacional de México (MEXU) de la
Universidad Nacional Autónoma de México y le fue asignado el No. de depósito 25502 y
25504.

4.2. Preparación de extractos

Los extractos fueron obtenidos vía maceración, para lo cual, en un garrafón de vidrio de
20 L se colocaron 4.2 kg de hojas secas y molidas de P. glomerata subsp. glomerata y se
adicionaron 9.6 L de hexano, Esta mezcla se dejó en reposo a la sombra por tres días,
transcurrido dicho tiempo, el hexano se filtró y se evaporó en un rotaevaporador al vacío
(Büchi Modelo R111, Waterbath B-461) obteniéndose un extracto de hexano y el residuo
vegetal, esta proceso se repitió tres veces. En la tercera repetición el residuo vegetal fue
puesto en contacto con 7 L de diclorometano (CH2Cl2) vía maceración (3 veces por 3 días),
en cada ocasión el disolvente filtrado fue evaporado en el rotaevaporador sin vacío. En la
tercera repetición se adiciono al residuo 7.5 L de metanol (MeOH), al igual que las dos
extractos anteriores se hizo tres veces cada 3 días, para poder evaporar el metanol se
utilizó vacío (Figura 3). Los extractos de corteza de obtuvieron de la misma forma que los

12
de hoja, en un garrafón de vidrio se agregaron 375.5 g de corteza y se utilizaron 4 litros de
hexano, diclorometano y metanol, respectivamente.

Figura 3.- Preparación de extractos: maceración, filtración y evaporación

13
4.3. Análisis de extractos de hojas de P. glomerata, por Cromatografía en columna

4.3.1. Análisis del extracto de hexano

El extracto de hexano obtenido de las hojas de Pouteria glomerata subsp.. glomerata, fue
sometido a un proceso de precipitación de material graso, aplicando una cantidad de
metanol y calentando en baño de agua durante 5 minutos, se permitió enfriar a temperatura
ambiente y se colocó bajo refrigeración a 5° C por espacio de 5 horas, observándose un
precipitado que fue separado por filtración a gravedad, el filtrado se sometió a otro proceso
adicional de refrigeración y así sucesivamente hasta que no se observó algún precipitado.
Finalmente se eliminó el disolvente en un rotavapor al vacío para dar 10 g de extracto de
hexano desengrasado. Este extracto libre de grasas fue disuelto en CH2Cl2 y preadsorbido
en 11 g de gel de sílice, se mantuvo con agitación ocasional y al final se obtuvo un polvo
verdoso. . El extracto hexánico preadsorbido anterior, fue aplicado en la parte superior de
una columna de vidrio empacada (Figura 4) con 100 g de gel de sílice. La columna se eluyó
primero con hexano, posteriormente con mezclas de hexano /AcOEt de polaridad creciente
y al final con AcOEt y metanol (MeOH). ). Se colectaron inicialmente fracciones de 200 mL,
mismas que fueron evaporadas en un rotavapor, a partir de la fracción 52 se recogieron
fracciones de 20 mL, evaporando el disolvente en un baño de agua. El seguimiento de
dichas fracciones se efectuó empleando la técnica de cromatografía en capa delgada (ccd),
aplicando cada una de ellas en cromatoplacas analíticas Merck y revelando con luz
ultravioleta y con disoluciones de ácido fosfomolíbdico o de sulfato cérico amoniacal en
ácido sulfúrico 2N, para enseguida someterse a un proceso de calentamiento para la
observación de manchas usando una pistola de aire caliente o una plancha de
calentamiento, se reunieron las fracciones semejantes por su similitud en sus valores de Rf
vistos en la ccd.

14
Figura 4 Preparación de la columna cromatográfica y aplicación del extracto

4.3.2. Análisis del extracto de diclorometano

Se pesaron 40 g de extracto de diclorometano de las hojas de Pouteria glomerata subsp.

glomerata, este extracto fue disuelto en CH2Cl2 y preadsorbido en 40 g de gel de sílice, se
dejó reposar y al final se obtuvo un polvo de color verde oscuro. El extracto preadsorbido,
fue aplicado en la parte superior de una columna de vidrio empacada con 400 g de gel de
sílice, eluyendo con hexano e incrementando la polaridad con mezclas de hexano/AcOEt y
al final con AcOEt y MeOH. Se colectaron fracciones de 200 mL, mismas que fueron
evaporadas en un rotavapor. Al igual que en el extracto hexánico las fracciones fueron
monitoreadas por cromatografía de capa delgada (ccd) y se reunieron las fracciones
semejantes por su similitud en sus valores de Rf.

4.3.3. Análisis del extracto de metanol

Para el análisis del extracto MeOH de las hojas de Tzocohuite se preadsorbieron 5 g de

extracto en 5 g de gel de sílice. Una vez preadsorbido el extracto se aplicó en la parte
superior de una columna de vidrio empacada con 50 g de sílica gel, eluyendo con CH2Cl2
e incrementando la polaridad con mezclas de diclorometano y metanol, al final solo con
metanol. Se colectaron 8 fracciones de 200 mL, mismas que fueron evaporadas en un
15
rotavapor, a partir de la fracción 9 se recogieron fracciones de 20 mL, evaporando el
disolvente en un baño de vapor. Las fracciones se monitorearon por cromatografía de capa
delgada, al igual que los otros dos extractos, y se reunieron aquellas fracciones con un Rf
similar (Figura 5).

Figura 5 Análisis de las fracciones por cromatografía de capa delgada (ccd)

4.4. Análisis de fracciones y sustancias puras

Se empleó en la identificación un espectrómetro Agilent 400 MR DD2 espectrómetro (Santa

Clara, CA, USA) operando a 100 MHz para 13C y 400 MHz para 1H.En la Figura 6 se
muestra el equipo de RMN que se encuentra en la Universidad Autónoma Chapingo, este
equipo está a cargo del Laboratorio de Productos Naturales.

16
De las fracciones procedentes de la columna de separación de los extracto de las hojas de
P. glomerata subsp. glomerata, se seleccionaron aquellas que mostraron cierto grado de
pureza en la ccd o formación de sólidos cristalinos. Se pesaron al menos 50 mg de cada
fracción seleccionada y se sometieron a un estudio de Resonancia Magnética Nuclear de
hidrógeno (RMN 1H), cuando se obtuvieron espectros de interés, entonces se determinó
otro espectro de RMN de carbono 13 (RMN 13C).

Figura 6.- Equipo de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) y preparación de la muestra

17
 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Identificación botánica

El material vegetal herborizado se identificó en el herbario JES, del área de Biología del
Departamento de Preparatoria Agrícola de la UACh, de acuerdo con las taxonómicas
(Standley y Stademark, año; Carranza 2005) dando como resultado Pouteria glomerata
subsp. glomerata. Se depositaron 5 ejemplares con frutos (25502-25506), que se
destinaran de la siguiente manera, 2 ejemplares para el herbario, 1 ejemplar para
enseñanza y 2 ejemplares para intercambio con otras instituciones (Figura 7).

5.2. Rendimiento de los extractos

De la preparación de extractos de hojas de Tzocohuite, se obtuvieron 38.1 g de extracto

hexanico de color verde oscuro, 73.8 g de extracto de diclorometano con un color verde
grisáceo y 217.4 g de extracto de metanol con un color verde oscuro. En cuanto a los
extractos de corteza de Tzocohuite el rendimiento fue el siguiente; 4.3 g de extracto de
hexano de color blanco, 4 g de extracto de cloruro de metileno de color verde oscuro
grisáceo, y 4.5 g de extracto de metanol de color café.

5.3. Análisis del extracto de cloruro de metileno de P. glomerata subsp. glomerata

En la Cuadro 1, se muestran las fracciones obtenidas y su polaridad, aproximadamente el

90% de las fracciones obtenidas de esta columna cromatográfica consistieron en sólidos y
algunos cristales de diversos colores.

18
 Cuadro 1 Fracciones del extracto de diclorometano de hojas de P. glomerata subsp.
glomerata

Metabolitos
Eluyente Fracciones Fracciones reunidas
identificados
5-6; 7-9; 10-18; 19-22; 24-27; 28-36; 40-65; 67- ---
Hexano puro 1-98
72; 73-81
82-101; 103-108; 109-115; 116-117; 127-135; ---
Hexano/AcOEt 136-143; 144-152; 153-161; 162-170; 162-170;
99-252
95:5 171-179; 180-188; 189-197; 198-206; 207-215;
216-232; 233-251
252-267; 268-283; 284-300; 301-305; 306-317; ---
Hexano/AcOEt 318-336; 337-339; 340-341; 342-345; 346-348;
253-469
90:10 350-352; 353-354; 355-371; 372-390; 391-395;
396-424; 427-443; 444-462
465-479; 480-498; 499-516; 517-522; 523-525; ---
Hexano/AcOEt
470-674 526-544; 545-552; 554-570; 571-588; 589-606;
80:20
607-624; 625-642; 643-660; 661-676
Hexano/AcOEt 677-696; 697-714; 715-732; 733-744; 745-757; ---
675-768
70:30 758-763; 764-768
Hexano/AcOEt ---
769-828 769-786; 787-804; 805-813; 814-822; 823-829
60:40
Hexano/AcOEt 831-835; 836-840; 841-858; 859-870; 871-876; ---
829-883
50:50 877-882
Hexano/AcOEt ---
884-972 883-894; 895-930; 931-966;
60:40
Hexano/AcOEt ---
973-977 967-982
30:70
983-986; 987-996; 997-1011; 1012-1018; 1019- ---
100% AcOEt 978-1048
1038; 1039-1048
100% MeOH 1049-1078 1049-1057; 1058-1078 ---

19
 5.4. Análisis del extracto metanólico de hojas de P. glomerata subsp. glomerata

El análisis del extracto de metanol fue complicado, debido a la presenciad e una saponina
en su composición, esta saponina taponeaba la columna, evitando la elución de los
compuestos. De las tres columnas, se colectaron menos fracciones (417); en el Cuadro 2
se muestra las fracciones obtenidas y su polaridad, ninguna de ellas tanto en su aspecto
físico como en la cromatografía de capa delgada mostraron algo interesante.

Cuadro 2.- Fracciones del extracto de metanol de hojas de P. glomerata subsp. glomerata

Metabolitos
Eluyente Fracciones Fracciones reunidas
identificados
CH2Cl2 puro 1-61 1-3; 2-12; 13-17; 19-36; 37-54; 55-66 ---
CH2Cl2/MeOH 71-81; 82-90; 91-101; 102-108; 109-126; 127-
62-153 ---
95:5 144;
CH2Cl2/MeOH 145-162; 163-177; 178-180; 181-198; 199-216;
154-247 ---
90:10 218-223; 224-234
CH2Cl2/MeOH
248-293 235-252; 253-270; 271-288 ---
85:15
CH2Cl2/MeOH
294-347 289-306; 307-324; 325-342 ---
80:20
CH2Cl2/MeOH
348-396 343-360; 361-378; 379-396 ---
70:30
CH2Cl2/MeOH
397-413 ---
60:40
100% MeOH 414-417 414-415; 416-417 ---

20
 5.5. Análisis del extracto de hexano de hojas de P. glomerata subsp. glomerata

De los tres extractos estudiados, el extracto de hexano de hojas de Tzocohuite, fue el que
más se analizó. Se obtuvieron 904 fracciones como se puede ver en el Cuadro 3. Se
identificaron 4 metabolitos secundarios del extracto hexánico, todos ellos previamente
descritos en la literatura y con una amplia variedad de estudios. Los 4 metabolitos
identificados fueron: escualeno (fracciones 16-20), acetato de β-lupeol y acetato de β-
amirina (fracciones 50-52) y espinasterol (fracción 68).

Cuadro 3 Fracciones del extracto de hexano de hojas de P. glomerata subsp. glomerata

Metabolitos
Eluyente Fracciones Fracciones reunidas
identificados
Hexano puro 1-48 1-15; 16-20; 21-36; 37-49 Escualeno
Hexano/AcOEt 49-257 50-52; 53-55; 56-59; 60-63; 86-100; 101-154; Acetato de
95:5 155-172; 173-208; 209-226: 227-244; β-lupeol

Acetato de
β-amirina

Espinasterol
245-304; 306-315; 316-340; 342-370; 371-388; ---
Hexano/AcOEt
248-616 389-400; 402-405; 406-424; 425-500; 501-514;
90:10
515-568; 569-586; 587-604; 605-615
616-658; 659-676; 677-694; 695-712; 713-724; ---
Hexano/AcOEt
617-874 726-734; 735-738; 739-768; 769-776; 777-784;
85:15
785-856: 857-874
100% AcOEt 875-901 875-901 ---
100% MeOH 902-904 902-904 ---

21
En la Figura 7 se muestra el avance de la columna cromatográfica del extracto de hexano
de las hojas del Tzocohuite

Figura 7 Análisis cromatográfico del extracto de hexano de Tzocohuite

22
 5.5.1. Aislamiento e identificación del escualeno

De las fracciones 16-20 obtenidas del extracto de hexano analizado por cromatografía en
columna de hojas de P. glomerata subsp. glomerata, se obtuvo una sustancia de aspecto
aceitoso que en su espectro de RMN (Figura 8) de 1H mostró en 5.1 ppm un conjunto de
señales que integraron para 6H correspondientes a hidrógenos de alquenos, así mismo en
2.01 ppm se observó un conjunto complejo de señales que integraron para 20H de protones
en posición alfa a un enlace doble, finalmente en 1.5 ppm se observaron dos señales
simples e intensas que integraron para 12H, con la información anterior es posible proponer
una serie de fragmentos que están presentes en este aceite.

13
Por otro lado, en su espectro de RMN de C (Figura 9), se observaron 15 señales, 6 de
ellas corresponden a carbonos de tipo alqueno y las 9 restantes corresponden a carbonos
con enlace simple.

En tanto que en su espectro DEPT (Figura 10) se observaron 3 señales de carbonos sin
hidrógenos en el trazo inferior, 3 señales para carbonos de alqueno tipo =C-H, en el trazo
de tercer nivel se observaron 5 carbonos de tipo CH2, y en el trazo superior se apreciaron
4 resonancias para grupos metilo (CH3), al reunir esta información, resulta un derivado de
fórmula C15H25, sin embargo ningún derivado del carbono responde a dicha fórmula, por lo
tanto la molécula deberá contener el doble de átomos y entonces su estructura deberá
corresponder a la formula C30H50, al analizar la información de productos naturales aislados
de otras plantas y cotejar sus datos del espectro publicado por la empresa Sigma-Aldrich,
se identificó este aceite como escualeno (He et al., 2002).

23
Figura 8 .- Espectro de RMN de 1H (400 MHz) de escualeno en CDCl3
24
Figura 9.- Espectro de RMN de 13C (100 MHz) en CDCl3 del escualeno

25
Figura 10 Espectro DEPT del escualeno
26
El escualeno (C30H50) es producido tanto por plantas como animales; se encuentra de
manera natural en algunas aceitunas, en el aceite de hígado de tiburón, germen de trigo y
en el salvado de arroz (Reddy y Couvreur, 2009). En humanos el escualeno es el precursor
de la síntesis del colesterol y de todas los esteroides (Gary et al., 2000), y se sintetiza en el
hígado y la piel, transportado en la sangre por lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)
y lipoproteínas de baja densidad (LDL), y secretado en grandes cantidades por las
glándulas sebáceas (Reddy y Couvreur, 2009). El escualeno ha sido estudiado debido a los
beneficios que este producto natural ha mostrado en la salud del ser humano, algunos de
los reportes han sido por su actividad anticancerígena. Se ha demostrados que el escualeno
puede prevenir o detener el crecimiento de tumores en conjunto con medicamento
anticancerígeno (Reddy y Couvreur, 2009). El aceite de olivo contiene importantes
cantidades de escualeno (150-170 mg/100g) y en estudios comparativos de incidencia de
cáncer de pecho entre países de la región Mediterránea donde el aceite de oliva es común
en su dieta diaria, contra países Escandinavos y EUA donde consumen 85% menos de
aceite de oliva, estos últimos tienen un 35% más de incidencia de cáncer de pecho que los
países Mediterráneos, esta diferencia se ha vinculado al consumo del aceite de oliva, (Popa
et al., 2015). Al igual que el aceite de olivo, el amaranto (Amaranthus sp.) en su composición
química hay escualeno (6000 a 8000 mg/100g), y ha sido recomendado para la cura de
dolores de cabeza y tumores (Ofitserov, 2001).

El escualeno también es conocido por los grandes beneficios para la piel. Se ha demostrado
que hidrata, repara la piel dañada y también la rejuvenece. Las propiedades de hidratación
y emulsión así como la biocompatibilidad con la piel hacen al escualeno un compuesto
importante en la industria de la cosmética (cremas, maquillaje, labiales y productos para
uñas y cabello) (Huang et al., 2009). Se sabe que el escualeno muestra actividad
antioxidante, y se le atribuye a su estructura química, sus dobles bandas en su esqueleto y
los isoprenoides actúan como un fuerte antioxidante y un natural antibiótico (Popa et al.,
2015). El aceite de oliva ha mostrado una considerable protección contra la enfermedad
cardiaca coronaria y el envejecimiento, debido a la presencia de escualeno y compuestos
fenólicos en su composición química. Este triterpeno se acumula en altas concentraciones
en la piel, donde tiene un papel importante al eliminar los radicales libres, previniendo el
efecto perjudicial de la peroxidación de lípidos (Reddy y Couvreur, 2009). Por otra parte
Widyawati et al., (2015), probaron el efecto anti-hiperglucémico del extracto metanólico de

27
Sysygium polyanthum (Wight.) en ratas diabéticas. Los resultados fueron positivos,
demostrando la actividad anti-hiperglucemiante del escualeno.

5.5.2. Aislamiento e identificación de los acetatos de β-lupeol y de β-amirina

De las fracciones 50-52 procedentes del extracto de hexano analizado por cromatografía
en columna de hojas del árbol de Tzocohuite. se obtuvo una sustancia sólida que en su
espectro de RMN de 1H, aportó en el intervalo de 5.2 a 4.4 ppm un conjunto de señales que
integraron para 5H correspondientes a hidrógenos de alquenos, y de protones base de
acetato de dos alcoholes triterpénicos, información que pudo corroborarse en el mismo
espectro al observar en 2.01 ppm dos señales intensas que integran para 6H, de dos metilos
de grupo acetato. Otro grupo de al menos 15 señales entre 1.7 y 0.6 ppm altas y finas que
indican la naturaleza triterpenica de esta mezcla, una de las señales en 5.15 ppm integra
para un hidrogeno que podría asignarse a un triterpeno de tipo amirina, en tanto que el
conjunto de dos hidrógenos en 4.55 y 4.68 ppm se ha observado en triterpenos de tipo
lupano. Por otro lado, en el espectro de RMN de 13C de la mezcla de triterpenos contenidos
en la fracción 50-52 del extracto hexanico de P. glomerata subsp. glomerata, se observaron
65 señales, restando tres del disolvente CDCl3 quedan 62 resonancias que corroboran la
presencia de al menos dos triterpenos.

Para analizar más detalladamente la estructura de los triterpenos contenidos en la mezcla

de la fracción 50-52 de P. glomerata subsp. glomerata, se aplicaron 110 mg disueltos en
hexano de esta mezcla a una columna de vidrio empacada con 10 g de gel de sílice y
eluyendo con mezclas de hexano/CH2Cl2, para dar 15 mg de un sólido blanco en cuyo
espectro de RMN de 1H (Figura 11) en el intervalo de 4.68 y 4.55 ppm se observaron tres
grupos de señales, dos de ellas correspondieron a los protones vinílicos del radical
isopropileno que se puede encontrar en varios metabolitos secundarios como en
monoterpenos, sesquiterpenos o en triterpenos de tipo lupano, además que en 4.45 ppm
se observó una señal múltiple que correspondió al protón base de acetato (CH3-C=O), y en
2.01 ppm se observó solo una señal del metilo (CH3) del grupo acetato. Al analizar el
espectro de RMN de 13C (Figura 12), del derivado purificado por cromatografía en columna
y procedente de la fracción 50-52 (F35) se observaron 36 señales, 2 de ellas corresponden
a carbonos de tipo alqueno en 109.3 y 151 ppm del grupo isopropileno y una corresponde
a carbono de tipo carbonilo en 171.0 ppm del grupo acetato. En 81 ppm se observó otra
28
señal característica de carbono tipo CH que contiene un átomo de oxigeno del grupo
acetato. Con los datos anteriores y por comparación con los publicados para triterpenos
con esqueleto de lupano, se dedujo que la estructura de este metabolito secundario
corresponde a la del acetato de β-lupeol (Reynolds et al., 1986).

29
Figura 11 .- Espectro de RMN de 1H del acetato de β-lupeol
30
Figura 12.- Espectro de RMN de 13C del acetato de β-lupeol

31
La mezcla de triterpenos procedente de la fracción F50-52 (F50) del extracto de hexano de
P. glomerata subsp. glomerata, fue sometida a una segunda recromatografía, por lo que
fue aplicada a una columna de vidrio empacada con silicagel pero esta vez se eluyo con
hexano y mezclas de hexano/CH2Cl2, incrementando la polaridad en el orden 99:1, 98:2,
97:3, 96:4 y 95:5. De las fracciones eluidas con la polaridad 99:1, se obtuvo una sustancia
solida cuyo espectro de RMN de 1H (Figura 13), en 5.18 ppm se observó una señal triple
que integro para 1H misma que fue asignada a un hidrógeno de tipo alqueno (C=C-H) en
4.5 ppm se observó una señal múltiple que correspondió al protón base de acetato (CH3-
C=O), y en 2.01 ppm se observó solo una señal del metilo (CH3) del mismo grupo acetato.

Al analizar el espectro de RMN de 13C (Figura 14), del derivado purificado por cromatografía
en columna y procedente de la F50-52 (F50) se observaron 36 señales, 2 de ellas
corresponden a carbonos de tipo alqueno en 121.6 y 145.2 ppm y una corresponde a
carbono de tipo carbonilo en 171.0 ppm del grupo acetato. En 81.0 ppm se observó otra
señal característica de carbono tipo CH que contiene un átomo de oxigeno del grupo
acetato. Para corroborar la información anterior, el espectro DEPT (Figura 15) de este
triterpeno, aporto 9 señales para grupos metilo (CH3), 10 resonancias para grupos metileno
(CH2), 4 señales para grupos metino (CH) y 8 resonancias para átomos de carbono no-
protonados (C). Con los datos anteriores y por comparación con los publicados para
triterpenos con esqueleto de amirina, se dedujo que la estructura de este metabolito
secundario corresponde a la del acetato de β-amirina (Hossain y Ismail, 2013).

32
Figura 13 Espectro de RMN de 1H del acetato de β-amirina
33
Figura 14.- Espectro de RMN de 13C del acetato de β-amirina
34
Figura 15.- Espectro DEPT del acetato de β-amirina
35
El acetato de α-amirina y el acetato de β-amirina aislados por Okoye et al. (2014) de la
corteza de Alstonia boonei, mostraron gran actividad anti-inflamatoria. Mientras que Aragão
et al. (2009) reporto que ambos triterpenos tiene actividad sedante, y propiedades
ansiolíticas y anticonvulsivo. Fabiyi et al. (2012) en su estudio concluyen que la actividad
antioxidante y citotoxica de las hojas de Bridelia ferrunginea se debe a la abundante
presencia del acetato de β-amirina (66.14%). El acetato de β-amirina también se ha
reportado con actividad antitubercular. Higuchi et al., (2011) estudiaron el extracto de
cloroformo de las hojas de Byrsonimia fagifolia para probar su actividad contra la
tuberculosis, midiendo la concentración mínima inhibitoria, siendo la menor, una mezcla de
lupeol, acetato de α- y β-amirina (31.25 μg/mL). Nasution et al. (2015) probaron la actividad
antidiabética del acetato de β-amirina, este compuesto fue aislado de la corteza de
Artocarpus camasi. Los resultados mostraron que el acetato de β-amirina disminuye los
niveles de glucosa en la sangre de los ratones a los 60 y 90 minutos, sin embargo su
actividad antidiabética es menor que el β-sitosterol.

Lupeol y sus derivados se han descrito con actividad antiprotozoaria, antinflamatoria,

antitumoral, protege el sistema cardiaco, hepatroprotectora, antimicrobiana y recientemente
se ha demostrado su actividad antihiperglucemiante (Gallo y Sarachine, 2009). El acetato
de β-lupeol es un derivado del lupeol, que se ha reportado con efectos anticonceptivos y
antinflamatorios. Chen et al. (2012) probaron los extractos de Balanophora spicata. Los
resultados mostraron que el acetato de β-lupeol, que fue uno de los terpenos identificados
en su composición química, es el metabolito que le da el mayor efecto antinflamatori a B.
spicata. Los derivados como el acetato de β-lupeol, toluato de β-lupeol, palmitato de β-
lupeol, y el cinamato de β-lupeol, se ha reportado con actividad antidiabética, hipoglucemica
y/o antihiperglucemiante. Lakshmi et al. (2014) evaluó dicho efecto en ratas diabéticas. Los
resultados probaron que los derivados del lupeol poseen mejor actividad antidiabética que
el lupeol, actúan disminuyendo los niveles de glucosa en la sangres, estos niveles son
comparables al efecto de la metmorfina, uno de los medicamentos más utilizado en el
tratamiento de la diabetes. El acetato de β-lupeol de forma natural se ha aislado de la
corteza, tallos y frutos de varias plantas medicinales, Adebajo et al. (2013), probó la
actividad hipoglucémica del acetato de lupeol, al aislarlo de las hojas de Gongronema
latifolium, evaluando su efecto en ratas diabéticas, y teniendo resultados positivos, ya que
tuvo un efecto similara a la insulina. Del extracto acuoso de las hojas de Ficus carica se

36
aislaron cuatro triterpenos, entre ellos el acetato de β-lupeol (Mawa et al., 2013). El extracto
fue administrado vía oral e intraperitoneal en ratas diabéticas, con excelentes resultados,
comprobando así los efectos hipoglucémicos de F. carica (Perez et al., 1998).

5.5.3. Aislamiento e identificación de espinasterol

De la fracción F68 del extracto de hexano estudiado por cromatografía en columna de hojas
del árbol de Tzocohuite, se obtuvo una sustancia sólida que en su espectro de RMN de 1H
(Figura 16), en 3.6 ppm se observa una señal múltiple que integra para 1H, misma que es
característica para esteroles como β-sitosterol y estigmasterol entre otros. Además en 5.15
y 5.05 ppm se observan dos señales que integran para dos hidrógenos vinílicos con una
multiplicidad de doble de dobles y constante de acoplamiento (J) de 15.3 y 8.6 Hz, que
corresponden a un enlace doble cuyos hidrógenos tienen una geometría trans- y están
acoplados con otro hidrógeno de dos grupos CH de cadena alifática. En el mismo espectro
de RMN de 1H, en 5.10 ppm se observa una señal triple que integra para 1H, misma que es
característica para esteroles y triterpenos, esta señal se encuentra sobrepuesta sobre el
sistema doble de dobles en 5.10 y 5.05 ppm, indicando entonces que dicho hidrógeno
vinílico está ubicado en una posición diferente al carbono C6 de la mayoría de los esteroles
como estigmasterol, proponiéndose una estructura semejante al de un ergosta-7,22-dien-
3β-ol (Figura 17).

13
Al estudiar el espectro de RMN de C (Figura 18), del metabolito obtenido de la fracción
F68 del extracto de hexano obtenido de columna cromatográfica de hojas del árbol de
Tzocohuite, se observaron 29 señales, 4 de ellas corresponden a carbonos de tipo alqueno
en 139.6, 138.2, 129.5 y 117.4 ppm entonces este metabolito debe contener dos enlaces
dobles C=C. Como se mencionó anteriormente, en 5.16 ppm (Espectro de RMN de
1
H)corresponde al protón vinílico (H-C=C) sobre el carbono C7 que absorbe en 117.4 ppm
13
en el espectro de RMN de C, a diferencia del estigmasterol (Figura 25) esta sustancia
natural posee un carbono adicional o sea es un esterol de 29 átomos de carbono, en su
espectro DEPT (Figura 19), se distinguen 6 señales para grupos metilo (CH3), 9 resonancias
para grupos metileno (CH2), 11 señales para grupos metino (CH) y 3 resonancias para
átomos de carbono no-protonados (C), aun cuando existe semejanza espectroscópica con
el ergosta-7,22-dien-3β-ol (Figura 25), la presencia de un grupo metileno (CH2) adicional,
13
permite distinguir a esta sustancia por sus valores de RMN de C, de 138.2 y 129.6 ppm
37
para el producto natural en discusión, contra los valores de 131.4 y 131.2 ppm para el
derivado 4. Entonces, de acuerdo con los datos proporcionados de sus espectros de RMN
de 1H y 13
C y comparados con los de literatura, se concluye que el producto natural en
discusión corresponde con la estructura del espinasterol (4) (Itoh et al., 1981; Itoh et al.,
1980).

38
Figura 16.- Espectro de RMN de 1H del espinasterol
39
 estigmasterol ergosta-7,22-dien-3β-ol

Figura 17.- Ampliación de los espectros de RMN de 1H del estigmasterol y ergosta-7,22-

dien-3β-ol mostrando la diferencia de desplazamientos químicos del protón vinílico C=C-H

40
Figura 18.- Espectro de RMN de 13C del espinasterol
41
Figura 19.- Espectro DEPT del espinasterol
42
 6. CONCLUSIONES

El espécimen colectado como Pouteria hypoglauca fue idenficado como Pouteria glomerata
subsp glomerata. El extracto hexánico de las hojas de este árbol fue analizado
fitoquímicamente y aportó cuatro metabolitos secundarios conocidos como escualeno, los
derivados acetilados de β-lupeol y β-amirina además de espinasterol. Existe evidencia de
la efectividad de P. glomerata en el tratamiento de diabetes, debido a que de los
compuestos aislados, tres han sido evaluados y todos ellos tienes actividad
hipoglucemiante. Otras propiedades farmacológicas atribuidas a P. glomerata son:
antioxidante, antiinflamatoria, antitumoral, antimicrobiana y sedante.

43
 7. RECOMENDACIONES

 Continuar y profundizar en el estudio de las fracciones obtenidas del extracto de cloruro

de metileno, ya que el 90% de ellas formaron sólidos y podrían contener compuestos
interesantes.
 Analizar los extractos de corteza de Tzocohuite ya que en algunos estudios fitoquímicos
reportan que los compuestos que se encuentran en los extractos de las hojas también
se pueden aislar de la corteza y en ocasiones en mayor cantidad.
 Evaluar el efecto hipoglucemico del acetato de β-mirina y acetato de β-lupeol en ratas,
y así tener mayor conocimiento sobre el efecto de los extractos del árbol de Tzocohuite
sobre el control de la diabetes.

44
 8. LITERATURA CITADA

Adebajo A. C., M.D. Ayoola, S. A. Odediran, A. J. Aladesamni, T. J. Schmidt and E. J.

Verspohl (2013) Evaluation of ethnomedical claimIII: anti-hyperglycemic activities of
Gongronema latifolium root and stem. Journal of Diabetes 5:336–343.

Andrade-Cetto A. and M. Heinrich (2005) Mexican plants with hypoglycaemic effect used in
the treatment of diabetes. Journal of Ethnopharmacology 99(2005):325-348.

Aragão G.F, L.M.V. Carneiro, A.P.F. Junior, P.N. Bandeira, I.L.G. Lemos and G.S. dB. Viana
(2009) Evidence for excitatory and inhibitory amino acids participation in the
neuropharmacological activity of alpha- and beta- amyrin acetate. The Open
Pharmacol J 3:9-16.

Azurdia. C. (2006). Tres especies de zapote en América tropical. Southampton Centre for
Underutilised Crops, Universidad de Southampton, Southampton, UK. 216 p.

Cañigueral, S., E. Dellacassa y A. L. Bandoni (2003). Plantas Medicinales y Fitoterapia:

¿Indicadores de dependencia o factores de desarrollo? Acta Farm. Bonaerense
22(3): 265-278.

Carranza, G.E. (2005). Flora del Bajío y de regiones adyacentes: Sapotaceae. Instituto
Nacional de Ecología 132: 34 p.

Carballo, M. A., C. Cortada M. y A. Gadano B. (2005). Riesgos y Beneficios en el Consumo

de Plantas Medicinales. Theoria 14 (2): 95-108.

Chen Y. F., C. Ching, T.S. Wu, C. R. Wu, W. T. Hsieh and H.Y. Tsai (2012) Balanophora
spicata and Lupeol Acetate Possess Antinociceptive and anti-inflammatory activities
in vivo and in vitro. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2012
(371273): 10 pages.

45
De la Peña, V. G. y C. Illsley. (2010). Productos Forestales no maderables y legislación
ambiental: sobre-regulación y vacíos jurídicos. Una propuesta de agenda para la
promoción del aprovechamiento sustentable de los productos forestales no
maderables desde la perspectiva legal.
México.http://www.raises.org/documentacion/documentos/manejocampesino/ANor
pfnm.pdf

Espinosa, S. A. J. (1985). Plantas Medicinales de la Huasteca Hidalguense. (Tesis inédita

de licenciatura). Universidad Nacional Autónoma de México, México.

Esquivel, G. E.R., R. Noriega C., M. A. Bello G., A. Saavedra M. y R. Salgado G. (2012).

Plantas utilizadas en la medicina tradicional mexicana con propiedades
antidiabéticas y antihipertensivas. Biológicas 14(1): 45-52.

Fabiyi O.A., O. Atolani, O.S. Adeyemi and G.A. Olatunji (2012) Antioxidant and Citotoxity of
beta-Amyrin acetate fraction from Bridelia ferruginea Leaves. Asian Pacific Journal
of Tropical Biomedicine S982-S984.

Gallo M.B.C. and M.J. Sarachine (2009) Biological activities of lupeol. Int. J. Biomed
Pharma. Sci. 3:46-66.

García de Alba, G. J., Ramírez, H. B., Robles, A. G., Zañudo, H. J., Salcedo, R. A. y García
de Alba, V. J. (2012). Conocimiento y Uso de las Plantas Medicinales en la Zona
Metropolitana de Guadalajara. Desacatos, 39, 29-44.

García, L. C., B. E. Pérez H., A. Martínez R. y F. Castro B. (2009). Uso de plantas

medicinales y suplementos dietéticos para el control glucémico de la diabetes.
Revista Chapingo Serie Zonas Áridas 8: 229-239.

Gary, R. M., N. M. Wassef, M. Rao y C. R. Alving. (2000). Induction and detection of

antibodies to squealene. Journal of Immunological Methods: 1-14.

He H. P., Y. Cai, M. Sun, and H. Corke (2002) Extraction and Purification of Squalene from
Amaranthus grain. Journal of Agricultural food Chemistry 50: 368–372

46
Hernández A. M., J. P. Pablo G. y N. Reynoso N. (2013). Diabetes mellitus en México. El
estado de la epidemia. Salud Pública de México 55(2): s129-s136.

Higuchi C.T., M. Sannomiya, F.R. Pavan, S.R.A. Leite, D.N. Sato, S.G. Franzblau, L.V. S.
Sacramento, W. Vilegas, and C.Q.F. Leite (2008) Byrsonima fagifolia Niedenzu
Apolar Compounds with Antitubercular Activity. Evid Based Complement Alternat
Med 2011(128349): 5 pages.

Hossain M.H. and Z. Ismail (2013) Isolation and characterization of triterpenes from the
leaves of Orthosiphon stamineus. Arabian Journal of Chemistry 6: 295-298

Huang Z.R., Y. K. Lin and J.Y Fang (2009) Biological and pharmacological activities of
squalene and related compounds: Potencial uses in cosmetic dermatology.
Molecules 12(1): 540-554.

Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. (2008). Flora del Valle de
Tehuacan-Cuicatlan. Universidad Nacional Autónoma de México. 29 p.

Itoh T., Y. Kikuchi, T. Tamura and T. Matsumoto (1981). Co-occurrence of chondrillasterol

and spinasterol in two cucurbitaceae seeds as shown by 13C NMR. Phytochemistry,
20: 761-764

Itoh T., T. Tamura, T. M. Jeong, T. Tamura and T. Matsumoto (1980). 10α-Cucurbita-5,24-

dien-3β-ol from gourd seed oil. Lipids, 15: 122-123

Juárez, R. C. R., C. Aguilar J.A., R. Juárez M. E., M. Bugarin, R., L. Juárez, P. y C. Cruz
E. (2013). Hierbas Aromáticas y Medicinales en México; tradición e innovación. Bio
Ciencias, 2(3), 119-129.

Lakshmi V., A. A. Mahdi, M. K. Ahmad, S. K Agarwal and A. K. Srivastava (2014)

Antidiabetic Activity of Lupeol and Lupeol Esters in Streptozotocin- Induced Diabetic
Rats. Bangladesh Pharmaceutical Journal 17(2): 138-146.

Mawa S., K. Husain and I. Jantan (2013) Ficus carica L. (Moraceae): Phytochemistry,
Traditional Uses and Biological Activities. Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine, 2013 (974256): 8 pages.
47
Miranda, B. M. L., L. Huacuja R., A. L. López V. y A. Panduro C. (2005). Fitoterapia
molecular como parte de la medicina alternativa complementaria en las
enfermedades del hígado. Investigación en salud, publicación del Centro
Universitario de investigación en salud VII: 64-70.

Nasution R., M. Nur and H. Nur (2015) beta- Amyrin acetate of ethyl acetate extract of the
bark plant Artocarpus camansi and its antidiabetic activity. Der Pharma Chemica
7(6):71-78.

Ofitserov E.N. (2001) Amaranth: Perspective raw material for food processing and
pharmaceutical industry, Chemistry and Computational Simulation. Butlerov
Communications 2(5):1-4.

Okoye N.N., D.L. Ajaghaku, H.N. Okeke, E.E. Ilodigwe, C.S. Nworu and F.B.C. Okoye
(2014) beta-Amiryn and alpha-amyrin acetate isolated from the stem bark of Alstonia
boonei display profound anti-inflammatory activity. Pharm Biol 52 (11):1478-1486.

Pennington, T. D. (1990). Sapotaceae, Flora Neotropica. Monograph 52: 1-770.

Perez E., E. Dominguez, J.M. Ramiro, A. Romero, J. E. Campillo and M.D. Torres (1998) A
study on the glycaemic balance in streptozotocin-diabetic ratas treated with an
aqueous extract of Ficus carica (fig tree) leaves. Phytotherapy Research 10(1): 364-
366.

Popa O., N. E. Băbeanu, I. Popa, S. Nită and C. E. Dinu-Pârvu (2015) Methods for Obtaining
and Determination od Squalene from Natural Sources. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine 2015 (367202): 16 pages.

Reddy L.H and P. Couvreur (2009) Squalene: A natural triterpene for use in disease
management and therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 61:1412-1426.

Reynolds, W.F., S. McLean, J. Poplawski, R. G. Enriquez, L. I. Escobar, I. Leon (1986).

Total assignment of 13C and 1H spectra of three isomeric triterpenol derivatives by
2D NMR: an investigation of the potential utility of 1H chemical shifts in structural
investigations of complex natural products Tetrahedron, 42: 3419-3428

48
Saucedo, T. M. A., N. Bañuelos F., R. M. Cabrera P. y M. N. Ballesteros V. (2006). La
práctica de la medicina alternativa una realidad en el paciente diabético en
Hermosillo, Sonora, México. RESPYN 7(4) 12 paginas.

Silva C. A. M., L. A. Simeoni and D. Silveira (2008) Genus Pouteria: Chemistry and biological
activity. Brazilian Journal of Pharmacognosy 19(2A):501-509.

Standley, C. P. y L. O. Williams (1967). Flora de Guatemala: Serie Fiel DIANA; Botany

24(VIII):3. Fiel Museum of Natural History. USA.

Tapia, T. E. C. y R. Reyes C. (2008). Productos forestales no maderables en México:

aspectos económicos para el desarrollo sustentable. Madera y Bosques 14(3): 95-
112.

Villa, R. N., H. Pachecho Y., Z. Lara B.E., M. Franco J., B. Cardeña M. I., V. Galvan T. O y
G. Ruiz L.M. (2011). Biotecnología de Plantas Medicinales Generando Fármacos de
un Futuro Tornado Presente. Temas de Ciencia y Tecnología 15 (43): 13-20.

Villareal, M. L., T. Cardoso A., A. Ortiz y A. Sharma (2014). Biotecnología para Producir
Medicinas de Plantas Medicinales. Revista Digital Universitaria 15 (8): 1-14.

Widyawati T., N. A. Yudoff, M. Z. Asmawi and M. Ahmad (2015) Antihyperglycemic Effect

of Methanol Extract of Sysygium polyanthum (Wight.)Leaf in Streptozotocin-Induced
Diabetic Rats. Nutrients 7: 7764-7780.

49