Manual Practicas 2017

Jr.
Ro Chepen N 290, El Agustino

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Universidad Nacional Facultad de
Tecnologa Mdica
Escuela Profesional de Laboratorio y Anatoma

Patolgica
Manual de Prcticas de
Laboratorio
Inmunologa I
Profesores:
Lic. TM Mirtha Hernndez Acasiete

Lic. TM Alejandro Retamal Salazar
Lic. TM Arturo Rivas Crdenas
2017
Jr. Ro Chepen N 290, El Agustino
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Tecnologa Mdica
Contenido
1. Presentacin 03
2. Principios Generales de Bioseguridad 04
3. Prctica N 1 Generalidades tcnicas en Inmunologa 05
Bioseguridad
4. Prctica N 2 Identificacin de rganos linfoides 10
5. Prctica N 3 Fagocitosis 13
6. Prctica N 4 Obtencin de mononucleares a partir de sangre 15
Perifrica
7. Prctica N 5 Obtencin de linfocitos T de sangre perifrica 19
(Rosetas T)
8. Prctica N 6 Poder Bactericida del suero 24
9. Prctica N 7 Obtencin de Antgenos Bacterianos 27
10. Prctica N 8 Estandarizacin de Antgenos H y O 31
11. Prctica N 9 Inoculacin de Animales de laboratorio para 33
La obtencin de anticuerpos.
12. Prctica N 10 Diluciones 39
13. Prctica N 11 Reaccin serolgica de aglutinacin 44
14. Prctica N 12 Aglutinacin Indirecta 49
15. Prctica N 13 Sangra de Animales de Laboratorio 53
16. Prctica N 14 Sangra de Conejos inoculados en laboratorio
17. Prctica N 15 Prueba de Tuberculina 64
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PRESENTACION
En la actualidad una de las asignaturas destacadas y que llevan a un mayor

entendimiento de las enfermedades del hombre y los animales es la
Inmunologa, ya que al adquirir conocimientos de procesos inflamatorios y
las clulas que participan en la respuesta inmune de un organismo vivo, la
realizacin de llevar a cabo las practicas es para que el alumno relacione la
teora, y sea mayor la comprensin del curso
El medio ambiente contiene una gran variedad de microorganismos

infecciosos que pueden causar infeccin si estos se adhieren y se
multiplican en los tejidos hasta llegar a causar enfermedad y o muerte del
hospedador. Las infecciones son de curso variable y pueden
ocasionalmente causar dao al sistema inmune.
Este manual describe las prcticas de laboratorio y pretende ser una gua
para que el estudiante comprenda el papel de estas reacciones in vitro e in
vivo de los agentes de inters en la salud humana y en algunos casos
aplicables a la vigilancia epidemiolgica.
La formacin de un estudiante, se complementa con los conocimientos

tericos y prcticos, siendo stos ltimos, los que afirman lo adquirido en el
seno de las aulas; de esta forma, se busca la formacin integral del estudiante
de Tecnologa Mdica, mediante una serie de prcticas que refuerzan sus
conocimientos. Dando como resultado que el alumno tenga el conocimiento
necesario, para desarrollar actividades de competencia en el campo laboral
de su rea profesional de Tecnologa Mdica
A travs el complemento del conocimiento, es necesario considerar los

aspectos visuales e intuitivos que estimulan al estudiante en su capacidad
inherente de creatividad, discernimiento, construccin, reconstruccin,
organizacin interna y externa de lo aprendido, considerando as mismo, las
limitaciones de cada uno.
En la elaboracin de este Manual, se busca mantener la coherencia con el

modelo educativo vigente, motivando al estudiante a la reflexin de su proceso
de desarrollo y formacin futura, coadyuvando as a la formacin de un
profesional crtico, comprometido con los cambios, reelaborando sus valores
y creencias, respetando a los dems y preservando el medio en el que vive.
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Tecnologa
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NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD
1.- Antes de realizar cada prctica leer cuidadosamente el protocolo de la

prctica para familiarizarse con el trabajo que va a desarrollar. El conocer el
protocolo disminuye la posibilidad de que ocurran accidentes y adems puede
aprovechar el tiempo de manera eficaz.
2.- No comer, beber, fumar y distraer al Profesor a la hora de la prctica y se

prohbe el acceso a toda persona ajena al laboratorio
.
3.- Llevar el equipo de proteccin personal necesario: Mandil, guantes,
anteojos, gorros. Esto garantiza que cualquier accidente que pueda ocurrir
sea de menor gravedad. De no acatar las reglas no se permitir acceso a la
prctica.
4.- Material: Aportado por el alumno: Debe llevar aquellos materiales

estrictamente necesarios para la prctica que va a desarrollar.
Aportado por la Institucin: Ser solicitado con tiempo suficiente antes de la
prctica y ser entregado al delegado
Ser cuidadoso con todo el material y equipo que utilice para evitar
accidentes y deterioro del mismo en las prcticas.
5.- Limpieza: Dentro del rea que se va a trabajar se comienza

limpiando el rea de trabajo y se repite este procedimiento despus de
que se haya terminado. Se recomienda el empleo de campos
descartables
El material de desecho depositarlo en el lugar que corresponde y
el material reutilizable lavarlo y desinfectarlo adecuadamente
6. Higiene: Durante la sesin de trabajo lavarse las manos con agua y

jabn antes de hacer cualquier procedimiento y al finalizar repita el
mismo procedimiento para mantener buenas condiciones higinicas.
7. Solventes: Si trabaja con sustancias, evite inhalarlo.
8. Desechos: Si utiliza guantes, frascos de medicamentos vacos, jeringas,

mascarillas, portaobjetos, cubreobjetos, etc., no reciclar y desecharlos.
9. Responsabilidades: En caso de accidente o lesin, avisar

inmediatamente al Profesor (a) responsable de la prctica
10.- En caso de errores o dudas preguntar inmediatamente al profesor (a)

Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades (Centers for Disease
Control and Prevention, CDC) y los Institutos Nacionales de Salud (National
Institutes of Health) abordaron el tema en su publicacin Bioseguridad en
laboratorios microbiolgicos y biomdicos (Biosafety in Microbiological and

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PRACTICA N 1
. Generalidades tcnicas en inmunologa. Principios de
Bioseguridad
Objetivo General
En esta prctica el estudiante aprender las normas de bioseguridad
aplicadas al laboratorio de inmunologa.
Objetivos Especficos
Que el estudiante:
- Se familiarice las normas de bioseguridad en el laboratorio de inmunologa
- Conozca la importancia de los riesgos biolgicos del manejo de material
infeccioso
- Aplique sus conocimientos en la resolucin de casos de accidente
ocupacional con material infeccioso
INTRODUCCION
El profesional del laboratorio de anlisis clnicos, est siempre expuesto a la
posibilidad de infectarse con muestras de patgenos altamente infecciosos. Las
medidas de bioseguridad que deben tomarse en cuenta en la prctica laboral ya
fueron establecidas por organismos nacionales e internacionales y deben ser
seguidas a plenitud. A pesar de ello, y por falta de conocimiento del riesgo en el
manejo del material contaminado, del tipo de muestra que se procesa o de las
medidas de bioseguridad que se deben seguir, as como la falta de un equipo de
proteccin adecuada, condiciones laborales inhspitas y un incorrecto desecho del
material infeccioso, se presentan accidentes de trabajo.
El concepto de cultura de seguridad, alienta a todos los laboratorios de

diagnstico para humanos y animales a promover una cultura organizativa de
evaluacin sistemtica de todos los procesos y procedimientos laborales, a fin de
identificar los riesgos asociados e implementar planes para mitigar esos riesgos.
Adems del riesgo de peligro biolgico, que a menudo se desconoce, asociado con
la manipulacin de muestras para diagnstico, cada seccin del laboratorio de
diagnstico tiene procedimientos y procesos para manipular agentes infecciosos
conocidos que implican un riesgo excesivo de exposicin y de una posible
infeccin y/o lesin ocupacional. Esos riesgos normalmente estn asociados con
defectos de diseo o con la falta de procedimientos de seguridad y capacitacin, o
con que estos no son adecuados.
La prevencin de las lesiones e infecciones ocupacionales es un asunto que ha
interesado a los responsables de los laboratorios durante muchos aos. Los
Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades (Centers for Disease
Control and Prevention, CDC) y los Institutos Nacionales de Salud (National
Institutes of Health) abordaron el tema en su publicacin Bioseguridad en
laboratorios microbiolgicos y biomdicos (Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories), que actualmente est en su 5. edicin (BMBL-5). No
obstante, el objetivo de BMBL-5 no era abordar las operaciones cotidianas de los
laboratorios de diagnstico en medicina humana y animal. En 2008, los CDC
convocaron a un panel de especialistas integrado por representantes de laboratorios
de diversos organismos, organizaciones de laboratorios y centros para revisar la
bioseguridad del laboratorio en los

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laboratorios de diagnstico. Los integrantes de este panel recomendaron que se

elaboraran pautas de bioseguridad para abordar las necesidades operativas
especficas de la comunidad de los laboratorios de diagnstico, y que estas
tuvieran una base cientfica y se difundieran ampliamente. Estas pautas
promueven una cultura de seguridad e incluyen recomendaciones que
complementan la publicacin BMBL-5, al abordar las necesidades especficas del
laboratorio de diagnstico. No son requisitos, sino recomendaciones que
representan el conocimiento cientfico actual y el buen juicio que pueden fomentar
un ambiente de trabajo seguro para todo el personal de laboratorios.
Bioseguridad
La bioseguridad se define como un conjunto de medidas encaminadas a proteger a
los trabajadores y los pacientes de la exposicin a riesgos biolgicos en el
laboratorio, as como tambin la proteccin del ambiente- Algunos de los pilares
fundamentales de la bioseguridad que deben considerarse en la aplicacin de los
procedimientos asociados a este tema son:
Universalidad
Las medidas de bioseguridad son aplicables a todo el personal del laboratorio y
durante todos los procesos que en l se desarrollan.
Uso de barreras
Permite evitar la exposicin directa a los fluidos biolgicos o sustancias qumicas
peligrosas.
Manejo y disposicin del material contaminado
En el trabajo de todo laboratorio, es imprescindible conocer y respetar las

prcticas bsicas de bioseguridad con el fin de resguardar la seguridad del
personal:
No est permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse
o aplicarse cremas en las reas de trabajo.
No guardar alimentos o bebidas en refrigeradores destinados al almacenamiento
de muestras o reactivos.
No pipetear con la boca.
Si usa lentes de contacto extremar la proteccin de la mucosa ocular.
El cabello largo debe estar recogido.
Las propiedades personales deben ser guardadas y aseguradas en casilleros
provistos fuera del rea tcnica de trabajo.
La Higiene de manos es una prctica fundamental en el laboratorio y puede ser
realizada de dos formas, lavado de manos con agua y jabn o uso de soluciones
de alcohol. El uso de esta ltima opcin es efectivo y rpido, pero requiere que las
manos no se encuentren visiblemente sucias.
Dado que el lavado de manos es una prctica fundamental es muy importante
conocer en qu momento se debe realizar:
Cada vez que se contaminen con cualquier fluido biolgico.
Cada vez que se retiran los guantes de procedimiento.
Cada vez que se retire de su rea de trabajo y/o sale del laboratorio
Antes de comer
Despus de ir al bao
Tcnica de lavado de manos: La duracin mnima recomendada para el lavado
de manos con agua y jabn es de 40-60 segundos, e incluye los siguientes
pasos:
Abrir la llave de agua.
Mojar las manos y muecas.
Aplicar suficiente y moderada cantidad de jabn lquido.

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Frotar vigorosamente ambas manos, los espacios interdigitales,

subungueales, dedos y muecas.
Enjuagar con abundante agua.
Secar sus manos con papel absorbente desechable.
Con el mismo papel, cerrar la llave y eliminar en basurero de uso comn.
Prcticas
Los procedimientos deben realizarse con cuidado para no producir salpicaduras
o aerosoles y preferir la utilizacin de dispositivos que prevengan su generacin,
tales como uso de tubos con tapas de rosca y sistemas automatizados y
semiautomatizados para destapar tubos.
Los procedimientos con grandes posibilidades de producir aerosoles de agentes
que se pueden transmitir por inhalacin deben llevarse a cabo en cabinas de
bioseguridad o utilizando equipos de contencin fsica como centrfuga con capachos
de bioseguridad.
Para extraer soluciones debe utilizarse dispositivos pipeteadores mecnicos o
automticos.
Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas con un desinfectante
efectivo.
Los equipos deben descontaminarse y embalarse de acuerdo a normativas
locales antes de enviarlos a reparacin o mantenimiento.
Respecto a las prcticas relacionadas con manejo de cortopunzantes:
El uso de elementos corto-punzantes debe restringirse a aquellos casos donde no
existe otra alternativa. Se recomienda usar materiales de plstico.
Para las inyecciones o aspiracin de materiales infecciosos, deben utilizarse
solamente jeringas y aguja descartables. Al momento de descartarlas, deben
colocarse en recipientes resistentes a punciones.
Cuando sea conveniente, usar jeringas que re-enfundan las agujas, sistemas sin
agujas
y otros dispositivos seguros.
Los artculos de vidrio rotos no deben manipularse directamente con las manos.
En caso de derrames o accidentes con exposicin a material infeccioso, debe
avisarse inmediatamente a la jefatura del laboratorio y realizarse la evaluacin,
control y tratamiento mdico si corresponde. En todos los casos debe
guardarse registro de estos eventos.
Los desechos del laboratorio contaminados deben ser descontaminados previo a
su eliminacin. En el caso que la descontaminacin se realice en un lugar externo,
el residuo debe ser transportado desde el laboratorio en recipiente hermticamente
cerrado.
Elementos de Proteccin Personal (EPP)

Los equipos o elementos de proteccin personal (EPP) son cualquier dispositivo,
accesorio o vestimenta llevados o sujetados por el trabajador con el propsito de
protegerlo de uno o riesgos que puedan amenazar su seguridad o su salud
Destacan: mandiles, mascarillas, anteojos, gorros y guantes
Medidas de contencin primaria:

Corresponden a las buenas prcticas de trabajo y el uso adecuado de los equipos
de proteccin (elementos de proteccin personal y equipos de contencin) y
buscan proteger al personal y el ambiente del laboratorio. Con relacin a los
elementos de proteccin personal, es importante tener en cuenta:
Se deben utilizar elementos de proteccin personal de acuerdo a los riesgos
identificados para cada actividad.
Es necesario el uso de guantes cuando exista la posibilidad que las manos entren en
contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados. Debe
utilizarse guantes

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desechables y no deben ser reutilizados. Es necesario el lavado de manos luego

de su retiro.
En caso de riesgo de salpicadura se debe utilizar proteccin facial
(mascarilla y lentes protectores), guantes y mandil antifluidos
Se recomienda el uso de mandil cerrado adelante,de manga larga para el trabajo
en reas tcnicas, sin embargo, la proteccin es mayor cuando son de abertura
trasera y puo ajustado Esta ropa se debe retirar y dejar en el laboratorio antes de
dirigirse a otras reas.
Se recomienda utilizar ropa desechable y antifluidos
Organizacin de la mesa de trabajo

La superficie de las mesas de trabajo debe ser de material resistente
especialmente en relacin a los productos utilizados en forma habitual para su
desinfeccin. Adems debe ser impermeable, no poroso y sin discontinuidades que
dificulten su limpieza.
Desde el punto de vista de la utilizacin de las mesas, stos debern estar
organizados de tal manera que se disponga solo de los reactivos y materiales
necesarios para el trabajo o actividad que se va a realizar, sin adornos naturales ni
artificiales.
Limpieza y desinfeccin de mesas de trabajo

En forma particular, la limpieza y desinfeccin de las mesas son responsabilidad de
los estudiantes, dependiendo de la cantidad de residuos que resulten y debe
hacerse al inicio y trmino de la jornada de trabajo. Para las mesas se recomienda
el uso de hipoclorito de sodio en concentraciones de 0.5%; si el material en
cambio, es liso y de fcil limpieza, puede descontaminarse con concentraciones
ms bajas de hipoclorito. El uso de alcohol al 70% en superficies ha demostrado
tener menor eficacia debido a su rpida evaporacin.
MANEJO DE RESIDUOS DE LABORATORIO

La disposicin adecuada de residuos es esencial para controlar y minimizar los
riesgos desde los lugares de generacin, favoreciendo el cuidado de la salud y
seguridad de los trabajadores y de la comunidad circundante. Es necesario que el
laboratorio disponga de procedimientos documentados que describan las
actividades relacionadas con su manejo, incluyendo la segregacin, el
almacenamiento, el transporte y la eliminacin, en concordancia con las
disposiciones locales y cumpliendo con la reglamentacin vigente
El uso de bolsas de distinto color establece la naturaleza del contenido de las

mismas, por consiguiente se debe descartar los materiales en bolsas de color
adecuado de acuerdo a las convenciones de identificacin de riesgo a saber:
Bolsas negras: residuos de tipo no infeccioso o riesgoso
Bolsas rojas: residuos patognicos
Bolsas amarillas: residuos especiales
Bolsas negras: Contiene residuos producidos en dependencias

administrativas, reas sin restriccin, depsitos, talleres y sitios de actividades
auxiliares y generales, que no representan peligro para la salud, propios de la
actividad cotidiana (envases descartables plsticos, papeles, etc.), sin embargo
al proceder de una institucin pblica se debe evitar o minimizar el contacto de
los mismos con terceros que los manipulen.
Bolsas rojas; Contiene residuos peligrosos para la salud humana tales como:
Materiales provenientes de actividad asistencial: Algodn, gasas, vendas,
guantes, tela adhesiva, apsitos, compresas, campos descartables,
provenientes de intervenciones

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quirrgicas menores (curaciones, por ejemplo), pipetas para nebulizaciones,

envases de vacunas a virus vivos atenuados (BCG, Sabin, triple viral, varicela),
espculos, hisopos, esptulas y todo material descartable utilizado en curaciones o
intervenciones quirrgicas menores, jeringas descartables.
Bolsas amarillas: Se utilizaran solamente para el descarte de residuos especiales

que por sus caractersticas -corrosividad, explosividad, inflamabilidad, toxicidad,
radioactividad,
reactividad - constituyen un peligro para la salud, aun sin haber sido usados.
El riesgo y los niveles de Bioseguridad.

El Riesgo Biolgico es aquel susceptible de ser producido por una exposicin no
controlada a
Agentes Biolgicos. Se entiende por agente biolgico microorganismos, incluidos
los modificados genticamente, los cultivos celulares y los endoparsitos humanos,
que pueden provocar cualquier tipo de infeccin, alergia o toxicidad (Directiva
europea n 90/679).
Animales de laboratorio.
El riesgo de infeccin por animales de laboratorio se produce por manipulacin
inadecuada de jaulas que los contienen, inhalacin de polvo contaminado con el
desecho de los animales, pelos o plumas, mordeduras, rasguos o auto
inoculacin involuntaria durante la manipulacin de ellos.
Entre los agentes Biopeligrosos se encuentran: ciertas bacterias, hongos,

virus,rickettsias, chlamidias, parsitos, productos recombinantes, alrgenos,
cultivos de clulas humanas y animales y los agentes infecciosos potenciales que
contengan estas clulas,viroides, priones y otros agentes infecciosos.
El riesgo concierne a aquel que trabaja directamente con estos agentes
biopeligrosos, a aquellos que trabajan en el mismo lugar fsico y tambin a todos
aquellos que estando fuera del lugar podran estar conscientemente o
inconscientemente en contacto con los desechos producidos por este trabajo de
laboratorio. De ah entonces que es necesario tener claridad sobre las diferentes
situaciones de riesgo, as como sobre los niveles de Bioseguridad que permitan
proteger internamente y externamente al Hombre de estas contingencias la
asignacin de un nivel de Bioseguridad deber tener en consideracin el agente
biolgico utilizado, las instalaciones disponibles y el equipo; y las prcticas y los
procedimientos necesarios para trabajar con seguridad en el laboratorio.
ninguna norma, ningn procedimiento por si solos garantizan la seguridad, a menos

que el equipo humano del laboratorio asuma su responsabilidad
consigo mismo
y con los dems miembros del grupo y de la
comunidad.
Referencias
1. Laboratory Biosafety Guidelines. 2004. 3rd edition. Published by the
authority of the Minister of Health Population and Public Health Branch,
Centre for Emergency Preparedness and Response, Government of
Canada. Pp. 19-23.
Universidad de Alicante,
2. http://www.ua.es/va/centros/facu.ciencies/seguridad/seguridad/hab_seg_lab
_biol.htm#B
.

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PRACTICA N 2
IDENTIFICACIN DE TEJIDOS DEL SISTEMA INMUNITARIO :

RGANOS LINFOIDES
Competencia: Identificar en el ratn los rganos linfoides o tejidos del sistema

inmunitario en los que los linfocitos T y B maduran y se hacen competentes para
responder a los antgenos y los rganos linfticos perifricos en los que se inicia
las respuestas inmunitarias adaptativas frente a los microbios.
MATERIALES
Ratones
jvenes
Equipo de
diseccin
Tabla de
diseccin
Hilos ,
alfileres
Laminas
porta-objetos
Laminillas
cubre-
objetos.
Suero Fisiolgico o Solucin salina al 0.85%
o 0,9 % Azul de Tripn
Colorante Wright.
INTRODUCCION
Nuestro entorno contiene una enorme variedad de agentes infecciosos virus, hongos,
protozoos y parsitos pluricelulares). Todos ellos pueden provocar enfermedades y
si , se multiplican sin control, pueden conducir a la muerte del organismo husped .
La mayora de las infecciones que contraen los individuos normales son de corta
duracin y apenas dejan secuelas. Esto se debe a la accin del Sistema Inmunitario,
que combate dichos agentes infecciosos.
ste sistema inmunitario o de respuesta a la agresin est constituido por una
serie de rganos y stos conformados por una serie de clulas especializadas en
sta funcin; dentro de ellas tenemos los LINFOCITOS. La participacin de estas
clulas es esencial en todas las respuestas inmunitarias adaptativas.
Los linfocitos se dividen en tres grandes grupos: Los linfocitos T (Cooperadores,
Citotxicos, reguladores) los linfocitos B y los linfocitos NK (citolticos naturales).
Los linfocitos T se desarrollan a partir de sus precursores en el Timo. Los linfocitos
B se diferencian en el Hgado Fetal y en la Mdula sea en los adultos. Los linfocitos
NK corresponden a la tercera poblacin de linfocitos y se denominan clulas
asesinas naturales, proceden de precursores linfoides de la mdula sea.
Los rganos en los que se diferencian los linfocitos se denominan ORGANOS
LINFOIDES, compuestos por:
1.- UN COMPONENTE CENTRAL: Implicado en la diferenciacin de las clulas
madre a linfocitos capaces de reaccionar con el antgeno. Consta de:
a) Mdula sea.
b) El Timo.
c) Componente nico en las aves Bolsa de Fabricio , en los mamferos

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Se conoce como Tejido equivalente de la Bolsa de Fabricio.

2.- UN COMPONENTE PERIFERICO : En el que estas clulas reaccionan con el
antgeno y luego prosiguen su diferenciacin y proliferacin. Esta etapa es
antgeno dependiente. Consta de:
a) Ganglios Linfticos
b) Bazo.
c) Tejido Linftico Asociado al Intestino (Placas de Peyer, Apndice).
Dada la importancia de estas clulas en el sistema inmunitario es conveniente que
los alumnos del curso de Inmunologa Bsica aprendan a identificar stos rganos.
En sta prctica se identificar los rganos linfoides en el ratn y luego se har
suspensiones celulares de cada uno de los rganos identificados.
IDENTIFICACIN DE LOS RGANOS LINFOIDES EN EL RATON
PROCEDIMIENTO
1).- Matar al ratn (Por dislocacin cervical o por el uso de un

algodn con ter) 2).- Fijar el ratn con alfileres o hilo en la tabla de
diseccin.
3).- Abrir la regin ventral y ubicar los
rganos linfoides: Timo
Bazo
Ganglios axilares
Inguinales
Mesentricos
Placas de Peyer ( adheridas al intestino )
PREPARACION DE SUSPENSIONES DE LINFOCITOS DE LOS ORGANOS

OBTENIDOS
Una buena suspensin de linfocitos es aquella en la cual ms del 90% de clulas
son viables. Para comprobar la viabilidad celular usaremos el azul de Tripn (Las
clulas vivas excluyen el colorante, solamente las clulas muertas se tien
intensamente con l)
PROCEDIMIENTO
1.- Extirpar cualquiera de los rganos ya mencionados con ayuda de las tijeras y
pinzas de diseccin.
2.- Limpiar los rganos de las adherencias grasas con papel de filtro, cuidando
mantener el tejido humedecido con Solucin Salina 0.85 %

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3.- Depositar el rgano escogido en un ( mortero, placa de Petri o un tubo de

prueba ) , agregar 0.5 ml de Solucin Salina 0.85% o mas y presionar
suavemente (si no se usa mortero que tiene su mango especial , puede usarse
una bagueta de vidrio con extremos romos).
Otra manera de obtener clulas es cortando el rgano en trocitos pequeos

para facilitar la salida de las clulas.
4.- Colocar una gota de la suspensin en una lmina porta-objetos y aadir una
gota de colorante azul de Tripn al 1%, mezclar y cubrir con una laminilla cubre-
objetos.
5.- Observar al microscopio ptico, usando el objetivo de 10x para el enfoque y

objetivo de 40x para identificar los linfocitos.
6.- Puede realizarse una impronta del tejido del rgano obtenido y colorear con
colorante Wright.
DISTRIBUCIN DE LOS RGANOS LINFOIDES Y GANGLIOS LINFTICOS

EN EL RATN
DIAGRAMA DE INCISION SUBCUTANEA
BAZ
AXILAR
AXILAR LATERAL
HIGADO
INTESTINA ESTOMAGO
L
NOTAS: RION
No permitas que se sequen los tejidos, mantelos siempre sumergidos en
laINGUINALsolucinSUPERFICIAL salina.
MESENTERICO
Cuando obtengas todos los rganos a investigar elimina el resto del
animal de
inmediato al bolso de eliminacin. POPLITEA
CUESTIONARIO
1.- Qu rganos linfoides primarios obtuviste?
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
--
2.- Por que para lavar los rganos usamos Solucin Salina y no Agua destilada?
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
--
3.- Cul es el objetivo de colorear las clulas con Wrigth?

PRACTICA N 3

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FAGOCITOSIS
Objetivo: Estudio de la funcin principal del macrfago en la respuesta inmune

innata y respuesta inmune adaptativa, como fagocito y como clula presentadora
de antgeno
Competencia: Apreciar in vitro el fenmeno de fagocitosis, despus de enfrentar

clulas de la serie leucocitaria con una emulsin de levaduras tipo Cndida albicans;
para luego observar el fenmeno haciendo uso de coloraciones como Rojo de
Congo y Wright.
MATERIALES
o Centrfuga
o Estufa o Bao
Mara a 37C o
Microscopio ptico
o Laminas
portaobjetos o
Laminillas
cubreobjetos o
Pipetas de
Pasteur
o Tubos de prueba de 12x75 ( Por lo menos 3 por mesa
de trabajo) o Cepa de Cndida albicans
o Muestra de sangre perifrica fresca
(anticoagulada) o Solucin calina
fisiolgica estril.
o Colorante rojo de
Congo 1% o
Colorante de
WRIGHT
Introduccin
La inmunidad Innata se caracteriza por desarrollar una respuesta rpida y efectora

por medio de molculas y clulas que limitan la multiplicacin de los rganos
invasores. El reconocimiento y destruccin de los microorganismos involucran
factores humorales, dentro de los cuales estn el sistema de complemento, las
citoquinas y los anticuerpos; as mismo actan clulas como los fagocitos, linfocitos
y clulas asesinas naturales, entre otras.
La fagocitosis es un mecanismo bsico de defensa presente en la mayora de las
especies. En los mamferos esta a cargo de clulas especializadas, principalmente
los polimorfonucleares (PMN) y los macrfagos.
Los PMN son clulas
sanguneas circulantes que se
ponen en contacto con el
material
a fagocitar a travs de la respuesta
inflamatoria. Los macrfagos
provienen de los monocitos circulantes
o bien estn distribuidos en los tejidos.
La fagocitosis es el proceso por el cual
las
clulas especializadas buscan, localizan,
identifican e introducen a su citoplasma
partculas o grmenes extraos. Los
fagocitos poseen receptores
para el componente C3b del sistema del
complemento as como para la regin
constante de la molcula
de inmunoglobulina, lo que permite que los microorganismos opsonizados puedan
adherirse a la superficie de estas clulas, facilitando la fagocitosis.

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PROCEDIMIENTO
1.- Tomar la cepa de cndida albicans y hacer una emulsin de ella

consiguiendo una concentracin aproximada de 1 x 106
2.- Colocar en un tubo 1 ml de sangre y agregar 0.5 ml de la
emulsin de Cndida albicans.
3.- Incubar en estufa o bao Mara por media
hora a 37C. 4.- Centrifugar a 3,500 r.p.m. por
5 minutos.
5.- Tomar la capa de leucocitos de la sangre centrifugada, colocar 2
gotas en un Tuboy agregar una gota de colorante rojo de Congo al
1% e incubar a 37 C
Por 15 minutos.
6.- Tomar una gota de la capa leucocitaria y realizar un frotis,
secar y luego Colorear con Wright.
*Despus de haber incubado lo referente al paso 5 , tomar una gota
y colocarla entre lmina y laminilla para ser observada al
microscopio ptico.
INTERPRETACIN
Observaremos la presencia intracelular en los PMN y MONOCITOS de

las levaduras indicndonos por consiguiente la accin fagoctica de
stos.
Proceso conseguido in vitro con cierta semejanza a la que se realiza in vivo.
NOTAS:
Usa sangre fresca (tomada el dia que proceses la prueba)
Ten cuidado al obtener la capa leucocitaria, aspirala con la pipeta de
Pasteur, en este grupo de clulas es donde observaras el fenmeno de
fagocitosis.
Los colorantes deben ser filtrados antes de su uso.
CUESTIONARIO
1.- En que clulas observaste el fenmeno de fagocitosis?
---------------------------------------------------------------------------------------------------------
2.- Que diferencia hay en el observar el fenmeno de fagocitosis en la
coloracin de Rojo de Congo y la de Wright?
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES
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Nosotros en la prctica realizaremos la tcnica de separacin por gradientes de
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PRACTICA N4

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OBTENCIN DE CELULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE

PERIFERICA
En el anlisis del sistema inmune es necesario evaluar las clulas que se desarrollan
y activan en forma especfica o inespecfica, en cada tipo de respuesta. De all el
inters por separar las clulas y evaluarlas en forma diferenciada.
En muchos de los experimentos in vivo e in vitro que llevan a cabo los inmunlogos
son precisas poblaciones linfocitarias puras. Las principales fuentes de linfocitos de
animales de experimentacin son el timo, el bazo y los ganglios linfticos
perifricos. En los estudios llevados a cabo en seres humanos la fuente de
linfocitos ms cmoda es la sangre perifrica, pero tambin se pueden obtener
clulas del bazo, las amgdalas o los ganglios linfticos mediante procedimientos
quirrgicos. Hay que tener en cuenta que las poblaciones celulares obtenidas a partir
de cada una de estas zonas es diferente de las dems en lo que respecta a la
madurez de los linfocitos y a la proporcin relativa de los diversos tipos de
clulas que contiene.
La inmunologa dispone de varios mtodos para la separacin rpida de poblaciones
linfocitarias, dentro de ellas contamos con la separacin en gradientes de densidad,
la formacin de rosetas, la separacin celular por medio de partculas magnticas,
Identificacin de linfocitos por Inmunofluorescencia y la identificacin por Citometra

de flujo.
densidad, la cual se basa en que los linfocitos son menos densos que los
eritrocitos y los granulocitos, y se utiliza para separar conjuntamente todos los
linfocitos sanguneos.
MATERIALES:
1.- Microscopio ptico

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2.- Tubos de vidrio ( 13x100

12x75 ). 3.- Gradillas para
tubos.
4.- Pipetas Pasteur.
5.- Cmara de Neubauer.
6.- Centrfuga.
7.- Laminas porta-objetos y laminillas cubre-objetos.
REACTIVOS:
1.- Solucin de Ficoll Hipaque
Ficoll 400 ............................................. 9 grs.
Agua destilada .............................................. 115.0 ml
Hipaque al 50% ..................................... 30 ml.
2.- PBS: Solucin salina amortiguadora con fosfatos.

Cloruro de Sodio .................................... 17 grs.
Fosfato dibsico de sodio (7 H2O ) ............ 2.35 grs.
Fosfato monobsico de sodio ..................... 0.45 grs.
Agua destilada c.s.p. ........................... 2.0 litros.
Ajustar pH a 7.4 con HCl 6 N.
3.- Azul de Tripn al 1% ( acuoso ).
4.- PBS Glicerol.

PBS..................................................... 1.0 ml
Glicerol ..................................................... 7.0 ml
OBTENCIN DE MUESTRAS PARA ESTUDIO
SANGRE PERIFERICA:
1.- Por venipuntura, extraer la sangre en una jeringa que contenga heparina a
concentracin de 10 U.I. por ml, mantener en agitacin lenta a temperatura ambiente.
No dejar transcurrir ms de 4 horas antes de procesar la muestra.
2.- Otra forma es obteniendo por venipuntura sangre venosa en un tubo con EDTA,
mezclar y puede ser conservada a temperatura ambiente hasta por 48 horas.
MEDULA SEA:

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Por puncin medular o de cresta iliaca, extraer 2 5 ml de mdula sea en una

jeringa que contenga 10 ml de PBS y 150 UI de heparina. Esta dilucin es
indispensable para obtener una adecuada separacin de clulas mononucleares.
Las muestras de mdula que no son diludas en el momento de su obtencin
deben rechazarse. La agitacin y tratamiento hasta el procesamiento es igual que
para sangre perifrica.
OBTENCIN A PARTIR DE GANGLIO:

a) Se coloca el ganglio en un mortero, se cubre con PBS y se punza con
una aguja; sta accin facilitar la salida de las clulas. A partir de
esta emulsin se obtendrn las clulas a investigar.
b) Otra forma es colocar el ganglio en un mortero y presionarlo con el piln
y a la vez se va agregando PBS, formndose as un machacado
de donde se obtendrn las clulas a investigar.
METODO:
1) Dilur la muestra de sangre perifrica heparinizada o con EDTA
1:2 (2 ml de sangre + 2 ml de PBS ). Las muestras de mdula
sea ya diludas no deben diluirse nuevamente.
2) En un tubo sobre un volumen de 2 ml de ficoll-hipaque,

depositar cuidadosamente en zona la muestra diluda. La
mezcla se evita si la muestra se desliza por la pared del tubo
en tanto ste se mantiene inclinado.
3) Centrifugar a 1000 3000 r.p.m. durante 20 30 minutos en

centrfuga refrigerada o a medio ambiente.
4) Separar de la interfase formada la capa de linfocitos con una

pipeta de Pasteur.
5) Lavar las clulas mononucleares dos veces con PBS,

centrifugando a 3,000 r.p.m. durante 10 minutos cada vez.
6) Contar en cmara de Neubauer o en contador electrnico y
ajustar en PBS la densidad requerida ( Un milln de clulas
por c.c.)
7) Podemos realizar comprobacin de viabilidad celular,

colocando una gota de azul de Tripn al 1% + 1 gota de
clulas en una lamina porta-objetos, cubrirla con una laminilla
cubre-objetos y observar al microscopio. Las clulas muertas
se vern de color azul y las vivas o viables se vern refringentes.
Una buena obtencin de mononucleares debe presentar
menos del 5% de clulas muertas

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ESQUEMADELAGRADIENTEDEDENSIDAD
INTERPRETACIN
Observaremos como los componentes de la muestra se ubicaran a diferentes

niveles dentro del tubo segn su propia densidad.
La capa de mononucleares obtenida es bastante pura y contiene linfocitos y
monocitos, los que se pueden distinguir por su morfologa, antgenos de
superficie, capacidad fagoctica, actividad enzimtica, adherencia.
NOTAS:
La separacin por gradiente de densidad fue una de las primeras
metodologas utilizadas para este fin.
Esta metodologa tiene la particularidad que adems de separar grupos
celulares, permite mantener una buena viabilidad celular para realizar otros
anlisis.
No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir
por las paredes del tubo y de inmediato debe ser centrifugada.
CUESTIONARIO
1.- En que consiste la separacin celular por medio de partculas magnticas?
...
..
2.- Qu es el Ficoll?
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3.- Qu es el Hipaque?
CONCLUSIONES
No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir
por las paredes del tubo y de inmediato debe ser centrifugada.

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PRACTICA N 5
OBTENCIN DE LINFOCITOS T DE SANGRE

PERIFERICA
(ROSETAS E)
La era de la inmunologa celular moderna comenz, esencialmente, con el

descubrimiento de que los linfocitos estn divididos en dos poblaciones principales
funcionalmente distintas.
Los trminos linfocitos T y linfocitos B por lo general, denotan las entidades
funcionales de las dos clases principales de clulas inmuno-competentes de la
sangre perifrica.
Los anlisis para las clulas T y B se hallan actualmente en amplio uso en la
inmunologa clnica. La cuenta precisa de las clulas T y de las clulas B en la
7.-Resuspender
sangre perifrica cuidadosamente el botn
del humano ha logrado de clulas con
contribuciones la ayuda para
importantes de una pipeta
entender:
Pasteur,
1) Los colocar 20 microlitros
padecimientos por entre porta y cubre objetos
inmunodeficiencia, 2) Las y leer en un microscopio
enfermedades auto-
la formacin de
inmunitarias, 3) rosetas.
La inmunidad tumoral y 4) La inmunidad de las enfermedades
infecciosas. Sin embargo debe hacerse hincapi en que la simple cuenta de las
clulas T B roseta
Se considera no proporciona informacin
a un mononuclear especfica
unido a ms deen dos
relacin con ladecapacidad
eritrocitos carnero.
funcional
El resultadodesestas
informaclulas. Cuandodemucho,
en porcentaje stos
un mnimo anlisis
de 200 proporcionan una
clulas.
clasificacin nosolgica de las clulas inmuno-competentes; la evaluacin ulterior
de la funcin de los linfocitos se deber hacer para estimar completamente la
competencia inmunitaria en la prctica mdica.
Las principales tcnicas de evaluacin cuantitativa de los linfocitos son:
a) La identificacin de linfocitos por rosetas: Las primeras
identificaciones de linfocitos T y B se hicieron mediante esta tcnica
actualmente en desuso. Nosotros la realizaremos por no contar con
otros medios para investigar LT.
b) Identificacin de linfocitos por Inmunofluorescencia: Con la produccin
de anticuerpos monoclonales fluorescentes, para un determinante
antignico en particular, fue posible identificar en una preparacin
celular la clula portadora de ese determinante antignico (epitopo) o
proteina, y su ubicacin.
c) Identificacin por Citometra de flujo:Tambin se basa en la marcacin
con anticuerpos monoclonales fluorescentes de los antgenos de
superficie. Ello se hace en forma automatizada en el citometro que
por su flujo permite el paso unicelular frente a un rayo Laser. A travs
de detectores especficos se puede

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hacer un anlisis computacional de varios parmetros, ya que adems

de poder detectar varias fluorescencias simultneas en una misma
clula, hace una evaluacin del tamao y complejidad de dicha clula.
MATERIALES Y REACTIVOS
1.- Todos los usados en la prctica de obtencin de mononucleares en

sangre. Porque, la primera fase de la obtencin de linfocitos T, es la
obtencin de mononucleares.
2.- Eritrocitos de carnero.
3.- Estufa a 37C
4.- Refrigeradora
METODO
1.- Lavar eritrocitos de carnero frescos 2 veces con PBS centrifugando a 3,500 r.p.m.
durante 10 minutos cada vez. Hacer una suspensin al 1 % ( Vol. Paquete/ Vol.
Diluiente).
2.- Ajustar las clulas mononucleares a: 1 x 106 / 0.1 ml.
3.- Depositar en un tubo de 12 x 75 mm 0.2 ml de la suspensin de
clulas mononu-cleares.
4.- Agregar 0.2 ml de la suspensin de eritrocitos de carnero al
1%, mezclar e incubar37C por 30 minutos.
5.- Centrifugar a 1,000 r.p.m. para promover el contacto
entre clulas. 6.- Incubar a 4C durante 12 a 18 horas.
7.-Resuspender
sangre perifrica cuidadosamente el botn
del humano ha logrado de clulas con
contribuciones la ayuda para
importantes de una pipeta
entender:
Pasteur,
1) Los colocar 20 microlitros
padecimientos por entre porta y cubre objetos
inmunodeficiencia, 2) Lasy leer en un microscopio
enfermedades auto-
la formacin de
inmunitarias, 3) rosetas.
La inmunidad tumoral y 4) La inmunidad de las enfermedades
infecciosas. Sin embargo debe hacerse hincapi en que la simple cuenta de las
Se considera roseta a un mononuclear unido a ms de dos eritrocitos de carnero.
El resultado se informa en porcentaje de un mnimo de 200 clulas.
INTERPRETACIN:
Los linfocitos que ligan cuando menos tres eritrocitos de carnero en la sangre normal
perifrica son considerados, por lo general, como linfocitos T. Las clulas muertas
no forman rosetas y pueden excluirse mediante la tincin vital de azul de Tripn.
El porcentaje de la formacin de rosetas E en la sangre normal es aproximadamente
de 65 75%. Los resultados en cada prueba de laboratorio deben expresarse en
cifras absolutas de clulas T /ul, calculndolas de la cuenta de los linfocitos de la
muestra original de sangre.
CALCULO DE LA CANTIDAD DE LINFOCITOS T EN UNA MUESTRA

SANGUINEA.

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1. Tomada la muestra de sangre realizar un frotis sanguneo y colorearlo con

colorante Wright.
2. Realizar un contaje de glbulos blancos.
3. Realizar una formula leucocitaria.
4. Realizar el recuento de las clulas T contando 200 clulas mononucleares y
determinando de estas 200 clulas cuantas han sido rosetas para obtener
luego el porcentaje al 100%
5. Ejemplo:
*Recuento de glbulos blancos: 8,000 leucocitos por mm3
*Formulaleucocitaria:
Eosinfilos: 1 %
Basfilos: 1 %
Abastonados: 3 %
Segmentados: 54 %
Linfocitos: 36 %
Monocitos: 5 %
*Recuento de rosetas: 130 rosetas en 200 clulas = 65 %
Calculo: 8,000 leucocitos -------- 100%

X -------- 36 %
X = 8,000 x 36
100
X = 2,880 linfocitos.
De donde: Linfocitos T es igual a:

2,880
---------------
100% X
---------------
65%
X = 2,880 x 65
100
X = 1,872 Linfocitos T
NOTAS:
La muestra usada debe ser fresca.
Los glbulos rojos de carnero pueden ser lavados en solucin salina
fisiolgica hasta que no se observe hemlisis o sea el sobrenadante debe
ser incoloro y transparente. La formacin completa de las rosetas se da a
las 18 24 horas a una temperatura de 2
8 C (refrigeracin)

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CUESTIONARIO
1. Realiza el clculo de los linfocitos T de la muestra trabajada.
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PRACTICA N 6
EL PODER BACTERICIDA DEL SUERO
INTRODUCCION
Si aceptamos que el sistema inmune existe porque existe la agregacin exgena

(virus, bacterias, hongos, parsitos en general) y endgenas (clulas neoplsicas
principalmente), entonces la funcin principal del complemento sera el
reconocimiento y destruccin de estos agresores.
De este encuentro, reconocimiento y destruccin resulta un estado de inmunidad que
permite al individuo reaccionar en forma ms efectiva en la eventualidad probable de
reencuentros con el agresor.
El sistema del complemento genera mecanismos muy eficientes de defensa
inmune innata y adaptativa. Su activacin y regulacin genera modelos
protemicos avanzados que ilustran la relacin entre estructura y funcin de
protenas,
3. Decantar
la influencia
el sueroque
en la
un variabilidad
tubo estril gentica
, medir latiene
cantidad
en laobtenida
estructura
para
y
deficiencias
dividirlo
de sus
en dos
componentes
partes iguales.
y sus consecuencias clnicas.
4. Tomar
La ruta clsica2 del
tubos estriles y rotularlos
complemento de lahace
se descubri siguiente
ms omanera:
menos 100 aos como
un sistema que funcionaba coordinadamente con anticuerpos. Cincuenta aos
despus, se propuso que el complemento poda ser activado por superficies
bacterianas a travs de una ruta independiente de anticuerpos, la ruta alterna.
Desgraciadamente los estudios en que Louis Pillemer, su descubridor, describe
esta ruta, fueron severamente objetados por sus pares de la poca. Estos hechos
condujeron a Pillemer al suicidio. La tercera ruta, de las lectinas, fue descrita slo
en 1987.
Para generar sus mltiples actividades biolgicas, el sistema cuenta con
aproximadamente 40 molculas, presentes en el plasma o sobre membranas
biolgicas, en todos los vertebrados estudiados hasta ahora.
La activacin del complemento implica la activacin sucesiva (en cascada) de
precursores de serino-proteasasplasmticas. Las principales consecuencias
biolgicas de este proceso son: Lisis de clulas agresoras, Opsonizacion de
antgenos, activacin de linfocitos, solubilizacion de complejos inmunes e
inflamacin.
La actividad ltica del complemento presente en el plasma o suero sanguneo se
destruye calentndolos a 56C por 30 minutos.
En la prctica a realizarse en la asignatura los alumnos enfrentaran suero humano
fresco mas bacterias (Escherichia coli) y suero humano fresco inactivado a 56C
por 30 minutos en Bao Maria mas bacterias (Escherichia coli), para luego de 24
horas de incubacin observar la diferencia del desarrollo bacteriano en ambos casos.
MATERIALES
Suero sanguneo fresco

Cepa de Escherichia coli en caldo de cultivo de 18 a 24 horas.
Tubos estriles de 13 x 100 y 12 x 75
Placas de Petri estriles.
Gradillas porta-tubos.
Solucin Salina Fisiolgica estril.
Escala de Mc Farland ( Tubo patrn de 1 x 106 clulas)

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Agar Nutritivo o Agar Tripticasa de Soya ( 1000 ml )

Mechero de Bunsen
Centrifuga.
Bao Mara a 56C
Pipetas de Vidrio estriles de 1c.c. y 10 c.c.
Plumones marcadores indelebles.
Visores de placas ( luz Indirecta ).
PROCEDIMIENTO
1. Tomar una muestra de sangre venosa estrilmente y dejar coagular a

temperatura ambiente por ms o menos 15 minutos.
2. Centrifugar la muestra por 10 minutos a 3,500 r.p.m.
protenas,
3. Decantar
la influencia
el sueroque
en la
un variabilidad
tubo estril gentica
, medir latiene
cantidad
en laobtenida
estructura
para
y
deficiencias
dividirlo
de sus
en dos
componentes
partes iguales.
y sus consecuencias clnicas.
4. Tomar
La ruta clsica2 del
tubos estriles y rotularlos
complemento de lahace
se descubri siguiente
ms omanera:
menos 100 aos como
cal sc
5. El tubo rotulado cal llevarlo al Bao Mara a 56C por 30 minutos. El tubo
rotulado sc queda en espera a temperatura ambiente en la mesa
correspondiente de trabajo.
6. PreparacindeladilucindelacepadeEscherichiacoli:
Tomando como patrn el tubo de la escala de Mc Farland correspondiente a
la concentracin de clulas de 1 x 106, realizar una emulsin de las bacterias
en un tubo
estril con ms menos unos 5 ml de solucin calina estril.
7.- A partir de esta dilucin en la cual hay 1000,000 de bacterias por ml se
realizara las Siguientes diluciones:
a) 1/100: Tomar 9.9 de solucin salina estril + 0.1 de la emulsin
bacteriana.
b) 1/1000: Tomar 9 ml de Solucin salina estril + 1 ml de la dilucin 1/100
c) 1/10,000: Tomar 9 ml de solucin salina estril + 1 ml de la dilucin
1/ 1000. 8.- Proceder de la siguiente manera: Tomar 3 tubos de 12 x 75 y
rotularlos como:
Cal 1, Cal 2 y Cal 3. Cal 1 corresponder a la dilucin bacteriana
1/100, Cal 2 corresponder a la dilucin bacteriana 1/ 1000 y Cal 3
corresponder a la dilucin bacteriana 1/10,000.
En cada tubo colocar 250 microlitros 500 microlitros de suero calentado
+ 250 500 Microlitros de emulsin bacteriana segn corresponda la
dilucin de cada tubo.
9.- Igualmente se proceder con el suero no calentado: Los tubos se rotularan
SC 1, SC2, SC3 y se proceder de la misma forma del paso 8.
10.- Luego los 6 tubos sern llevados a la incubadora a 37C por espacio de 1
hora.
11.- En el tiempo de la incubacin aprovechar el tiempo para licuar el medio de cultivo

a usarse ( Agar nutritivo o Tripticasa de soya) y conservarlo a 40 C y tambin rotular
las placas de Petri con el rotulo usado en cada uno de los tubos que se encuentran
en la incubacin.

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12.- Cumplido el tiempo de incubacin se proceder al sembrado, de la

siguiente manera: Verter el contenido de los tubos incubados en cada una de
las placas rotuladas segn corresponda.
13.- Agregar 9.5 ml de agar y mezclar en forma rotatoria para obtener una buena
distribucin bacteriana, dejarlas enfriar y solidificar, voltearlas, envolverlas y luego
incubarlas a 37C por 24 horas.
OBTENCION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
14.- Realizar la observacin y recuento de colonias por c.c. con ayuda de un visor.
RESULTADOS:
Comparar el nmero de colonias obtenidas en cada una de las
diluciones y contar el nmero de colonias desarrolladas y luego
calcular el nmero de bacterias viables por ml.
El nmero de bacterias viables deber ser menor en las placas
de Petri que contienen suero no inactivado o no calentado.
NOTAS:
No olvides que todo el trabajo se realiza en forma estril y para ello
trabaja cerca del mechero.
La temperatura de inactivacin del complemento escritica, unos grados
de diferencia por encima de lo establecido puede alterar totalmente la
muestra.
CUESTIONARIO
1.- Qu diferencia esperas observar entre el desarrollo bacteriano de las
bacterias incubadas con el suero calentado y el suero sin calentar?
2.- Por qu se da esta diferencia?

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PRACTICA N 7
OBTENCION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
14.- Realizar la observacin y recuento de colonias por c.c. con ayuda de un visor.
La necesidad de encontrar pruebas de laboratorio que orienten al diagnstico de

enfermedades dio gran impulso a los exmenes serolgicos que lleven a
determinar en el suero del paciente la presencia de antgenos como de
anticuerpos.
En las bacterias se han podido caracterizar antgenos que pueden ser protenas, que
frecuentemente estn situadas en la membrana celular y el espacio peri- plasmtico;
hidratos de carbono, que constituyen sobre todo los antgenos de superficie y
en algunos casos particulares como el de las enterobacterias, complejos glucido-
fosfolipdicos que son verdaderas endotoxinas y forman parte de la pared celular.
A los antgenos bacterianos ubicados en el soma o cuerpo se los denomina
antgenos O, a los de envoltura o capsulares antgenos K y a los ciliares, H.
La preparacin de antgenos bacterianos en el laboratorio de Inmunologa
responde a dos propsitos:
1.- Usar un antgeno conocido para detectar anticuerpos en sueros problema.
2.- Inocular los antgenos a animales de experimentacin para la produccin de
anticuerpos especficos.
El objetivo de la prctica es preparar antgenos H y O de Salmonella typhi para ser
usada en pruebas de aglutinacin.
PREPARACIN DEL ANTIGENO H DE S. Typhi.
La cepa de S. Typhi a utilizarse deber seleccionarse de acuerdo a la recomendacin

proporcionada por las entidades autorizadas ( OMS OPS ) y en base a su
movilidad ( cultivo joven de no ms de 48 horas ), teniendo en cuenta que hay
correlacin entre presencia de flagelos y movilidad. El tratamiento con formol fija los
flagelos a la bacteria, enmascarando stos a los antgenos somticos.
Siendo ste un antgeno particulado se usar en pruebas de aglutinacin.

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Tecnologa Mdica
MATERIALES:
1.- Cultivo de S. Typhi en medio
lquido ( 5 ml ) 2.- Formol al 0.6 %
en agua destilada.
3.- Solucin salina formolada al 0.3 %
4.- Antgeno H comercial.
5.- Placas de agar BHI y Saboureau para control
microbiolgico. 6.- Pipetas de 10 ml estriles.
7.- Tubos capilares.
8.- Propipetas
9.- Asas de siembra.
10.- Centrfuga.
11.- Estufa.
PROCEDIMIENTO:
1.- Agregar 5 ml de formol al 0.6 % al tubo con cultivo de S. Typhi, mezclar y
dejar en reposo por 30 minutos.
2.- Centrifugar a 3,000 r.p.m. por 20 minutos, descartar el sobrenadante y

resuspender el sedimento en salina formolada (5ml); repetir la centrifugacin
para lavar las bacterias.
3.- Hacer la resuspensin final de bacterias en solucin salina formolada, usando

como patrn de concentracin un antgeno comercial. Para este fin, se colocan
los antgenos en capilares y se centrifugan. Por comparacin se determina si el
antgeno preparado necesita ser concentrado o diluido.
4.- De la resuspensin bacteriana tomar una muestra y sembrarla en la placa

de agar BHI y Saboureaud para el control de esterilidad respectivo.
PREPARACIN DEL ANTGENO O DE SALMONELLA TYPHI

El antgeno O se encuentra en el soma bacteriano, por lo que para esta
preparacin se deben extraer los flagelos, sin que el tratamiento interfiera con la
pared celular de la bacteria.
MATERIALES:
1.- Placa de cultivo de salmonella.
2.- Solucin salina con merthiolate al 0.1 %.
3.- Antgeno O comercial.
4.- 1 ml de acetona.
5.- 1 ml de alcohol absoluto.
6.- Placas Petri con agar BHI y agar
Saboureaud. 7.- Pipetas de 5 10 ml
8.- Frascos de penicilina con perlas de
vidrio estriles. 9.- Embudo con gasa,
estriles.
10.- Tubos de 16 x 125 mm con tapa
rosca, estriles. 11.- Capilares.
12.- Propipetas.
13.- Asa de siembra.
14.- Bao Mara en ebullicin.
15.- Centrfuga.
16.- Estufa.

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MATERIALES:
1.- Cultivo de S. Typhi en medio
lquido ( 5 ml ) 2.- Formol al 0.6 %
PROCEDIMIENTO:
1.- Introducir las perlas de vidrio en la placa que contiene el cultivo de salmonellas
y agregar 5 ml de solucin salina con merthiolate al 0.1 %.
2.- Rotar la placa suavemente para desprender las bacterias de la superficie del
medio.
3.- Con un embudo y gasa, recoger la suspensin bacteriana en un tubo de prueba

de 16 x 125 mm, evitando que las perlas caigan en el embudo.
4.- Agregar 5 ml de solucin salina, lavando la superficie de la placa del cultivo,

recoger el resto del crecimiento bacteriano, filtrndolo siempre por la gasa del
embudo.
5.- Llevar el tubo a ebullicin en Bao mara por 2 horas.
6.- Centrifugar a 3000 r.p.m. por 15 20 minutos, descartar el sobrenadante y

resuspender el sedimento en alcohol; repetir la centrifugacin para lavar las
bacterias.
7.- Centrifugar a 3000 r.p.m. por 15 minutos, descartar el sobrenadante y

resuspender el sedimento en alcohol; repetir la centrifugacin para lavar las
bacterias.
8.- Resuspender las bacterias en acetona y dejar en estufa a 37C hasta la

evaporacin del solvente.
9.- Homogenizar las bacterias en Solucin salina con merthiolate al 0.1 % con
ayuda de un mortero.
Establecer el volumen celular bacteriano siguiendo el mismo procedimiento
empleado para el antgeno H.
10.- Sembrar una muestra en la placa de agar BHI y Saboureaud para control
microbiolgico.
Fuente: Manual de Practicas de Inmunologa y Vacunas. UNMSM 2000
NOTAS:
Si no tienes medio de cultivo BHI puedes usar el Tripticasa de soya agar.
Si la cepa de salmonella es sembrada en tubos; no necesitas: gasa,
embudo ni perlas de vidrio.
Se recomienda usar tambin un medio lquido para el control de
desarrollo bacteriano. Este puede ser un caldo nutritivo.

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CUESTIONARIO
1.- Este tipo de antgenos son usados actualmente en la investigacin de

anticuerpos en el laboratorio de Inmunologa?
2.- Investiga las diferencias en la obtencin de estos antgenos en los laboratorios

industriales.
CONCLUSIONES:

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PRACTICA N 8
ESTANDARIZACION DE LOS ANTIGENOS H y O
INTRODUCCIN:
Despus de preparar los antgenos bacterianos O y H necesariamente deben ser

sometidos a una estandarizacin. sta se lleva a cabo mediante las siguientes
pruebas: a) Sensibilidad, b) Determinacin del Volumen celular, c) Examen de
pureza y esterilidad y d) Medicin del pH. La sensibilidad del antgeno preparado
se lleva a cabo por comparacin con la sensibilidad de un antgeno tipo estndar
(Estndar: Algo que sirve como base de comparacin; especificacin tcnica o
informe escrito diseado por expertos, basados en los resultados consolidados y
obtenidos mediante el estudio cientfico, la tecnologa y la experiencia, dirigido a
lograr unos efectos beneficiosos ptimos y que ha recibido la aprobacin de una
corporacin reconocida y representativa.Diccionario de Epidemiologa. J. Last. ).
La prueba consiste en hacer la aglutinacin a diferentes diluciones, de ambos
antgenos, usando 20 30 sueros de ttulos escalonados, desde negativos a
positivos de ttulo bajo, mediano y alto.
La determinacin del volumen celular mide el contenido de bacterias, aunque no su
reactividad antignica. Se llenan cuatro tubos capilares para micro hematocrito con
el antgeno en estudio y otros cuatro con el antgeno de referencia, se centrifugan y
se mide el volumen celular.
La pureza del antgeno se realiza mediante la coloracin de Gram, debiendo
observarse slo la presencia de bacilos Gram- negativos.
Para la prueba de esterilidad se siembra una gota del antgeno en medios
enriquecidos para bacterias y hongos, y luego de tres a siete das de incubacin no
debe observarse el crecimiento de grmenes en ninguno de los medios.
En la prctica se normalizar el volumen celular del antgeno preparado contra un
antgeno comercial. Asimismo, se evaluar su sensibilidad y esterilidad.
MATERIALES:
1.- Sueros problema ( negativo, positivo de ttulos
alto y bajo ). 2.-Antgenos H y O de S. typhi
comerciales.
3.- Antgenos O y H de S. typhi
preparados en clase. 4.- Laminas para
aglutinacin.
5.- Pipetas.
6.- baguetas.
7.- bocal con leja al 5 %.
8.- Aglutinoscopio.
PROCEDIMIENTO:
1.- En la lamina preparada para las aglutinaciones colocar en los cuadrilteros
respectivos los siguientes volmenes: 0.08; 0.04: 0.02; 0-01 y 0.005 ml de suero de
cada uno de los sueros problema. Cada suero por duplicado.
2.- Agregar a cada volumen una gota del antgeno comercial, dado que no se
cuenta con antgeno estndar. Emplear una serie de los sueros para el antgeno O
y otra para el antgeno H.
3.- Mezclar los reactivos con las baguetas.
4.- Rotar suavemente la lmina por dos minutos.
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5.- Hacer la lectura de las lminas.

Repetir el mismo procedimiento, con el antgeno preparado en clase.
RESULTADOS:
Se leen los resultados de cada suero en sus diferentes diluciones,
comparando una misma dilucin con ambos antgenos (comercial y el
preparado en clase). Las lecturas de aglutinacin deben de coincidir para
considerar que el antgeno est apto para su uso.
Debido a que no existe una normalizacin internacional del
antgeno, se desconoce cul es el volumen celular adecuado para la prueba
de aglutinacin en lmina, habindose observado una gran variacin en los
valores obtenidos con los antgenos comerciales.
No debe haber crecimiento de bacterias u hongos en los medio sembrados.
Calcular el ttulo de cada suero, refirindose al siguiente cuadro:
Volumen de suero ( ml ) Dilucin del suero Titulo

0.08 1:20 20
0.04 1:40 40
0.02 1:80 80
0.01 1:160 160
0.005 1:320 320
*Fuente: Manual de Practicas de Inmunologa y Vacunas.UNMSM-2000

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PRACTICA N 9
INOCULACION DE ANIMALES PARA LA

OBTENCION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS.
GENERALIDADES SOBRE INOCULACIONES:

Las inoculaciones en animales de experimentacin se realizan a fin de obtener una
respuesta inmunitaria especfica al antgeno utilizado. La modulacin de la respuesta
inmunitaria puede lograrse a travs de la inoculacin del antgeno, que incluye la
eleccin del animal, la dosis y estado fsico del antgeno, el uso de adyuvantes, la
va y nmero de inoculaciones y el perodo entre inoculaciones.
La eleccin del animal para inmunizacin depende de:
Cuanto suero se necesite.
De cuanto antgeno se dispone y
Del tipo de anticuerpos que se requiere ( policlonal o monoclonal )
La determinacin de la dosis de antgeno es emprica, es decir se alcanza luego de
probar varias dosis. (Nosotros usaremos un esquema de inoculacin ya establecido).
En general, para conejos se suele emplear una dosis de antgeno de
0.5 a 10 mg en coadyuvante por inoculacin. Los anticuerpos resultantes tienen un
alto ttulo de Ig G especfica, son de alta afinidad y de muy elevada diversidad.
La va de inoculacin elegida depende del volumen de antgeno a ser inoculado, la
sustancia que acompaa al antgeno y cun rpido debe ser ste liberado en la
circulacin.
Los objetivos de la prctica son:
Aprender a inocular un animal de experimentacin (Conejo)
Obtener un antisuero.
CONSIDERACIONES A TENER EN CUENTA EN EL MANEJO DE EL CONEJO.

Los conejos no muerden con frecuencia pero pueden causar heridas con las uas
de las patas. Sujtelo de forma tal que las patas traseras estn lejos del cuerpo del
operador.

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Sujetndolo por la piel sobre los hombros con la cabeza en direccin al operador
es el mejor mtodo de sujecin para el conejo. Los conejos nunca deben ser
levantados por las orejas. Si el conejo comienza a moverse violentamente y en
rotacin, debe colocarse rpidamente sobre una superficie plana y esperar que se
tranquilice. Los conejos pueden ser llevados a un estado de hipnosis cuando se les
acaricia sobre su espalda y el abdomen. Durante la sujecin los conejos pueden
intentar escapar de forma violenta y pueden daarse con la aguja o cualquier otro
instrumento pudiendo causar daos en el animal o el operario. Por lo tanto la sujecin
firme debe realizarse antes de iniciar el procedimiento experimental. Existen varios
mtodos entre los ms comunes como el uso de jaulas de restriccin y otros
menos rgidos como las bolsas de restriccin que cubre el cuerpo del conejo y
permite con igual eficiencia su manipulacin y el uso de diversas tcnicas
experimentales.
TIPOS DE INOCULACIONES
INOCULACIN INTRADRMICA O INTRACUTANEA.
La inoculacin intradrmica se usa cuando se desea obtener una lenta liberacin

del antgeno en el animal. El antgeno puede ser particulado (glbulos rojos) o
emulsionado en coadyuvante. Se emplean volmenes pequeos de inculo, y es
usual realizar mltiples inoculaciones. El mtodo requiere de una mayor pericia
tcnica que para otras inoculaciones.
El rea mejor de inocular es el rea escapular.
PROCEDIMIENTO:
1) Rasurar un rea de 10 15 cm del lomo o del muslo del animal.
2) Cargar la jeringa de inoculacin con el antgeno a inocular.
3) Estirar la piel del animal con la ayuda de los dedos medio y pulgar.
4) Insertar la aguja, con el bisel hacia arriba, ligeramente por debajo de
la piel. Empuje la aguja hasta alcanzar ms o menos 0.5 cm de
distancia desde el punto de su ingreso.
5) Inocular el antgeno.
6) Retirar la aguja. Comprimir suavemente la piel del animal.
RESULTADOS:
Una buena inoculacin se evidencia cuando el inculo forma
una ppula dura debajo de la piel.
Los conejos no muerden con frecuencia pero pueden causar heridas con las uas

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INOCULACIN ENDOVENOSA:
Los antgenos inoculados por esta va deben estar en soluciones o en buffers
fisiolgicos. No se recomienda utilizar el coadyuvante de Freund para esta va de
inoculacin.
PROCEDIMIENTO:
1) Retirar al conejo de su jaula y colocarlo sobre la mesa de trabajo.
2) Cargar la jeringa de inoculacin de 5ml o menos y agujas de 21 a 25
con el antgeno a inocular.
3) Inmovilizar al conejo. La vena marginal de la oreja es ideal para la
aplicacin el pelo de la oreja debe ser eliminado y la piel desinfectada
con alcohol o yodo antes de realizar la puncin. La limpieza de la piel
reduce la posibilidad de infeccin. La vena puede golpearse
delicadamente varias veces con el dedo para su dilatacin. Si se usa
Xilol como dilatador, despus del procedimiento debe lavarse la oreja
con agua y jabn pues es irritante en contacto con la piel.
4) Presionar ligeramente la base de la oreja del animal. A continuacin
insertar la aguja en la vena. Desplazar suavemente el embolo hacia
arriba. Si aparece sangre en la jeringa, inocular el antgeno
lentamente.
5) Al terminar la inoculacin, esperar unos segundos y despus retire la
aguja. Colocar un trozo de algodn sobre el sitio de inoculacin y
esperar hasta que se coagule la sangre.
RESULTADOS:
Una buena inoculacin se evidencia por la ausencia de
edema en la zona de inoculacin.
Equipamiento: Agujas de 22 23 g x 1. El lugar mas comn es la parte trasera del
muscula lateral. Si se quiere realizar mas de una puncin el rea debe de rotarse.
El pelo debe ser rasurado y la piel desinfectada.
INOCULACIN INTRAPERITONEAL:
MATERIALES
ste mtodo es PARA INOCULACION
el ms comnmente DE GLOBULOS
usado ROJOS
para introducir .
antgenos en el ratn
(1) Conejo
solubles de raza New
o particulado ). Zeland(NuevaZelanda) de aproximadamente 2 a 3
En el caso del conejo puede usarse una tabla plana con cuerdas en las 4 esquinas
que permitan la sujecin de cada pata. Esta debe ser lisa, limpia y desinfectada. El
conejo tiende a encogerse cuando se le ata por las cuatro patas. El abdomen del
conejo se rasura, para evitar

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la dispersin del pelo, utilice alcohol de 95%. Debe cuidarse no daar estructuras y
rganos en el momento de hacer la puncin.
PROCEDIMIENTO:
1.- Cargar la jeringa de inoculacin con el antgeno.
2.- Sujetar al ratn con una mano, de modo que quede en
posicin ventral. 3.- Frotar la regin abdominal con algodn
embebido en alcohol.
4.- Manteniendo la posicin ventral del ratn inclinar al animal de modo que su
cabeza quede por debajo del plano horizontal. Con la otra mano introducir la aguja,
cuidando de atravesar el msculo abdominal, y presione lenta pero firmemente el
mbolo para depositar el antgeno.
RESULTADOS:
Una correcta inoculacin se evidencia por la facilidad con que se desplaza el mbolo
hacia abajo, y por la ausencia de edema en el lugar de inyeccin del antgeno.
INOCULACION INTRAMUSCULAR
Equipamiento: Agujas de 22 23 g x 1. El lugar mas comn es la parte trasera del
muscula lateral. Si se quiere realizar mas de una puncin el rea debe de rotarse.
El pelo debe ser rasurado y la piel desinfectada.
MATERIALES PARA INOCULACION DE GLOBULOS ROJOS .

1) Conejo de raza New Zeland(NuevaZelanda) de aproximadamente 2 a 3
kilogramos de peso. El conejo debe ser conservado en un lugar con
buena ventilacin y con las condiciones adecuadas de higiene.
2) Sangre humana del grupo O extrada con EDTA .
3) Suero Fisiolgico.
4) Gradilla y tubos de prueba de 13 x 100
5) Jeringas y agujas descartables de 1 x 21.

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PREPARACIN DE LA SANGRE A INOCULAR:

La sangre extrada grupo O debe ser centrifugada por 5
Minutos a 3000 r.p.m... Extraer el plasma, medirlo y eliminarlo.
Al paquete globular se le agrega la cantidad extrada de plasma
de solucin salina fisiolgica, se centrfuga por 5 minutos a
3000 r.p.m , se decanta el sobrenadante y se vuelve a agregar
la misma cantidad de solucin salina fisiolgica para recuperar
el volumen original.
ESQUEMA DE INOCULACIN AL CONEJO

DIA DOSIS VIA MATERIAL INOCULADO
1 05 ID Sangre total humana o

3 1.0 ID Sangre total humana o
12 1.0 EV Glbulos rojos O al 20 %
15 1.0 EV En solucin salina al 0.85 %
18 1.0 EV
21 1.0 EV
23 1.0 EV
25 - - SANGRIA DE PRUEBA
*Esquema adaptado de la tcnica de A. Curvello y V. Marquez, para la

obtencin de hemolisina.
MATERIALES PARA INOCULACION DE SALMONELLA TYPHI.

1. Preparar una suspensin bacteriana de la cepa muerta 1x106 bacterias. En
solucin salina estril.
2. Esta suspensin bacteriana va a ser usada en todo el proceso de
inoculacin.
ESQUEMA DE INOCULACIN AL CONEJO

DIA DOSIS VIA MATERIAL INOCULADO
1 0.5 ml ID Emulsin bacteriana

12 1.5 ml EV Emulsin bacteriana
25 - - SANGRIA DE PRUEBA

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NOTAS
Formar sus equipos de trabajo: De inoculacin de los animales (no

se olviden que en la investigacin no hay feriados). El equipo de
mantenimiento de los animales: ellos deben alimentarse muy bien
para que su sistema inmune responda.
Los animales deben permanecer en un lugar cmodo para que no
se estresen. Si los mantienen en jaulas, estas deben permanecer
limpias.
El donante de sangre se compromete a donar cada vez que se
necesite.
CUESTIONARIO
1. Cmo se prepara el paquete globular?
2. Por qu se elimina el plasma de la sangre para inocular?
3. Cul es el resultado final al terminar todo el proceso de inoculacin de los

conejos?
4. De que se alimentan los conejos?

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PRACTICA N 10
DILUCIONES
Serologa:Es un examen del lquido seroso de la sangre (suero, el lquido

transparente que se separa cuando la sangre se coagula) que se utiliza para
detectar la presencia de anticuerpos contra un microorganismo.
La serologa se refiere al estudio del contenido de anticuerpos en el suero. Ciertos

microorganismos estimulan para producir estos anticuerpos durante una infeccin
activa. En el laboratorio, los anticuerpos reaccionan con los antgenos de formas
especficas, de tal manera que se pueden utilizar para confirmar la identidad del
microorganismo en particular.
Existen varias tcnicas serolgicas que se utilizan dependiendo de los anticuerpos

de los cuales se sospecha entre las que se pueden mencionar aglutinacin,
precipitacin, fijacin del complemento, anticuerpos fluorescentes y otras.
Los laboratorios de inmunologa se concentran en lo siguiente:
Identificar anticuerpos, como respuesta a un Ag,

Investigar los problemas del sistema inmunolgico, como las
enfermedades autoinmunes y transtornos de inmunodeficiencia
En los Bancos de Sangre, se aplica en:
Determinar la compatibilidad de la sangre para transfusiones.
1. Dilucin Simple (Mtodo del factor de dilucin)

V1
Una=dilucin
El volumen
simpledeeslaaquella
solucin
enmadre
la cualcon
unaelunidad
cual usted partir de
de volumen para
un hacer la
material
segunda solucin. (Este valor es desconocido para usted.)
lquido
C1 = 100demg/ml
inters
(lase combina con
concentracin deun volumen madre)
la solucin apropiado de un solvente lquido
para alcanzar la concentracin deseada. El factor de dilucin es el nmero total de
unidades
V2 = 200 de volumen en
ul (volumen losde
total cuales su material
la solucin ser disuelto.
que usted El material
va a preparar con unadiluido se
nueva
debe mezclar muy bien para alcanzar una dilucin verdadera.
Ejemplo:
Un volumen de suero se puede diluir en 4 volumenes de Suero fisiologico (el

solvente de la dilucin) dando un factor de dilucin 5. Es decir, el concentrado de
suero representa 1 unidad de volumen al cual usted le adiciona 4 unidades ms de
volumen (el SF). De esta forma, su muestra de suero est distribuida en las 5
unidades de volumen. Esta sera una dilucin 1:5 y ahora el suero es 1/5 del
concentrado original. As pues, en una dilucin simple usted agrega una unidad de
volumen de solvente de acuerdo con el factor de dilucin deseado.

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2. Dilucin seriada
Una dilucin seriada es simplemente una serie de diluciones simples que

amplifican el factor de dilucin rpidamente, comenzando con una pequea cantidad
inicial de muestra (suero, plasma, un reactivo qumico, etc.). La fuente del material
para diluir en cada paso viene del material diluido en el tubo anterior. En una dilucin
seriada el factor de dilucin total en cualquier punto es el producto del factor de
dilucin individual en cada uno de los tubos.
3. Cmo hacer volmenes fijos de concentraciones

especficas: Mtodo de V1C1=V2C2
Con frecuencia es necesario tener hacer una cantidad determinada de una

solucin con una concentracin conocida. Debido a la disponibilidad limitada de
materiales (algunos qumicos son muy costosos y solo se venden o utilizan en
pequeas cantidades e. g. microgramos) o para evitar el desperdicio de material.
La frmula V1C1 = V2C2 es un mtodo rpido para calcular tales diluciones, donde:
V = volumen, C = concentracin; en cualquier unidad que usted est trabajando
(Atributos de la solucin fuente) V1C1=V2C2 (atributos de la nueva solucin)
Ejemplo: Suponga que usted tiene 3 ml de una solucin madre de ampicilina a una
concentracin de 100 mg/ml y usted quiere hacer 200 ul de una solucin que tenga
una concentracin de 25 mg/ml. Usted necesita saber qu volumen de la solucin
madre necesita usar para hacer los 200 ul del volumen total necesitado.
V1
Una=dilucin
El volumen
simpledeeslaaquella
solucin
enmadre
la cualcon
unaelunidad
cual usted partir de
de volumen para
un hacer la
material
segunda solucin. (Este valor es desconocido para usted.)
C1 = 100 mg/ml (la concentracin de la solucin madre)
V2 = 200 ul (volumen total de la solucin que usted va a preparar con una nueva
concentracin).
C2 = 25 mg/ml (la nueva concentracin)
Por ordenamiento algebraico:
V1 = (V2 x C2) / C1
V1 = (0.2 ml x 25 mg/ml) / 100 mg/ml = 0.05 ml = 50 ul
Por lo tanto, usted debe tomar 0.05 ml, es decir, 50 ul de la solucin madre y
diluirla con 150 ul de solvente para lograr los 200 ul de la solucin con una
concentracin de 25 mg/ml (recuerde

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que la cantidad de solvente utilizada se basa en el volumen final que se necesita

de tal forma que usted debe restar el volumen inicial del volumen final para poder
calcular la cantidad de solvente).
INTERPRETACIONCLINICA
Existen 2 maneras de cuantificar sustancias en el laboratorio clnico que dependen

de la concentracin en que se encuentre la sustancia en el fluido biolgico y el rango
en l que sta se encuentre de manera normal.
Cuando la concentracin es alta, se utiliza el sistema de medicin tradicional y se

informa por cantidad dependiendo de la concentracin. Por ejemplo, glucosa en
sangre: 80 110 mg/dl ; valor total de IgG: 80 1200 mg/dl. Cuando la concentracin
de la sustancia es baja, se utilizan unidades de reaccin. Es as como el fluido
biolgico es diluido y se halla el titulo en la ltima dilucin que presente reacciona
positiva
La practica diaria ha establecido sistemas de dilucin que se conocen de manera

universal como seriadas en mltiplos de 2 (1/2, , 1/8, 1/16, 1/32), o en mltiplos
de 10 (1/100, 1/1000, 1/10000, etc). Este tipo de cuantificacin no arroja valores
reales, por lo cual es necesario repetir la prueba 20 das mas tarde, lo que permite
buscar el ascenso en el ttulo en por lo menos 3 diluciones para considerar la prueba
positivo o verificar que el titulo se mantiene estable. Esto significa que hay ausencia
de anticuerpos o antgenos en el organismo.
En otros casos un solo titulo es suficiente para considerarse positivo o negativo. Otra
manera de cuantificar sustancias se basa en el valor dado en la absorbancia a
determinada longitud de onda, con el cual se extrae un punto de corte que se
obtiene segn los valores del control negativo. Estas pruebas se informan en
Unidades Internacionales -UI- que deben ser comparadas bien sea con ttulos
promedios poblacionales, o con un segundo titulo, das
despus .

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Hemaglutinacin
Esta prueba se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para
aglutinar glbulos rojos. Se realiza en una microplaca, aadiendo glbulos rojos
a diluciones de la muestra que contiene virus, y observando posteriormente la
hemoaglutinacin.
Las diluciones seriadas son muy tiles. Estas diluciones son aquellas en las
cuales todas las diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera
poseen el mismo factor de dilucin.
Ejemplo:
Para determinar la concentracin de protenas en un suero animal, la muestra es

diluida 1/5 mediante la adicin de 0.02 ml de suero a 0.08 ml de solucin salina en
el tubo nmero 1.
Los tubos 2 al 8 contienen 0.5 ml de solucin salina como diluyente. La

dilucin seriada se realiza al transferir 0.5 ml del tubo 1 al tubo 2, mezclar
y transferir 0.5 ml del tubo 2 al tubo 3 y as sucesivamente hasta el tubo 8.
La concentracin de suero en los tubos 2 al 8 decrece por un factor de 2,
siendo cada dilucin: tubo 1:1/5,
tubo 2: 1/10, tubo 3: 1/20, tubo 4: 1/40, tubo 5: 1/80, tubo 6: 1/160, tubo 7: 1/360 y
tubo 8: 1/640.
MATERIALES Y EQUIPOS
Algodn, Alcohol, agujas descartables

Pipeta de 10 ml con escala de 1/10 (1 por cada grupo de trabajo)
Pipeta de 5 ml con escala 1/10 (1 por cada grupo de trabajo)
Pipeta de 2 ml con escala 1/100 (1 por cada grupo de trabajo)

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Pipeta de 1 ml con escala de 1/100 (1 por cada grupo de trabajo)

6- 7 tubos de ensayos 12 x 75 o 13x 100 mm ( por cada grupo de trabajo)
Azul de Metileno
Agua destilada
Propipetas + Pipetas automaticas (todos los rangos de volumen)
Puntas amarillas, Puntas azules

Tubos vacutainer sin anticoagulante (1 por cada grupo de trabajo)
Centrifugas
PROCEDIMIENTO
Ejemplo 1:
1. Tomar muestra de sangre en tubo sin anticoagulante.
2. Dejar que se retraiga el coagulo. Centrifugar para obtener suero
3. Alicuotar el suero y congelar lo que no se usa.
4. Rotular tubos del 1 al 6. En cada tubo colocar
200 ul de solucin salina
5. en el primer tubo colocar 200 ul suero problema. Mezclar bien y traspasar 200
ul al tubo 2, mezclar bien y pasar 200 ul al tubo 3, y asi sucesivamente. De modo
que las
diluciones obtenidas sean , , 1/8, 1/16, 1/32, 1/64
Ejemplo 2: En el laboratorio de Inmunologa usted realizar una dilucin seriada
1:10 de un suero X, en tres pasos. El paso inicial combina 1 unidad de volumen del
Suero con 9 unidades de volumen de SF = dilucin 1: 10. En el siguiente paso
usted combina 1 unidad de volumen del suero 1:10 con 9 unidades de volumen de
SF. Usted ahora tiene una dilucin 1:100 (1:10 x 10 = 1:100). En el tercer paso
usted combina 1 unidad de volumen del suero diluido 1:100 con 9 unidades de
volumen de SF. Usted ahora tiene una dilucin 1:1.000, (1:100 x 10 = 1:1000). La
concentracin del suero es ahora una milesima parte menos que en la muestra
original.
Obtenidas las diluciones, realizar el test deseado, enfrentando 1 gota del Antigeno,
con 1 gota de cada dilucin de la muestra de suero problema.
El resultado ser reportado como titulo de Acs, por ejemplo Positivo 1/64 que indica
que es la ultima dilucin en donde se obtuvo reaccin franca.

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PRACTICA N 11
REACCION SEROLOGICA DE AGLUTINACIN

INTRODUCCIN:
La aglutinacin bacteriana fue la primera reaccin serolgica de aglutinacin
descrita. La reaccin de aglutinacin o aglomeracin de bacterias por antisueros
especficos fue descubierta por Max Grber y Herbert Durham en 1896.Estos
investigadores demostraron que el vibrio del clera era aglutinado por el antisuero
del clera y que al bacilo de la Tifoidea le suceda lo mismo con el antisuero de la
tifoidea, pero que no ocurra aglutinacin al intercambiar esos antisueros.
La aglutinacin es una formacin de agregados suficientemente grandes de
clulas interligadas por puentes moleculares de anticuerpos que se combinan
simultneamente con dos sitios de combinacin iguales, pero situados en superficies
de dos clulas diferentes.
Las partculas involucradas son clulas (bacterias, levaduras, eritrocitos) o partculas
de ltex, las cuales, son bastante grandes y pueden ser observadas directamente.
Cuando stos antgenos se combinan con sus anticuerpos especficos, la agregacin
de las partculas son vistas y ocurre en dos fases o mementos:
1) Combinacin especfica de anticuerpo y antgeno.
2) Agregacin visible de partculas.
Esta reaccin antgeno anticuerpo es un ejemplo de reaccin inmune secundaria.
Varios son los factores que influyen en la reaccin: la elevacin o disminucin de la
temperatura, movimiento (Vibracin, agitacin, centrifugacin, rotacin), pH, clase de
anticuerpo, potencial zeta, viscosidad del medio, fenmeno de zona.
La aglutinacin que comprende determinantes antignicos que son un
constituyente intrnseco de la partcula se denomina aglutinacin activa o directa.
La aglutinacin que involucra determinantes antignicos que no son un
constituyente intrnseco de la partcula se denomina aglutinacin pasiva o indirecta.

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En la prctica realizaremos: 1) Aglutinacin directa en placa. 2) Aglutinacin directa

en tubo. 3) Aglutinacin Indirecta (uso de partculas de Ltex) en lamina o placa.
AGLUTINACIN EN LAMINA O PLACA
Esta aglutinacin se manifiesta cuando antgenos particulados (eritrocitos,

bacterias o partculas) reaccionan con anticuerpos especficos en condiciones
adecuadas.
En esta prueba se colocan pequeos volmenes de suero (anticuerpos) dentro de
los cuadrilteros preparados en la placa y se mezclan con el antgeno a usar
(antgeno particulado).
En la prctica usaremos: Anticuerpos (suero del paciente) y antgeno particulado
(suspensin bacteriana y partculas de Ltex), por lo cual realizaremos dos
mtodos de aglutinacin: directa e indirecta. Evaluaremos niveles de anticuerpos
sricos especficos presentes en el suero.
Se dispone de muchas suspensiones bacterianas comerciales estandarizadas que
permite al Laboratorio de Inmunologa Clnica llevar a cabo un diagnstico tentativo
de una enfermedad infecciosa aun cuando la bacteria no sea aislada del paciente.
La ventaja de ste mtodo es su rapidez y simplicidad; su desventaja es ser menos
sensible que la prueba en tubo, es semicuantitativa y puede presentar aglutinaciones
inespecficas.
MATERIALES Y EQUIPO
1.- Centrfuga
2.- Rotador de placas de 100 180 r.p.m.
3.- Placas de vidrio divididas en cuadrados, cada uno de 3.0 a 3.5 cm por lado.

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4.- Caja de lectura o aglutinoscopio o visor, con

iluminacin indirecta. 5.- Pipetas graduadas de 0.2 ml o
pipetas automticas.
6.- Gradillas
7.- Reloj de tiempo.
8.- Baguetas de vidrio o baguetas descartables o palitos
mondadientes. 9.- Bocales para colocar los materiales usados
(con leja).
10.- Sueros problema.
11.- Antgenos bacterianos comerciales. Estos Antgenos renen condiciones de
pureza, esterilidad y volumen celular. El gotero del antgeno debe distribuir 0.03 ml
por gota. ste es calibrado midiendo 3 ml por cada 100 gotas.
PROCEDIMIENTO
en las cantidades
MTODO mayores, hacindolo
DE AGLUTINACIN SCREENING con OlaDE
misma bagueta
TAMIZAJE o mondadientes,
(Ags.
empezando
BACTERIANOS): por la dilucin ms alta.
4.- Rotar la lmina como en el paso 5 de la
prueba screening. 5.- Realizar la lectura
1.-Colocar la placa
correspondiente en de vidrio y rotularla segn el nmero de
el visor.
sueros
6.- El titulo est dado porellacuadriltero
a trabajar. 2.- En determinado
mxima dilucin para
del suero quelaaglutina ms del 50 %
muestra colocar 0.04 ml de suero.
3.- A los 40 microlitros de suero aadir una gota de antgeno. El antgeno antes de
ser colocado ha sido mezclado para conseguir una emulsin completa. Evitar que
el gotero del antgeno toque la gota de suero.
4.- Con la bagueta o el mondadientes, mezclar el suero y el antgeno con
movimientos circulares. Usar una bagueta o mondadientes para cada suero.
5.- Inmediatamente luego de mezclar, rotar la lmina con movimientos rotatorios
que pueden ser manuales o usando un rotador mecnico por espacio de 2 8
minutos dependiendo del antgeno empleado y las indicaciones establecidas por el
fabricante.(En la prctica rotaremos 2 minutos).
6.- Realizar la lectura colocando la placa sobre el visor o aglutinoscopio y observar
la aglutinacin.
7.- La cantidad de antgeno usada y de suero al ser mezclado dar diluciones de
ste aproximadamente de 1:40.
LECTURA:
o La aglutinacin se evidencia por la formacin de
grumos. o La presencia de aglutinacin se
reportar como: Positivo o La ausencia de
aglutinacin se reportar como: Negativo o El
suero que resulte positivo pasar a ser
cuantificado.
Los grados de aglutinacin se pueden calificar de la siguiente manera:

o 4+ cuando la aglutinacin es del 100 %. Sobrenadante
transparente. o 3+ cuando la aglutinacin es del 75 %.
Sobrenadante claro
o 2+ cuando la aglutinacin es del 50 %. Sobrenadante
ligeramente turbio
o 1+ cuando la aglutinacin es del 25 %. Sobrenadante turbio.

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MTODO DE AGLUTINACIN SEMICUANTITATIVA
Cuando la reaccin es positiva, o presenta ms del 50% de positividad se procede

a cuantificar.
1.- Rotular y colocar con una pipeta graduada o automtica las siguientes
cantidades de suero problema:
0.04 ml 0.02 ml 0.01 ml 0.005 ml
2.- Colocar una gota de antgeno a cada uno de los volmenes de suero anteriores.
3.- Mezclar cada dilucin en forma circular con la bagueta o mondadientes tratando
que el dimetro de dispersin sea de 2cm en las cantidades menores y llegar a 2.5
en las cantidades
MTODO mayores, hacindolo
DE AGLUTINACIN SCREENINGcon OlaDE
misma bagueta
TAMIZAJE o mondadientes,
(Ags.
empezando
BACTERIANOS): por la dilucin ms alta.
4.- Rotar la lmina como en el paso 5 de la
prueba screening. 5.- Realizar la lectura
correspondiente en el visor.
6.- El titulo est dado por la mxima dilucin del suero que aglutina ms del 50 %
del antgeno bacteriano.
DILUCIN TITULO
0.04 ml 1/40
0.02 ml 1/80
0.01 ml 1/160
0.005 ml 1/320
Nota: Estas mezclas suero-antgeno nosonverdaderasdiluciones.
Aglutinacin Negativa Aglutinacin positiva
NOTAS:
Recuerde que en las tcnicas de aglutinacin la observacin del tiempo es
fundamental.
En general las reacciones de aglutinacin pueden observarse a simple vista
sin necesidad de uso de microscopio.
Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por
lo que debe observar las medidas universales de bioseguridad.
Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los
materiales.

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CUESTIONARIO
1.- Qu diferencia hay entre aglutinacin y precipitacin?

2.- Qu te recuerda este esquema?
Sera importante tenerlo en cuenta en la AGLUTINACION?

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PRACTICA N 12
AGLUTINACIN INDIRECTA O PASIVA
2.- Qu te recuerda este esquema?
Sera importante tenerlo en cuenta en la AGLUTINACION?
INTRODUCCIN
El desarrollo de la tcnica de aglutinacin indirecta o pasiva, ha tenido numerosas
derivaciones en el Laboratorio.
Esta verstil tcnica consiste en la aglutinacin de clulas o partculas cubiertas
con antgeno solubles. El anticuerpo tambin se puede unir a partculas, invirtiendo
en un sentido la reaccin (aglutinacin pasiva inversa) en esta prueba.
Las clulas o partculas actan como transportadores pasivos de antgenos o
anticuerpos. Generalmente el antgeno se adsorbe o se une por covalencia a la
superficie de las partculas. Se pueden utilizar eritrocitos humanos o de animales
para desarrollar pruebas de aglutinacin indirecta (hemaglutinacin indirecta o
pasiva).
Igualmente se han desarrollado sistemas indirectos que utilizan partculas inertes
tales como bentonita (arcilla de cermica), ltex (polmero del poliestireno),
colodin y carbn activado, han aumentado considerablemente la capacidad del
serodiagnstico moderno en los laboratorios de inmunologa. El transportador sirve
de aglutingeno, indicando la interaccin especfica de antgeno y anticuerpo.
Las esferas de ltex (0.81 micras) en suspensin, se comportan como un coloide
inerte con carga negativa. El ltex adsorbe fcilmente las protenas, y es una
fuente til de antgeno en partculas. Las partculas de ltex son clasificadas de
acuerdo a su tamao, diludas, cubiertas con antgeno y conservadas a 4C hasta
el momento de utilizarse.
AGLUTINACIN DE PARTICULAS DE LATEX

Singer y Plotz fueron los primeros en demostrar que la gammaglobulina humana
adsorbida al ltex sufre agregacin en presencia de factores reumatoideos en el
suero, anticuerpos Ig M contra inmunoglobulina humana.
Las tcnicas que utilizan el ltex, son desde aquel tiempo, muy populares y se
usan an en la investigacin de: Factor reumatoideo, Protena C Reactiva,
Anticuerpos a Antiestreptolisinas,

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Anticuerpos antinucleares, Anticuerpos a Toxoplasma g., Antgeno de superficie

para la Hepatitis B, etc...
Los objetivos de la prctica son conocer la metodologa y lectura de la prueba, as
como sus ventajas y limitaciones.
TCNICA DE AGLUTINACIN PASIVA

3. Aadir una gota ( 50 uL ) del reactivo de ltex sobre los crculos
con la muestra problema y los controles.
4. Mezclar con las baguetas o mondadientes hasta obtener una
suspensin Uniforme en toda la superficie de cada crculo.
5. Rotar suavemente la lmina a +/- 100 r.p.m. por 2 minutos.
Partcula Antgeno Antgeno unido
Transportadora al transportador
Antgeno Anticuerpo Aglutinacin Ag - Ac
MATERIALES:
1.- Suero problema
2.- reactivo de Ltex.
3.- Buffer glicina
4.- Controles: positivo y negativo.
5.- Tubos de 10 x 75
6.- Micropipetas.
7.- Laminas de vidrio ( fondo oscuro )
8.- Baguetas o palillos mondadientes.
9.- Reloj.
10.- Bocal con leja.

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PRUEBA CUALITATIVA
PROCEDIMIENTO
1. Llevar los reactivos y la muestra problema a temperatura
ambiente, y Mezclarlos bien antes de usarlos.
2. Colocar una gota ( 50 uL ) de la muestra, control positivo y
control Negativo en diferentes crculos de la lmina.
3. Aadir una gota ( 50 uL ) del reactivo de ltex sobre los crculos
con la muestra problema y los controles.
4. Mezclar con las baguetas o mondadientes hasta obtener una
suspensin Uniforme en toda la superficie de cada crculo.
5. Rotar suavemente la lmina a +/- 100 r.p.m. por 2 minutos.
Partcula Antgeno Antgeno unido
RESULTADOS
o Una suspensin homognea de la mezcla indica una
aglutinacin negativa.
o La presencia de pequeos agregados indica una aglutinacin
positiva.
o La lectura debe realizarse dentro de los 2 minutos siguientes al
trmino de la prueba, debido a que la evaporacin de la mezcla
de reaccin puede conducir a resultados falsos positivos.
PRUEBA SEMICUANTITATIVA.
PROCEDIMIENTO
1. Si la muestra resulta positiva, se procede a realizar la semicuantificacin.
2. Diluir el buffer glicina segn indicacin del inserto.
3. Hacer diluciones seriadas del suero con el buffer: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,
1:64,.......
4. Procesar cada dilucin segn la prueba cualitativa.
RESULTADOS
o Negativo: suspensin homognea.
o Positivo: aglutinacin en el tiempo especificado.
o El ttulo de la muestra es la inversa de la mxima dilucin a la
que se produce aglutinacin visible macroscpicamente.
NOTAS:
Recuerda hacer una buena mezcla del reactivo ( emulsin de
ltex) El tiempo de rotacin es fundamental. As como el
tiempo de lectura. Leer el inserto del kit para obtener los datos
precisos de la prueba.

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CUESTIONARIO
1. Cules son las ventajas de las pruebas de aglutinacin?

.
2. Cules son las desventajas de las pruebas de aglutinacin?
.
.

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PRACTICA N 13
SANGRIA DE ANIMALES DE USO DE LABORATORIO.
INTRODUCION
2. Cules son las desventajas de las pruebas de aglutinacin?
.
.
Los animales de laboratorio utilizados en la prctica deben ser sangrados antes del
protocolo de inmunizacin para contar con el suero testigo, el cual servir
posteriormente en la prctica para detectar la produccin de anticuerpos al
compararlo con el suero extrado despus de haber concluido el esquema de
inmunizacin. Los sitios ms comunes para la obtencin de muestras de estos
animales es la puncin capilar y la puncin venosa. .Se puede pinchar una vena
superficial para obtener sangre destinada a realizar valoraciones hematolgicas o
qumicas que requieran solamente 50-200 ul (aproximadamente equivalente a 1-4
gotas). Normalmente no se necesita anestesia ya que el estrs asociado sera
probablemente mayor que la incomodidad de un pinchazo de aguja o de una puncin
con un pequeo objeto esterilizado puntiagudo.
Equipamiento: Hay que utilizar una aguja o lanceta esterilizada para pinchar la piel
y el vaso sanguneo subyacente. No es recomendable utilizar una hoja de
escalpelo (bistur) ya que su uso es impreciso y puede ocasionar una mutilacin
accidental del animal o de la persona, si el animal no est adecuadamente sujeto.
Para familiarizarse con la ubicacin de una vena, se recomienda encarecidamente
estudiar primero la anatoma correspondiente en los animales muertos, para evitar
tener que realizar repetidas entradas fallidas a la hora de encontrar un vaso
sanguneo.
Un lugar habitual para practicar la puncin venosa en un animal pequeo es la
vena coccgea o de la cola. En pequeos roedores, la extremidad de la cola puede
ser amputada y en el caso de los ratones a diferencia de las ratas no parece implicar
la eliminacin de ninguna vrtebra coccgea. El corte de la cola tiene que realizarse
una sola vez o dos como mximo. (En ratas topo desnudas se puede hacer
pequeas extirpaciones al final de la cola, que vuelve a crecer en 4-6 semanas
y entonces puede realizarse de nuevo.)
En pequeos animales sin cola, como los cobayas y hmsteres, se puede utilizar
la vena yugular o la de la oreja, pero requiere gran habilidad; en estos mamferos,
la puncin cardaca con anestesia general puede ser el mtodo ms adecuado.
Es importante mantener una antisepsia completa a lo largo del muestreo, de forma
que todo pelo o resto de piel superficial de encima de la vena, sea retirado. El mtodo
para eliminar el pelo depender de la localizacin de la vena y de la especie
animal. Las cremas depilatorias qumicas pueden aplicarse en zonas difciles pero
generalmente no se recomiendan ya que pueden provocar reacciones en la piel y
contaminar las muestras.
El alcohol (etanol 70% en agua) desengrasar efectivamente la piel de aquellas
especies en las cuales la secrecin de glndulas sebceas sea pronunciada (por
ejemplo en las ovejas), pero puede contaminar una muestra de sangre si no se le
deja evaporar.
Para disminuir toda molestia asociada a la puncin venosa, algunos cientficos han
investigado recientemente el uso de cremas de anestesia local aplicadas sobre la
piel unos 30-60 minutos antes de tomar la muestra.
Para cada animal de experimentacin se realizan tcnicas de sangra diferentes,
teniendo en cuenta que algunas veces se quiere mantener vivo el animal ( sangra
parcial o de prueba), mientras que en otras ocasiones se extrae el mximo de
sangre posible ( sangra total o en blanco).

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TIPOS DE SANGRIA EN ANIMALES DE LABORATORIO PARA LA
Los animales ms usados en el laboratorio clnico son: conejo, ratn, cobayo, rata,
cabra, carnero, caballo y gallina. La tabla 1 muestra los lugares para la
venopuncin y la venoseccion en pequeos mamferos.

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TIPOS DE SANGRIA EN ANIMALES DE LABORATORIO PARA LA
OBTENCION DE
SANGRE
1. Puncin cardiaca
2. Puncin de la vena safena
3. Puncin de la vena central de la oreja
4. Puncin de la vena cubital
5. Puncin de la vena yugular externa.
PUNCION CARDIACA.
La puncin cardaca siempre deber llevarse a cabo bajo anestesia general
para todos los Animales de Laboratorio.
Normalmente se pincha el ventrculo izquierdo con el animal tumbado sobre el lado

derecho.
(Alternativamente el ventrculo derecho puede ser penetrado y el animal

tumbado en el lado
Izquierdo para el muestreo venoso.)
Otro mtodo igualmente aceptable es colocar el animal de espaldas
e introducir una larga aguja justo debajo del esternn hasta el corazn .Es
comn utilizar este mtodo para sangras totales, pero tambin es til para
obtener muestras nicas de sangre en cobayas y hmsteres y
ocasionalmente en los hurones.
Cuando se aplica este procedimiento con fines terminales, hay que asegurar la muerte
despus de la exanguinacin administrando una sobredosis de anestsico
o practicando una incisin en el corazn.
La puncin cardaca repetida habr de justificarse cuidadosamente en una
autorizacin de proyecto debido a su potencial de efectos adversos y no se
recomienda para cualquier especie es preferible la canulacin de larga
duracin.
MATERIALES:
Las agujas para la puncin cardiaca deben ser suficientemente largas para
penetrar en el ventrculo.
Para un solo sangrado (con la recuperacin subsecuente) en animales
pequeos, una aguja de 25 mm x 21-23 G ser suficiente.
Para otros animales el tamao de la aguja habr de ser aumentado en
relacin con el tamao del animal.
La puncin cardaca para la exanguinacin en animales de mayor tamao
como conejos, probablemente se llevar mejor a cabo con una aguja de 25-
50 mm x 18 G acoplada a una jeringuilla de 10 o 20 ml. Tambin es til
tener una o dos jeringas extras listas que puedan ser acopladas
rpidamente a la aguja.

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PUNCION DE LA VENA SAFENA:
La tcnica emplea la vena safena lateral, la cual discurre primero por la
cara caudal(posterior) de la extremidad posterior y luego lateralmente sobre
la articulacin del tarso
Utilizada para rata, ratn,hmster, el gerbillo, la cobaya, el
hurn y mink. No es necesaria la sedacin
Limpiar la zona con etanol 70%
uso de sedantes que contengan vasodilatadores perifricos
( Hypnorm,dosis bajas)utilizados en laboratorio europeos
Inmovilizadores : tubo de plstico
transparente Animales grandes :
tubos y cepos de plstico
Inmovilizar el miembro posterior del animal, aplicando una ligera presin
hacia abajo, justo por encima de la articulacin de la rodilla.
MATERIALES:
1. Hoja de bistur n 11
2. Aguja de 25 27 G en ratones.
3. Volmenes pequeos.

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PUNCION DE LA VENA CENTRAL DE LA OREJA:
El conejo ser envuelto con una toalla que se envuelve alrededor del
cuerpo, y se cruza en su abdomen. Se relajar ms si se envuelve bastante
bien.
Se utiliza un sedante como acepromacina o fluanisona que causa la
dilatacin de los vasos sanguneos perifricos.
El sitio se afeita con una hoja de bistur amplio (por ejemplo, no. 23). El
dao a la piel se evita mediante el apoyo a la oreja de debajo utilizando el
dedo ndice.
El sitio debe ser desinfectado antes de la puncin.
La arteria central es normalmente fcil de perforar a lo largo de la mayor
parte de su longitud. Comience por lo ms distalmente posible, de manera
que ms muestras pueden ser tomadas si es necesario ms adelante.
La sangre se puede recoger usando equipo al vaco y una aguja (0,7 x 25
mm) 22G 1.
La aguja debe ser asegurada mediante la celebracin firmemente con el
pulgar para evitar la retirada accidental si el animal se mueve.
Igualmente la sangre se puede recoger usando una aguja calibre 21x1mm,
dejando que la sangre fluya en el tubo de prueba.
Rotacin o el movimiento ligero de la punta de la aguja pueden ayudar a la
recogida de sangre.
El tubo debe ser retirado antes de la aguja. Aplicar presin sobre el sitio de
puncin usando el algodn y retirar la aguja.

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Facultad de
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El algodn se mantiene en su lugar durante unos minutos con un clip de

papel grande, que debe ser doblado hacia afuera ligeramente para evitar la
aplicacin de una presin innecesaria.
PUNCION DE LA VENA CUBITAL EN UNA GALLINA:
La gallina debe levantarse con cuidado mientras se debe inmovilizar las

alas con una mano. La gallina se apoyara en el cuerpo del manipulador.
Una mano se utiliza para mantener las patas, con la otra sostiene la gallina
alrededor de sus alas.
Se necesitan dos operadores. La gallina se mantiene sobre la mesa con un
ala inmovilizada bajo su cuerpo. Una persona sostiene dos patas y agarra
el cuerpo, mientras que la otra persona localiza la vena cubital bajo el ala
superior.
Los dedos del operador se utilizan para inmovilizar el ala en la posicin
correcta.
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El rea alrededor del vaso sanguneo debe ser desinfectado antes de la

venopuncin.
La vena cubital est listo para la puncin. Las plumas deben ser divididos
para visualizar la vena.
Se debe utilizar agujas de 22G (0,7 mm) .La aguja debe insertarse en la
medida de lo posible en el extremo distal de la parte superior (hmero) del
ala. La vena es bastante mvil y un hematoma se puede formar fcilmente
durante la puncin.
Si la aguja est en la posicin correcta, la sangre debe correr rpidamente
en el tubo.
El tubo se retira de la aguja antes de que la aguja se retira de la vena. Es
muy importante que el flujo sanguneo se detenga usando algodn
firmemente contra el sitio de puncin.
PUNCION DE LA VENA YUGULAR EXTERNA:

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Para la tomar muestras de sangre en cerdos pequeos se ubica el valle en

forma de V, Coloque el cerdo en sus espaldas e incline la cabeza hacia atrs.
Otra forma de inmovilizar cerdos pequeos es colocarlos boca arriba con
una persona sujetndolo. Incline la cabeza hacia atrs.
Las flechas indican el sitio de puncin para tomar muestras de sangre
utilizando equipos al vacio.
Utilice una aguja calibre 20.
La sangre debe fluir fcilmente cuando se inserta el tubo al vaco en el
soporte de la aguja.
NOTAS:
La seleccin de los animales para uso en el laboratorio debe basarse en:
Cantidad de antgeno disponible.

Cantidad de anticuerpo o antisuero que se necesita preparar
Relacin filogentica entre las especies de origen del antgeno y la especie
usada para obtener el antisuero.
Uso que se le dar a los anticuerpos.
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CUESTIONARIO:
1.- Qu consideraciones debes tener en cuenta antes de elegir un animal para ser
inoculado?

..

.
2.- Qu debe hacerse Antes de realizar la sangra a un animal despus de haber

recibido el protocolo de inoculacin?

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PRACTICA N 14
SANGRIA DE LOS CONEJOS INOCULADOS EN LA CLASE DE
INMUNOLOGIA I.
INTRODUCION
Los conejos blancos de Raza Nueva Zelanda inoculados en la clase de

Inmunologa I son dos: A uno se le inocula glbulos rojos humanos del grupo
O y al otro Una cepa de Salmonella entrica ATCC 14028.
Qu son las cepas ATCC?
Son cepas de bacterias que derivan de la empresa comercial American
Type Culture Collection.
Estas cepas ATCC son preparadas como controles para la rpida
identificacin, concentracin mnima inhibitoria de los antibiticos y paneles
de sensibilidad a los antibiticos. Las especies y cepas especificadas, se
recomienda su uso y se encuentran enumeradas en un folleto hecho por la
empresa.
El Subcultivo repetido puede ser perjudicial para el control de calidad de las cepas.
Cada pasaje lleva el potencial de contaminacin, cambio y mutacin gentica,
tornndose el cultivo cada vez ms lejos del original.
ATCC proporciona cepas microbianas de la mejor calidad necesarias para
mantener los programas de control de calidad sobresalientes. Al identificar las
cepas microbianas que se manejan, almacenan y prueban con la experiencia
incomparable que proviene de ms de 85 aos de experiencia, de bsqueda del
logotipo de cultivos originales de ATCC. Las cepas ATCCson meticulosamente
caracterizada y conservadas para mantener estos materiales de una manera que
permite la reproducibilidad de los resultados a travs del tiempo y entre
laboratorios de todo el mundo.
COMPROBACION DEL ANTISUERO ANTI SALMONELLA ENTERICA ATCC

14028
Al conejo inoculado con la cepa segn el protocolo establecido fue sangrado

y se le tomaron dos tubos de sangre de la vena central de la oreja en dos tubos
secos estriles, se dej coagular la sangre y se centrifugo por 10 minutos a
3,500 r.p.m.
El suero se separ de los hemates y se procedi a enfrentarlo con cepas
bacterianas para comprobar su especificidad, mediante el mtodo de
aglutinacin en placa.
Se usaron las siguientes cepas:
1. Cepa salvaje de Salmonella enteritidis o entrica
2.Glob.
Escherichia
Rojos coli ATCC 25922
3.O
Enterobacter
al 1% aerogenes
0,2 ATCC 0,2
0,2 13048 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
4. Proteus vulgaris ATCC13315
El esquema de trabajo fue el siguiente:
a)SeSe realizaenuna
colocan emulsin
bao mara abacteriana
37C por en solucin
2 horas salina
y luego enfisiolgica
estril de cada una de las cepas
refrigeracin a 4C por 18 Horas. bacterianas.
b) En la placa de aglutinaciones se coloca en el cuadriltero definido
50 microlitros de antisuero y 2 3 asadas (asa de Koll) de emulsin
bacteriana.
c) Se mezcla y rota a 100 r.p.m. por 2 minutos.
d) Lectura en visor con luz indirecta.

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CEPA S. E. coli P. E. S.enterica

entrica vulgaris aeroge salvaje
nes
Antisuero 50 uL 50 uL 50 uL 50 uL 50 uL
Emulsin
de la cepa 2-3 2-3 2-3 2-3 2-3
asadas asadas asadas asadas asadas
Rotac.:2
lectura Positivo. Negativo Negativo Negativo Positivo
Se comprueba que el antisuero es especifico

a la salmonella que le dio
origen y a la salmonella salvaje (es una salmonella entrica).
TITULACIONDELSUEROHEMOLITICO
Se realiza una toma de muestra al conejo para obtener

aproximadamente 5 10 c.c. de sangre para la titulacin del suero
hemoltico.
Se prepara una solucin madre para trabajar la titulacin 1/10. Se
prepara una serie de tubos de hemolisis en las cuales se mezclan
volmenes iguales de diluciones crecientes de hemolisina O
(dilucionesseriadas) en suero fisiolgico y una suspensin al
1% de hemates humanos O lavados y no sensibilizados, segn la
siguiente tabla.
Se colocan en bao Maria a 37C por 2 horas, y en refrigeracin a 4C por 18
horas.
TITULACON DEL SUERO ANTIGLOBULAS ROJOS HUMANOS O

(HEMOLISINA)
TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9
TITULO 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120
Sol. Sal.
0,85 % 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Sol. Madre
1/10 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
2.Glob.
Escherichia
Rojos coli ATCC 25922
3.O
Enterobacter
al 1% aerogenes
0,2 ATCC 0,2
0,2 13048 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
4. Proteus vulgaris ATCC13315
Se colocan en bao mara a 37C por 2 horas y luego en

refrigeracin a 4C por 18 Horas.
El ltimo tubo que presente hemolisis total es el que nos indica el ttulo de
fuerza de hemolisis que presenta el antisuero anti glbulos rojos humanos
o hemolisina.

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PRACTICA N 15
PRUEBA DE TUBERCULINA (MANTOUX)
Definicin
La prueba de la tuberculina es una tcnica normalizada por la OMS en 1964, que
Charles Mantoux present en 1908 ante la Academia de Ciencias. Su trabajo de
reacciones intradrmicas demostr que su test era ms sensible que los
anteriormente utilizados. Se basa en la capacidad de la micobacteria de inducir una
reaccin de hipersensibilidad retardada, entre la 2 y 12 semana tras la infeccin,
que son capaces de reconocer las fracciones antignicas y desencadenar una
respuesta frente al derivado proteico purificado (PPD) tuberculnico.
Objetivos
El objetivo principal ser realizar correctamente la administracin y lectura de
resultados de la prueba de Mantoux .
Desarrollo
Equipo y
Material
Guantes
no
estriles.
Gasa estril impregnada con antisptico.
Jeringa de tuberculina de 1ml (graduada como mximo en dcimas de ml.)
dotada con aguja del calibre 26, 10mm de longitud y bisel corto.
Solucin de PPD. Cantidad a administrar: 0,1ml de PPD RT-23 con
Tween80 (2UT) o 0,1ml de PPD CT-68 (5UT) ambas equivalentes a 5UT de
PPD-S (estndar internacional desde 1951).
Regla transparente, flexible, suave y
calibrada en mm. Bolgrafo de sistema
convencional de bola.
Descripcin de la tcnica
Administracin: Con el brazo del nio ligeramente flexionado y apoyado en una
superficie plana, exploraremos e identificaremos una zona del antebrazo
(preferentemente el no dominante) a nivel de la unin entre el tercio medio y el
superior, libre de escoriaciones y alejada de los vasos, donde realizaremos la
tcnica. Procederemos a la limpieza de la zona con el antisptico elegido,
dejndolo secar completamente antes de la inyeccin para evitar que la
penetracin en la dermis afecte al resultado. Se utilizaran guantes desechables no
estriles, para la administracin de este test, como medida universal profilctica.
Se introduce la aguja en la epidermis, con el bisel girado hacia arriba, intentando que
la punta quede intradrmica y no subcutnea, en direccin de la zona distal a la
proximal del antebrazo. La inyeccin del contenido debe ser lenta y cuidadosa para
evitar la salida de lquido al exterior, consiguiendo una ampolla del tamao similar a
una lenteja, de bordes definidos, plida y con aspecto de piel de naranja, que se
absorber en unos minutos. (imagen 4: tcnica) En caso de no formarse la ppula
significar que el contenido se ha vertido a la dermis, con lo que se deber repetir la
prueba en una zona distante de la anterior como

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Tecnologa Mdica
mnimo 5 cm. No debe manipularse la zona hasta la completa absorcin del

contenido, para evitar romper o aplastar la ampolla.
Se identificar la zona de la puncin con la rotulacin de una circunferencia de ms

de tres centmetros de dimetro.
Lectura: se debe realizar en las 48-96h posteriores a la inoculacin de la prueba de
tuberculina, y su base la constituye la ausencia o presencia de induracin y su
tamao, que se determina como el dimetro de induracin transversal al eje mayor
del antebrazo. (imagen 5: lectura correcta e incorrecta)
Se realizar medicin de la induracin, no del eritema circundante, directamente,
sobretodo en personal poco experimentado. Para ello emplearemos un bolgrafo
con punta de bola tradicional que traccionaremos a travs de la piel circundante hacia
la induracin, detenindose en el lugar donde se inicia sta. Realizaremos el
procedimiento de igual manera en la zona contralateral, delimitando un espacio
que corresponde al endurecido, facilitando as la medicin de los puntos finales
trazados y obteniendo el dimetro de la zona indurada con la regla flexible
Registro: se debe anotar el dimetro en milmetros (no como positivo o negativo),
el tiempo exacto transcurrido desde la realizacin de la prueba diagnstica, y
posibles factores que hayan podido influir en el resultado o lectura del test
intradrmico.
Resultados: Cada sociedad elige unos puntos de corte de positividad de la prueba
de Mantoux, hecho que junto a la infradeclaracin de la enfermedad, hace menos
uniformes los resultados

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Tecnologa Mdica
obtenidos en los diferentes pases y poco comparables. Estos estndares estn

ligados a la prevalencia de la enfermedad en cada medio.
As la American Academy of Pediatrics considera la intradermoreaccin de
Mantoux positiva:
Induracin Casos Positivos
5 mm Contacto ntimo con casos ciertos o sospechosos.
Nios sospechosos de enfermedad tuberculosa clnica o radiolgica.
Inmunodeprimidos o Infectados por el VIH.
10 mm Menores de 4 aos
Malnutricin, linfoma, Enfermedad de Hodgkin, diabetes o IRC.
Expuestos a adultos de riesgo: infectados por el VIH, drogadictos,
vagabundos, cuidadores de instituciones, institucionalizados,
seroconversores de la prueba de tuberculina en los dos ltimos aos.
Nios con riesgo aumentado de tuberculosis diseminada.
15 mm Nios mayores de 4 aos sin contacto ni factores asociados de riesgo.
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7. Solventes: Si trabaja con sustancias, evite inhalarlo.

8. Desechos: Si utiliza guantes, frascos de medicamentos vacos, jeringas,

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