Manual de Inmunologia

UNIVERSIDAD MARIANO GLVEZ FACULTAD DE CIENCIAS MDICAS Y DE LA SALUD CARRERA DE MDICO Y CIRUJANO
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
INMUNOLOGA
Licda. Ana Margarita Paz Morales de Ramrez (QB, MA) Licda. Isabel Cristina Gaitn Fernndez (QB, MA) Guatemala, 2011
Universidad Mariano Glvez Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud Carrera de Mdico y Cirujano
NDICE
Titulo de la prctica
Practica 1. Practica 2. Practica 3. Practica 4. Practica 5. Practica 6. Practica 7 Practica 8 Practica 9 Practica 10 Bioseguridad Venipuncin y manejo de especmenes hematolgicos Clulas sanguneas Inmunodifusin radial Reacciones de Precipitacin Reacciones de aglutinacin Reacciones de Aglutinacin directa e indirecta (Grupo ABO y Rh) Hemaglutinacin pasiva Inmunocromatografa Ensayo inmunoenzimticos (ELISA)
Pgina
3 8 18 26 31 35 39 43 47 50
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Practica 1
1. Introduccin
Las siguientes son las prcticas generales requeridas para todo laboratorio que maneja sustancias infecciosas.
1.
Deber estar disponible un manual de procedimientos especficos (de seguridad) en el laboratorio para todo el personal que trabaje en l. Todos sus requerimientos debern ser seguidos, el mismo estar documentado y ser revisado y actualizado con regularidad. Deber estar colocado en un lugar accesible para todos y ser firmado por todo el personal. El personal debe recibir entrenamiento sobre todos los potenciales peligros asociados con el trabajo, as como sobre las precauciones necesarias para prevenir la exposicin a agentes infecciosos y la disposicin y descarte de materiales. El personal debe mostrar evidencia de que ha entendido las instrucciones dadas en el entrenamiento, el cual deber ser documentado y firmado por el personal y por el supervisor; debern tambin implementarse programas continuos de entrenamiento. No est permitido comer, beber, fumar, guardar cualquier tipo de alimentos, pertenencias personales o utensilios. Est prohibido maquillarse, colocarse o removerse lentes de contacto. El uso de lentes de contacto est permitido solamente cuando no hay otra opcin. El uso de joyas y accesorios no es recomendado en el laboratorio. Est prohibido pipetear con la boca cualquier sustancia. El cabello largo debe estar atado atrs o arreglado de manera que no entre en contacto con las manos, con las muestras, con los contenedores ni con el equipo. El acceso al laboratorio y reas de apoyo est limitado a personal autorizado. No se admiten nios. Las heridas abiertas, cortadas, rasguos y abrasiones deben estar cubiertos con materiales a prueba de agua. Los laboratorios deben mantenerse limpios. El almacenamiento de materiales que no son pertinentes al trabajo y que no puedan ser fcilmente descontaminados (por ejemplo revistas, libros, correspondencia), debe ser minimizado; el trabajo de papelera y escritura de reportes debe estar aparte de las reas de trabajo con material infeccioso. Deber usarse ropa protectora, apropiadamente cerrada, por todo el personal, incluyendo visitantes, estudiantes y todas las personas que entren o trabajen en el laboratorio. Deber usarse zapato cerrado y con tacones adecuados en todas las reas de laboratorio. La bata del laboratorio debe ser usada siempre. durante las operaciones de rutina o bajo circunstancias especiales (ej. Accidentes), debe
2.
3.
4. 5. 6. 7. 8.
9.
10. Cuando se sabe de un riesgo potencial de exposicin a salpicaduras y otros objetos, ya sea
usarse proteccin de los ojos y la cara. Debe tenerse cuidadosa identificar los procedimientos que requieran proteccin de ojos y cara.
consideracin para
11. Para todos los procedimientos que involucren contacto directo con la piel y material biolgico
o animales infectados, deben usarse guantes (de ltex, vinilo u otro co-polmero). Estos debern ser removidos antes de abandonar el laboratorio y descartados.
12. La ropa protectora (bata) no debe ser usada en las reas que no son de laboratorio (pasillos,
biblioteca, etc.).
13. Si existe sospecha o certeza de exposicin, la ropa contaminada debe ser descontaminada
antes de lavarla.
14. El uso de agujas, jeringas y otros objetos punzo-cortantes debe estar estrictamente limitado;
las agujas y jeringas deben ser usadas slo para la inyeccin parenteral y aspiracin de fluidos de animales de laboratorio. Debe tenerse especial cuidado cuando se usan agujas y jeringas para evitar auto-inoculacin y generacin de aerosoles durante su uso y descarte. Las agujas no deben ser dobladas, cortadas, tapadas o removidas de las jeringas; deben ser colocadas rpidamente en un contenedor resistente de punzo-cortantes para su descarte.
15. Las manos deben ser lavadas despus que se han quitado los guantes y antes de dejar el
laboratorio, as como en cualquier momento despus de manipular material conocido o sospechoso de estar contaminado.
16. Las superficies de trabajo deben estar limpias y descontaminadas con un desinfectante
adecuado (etanol 70%) al final del trabajo y despus de cualquier salpicadura de material potencialmente infeccioso. No usar cloro en las campanas, excepto en caso de algn derrame. Es altamente corrosivo.
17. Si algn material o equipo debe salir del laboratorio para servicio de mantenimiento o para
descarte, debe ser apropiadamente descontaminado y etiquetado como tal. Es responsabilidad del operador autoclavear y descartar todo desecho potencialmente peligroso.
18. Debe realizarse regularmente un monitoreo de las autoclaves usadas para descontaminar,
usando indicadores biolgicos y todos los resultados deben ser archivados.

19. Todo material contaminado, slido o lquido, debe ser descontaminado antes de descartarlo o
de reusarlo.
20. Todo el tiempo deben estar disponibles los desinfectantes efectivos dentro de las reas en
donde se manipula o se almacena material infectivo (ej: hipoclorito al 10%).

21. Para el transporte de materiales infecciosos dentro de las instalaciones, debern usarse
contenedores a prueba de derrames.
22. Las salpicaduras, accidentes o exposiciones a materiales infecciosos, deben ser reportados
inmediatamente al supervisor del laboratorio. Deben mantenerse registros escritos de tales incidentes dentro del Departamento, y los resultados de las investigaciones de tales incidentes deben ser usados para educacin continua.
23. Debe mantenerse un programa efectivo de control de insectos y roedores.
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2.
Objetivo General
En esta prctica el estudiante aprender las normas de bioseguridad aplicadas al laboratorio de inmunologa. 3. Objetivos Especficos
Que el estudiante: Se familiarice las normas de bioseguridad en el laboratorio de inmunologa Conozca la importancia de los riesgos biolgicos del manejo de material infeccioso Aplique sus conocimientos en la resolucin de casos de accidente ocupacional con material infeccioso Procedimiento
4.
Revise literatura sobre bioseguridad en el laboratorio y esuelva los siguientes casos de accidente ocupacional: CASO No. 1 Edad: 34 aos Sexo: femenino Profesin: tcnico de laboratorio Evento: Manipulacin de tubo de ensayo para procedimiento de valores sanguneos Situacin: Ruptura de tubo de ensayo que provoc herida del dedo medio de la mano derecha en contacto con sangre de paciente VIH positivo, se desconoce valores de CD4 y carga viral. Cul es el riesgo para el tcnico de laboratorio al entrar en contacto con la sangre del paciente? Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al tcnico de laboratorio? Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el tcnico para disminuir el riesgo de contacto con el material infeccioso? CASO No. 2 Edad 27 aos Sexo. Femenino Profesin: Mdico Evento: colocacin de sonda nasogstrica a con tuberculosis pulmonar, con franca hemoptitis y hematemesis.
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Situacin: hemoptitis y hematemesis activa durante el procedimiento de colocacin de la sonda que contamina la conjuntiva del mdico. Cul es el riesgo para el mdico al entrar en contacto con los fluidos del paciente? Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al mdico? Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el mdico para disminuir el riesgo de contacto con el material infeccioso? CASO No. 3 Edad: 42 aos Sexo: masculino Profesin: mdico Evento: puncin del ganglio cervical en paciente VIH positivo en fase de SIDA, Situacin: realiza procedimiento de obtencin de muestra y al separar la aguja de la jeringuilla el protector se separa y se introduce profundamente en el pulgar de la mano derecha Cul es el riesgo para el mdico al entrar en contacto con los fluidos del paciente? Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al mdico? Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el mdico para disminuir el riesgo de contacto con el material infeccioso? CASO No. 4 Edad: 22 aos Sexo: masculino Profesin: estudiante de medicina Evento: preparacin de pipetas de Westerngreen para la evaluacin de velocidad de sedientacin Situacin: realiza procedimiento de llenado de la pipeta, sin embargo el estudiante NO utiliza un pipetor y lo hace con la boca. La sangre entra en contacto con su boca. Cul es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con los sangre del paciente? Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al estudiante? Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el estudiante para disminuir el riesgo de contacto con el material infeccioso?
CASO No. 5 Edad: 19 aos Sexo: femenino Profesin: estudiante del curso de Inmunologa Evento: preparacin de reactivos para la elaboracin de agua regia (cido clorhdrico y cido ntrico, proporcin 3:1) Situacin: al realizar la mezcla de suero y reactivo el estudiante deja caer sobre la mesa de trabajo gots, de lo cual no se da cuenta. Posteriormente pone el antebrazo sobre el lquido derramado Cul es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con el suero y reactivos? Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al estudiante? Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el estudiante para disminuir el riesgo de contacto con el material infeccioso? CASO No. 6 Evalu la bioseguridad en el laboratorio de inmunologa, haciendo nfasis en los cuidados que se debe de tener para mantener un ambiente seguro para las personas que trabajen en el, incluya: Descarte de material bioinfeccioso Limpieza del rea de trabajo Lavado de cristalera Lavado de manos 5. Referencia
Laboratory Biosafety Guidelines. 2004. 3rd edition. Published by the authority of the Minister of Health Population and Public Health Branch, Centre for Emergency Preparedness and Response, Government of Canada. Pp. 19-23.
VENIPUNCIN Y MANEJO DE ESPECIMENES HEMATOLGICOS

Prctica 2
1. Introduccin Las venas de un paciente constituyen la principal fuente de especmenes para anlisis de laboratorio, como punto de entrada de medicamentos, as como el sitio ideal para transfusiones sanguneas y/o procedimientos intravenosos. El proceso mediante el cual la sangre es removida de la vena es conocido como venipuntura o flebotoma. La importancia de la flebotoma reside en que es el primer contacto entre el laboratorio y sus pacientes, mientras que desde el punto de vista de la muestra, un proceso cuidadoso conlleva una muestra apropiadamente colectada, as como la garanta de la seguridad de su origen y el correcto envasado y transporte, factores necesarios para la correcta evaluacin e informe de los exmenes a realizar. La toma de muestra de sangre para anlisis de laboratorio se puede realizar mediante las siguientes tcnicas: venosa o perifrica y capilar. Para la mayora de los exmenes clnicos, incluyendo hemogramas y dosificacin de hemoglobina, se recomienda utilizar sangre venosa, mientras que para las frmulas leucocitarias o frotes perifricos puede extraerse sangre en el lbulo de la oreja o de la yema de un dedo. En los casos de nios, se recomienda utilizar la yema del dedo gordo del pie o del taln. 2. Objetivos Que el estudiante: Se familiarice con el equipo utilizado para la extraccin de sangre. Realice la extraccin de sangre venosa utilizando jeringa o equipo vacutainer. Conozca la importancia de realizar correctamente este procedimiento.
3. Alcance En esta prctica el estudiante aprender el procedimiento correcto de extraccin de sangre venosa. 4. Antecedentes REQUERIMIENTOS PREVIOS A LA VENIPUNTURA 4.1 Orden mdica
Una solicitud mdica debe acompaar cada muestra admitida dentro del laboratorio. Dicho documento debe contener la informacin apropiada para el correcto procesamiento de la muestra. Los elementos esenciales de una orden mdica son: Nombre del paciente Nmero de identificacin del paciente y/o nmero de historia clnica Gnero y edad del paciente Nombre completo del mdico solicitante
a) Anlisis requeridos 4.2 Equipo necesario para la venipuncin El siguiente equipo es necesario para la venipuntura de rutina: Equipo Vacutainer o Tubos de vaco: Estos dispositivos estn diseados para llenarse con un volumen predeterminado de sangre por medio de vaco, esto garantiza una adecuada relacin entre sangre y anticoagulante. Los tapones de goma estn codificados por color de acuerdo con el aditivo que contienen as por ejemplo, los tubos morados (EDTA) son los ms utilizados para hematologa rutinaria y los tubos celestes (citrato) para pruebas de coagulacin. Agujas especiales para adaptador. Adaptador para tubos de vaco.
o o -
Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc. Agujas: Estn numeradas dependiendo de su calibre. Para coleccin de sangre para hemogramas, se recomienda una aguja de dimetro de 0.8mm (21G) para evitar dao a las clulas. Las agujas de 0.9-1.1mm de dimetro (20G-19G) se utilizan normalmente para puncin venosa en adultos. Torniquete: Generalmente una liga plana de ltex. Alcohol: Etlico o isoproplico al 70%. Algodn Gasas y/o vendas adhesivas Dispensador de agujas
4.3 Etiquetado de los tubos Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de los anlisis concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el etiquetado para garantizar la calidad de la muestra pre-analtica son: Nombre o iniciales del paciente Nmero de identificacin del paciente Fecha y hora de la toma de muestra Iniciales del flebotomista
PUNCIN VENOSA Fundamento terico La puncin venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las pruebas necesarias en hematologa. Las venas de eleccin suelen ser las de la cara anterior del antebrazo (vena cubital, vena ceflica y la vena baslica) porque resulta fcil acceder a ellas. Las cifras hemticas permanecen constantes no obstante el sitio seleccionado para obtener la puncin venosa. Preparacin del paciente Instruya al paciente sobre la tcnica para tomar la muestra. problemas hemorrgicos o de circulacin, o alergias en ltex. Valore la existencia de
Evite puncionar en un rea con hematoma, fstulas, quemaduras, escoriaciones de la piel, cicatrices o del costado en que se ha realizado mastectoma reciente. Evite puncionar en el brazo donde hay venoclisis, inyeccin intramuscular previa o administracin de medicamentos va intravenosa. Avisar al paciente que al introducir la aguja sentir dolor. Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba. Solicite ayuda del paciente, si ste est consciente, para realizar palanca con el brazo libre. Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con masajes. Se debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios minutos antes de realizar la puncin. Si el paciente no tiene pruebas de glucosa o electrolitos, favorecer el ejercicio leve del brazo.
Metodologa Precauciones generales Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene. Practique las precauciones universales mnimas con todo paciente a ser atendido.Toda muestra debe ser considerada potencialmente infecciosa y se deben tomar las precauciones que garanticen la seguridad del flebotomista y de los pacientes.
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El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se le considere nuevo. o Tome precauciones al manipular agujas y/o lancetas. o No deje agujas y/o lancetas usadas en la mesa de trabajo. o No coloque el protector a la aguja. o Evite que los nios toquen o jueguen con los equipos de flebotoma.
Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. Los recipientes que contienen algodn y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirn solamente al momento de usar. Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se mantendrn puestos durante todo el procedimiento. Si ocurre un pinchazo accidental, informar inmediatamente al jefe de laboratorio. Mantenga la calma, y lvese inmediatamente con agua, jabn y alcohol. Favorezca la salida de sangre por presin continua.
Procedimiento en adultos Identifique correctamente al paciente. correctamente para la extraccin. Preprelo
Coloque un torniquete en la parte superior del brazo (aproximadamente 5 cm por encima del pliegue) para producir congestin venosa. El torniquete prolongado causa estasis y hemo-concentracin. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresin del msculo no mayor a 1 mm. Seleccione el sitio de la puncin: Pida al paciente que abra y cierre el puo varias veces; escoja una vena accesible. Limpie el sitio de la puncin, previo a puncionar debe estar seco. Debe tener presente que una vez realizada la decontaminacin, no debe volver a tocar el rea venosa. Para realizar la puncin el paciente debe tener el puo cerrado. Coloque la punta de la aguja en un ngulo de 15-30 sobre la superficie de la vena escogida y atraviese la piel
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con un movimiento firme y seguro, hasta el lumen de la vena. Una vez que penetra en la vena, la sangre llena los tubos aspiradores automticamente por la presin negativa dentro del tubo en el caso de Vacutainer, mientras que con jeringas se debe jalar el mbolo con movimiento continuo para extraer la sangre hasta el volumen requerido. Evite presionar fuertemente la aguja durante la extraccin. Solicite al paciente que abra el puo y afloje el torniquete para que la sangre fluya mejor y remueva la aguja del brazo con movimiento suave al terminar de colectar, sin apretar el rea de la puncin con el algodn. Presione el algodn sobre el sitio de la puncin aplicando una presin adecuada y no excesiva para evitar la formacin de hematoma. Descartar las agujas y/o jeringuillas en un contenedor apropiado.
Procedimiento en nios En nios mayores de 6 meses, se recomienda hacer la extraccin del brazo como en adultos, pidindole a un adulto que colabore en mantener inmvil al nio, en particular el brazo. En el caso de nios menores de 6 meses, se proceder a extraer la muestra del taln con una lanceta descartable. Antes de la extraccin conviene calentar el taln frotndolo entre las manos para favorecer la irrigacin de la zona. Desinfectar con un trozo de algodn embebido en alcohol, dejar evaporar y punzar con la lanceta en la zona lateral del taln. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. Secar la zona con un trozo de algodn seco y una vez que no haya sangrado, colocar una curita o apsito.
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PUNCIN CAPILAR Fundamento terico Es utilizada para extraer pequeas cantidades de sangre para determinaciones de hemoglobina, hematocrito y frotes perifricos. Hay tres lugares de donde realizar esta puncin: el lbulo de la oreja, la yema del dedo y el taln del pie. Metodologa Tome la muestra de las yemas de los dedos o lbulo de la oreja (adultos); del dedo pulgar del pie o del tobillo (en lactantes o nios menores de 6 meses). Desinfecte el sitio de la puncin, squelo y puncione la piel con una lanceta estril que no debe penetrar ms de 2 mm. Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un microtubo y prepare las laminillas con esa muestra. No oprima el sitio de la puncin para obtener sangre porque se altera la composicin hemtica o invalida los resultados. Muchas veces se facilita la toma e muestra si se calienta la extremidad o se coloca en postura colgante. Cuidados del paciente despus de la puncin: Aplique una pequea curacin o cinta adhesiva sobre el sitio de la puncin, si bien hay que verificar presencia de hemorragia. De haberla, presione; en caso de que persista el sangrado, busque en los antecedentes del paciente si ha sido sometido a un tratamiento con anticoagulantes (aspirina) y/o antecedentes de alteraciones en la circulacin o coagulacin. CONSIDERACIONES ADICIONALES PARA LA BUENA CALIDAD DE LA EXTRACCIN DE MUESTRA Para prevenir la formacin de hematoma: No puncionar directamente sobre la pared de la vena. Remover el torniquete antes de retirar la aguja. Sostener las venas superficiales al momento de la puncin. Asegurarse que la aguja penetre completamente hacia el lumen de la vena. La penetracin parcial permite que la sangre escape hacia el tejido blando, rodeando la vena va el bisel de la aguja. Aplicar una presin adecuada en el sitio de la puncin.
Recomendaciones:
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Para prevenir la hemlisis (principal interferente en muchas pruebas): Mezclar los tubos con anticoagulante gentilmente (en forma de 8) de 15-20 veces. Evite la extraccin sangunea directamente de un hematoma. Evite la extraccin forzada generada por el aspirado violento del mbolo, en el caso de jeringas. Evite la formacin de espuma en la muestra. Asegrese que el sitio de venipuncin est seco. Evite la venipuncin traumtica. En tubos no llenados al vaco, puede ocurrir hemlisis al llenarlos cuando se hace una fuerte presin sobre el mbolo provocando un chorro de sangre violento. La aplicacin prolongada del torniquete conlleva... A la hemo-concentracin de elementos no filtrables (ej. protenas). La presin hidrosttica ocasiona que el agua y algunos elementos filtrables abandonen el espacio extracelular y se acumulen en la sangre. En algunos casos esto ocasiona serias interferencias en los anlisis a efectuar. Un aumento del volumen del paquete globular sanguneo. Alteraciones dentro de los parmetros evaluados en la qumica sangunea. GUA PARA LA RESOLUCIN DE PROBLEMAS DURANTE LA EXTRACCIN VENOSA Si no se obtiene muestra sangunea o la misma es incompleta... Cambie la posicin de la aguja. Un leve movimiento hacia delante (cuando hay menos de 2/3 de la aguja dentro de la piel), en el ngulo correcto ayuda. Es muy probable que no se encuentre en el lumen. En caso de una penetracin muy profunda (cuando hay ms de 2/3 de la aguja dentro de la piel), un leve movimiento hacia atrs favorece la entrada al lumen venoso. Asegrese que el ngulo sea el correcto. En caso fallido, tome en cuenta lo siguiente: o Afloje el torniquete. Este podra estar obstruyendo el flujo sanguneo.
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o Pruebe otro tubo. Es posible que no haya vaco en el que se est utilizando. o Fije nuevamente la vena. Algunas veces las venas se mueven del sitio de la puncin. Si la sangre deja de fluir en el tubo... Es probable que la aguja se haya salido de la vena durante el recambio de tubos. Con movimientos gentiles, redireccinela. Para evitar los anterior, mantenga el equipo firmemente sin ejercer una presin que cause molestias al paciente. Es probable que la vena haya colapsado; afloje el torniquete para incrementar el flujo venoso, remueva la aguja ligeramente y vuelva a redireccionarla. Si esto no es exitoso, remueva la aguja, tenga los cuidados correspondientes en el sitio de la puncin. Puncione nuevamente en un lugar diferente.
Otros problemas que deben considerarse Si se forma un hematoma bajo la piel adyacente al sitio de la puncin, afloje el torniquete y retire la aguja. Aplique presin firmemente sobre el hematoma. Aconseje el uso de paos intermitentes de agua fra y caliente.
Pudiera suceder que se atraviese una arteria, en estos casos la sangre se observa de color rojo brillante. Afloje el torniquete, retire suavemente la aguja y aplique una presin uniforme y constante durante 5 minutos.
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5. Materiales y equipo Algodn Etanol al 70% Ligadura Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA Jeringas de 3 cc Descartador de punzocortantes
6. Procedimiento Instruya al paciente sobre la tcnica para tomar la muestra: Coloque al paciente bien sentado con el brazo a puncionar extendido. Busque la vena que va a puncionar visualmente, y luego con el dedo ndice tquela para ver su trayectoria. Figura 1. Venas del antebrazo
Coloque el torniquete haciendo un nudo moderadamente apretado en la parte superior del brazo donde va a hacer la puncin Avisar al paciente que al introducir la aguja sentir dolor.
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Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba. Solicite ayuda del paciente, si ste est consciente, para realizar palanca con el brazo libre. Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con masajes. Se debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios minutos antes de realizar la puncin. Si el paciente no tiene pruebas de glucosa o electrolitos, favorecer el ejercicio leve del brazo. 7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad
Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el tiempo se est trabajando con muestras potencialmente infectivas. 8. Formato de presentacin de resultados Entregar un informe completo de sus resultados. 9. Cuestionario 1. Enumere los accesos venosos empleados en la venipuncin central y perifrica. 2. Grafique la disposicin anatmica de las venas ms utilizadas para la venipuncin de muestras clnicas. Descrbalas brevemente. 3. Cul es la diferencia entre venipuncin y venoclisis? 4. En qu casos se utiliza la puncin yugular y la puncin femoral? Describa brevemente los procedimientos. 5. La donacin voluntaria de sangre consiste en extraer aproximadamente 500 mL de sangre venosa del organismo: a) Describa brevemente el proceso de extraccin, cul es el calibre de la aguja utilizada para este procedimiento?, Existe alguna variacin con la venipuncin de muestras clnicas? b) En qu rangos deben encontrarse la temperatura corporal, el peso y la presin arterial para que el donante sea aceptado?, por qu es necesario evaluar estos parmetros en este tipo de extraccin? Qu parmetros hematolgicos son evaluados para la aceptacin del donante? 10. Bibliografa 1. William W., et al. Hematologa. Barcelona: Salvat, 1979. x + 455p. 2. Fink N., et al. Mtodos del laboratorio hematolgico. Primera parte. Argentina: Universidad Nacional de la Plata, 2005. 58p.
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3. Prez JR., Fernndez J. Manual de prcticas de laboratorio de hematologa. Guatemala: Universidad de San Carlos, 1997. 102p.
3 ed.
4. Albarenga S., Crdoba C., Plazas L. Sangre. Mar de Plata: Escuela de Enfermera Hospital de la Comunidad, 2004. 11p. 5. Phlebotomy. Disponible en URL: http://www.medlib.med.utah.edu/WebPath/TUTORIAL/ TUTORIAL.html#2 Fecha de consulta: Junio, 2006.
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CLULAS SANGUNEAS
Prctica 3
1. Introduccin La frmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes puede incluso calcularse el nmero real de cada clase de leucocitos por mm3 de sangre (valor absoluto), conocindose el total de leucocitos. Por ejemplo: Si se tiene 60% de neutrfilos segmentados y el recuento total de leucocitos es de 20 000, entonces el valor absoluto de neutrfilos segmentados sera: 60/100 x 20 000 = 12 000. Valores de referencia absolutos de neutrfilos segmentados = 3000 5000 por mm3 Conclusin: Los valores relativos slo nos sirven cuando los valores totales de leucocitos se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o leucopenia) se debe emplear la frmula para obtener el valor real, y as determinar que elemento celular se encuentra fuera del rango normal, sea elevado o disminuido. 2. Objetivos Conocer las clulas que conforman la sangre Identificar la morfologa de cada una de los leucocitos presentes en la sangre Realizar una formula leucocitaria y conocer las distintas patologas donde hay alteracin.
3. Alcance Al final de la prctica el estudiante podr identificar las distintas morfologas de los leucocitos presentes en la sangre, as como la aplicacin de de la realizacin de una formula leucocitaria y su importancia en el diagnstico de determinadas patologas. 4. Antecedentes 4.1 Granulocitos Aquellos que tienen grnulos especficos: neutrfilos, eosinfilos y basfilos. Los grnulos observados en extendido estn cargados de lisosomas y enzimas hidrosolubles que son agentes antibacterianos necesarios para la digestin de partculas fagocitarias. Aqu tenemos: 4.1.1 Neutrfilos 4.1.1.1 Neutrfilos en cayado (Fig. 1)
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Es el granulocito en banda. Mide de 10m a 14m, ncleo condensado que puede presentar una dos constricciones, pero no tiene puente de cromatina. El citoplasma presenta grnulos especficos e inespecficos, membrana celular lisa, citoplasma de color ligeramente rosado dependiendo de la coloracin. 4.1.1.2 Neutrfilos segmentados (Fig. 2) Mide igualmente de 10m a 14m, ncleo que presenta mayor condensacin y est formado por varios lbulos (hasta 4) unidos por puentes de cromatina. El citoplasma est cargado de grnulos. Alteraciones leucocitarias de los neutrfilos Granulaciones txicas (Fig. 3) Son grnulos basfilos ms oscuros que lo normal y se observan durante el transcurso de infecciones severas y estadios txicos. Vacuolas txicas (Fig. 4) Se observan en el citoplasma de los neutrfilos durante infecciones severas y estados txicos. Cuerpos de Dohle (Fig. 5) Son reas teidas de azul en el citoplasma de los polimorfonucleares neutrfilos y se encuentra en infecciones, especialmente en neumonas. Palillo de tambor (Fig. 6) Es un pequeo apndice (cromatina sexual) que permite conocer el sexo del individuo mediante una simple observacin en un frotis de sangre perifrica en los neutrfilos. Se presenta en las mujeres. Polisegmentacin (Fig. 7) Son neutrfilos con 5 o ms lobulaciones. Se observa en las anemias por deficiencia de vitamina B-12 y cido flico, Sndrome de Down y otras anomalas. Existe aumento en el nmero de neutrofilos (neutrofilia) en: Infecciones bacterianas por agentes piognicos. Abscesos y septicemias. Procesos inflamatorios y necrosis tisular. Trastornos metablicos por intoxicacin. Procesos malignos: Carcinoma Hemorragias y hemlisis. Postesplenectoma.
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Fig. 1 Neutrfilo en banda y neutrfilo segmentado
Fig. 2 Neutrfilos segmentados
Fig. 3 Granulacin txica
Fig. 4 Vacuolizacin del citoplasma
Fig. 5 Cuerpos de Dohle
Fig. 6 Palillo de tambor
Fig. 7. Polisegmentacin
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Desviacin a la izquierda: Significa el aumento de las formas inmaduras (en banda o cayado, y juveniles) dentro de los neutrfilos. Constituye un importante valor diagnstico y pronstico. Puede observarse en: infecciones e intoxicaciones. Desviacin a la derecha: Corresponde a la hipersegmentacin nuclear. La mayora de polimorfonucleares presenta ms de 5 lobulaciones. Ocurre en: 4.1.2 Anemia perniciosa. Hipersegmentacin constitucional hereditaria. Reacciones mieloides de la sepsis. Afecciones hepticas. Leucemia mieloide. En la agona. Aplasia medular Mieloptisis de la mdula sea Agentes citotxicos Granulopoyesis inefectiva (anemias megaloblsticas). Eosinfilos (Fig. 8)
Existe disminucin de neutrfilos (neutropenia) en:
Son parecidos a los neutrfilos, pero son algo mayores. Generalmente el ncleo es bilobulado y lo que ms caracteriza a esta clula es la presencia de grnulos color naranja-marrn vistos claramente, muchas veces estos grnulos hacen que se pierda la membrana celular por el rompimiento de sta, ya que estas clulas son muy frgiles. Patologa: Existe aumento de eosinfilos (eosinofilia) en: 4.1.3 Infecciones parasitarias. Reacciones alrgicas. Enfermedades cutneas. Neoplasias. Basfilos (Fig. 9)
Figura 8. Eosinofilo
La caracterstica ms importante de esta clula es la cantidad de grnulos de color azul negruzco que se encuentra ocupando toda la clula (esto cuando la clula es madura) y parte de la clula cuando
22 Figura 9. Basofilo
sta es inmadura. Presenta un ncleo que muchas veces no logra observarse por la cantidad de grnulos que contienen histamina y heparina. Patologa: Existe aumento (basofilia) en Leucemia por basfilos. 4.2 Agranulocitos No poseen grnulos. Aqu tenemos a los linfocitos y monocitos. 4.2.1 Linfocitos: Linfocitos grandes y linfocitos pequeos. 4.2.1.1 Linfocitos grandes (Fig. 10) Miden de 15m a 25m, presentan generalmente un ncleo ligeramente oval discretamente indentado, la cromatina es densa pero no tanto como en el linfocito pequeo (esto lo puede confundir con el monocito). Citoplasma abundante, azul plido y puede contener grnulos azurfilos inespecficos. 4.2.1.2 Linfocitos atpicos (Fig. 11) Llamados tambin virus linfocitos, clulas linfomonocitoides, clulas activadas de Turk, clulas de Turk, virocitos, inmunoblastos, etc. Miden de 15m a 30m, ncleo irregular, indentado, excntrico y puede observarse nucleolos. El citoplasma es amplio, color azul tenue, y puede presentar grnulos azurfilos y vacuolas. Estas clulas pueden observarse en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, herpes zoster, enfermedades autoinmunes y normalmente pueden hallarse hasta en 5%. 4.2.1.3 Linfocitos con mitosis o binucleados (Fig. 12) Pueden encontrarse en enfermedades virales. 4.2.1.4 Linfocitos vacuolados (Fig. 14) En caso de linfocitos que reaccionan por efecto de la radiacin ultravioleta o respuesta a tratamientos de quimioterapia. 4.2.1.5 Linfocitos pequeos (Fig. 10b) Miden de 9m a 15m, presentan un ncleo que ocupa casi toda la clula, excntrico, cromatina fuertemente densa. El citoplasma es escaso, basfilo y puede contener grnulos azurfilos inespecficos.
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Figura 10. Linfocitos grandes y pequeos
Figura 11. Linfocitos atpicos
Figura 12. Linfocitos en mitosis
Figura 13. Linfocitos vacuolados
4.2.2
Monocitos (Fig. 14)
Son los leucocitos de mayor tamao en la sangre (14m a 20m). Su ncleo es generalmente excntrico, aunque puede ser central. Su cromatina nuclear es laxa, distribuida en forma regular, la forma del ncleo generalmente es de una madeja de lana o arrionada, aunque puede tener forma de un abastonado. El citoplasma es de color gris y puede presentar grnulos inespecficos (azurfilos) que carecen de significado clnico. Patologa: Los monocitos estn elevados en: Tuberculosis. Endocarditis bacteriana. Enfermedades virales como sarampin, rubola, etc. Colagenosis, neoplasias, etc.
Figura 14. Monocito
CRITERIOS PARA EL DESARROLLO DE UN LEUCOGRAMA Se considera leucocitosis cuando la cifra de glbulos blancos excede de 10 000. Se considera leucopenia cuando la cifra de glbulos blancos es inferior a 5 000. No olvidar que el ejercicio produce leucocitosis fisiolgica de consideracin, de all que el recuento debe hacerse en condiciones basales. En los granulocitos debe informarse el nmero de lobulaciones del ncleo. A mayor edad de la clula mayor el nmero de lbulos y lo contrario.
citoplasma
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5. Materiales Aceite de inmersin Alcohol 70% Algodn Beaker con cloro al 5% Cloro 5% Colorante de Wright Laminas portaobjetos (3/A) Muestras de sangre Pizeta con agua de chorro Varillas para tincin
6. Procedimiento Preparar frotes sanguneos utilizando para ello una gota de sangre sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. Extender la gota de sangre con otro portaobjetos, procurando una capa fina de clulas Teir los frotes con colorante de Wright durante 10 minutos. Agregar agua destilada hasta formar una capa tornasolada. Lavar. Limpiar los frotes con algodn y alcohol en la parte de abajo para quitar el exceso de colorante. Examinar la lmina a pequeo aumento para comprobar si los elementos celulares estn bien distribuidos. Si es favorable se examina con el objetivo de inmersin. La parte ideal para visualizar clulas para la frmula leucocitaria es en la parte final del cuerpo y comienzos de la cola, recorriendo la lmina de izquierda a derecha o de arriba hacia abajo hasta contar 100 leucocitos incluidos los agranulocitos y granulocitos. Aqu no se incluyen los elementos inmaduros de sangre roja. Anotar a medida que se va contando, el nmero de cada una de las clases de glbulos blancos observados. Determinar luego los porcentajes de cada uno de ellos para luego comparar con los porcentajes normales.
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LEUCOCITOS Neutrfilos segmentados Neutrfilos en banda Eosinfilos Basfilos Monocitos Linfocitos
Valores relativos (%) 55-65 3-5 0,5-4,0 0-0,5 4-8 25-35
Valores absolutos (%) 3000-5000 150-400 20-350 10-60 100-500 1500-400
7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el tiempo se est trabajando con muestras potencialmente infectivas. 8. Formato de presentacin de resultados Entregar un informe completo de sus resultados. 9. Cuestionario
1. 2.
Indique las caractersticas de un frote sanguneo bien preparado. Realice un cuadro comparativo de las anormalidades que pueden observarse en los leucocitos diferenciando cada una de las clulas: Neutrfilos, eosinfilos, linfocitos, basfilos y monocitos.
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INMUNODIFUSIN RADIAL
Prctica 4
1. Introduccin La inmunodifusin radial (IDR) es una tcnica que puede determinar cuantitativamente la concentracin de un antgeno. Es una tcnica sensible que es usada clnicamente para detectar niveles de protenas plasmticas. Principio: Un anticuerpo es incorporado en agarosa fundida, la cual es vertida dentro de una caja de Petri la cual se deja solidificar. Se cortan pequeos pozos dentro de la agarosa y estos son llenados con concentraciones conocidas de antgeno correspondientes al anticuerpo, con el objeto de construir una curva de calibracin. Las muestras desconocidas se colocan dentro de los pozos. Los antgenos en solucin difundirn hacia fuera del pozo en un patrn circular rodeando al pozo. El anticuerpo est presente en exceso y la difusin del antgeno continuar hasta que se forme un precipitado antgeno-anticuerpo en forma de anillo estable. Habr complejo Ag-Ac en toda la zona circundante al pozo dentro de la lnea de precipitina. En esta lnea es donde est presente el mayor nmero de complejos, ya que en ese punto el antgeno y el anticuerpo estn en proporciones iguales. Esta es conocida como la zona de equivalencia. Generalmente toma de 24 a 48 horas para que ocurra la difusin ptima y la precipitacin se haga evidente. Para cada antgeno, se formar una precipitacin final en anillo de cierto dimetro. De las concentraciones conocidas estndar, se traza una curva de calibracin, colocando en los ejes: concentracin de antgeno vrs mediciones de dimetro cuadrado de los anillos. A partir de esta curva de calibracin lineal, la presencia y cantidad de antgeno en las muestras desconocidas pueden ser determinadas. 2. Objetivos Comprender la naturaleza de la reaccin antgeno-anticuerpo in vitro. Conocer los factores que intervienen en la reaccin Ag-Ac y la forma en que afectan el resultado final. Conocer la diferencia entre la reaccin primaria y las reacciones secundarias. Conocer los diferentes tipos de reacciones secundarias, sus ventajas, desventajas y sus aplicaciones.
3. Alcance Al final de la prctica el estudiante podr visualizar los tipos de reaccin Ag-Ac in vitro que existen as como la aplicacin de cada una de ellas de acuerdo a sus caractersticas individuales en el diagnstico serolgico.
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4. Antecedentes La reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una unin molecular entre el epitopo (antgeno) y la regin hipervariable del anticuerpo, mediante interacciones no covalentes o secundarias. Estas uniones son dbiles tales como: puentes de hidrgeno, fuerzas inicas y fuerzas de van der Waals. Estas fuerzas slo se convierten en agentes de unin efectivos cuando ocurren a distancias muy cercanas. Las interacciones hidrofbicas intervienen tambin y constituyen el 50% de la fuerza total. De tal manera que debe ocurrir una combinacin de molculas complementarias entre el sitio de unin del anticuerpo y el determinante antignico o epitopo. Mientras ms se complementan las configuraciones moleculares, ms uniones secundarias se forman entre el antgeno y el anticuerpo, y es ms difcil que ese complejo sea alterado por fuerzas tales como la agitacin trmica. La asociacin Ag-Ac est determinada por la ley de accin de masas, es reversible y est definida por una constante de equilibrio K = AcAg/(Ac)(Ag). La velocidad de la reaccin depende de tres factores: la afinidad, la avidez y la especificidad: Aunque estos dos trminos a menudo son usados indistintamente, no son exactamente lo mismo. La avidez se refiere a la fuerza de unin mostrada por los anticuerpos a un antgeno complejo (antgeno que contiene una variedad de epitopos), y la afinidad se refiere a la fuerza de unin entre el anticuerpo y un epitopo; es la suma de las fuerzas de atraccin sobre las de repulsin. En la unin Ag-Ac ocurren dos reacciones: la reaccin primaria y la secundaria. La reaccin primaria es la formacin del complejo Ag-Ac y la secundaria es la evidencia de esos complejos mediante la observacin de un fenmeno, el cual depende de la naturaleza del antgeno, las propiedades de los anticuerpos y la presencia de otros factores en el medio de reaccin. La mayor aplicacin de estas reacciones in vitro son las pruebas serolgicas. Son llamadas as porque es el suero el vehculo habitual de los anticuerpos. Sin embargo, pueden realizarse en otros fluidos corporales tales como plasma, orina o lquido cefalorraqudeo, en busca de antgenos o anticuerpos especficos. Una prueba serolgica para un antgeno especfico idealmente es realizada usando un reactivo de anticuerpo monoespecfico (que contenga anticuerpos reactivos con una sola clase de epitopo). No siempre es posible obtener anticuerpos monoespecficos, por lo que en estos casos son usados los antisueros polivalentes (que contienen anticuerpos de ms de una especificidad. Existen dos trminos importantes en los mtodos serolgicos: Idealmente, las pruebas serolgicas debieran ser 100% especficas y 100% sensibles. La especificidad se refiere a la relativa ausencia de reaccin cruzada de los anticuerpos con sustancias que estn qumicamente relacionadas (pero no idnticas) al antgeno contra el que se produjeron, y la sensibilidad se refiere a la cantidad ms pequea de sustancia desconocida (antgeno o anticuerpo) que pueda ser detectada por la prueba. Si una muestra reacciona cruzadamente con sustancias naturales diferentes a las que se intentan determinar en la prueba, decimos que se obtiene un resultado biolgico falso positivo (BFP). Si una prueba serolgica no detecta la sustancia que se est buscando y que realmente s est contenida en la muestra, se obtiene un resultado biolgico falso negativo (BFN). Si en cien muestras de suero que contienen
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todos los mismos antgenos, la prueba produce cinco BFN, se dice que tiene una sensibilidad del 95%. Existen otros factores, tales como los errores tcnicos, que producen resultados falsos positivos y negativos, pero no son considerados de origen biolgico. 5. Materiales
-
Agarosa al 3% Alcohol al 70% Algodn Antiglobulina humana Beaker con cloro al 5% Cmara hmeda Cloro al 5% Lmina porta objetos de vidrio Laminas con muestras positivas y negativas para inmunodifuisn radial Muestras de suero desconocidas Pipetas automticas de 20 uL Pipetas serolgicas de 10 mL Pipetores o bulbos Puntas amarillas para pipeta automtica Rosetones para perforar las laminas de agarosa
6. Procedimiento Preparacin de una lmina con agarosa: Colocar la lmina horizontalmente y con la ayuda de un hisopo estril embadurnar con agarosa al 3% toda la superficie. Dejar secar por unos minutos. Con la ayuda de una pipeta serolgica verter el contenido del tubo con agarosa 12 % fundida a una temperatura de unos 37-40C. Dejar enfriar. Horadar los pozos sobre el agar como se indica en la plantilla. Marcar la esquina superior derecha haciendo un corte sobre el agar. Colocar en cmara hmeda y refrigerar hasta que se vaya a utilizar. Abrir con la ayuda de la plantilla cinco agujeros en el centro de la lamina
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Colocar en el centro el antgeno a utilizar (antiglobulina humana) y en los agujeros del la periferia suero desconocido (Anticuerpos) Observar la reaccin
7. Interpretacin de resultados Interpretar las laminas de difusin en agar, determinando en que pozos hay reaccin Ag-Ac Interpretacin: Rosetn 1 1. Positivo 2. Positivo 3. Negativo 4. Negativo 5. Negativo 6. Negativo Rosetn 2 1. Positivo 2. Positivo 3. Negativo 4. Negativo 5. Positivo 6. Negativo
1 6 5 4 2 3 6 5
1 2 3 4
Rosetn 4 Todos negativos
1 6 5 4 2 3
La reaccin de identidad (I), corresponde a los Ag. que comparten todos los determinantes antignicos, es decir que estamos ante la misma molcula, en la de no identidad (II), ningn determinante es compartido y por lo tanto son Ag. distintos mientras que en la identidad parcial ( III), hay determinantes en comn, o sea que hablamos de Ag. emparentados, esto se ve como un espoln dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. Notese que en este caso ltimo, ab es una sola molcula
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8. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el tiempo se est trabajando con muestras potencialmente infectivas. 9. Formato de presentacin de resultados Entregar un informe completo sobre sus resultados obtenidos. 10. Bibliografa 1. Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington, ASM, 2000. 2. Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998. 11. Cuestionario 1. Cul es el principio de la prueba de precipitacin inmunolgica?, explique 2. Qu aplicaciones tiene la inmundodifusin radial en el diagnstico de enfermedades?
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Reacciones de Precipitacin
Prctica 5
1. Introduccin
Los precipitados inmunolgicos son complejos insolubles formados por la unin de anticuerpos (precipitinas) y antgenos (precipitingenos) que se encuentran en solucin. Para la formacin de una malla de precipitado se requiere que tanto las precipitinas como los precipitingenos sean al menos bivalentes. Esta reaccin tiende a ocurrir ms rpido con el aumento de la temperatura, aunque la precipitacin ms completa es obtenida usualmente a temperaturas bajas (0-4C). Est determinada por el fenmeno de zona, lo cual quiere decir que la mxima precipitacin ocurre en un punto o zona de equivalencia que para poder ser visible es necesario determinar las proporciones ptimas de los reactivos.
2. Objetivos
Comprender las bases tericas de la reaccin de precipitacin Conocer los diferentes factores que contribuyen a la reaccin Conocer las distintas formas de reacciones basadas en la precipitacin de Ag-Ac Conocer las aplicaciones clnicas de la precipitacin
3. Alcance
Al final de la prctica se pretende que el estudiante tenga una visin clara del fenmeno de precipitacin del complejo antgeno-anticuerpo y que adquiera las destrezas para aplicar diferentes metodologas basadas en dicha reaccin.
4. Antecedentes
La precipitacin de los complejos antgeno-anticuerpo en solucin, ha sido utilizada desde 1920 para la cuantificacin de antgenos y anticuerpos. Las reacciones en geles fueron utilizadas primero para estudios inmunoqumicos a mediados de la dcada de 1940, cuando Oudin introdujo la inmunodifusin simple en una dimensin en tubos conteniendo gel de agar. El demostr que un sistema sencillo Ag-Ac daba lugar a una banda de precipitina y que la mezcla de sistemas en el mismo tubo daba bandas mltiples e independientes. Con estas observaciones, las reacciones de precipitina se desarrollaron tanto cualitativas como cuantitativas. Los mtodos en gel tienen significativamente mayor sensibilidad y mayor poder de resolucin que las tcnicas sin medio de soporte. Adems, los geles actuales pueden ser fotografiados y
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almacenados, ya que los inmunoprecipitados insolubles que se forman en la zona de equivalencia, son atrapados permanentemente en la matriz del gel. Muchas modificaciones han surgido despus del mtodo de difusin de Oudin y probablemente las ms usadas sean la inmunodifusin doble y la inmunodifusin radial para estudios cualitativos y cuantitativos, respectivamente. La combinacin de la electroforesis con la difusin ha resultado en mtodos muy importantes, que sern tratados en otra prctica.
Todas las reacciones de precipitacin estn basadas en los mismos principios fsico-qumicos. Los aspectos bsicos de exceso y de equivalencia de antgeno o anticuerpo son de particular importancia; de hecho, la relativa solubilidad de los complejos con un exceso significativo de cualquiera de los reactantes y la insolubilidad de los mismos en la zona cercana a la equivalencia (proporciones ptimas), son crticos para el proceso de visualizacin. La reaccin de precipitacin tiene base en la reaccin fundamental antgeno-anticuerpo in vivo, ya que la formacin de este complejo es el primer paso en la remocin de agentes infecciosos del cuerpo por el sistema inmune. Estos complejos forman precipitados que pueden ser depurados por diversos mecanismos.
5. Materiales
Alcohol al 70% Algodn Agua destilada Beaker con cloro al 5% Caja plstica cerrada Cloro al 5% Envoltorio plastic Lminas de reaccin de VDRL Micropipetas automticas y puntas de 5-50 l
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Muestras desconocidas. Papel aluminio Placas de inmunodifusin Reactivo de VDRL Regla milimetrada Toallas de papel
6. Procedimiento
Floculacin: Reaccin de VDRL - Tomar la placa e identificar los pozos como control positivo, control negativo y muestra. - Colocar una gota de reactivo de VDRL en cada pozo - Con la pipeta colocar una gota de la muestra (pozo de Mx) y una de control (pozo control) - Mover la placa suavemente - Observar en el microscopio la formacin de precipitado y cuantificar por cruces, utilizando el aumento de 10x.
7. Interpretacin:
Positivo
8. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad
Negativo
El manejo de agarosa requiere proteccin evitando condiciones que faciliten las rutas de entrada por inhalacin, ingestin o contacto con la piel. No existen datos sobre consecuencias de salud por inhalacin. La ingestin de grandes cantidades puede causar diarrea. No son necesarias medidas especiales de manejo y su procedimiento de descarte es como el de un slido comn. Tener en mente que trabaja con materiales biolgicos, potencialmente infecciosos. medidas de bioseguridad tanto personales, como en el descarte de los materiales. Aplicar las
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9. Formato de presentacin de resultados
Presentar los resultados en forma grfica y en forma escrita, con una discusin de los mismos.
10. Bibliografa de referencia
3. Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington, ASM, 2000. 4. Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998.
11. Cuestionario
1. De la sfilis investigue a. Agente causal b. Vas de transmisin 2. Qu diferencia existe entre la prueba de VDRL y RPR? 3. Explique por qu el VDRL no es una prueba confirmatoria para sifilis 4. Qu otras enfermedades pueden dar un falso positivo en la prueba de VDRL
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Reacciones de Aglutinacin
Prctica 6
1. Introduccin Las reacciones de aglutinacin consisten en la agregacin de material en partculas, tales como clulas o material sinttico por los anticuerpos llamados aglutininas. La reaccin toma lugar sobre la superficie de las partculas que poseen el antgeno disponible para los sitios de unin especfica de los anticuerpos. La aglutinacin es un ejemplo de una reaccin inmune secundaria. Las primeras reacciones de aglutinacin involucraban aglutininas bacterianas en experimentos llevados a cabo por los primeros bacterilogos. Este trabajo llev a la formulacin de la idea de anticuerpos. La utilidad de este simple procedimiento dio lugar a la era del serodiagnstico en microbiologa. El uso prctico de los procedimientos de aglutinacin se ha expandido de las reas de la infectologa e inmunohematologa para el estudio de enfermedades infecciosas, autoinmunes, ensayos endcrinos y otros. Las tcnicas clsicas de aglutinacin directa han dado lugar a una variedad de tcnicas que involucran el recubrimiento de partculas portadoras con antgeno (o anticuerpo), ya sea por procesos de adsorcin pasiva o a travs de la unin covalente de los antgenos al portador, mediante una manipulacin qumica. 2. Objetivos Comprender las bases tericas de la reaccin de aglutinacin Conocer los diferentes factores que contribuyen a la reaccin Conocer las distintas formas de reacciones basadas en la aglutinacin Conocer las aplicaciones clnicas de la aglutinacin
3. Alcance Al final de la prctica se pretende que el estudiante tenga una visin clara del fenmeno de aglutinacin del complejo antgeno-anticuerpo y que adquiera las destrezas para aplicar diferentes metodologas basadas en dicha reaccin. 4. Antecedentes Bordet propuso que la aglutinacin tomaba lugar en dos fases: a) la combinacin especfica del anticuerpo y el antgeno y b) la agregacin visible de las partculas. Ambas fases son mediadas por la atraccin especfica entre el anticuerpo y el antgeno. Las partculas tales como los eritrocitos y las bacterias, poseen cargas ligeramente negativas en suspensin (potencial z) y se repelen unos a otros. La reduccin de la fuerza inica mediante protenas u otras sustancias
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inorgnicas, reduce las distancias entre las partculas, permitiendo la formacin de puentes y de una malla del complejo Ag-Ac visible: la aglutinacin. Aunque la carga es importante para determinar que la aglutinacin sea completa, es evidente que otros efectos juegan un papel en la aglutinacin de las partculas por los anticuerpos. La viscosidad del medio de prueba, por ejemplo, aumenta la aglutinacin. La principal desventaja del fenmeno de aglutinacin es que la reaccin es semi-cuantitativa. Sin embargo, el hecho de que numerosos sistemas permiten reacciones de aglutinacin, la simplicidad bsica del sistema de aglutinacin desarrollado en la actualidad y la alta sensibilidad de esta reaccin, la hace de amplia aplicacin y uso. La exitosa aplicacin de las reacciones de aglutinacin para la deteccin de antgenos o anticuerpos, requiere una partcula estable, un antgeno puro y un anticuerpo especfico. Generalmente, el uso del fenmeno de aglutinacin tambin requiere el conocimiento de la posibilidad de que la reaccin se realice. Los anticuerpos IgM en el medio de prueba usualmente agregan al antgeno sobre las partculas, en base al tamao de la molcula de IgM, mientras que los anticuerpos de tipo IgG por s mismos, no pueden completar la reaccin. Se dice que la IgM es unas 750 veces ms eficiente que la IgG en las reacciones de aglutinacin. Tambin debe tenerse en mente que el llamado fenmeno de zona (pro-zona) puede contribuir a que la reaccin de aglutinacin no sea completa, an con ttulos adecuados de anticuerpos IgM en el medio. Este fenmeno puede producirse por diversos factores: por ejemplo, un suero de baja dilucin puede no ser capaz de agregar partculas debido al recubrimiento de los sitios antignicos con un gran nmero de anticuerpos individuales, situacin que bajo las condiciones de equilibrio, disminuye el nmero de complejos. De forma similar, la cantidad de reaccin tambin puede disminuir cuando se aumenta la concentracin de antgeno. El fenmeno de prozona tambin puede ser producido por la alteracin de protenas (por calor, por ejemplo) o por interferencia con la aproximacin excesiva de partculas por la presencia de material coloidal extrao. En general, las reacciones de aglutinacin pueden ser observadas a simple vista, sin necesidad de aumento ni la ayuda de microscopio. En la actualidad, las partculas ms empleadas como portadoras de antgeno o anticuerpo en las reacciones de aglutinacin son: ltex, partculas de gelatina y partculas de carbn. Los eritrocitos son empleados para las reacciones de hemaglutinacin. Los ensayos de aglutinacin puede clasificarse en: 1) Ensayo de aglutinacin directa: es la clsica reaccin que involucra la agregacin de clulas o antgenos en partculas. 2) Ensayo de aglutinacin indirecta o pasiva: el desarrollo de esta tcnica tiene numerosas ramificaciones en el laboratorio. Esta consiste en la aglutinacin de clulas o partculas recubiertas artificialmente con antgeno soluble. 3) Ensayo de aglutinacin pasiva en reversa: es la modalidad de la aglutinacin, en la que el anticuerpo est unido a las partculas.
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5. Materiales Agua destilada Alcohol al 70% Algodn Aplicadores Beaker con cloro al 5% Calibradores con concentraciones conocidas de antgeno de ASO o FR Cloro al 5% Descartadores de punzo cortantes Lminas de reaccin de fondo oscuro Micropipetas automticas y puntas de 5-50 l Muestras desconocidas.
6. Procedimiento Aglutinacin pasiva de ltex: Deteccin de Factor Reumatoideo, Antiestreptolisina O. Lleve los reactivos, sueros control y muestras de suero de pacientes a temperatura ambiente. Agregue sobre el rea de reaccin 50 l de suero o control. Agite el reactivo de ltex, asegurndose que est en homogneo antes de usarlo. Agregue una gota de la suspensin de partculas antignicas sobre la gota de suero. Con la ayuda de un aplicador, distribuya la mezcla en el rea de reaccin, homogneamente. Agitar por 2-5 minutos sobre un agitador mecnico o con un movimiento rotatorio y gentil entre sus manos. Realice la lectura de resultados despus del tiempo de agitacin, teniendo cuidado que la mezcla no se seque.
7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que debe observar las medidas universales de bioseguridad. Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales.
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8. Formato de presentacin de resultados Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos. Investigue las aplicaciones de la reaccin de aglutinacin y especficamente sobre la deteccin de Factor Reumatoideo y Antiestreptolisina O sus usos y su importancia. 9. Bibliografa de referencia 5. Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington, ASM, 2000. 6. Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998. 10. Cuestionario 1. Qu diferencias existen entre las reacciones de aglutinacin y precipitacin? 2. Investigue sobre la importancia de detectar el Factor Reumatoideo y la Antiestreptolisina O. 3. Qu es la PCR? En qu patologas se encuentra elevada? 11. Anexo Figura 1. Reaccin de aglutinacin
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Reacciones de Aglutinacin directa e indirecta (Grupo ABO y Rh)

Prctica 7
1. Introduccin La determinacin de grupo sanguneo se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, la cual se puede llevar a cabo de forma directa (determinando los antgenos presentes en la superficie del eritrocito del paciente al contacto del reactivo anti A, B, AB o D) o indirecta (determinando los anticuerpos presentes en el suero del paciente y enfrentndolo a eritrocitos conocidos (A, B o AB). 2. Objetivos Comprender las bases tericas de la reaccin de aglutinacin para la determinacin de grupo sanguneo Conocer los diferentes factores que contribuyen a la reaccin
3. Alcance Al final de la prctica se pretende que el estudiante tenga una visin clara del fenmeno de aglutinacin del complejo antgeno-anticuerpo para la determinacin de grupo sanguneo ABO y RH y que adquiera las destrezas para aplicar diferentes metodologas basadas en dicha reaccin. 4. Antecedentes El grupo sanguneo son los tipos en que se ha clasificado la sangre de las personas en relacin con la compatibilidad de los hemates y suero de otro individuo que la recibe. Segn la clasificacin de Landsteiner (clasificacin hoy universal) y se denominan: O, A, B, AB. Se caracterizan por las diferentes combinaciones de dos aglutingenos existentes en los glbulos rojos y de dos aglutininas contenidas en el suero. Los eritrocitos poseen antgenos en su membrana que son distintos para cada individuos; las pruebas utilizadas para establecer la hemoclasificacin sangunea relacionada a los diversos grupos sanguneos, aprovechan las caractersticas inmunolgicas que expresa cada individuo de acuerdo a su particular codificacin gentica. En dichas pruebas se evidencian los antgenos y/o anticuerpos del grupo sanguneo, de acuerdo a su comportamiento in vitro. En el sistema ABO se investigan tanto antgenos o aglutingenos como los anticuerpos o isoaglutininas naturales. El factor Rh es un aglutingeno encontrado en 1940 por Landsteiner y Weiner, en los glbulos rojos de primates (Macacus rhesus) y que tambin existe normalmente en el 85% de los humanos,
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que por esta causa se denomina Rh positivos. En el sistema Rh, existen varios antgenos: D, C, c, E, e; sin embargo, de rutina, solo se determina la presencia del antgeno D en los eritrocitos y de acuerdo a su presencia o ausencia se dice que un individuo es Rh D positivo o Rh D negativo. 5. Materiales Alcohol al 70% Algodn Beaker con cloro al 5% Cloro al 5% Descartadores de punzo cortantes Glbulos rojos A, B y O Lminas de reaccin de fondo oscuro Palillos Suero Anti A, Anti B, Anti A,B y anti D (anti Rh) Laminas portaobjetos Tubos de ensayo Suero de grupos A, B, AB y O
6. Procedimiento Hemoclasificacin directa Mtodo en lmina - Marcar tres lminas portaobjeto como A, B, AB y D. - Adicionar una gota de anti A, anti B, anti AB y anti D en su lugar correspondiente. - Agregar una gota de eritrcitos del paciente a cada antisuero. - Mezclar cada preparacin con un palillo de madera. - Rotar manualmente cada lamina con cuidado de que no se mezclen. - Observar aglutinacin y registrar los resultados: POSITIVO: La aglutinacin fuerte de los glbulos rojos en presencia de cualquier anticuerpo ABO y Rh. Las reacciones positivas muestran 3+ de aglutinacin. NEGATIVO: La presencia de una suspensin uniforme (O) de glbulos rojos. Mtodo en tubo - Separar el plasma de los eritrocitos de la muestra desconocida. - Lavar los glbulos rojos del paciente 3 veces consecutivos en solucin salina y preparar una suspensin final al 2% en dicha solucin.
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Rotular cuatro tubos con Anti A, Anti B, Anti AB y Anti D. Colocar una gota de suero Anti A, Anti B, Anti AB y Anti D en el tubo respectivo. Agregar una gota de la suspensin al 2 % de eritrocitos a cada uno de los tubos. Mezclar cada tubo y centrifugar 15 30 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000 rpm. Resuspender suavemente los botones celulares y observar aglutinacin: (4+) Botn completo, fcilmente desprendible, fondo limpio (3+) Botn disperso, 2 o 3 partes, fondo limpio (2+) No hay botn, pequeos grumos (1+) Pequeos grumos (0) No hay seales de grumos (aglutinacin)
Hemoclasificacin inversa Mtodo en tubo - Marcar tres tubos como A, B y O. - Adicionar dos gotas de suero del paciente a cada tubo. - Agregar una gota de suspensin de eritrocitos del grupo A al tubo rotulado como A, una gota de eritrocitos del grupo B al tubo rotulado como B y una gota de eritrocitos del grupo O al tubo rotulado como O. - Incubar de 5 15 minutos a temperatura ambiente - Centrifugar por 15 30 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000 rpm. - Resuspender los botones celulares y observar aglutinacin. - Interpretar los resultados. 7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que debe observar las medidas universales de bioseguridad. Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales. 8. Formato de presentacin de resultados Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos. 9. Bibliografa de referencia 7. Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington, ASM, 2000. 8. Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998. 10. Cuestionario 1. Cules son los carbohidratos presentes en los grupos A, B, AB y O 2. Complete el siguiente cuadro
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DONADOR DE ERITROCITOS Grupo 0 Rh (-) Grupo 0 Rh (+) Grupo A Rh (-) Grupo A Rh (+) Grupo B Rh (-) Grupo B Rh (+) Grupo AB Rh(-) Grupo AB Rh(+) 11. Anexo
Figura 1. Antgenos presentes en los grupos sanguneos ABO
RECEPTOR DE ERITROCITOS
Figura 2. Esquema de reaccin en la prueba de tipificacin directa de grupo sanguneo ABO
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Hemaglutinacin pasiva
Practica 8
1. Introduccin
La hemaglutinacin indirecta (HAI), tambin llamada hemaglutinacin reversa pasiva, se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos (que en este caso son anti-T. cruzi) de producir aglutinacin especfica en presencia de glbulos rojos sensibilizados con los correspondientes antgenos. En el suero existen anticuerpos inespecficos (heterfilos) que son capaces de aglutinar glbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga enfrentando el suero con glbulos rojos no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan mediante tratamiento con 2mercaptoetanol. 2. Alcance
En esta prctica el estudiante comprender los conceptos bsicos de la hemaglutinacin pasiva y su aplicacin en el diagnstico de la enfermedad de Chagas. 3. 4. Objetivos Especficos Que el estudiante: Sea capaz de describir el principio de la hemaglutinacin inversa. Comprenda el uso eritrocitos como fuente de antgenos Conozca una de las pruebas para el diagnstico de la enfermedad de Chagas Materiales y equipo Alcohol al 70% Algodn Beaker Bolsas blancas y rojas Cloro al 5% Descartadores de punzo cortantes Frasco vaco de 10 mL Goteros de 25 uL Guantes, S, M y L
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Kit de Chagatest Pipetas automaticas de 25 uL Pizetas cloro 5% Pizetas etanol 70% Placas de fondo en U Puntas amarillas Torundas de algodn Sueros control
5. Antecedentes La enfermedad de Chagas es una infeccin parasitaria producida por el Trypanosoma cruzi. El diagnstico de laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad. Durante la fase aguda, el diagnstico se efecta directamente mediante la comprobacin de los parsitos en sangre o por mtodos inmunolgicos que detecten anticuerpos especficos. Durante la fase crnica, se pueden usar mtodos inmunolgicos como la reaccin de aglutinacin de ltex, hemaglutinacin, aglutinacin directa, inmunofluorescencia y ltimamente ELISA. 6. Procedimiento Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de Diluyente de Sueros HAI en todos los pocillos a usar de la policubeta. Tomar una alcuota de cada suero a ensayar con microdilutores de 25 ul (uno para cada muestra). Colocar cada microdilutor en el primer pocillo y rotarlo por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin de la muestra. Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilucin 1/2), pasando los microdilutores al pocillo siguiente (dilucin 1/4) y as sucesivamente hasta la dilucin que se desea investigar (por ejemplo: 1/8, 1/16, 1/32), rotando en cada paso el microdilutor por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin de la muestra. Si se emplea una micropipeta automtica de 25 ul para la toma y/o dilucin de la muestra, homogeneizar por carga y descarga. Transferir 25 ul de pocillo a pocillo hasta la dilucin que se desee investigar. Descartar los ltimos 25 ul. Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones y 1/4, una gota (25 ul) de GR no sensibilizados para control de heterofilia. En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul) de Antgeno HAI. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta. Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones, durante 90 minutos.
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Leer a partir de los 90 minutos. Se puede aumentar la nitidez de la apreciacin, leyendo sobre un espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un papel blanco y traslcido entre la policubeta y la fuente de luz. No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botn. Reactivo: formacin de una pelcula o manto en el fondo de los pocillos. En caso de observar la presencia de un pequeo anillo de bordes regulares, la muestra se considerar dudosa y deber ser ensayada por otro mtodo
Interpretacin -
7. Formato de presentacin de resultados Realice una discusin de resultados y conclusiones de la teora e indique con un esquema el principio de la prueba (anexo) 8. Precauciones Los Reactivos Provistos son para uso diagnstico "in vitro". Las muestras deben manipularse como si fueran capaces de transmitir la infeccin. Los sueros controles han sido examinados para antgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y virus de inmunodeficiencia humana (HIV) encontrndose no reactivos. Sin embargo deben emplearse como si se tratara de material infectivo. Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de asegurar la inactivacin de agentes patgenos. No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes. 9. Bibliografa de referencia 1. Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington, ASM, 2000. 2. Mazza, S. - VI Congreso Nacional de Medicina (Crdoba), pg. 155 (1938). 3. Cerisola, J.A. - La Prensa Mdica Argentina 49/34:1761 (1962). 4. Fontenla S., Moretti, E. y Gonzlez, G. - 50 Triduo de la ABA, Huerta Grande (Crdoba), 1985. 5. Basso, A. y col. - 50 Triduo de la ABA. Huerta Grande (Crdoba), 1985. 6. Lorenzo , L.; Capriotti, G.; Rojkn, F. - Rev. Arg. Transf. XVII/ 1: 51, 1991. 7. Ministerio de Salud y Accin Social, Instituto Nacional de Parasitologa "Doctor Mario Fatala Chabn" - Normas para el diagnstico de la infeccin chagsica - Resolucin ministerial 523/97, 1998
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10. Cuestionario 1. Defina que es un eritrocito sensibilizado 2. Cul es el procedimiento in vitro de sensibilizacin de eritrocitos con anticuerpos anti T. cruzi? 3. Por qu se utiliza eritrocitos no sensibilizado como control? 4. Describa brevemente la inmunopatologa de la enfermedad de Chagas. 11. Anexo: Figura 1. Esquema de la prueba
25 uL 25 uL 25 uL
1 Sin dilucin 50 uL Mx + ES
2 1:2 25 uL mx + 25 uL diluyente + ES
4 1:8
5 1:16
6 1:32
25 uL mx 25 uL mx 25 uL mx + + + 25 uL 25 uL 25 uL diluyente diluyente diluyente + + + ES ES ES ES: Eritrocitos sensibilizados
Descartar ltimos 25 uL
Figura 2. Interpretacin de resultados
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INMUNOCROMATOGRAFA
Prctica 9
1. Introduccin La inmunocromatografa es una de las tcnicas de inmunodiagnstico ms modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez de la prueba. Actualmente se utiliza como prueba rpida de tamizaje para la deteccin de antgenos o anticuerpos presentes en el suero del paciente. 2. Objetivos
Explicar el fundamento inmunolgico de la prueba de inmunocromatografa Conocer las aplicaciones de la prueba Conocer los diferentes tipos de pruebas que existen en el mercado basados en esta tcnica-
3. Alcance Al final de la prctica el estudiante podr describir el principio de las pruebas de inmunocromatografa, as como su interpretacin. 4. Antecedentes La inmunocromatografa se basa en la migracin de una muestra a travs de una membrana de nitrocelulosa. La muestra es aadida en la zona del conjugado, el cual est formado por un anticuerpo especfico contra uno de los eptopos del antgeno a detectar y un reactivo de deteccin. Si la muestra contiene el antgeno a problema, ste se unir al conjugado formando un complejo inmune y migrar a travs de la membrana de nitrocelulosa. De lo contrario, migrarn el conjugado y la muestra sin unirse. La zona de captura est formada por un segundo anticuerpo especfico contra otro eptopo del antgeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unin del antgeno y conjugado quedarn retenidos y la lnea se colorear (muestras positivas). En el caso contrario las muestras son negativas. La zona control est formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de deteccin. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unir al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta lnea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativa.
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Figura 1. Esquema de la prueba de inmunocromatografa
5. -
s. Materiales Pipetas pasteur Pruebas rpidas de inmunocromatografa Papel mayordomo Descartador de punzocortantes Muestras de suero Beaker con cloro
6. Procedimiento - Anotar cada una de las pruebas a realizar - Colocar una gota de muestra de suero de paciente en cada una de las pruebas rpidas que se le proporcionan. - Dejar que la muestra fluja a lo largo de la prueba de inmunocromatografa - Anotar los resultados positivos y negativos 7. Interpretacin de resultados o Positivo: dos lneas en el casete o Negativo: una lnea en el casete NOTA: Si no aparece la lnea de control, la prueba debe de repetirse. 8. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que debe observar las medidas universales de bioseguridad. Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales. 9. Formato de presentacin de resultados Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos. 10. Cuestionario Cul es el fundamento de la prueba? Defina que es conjugado Escriba tres ventajas y tres desventajas de estas pruebas
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Mencione cinco aplicaciones en el diagnstico de enfermedades que se pueden realizar por inmunocromatografa De qu est compuesto el control interno de la prueba de inmunocromatografa?
11. Bibliografa Inmunocromatografa. Disponible en http://es.scribd.com/doc/36487446/ INMUNOCROMATOGRAFIA-pba-rapida. http://www.socpemi.org/Doc/pruebasrapidas.pdf http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mariamc/lacteos/practica8.htm
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ENSAYO INMUNOENZIMTICOS (ELISA)

Prctica 10
1. Introduccin La tcnica ELISA (ensayos de inmunoabsorbencia ligada a enzimas) se basa en la deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reaccin marcada enzimticamente cuyo producto, puede ser medido espectrofotomtricamente. La cantidad de antgeno se determina comparando la curva estndar generada con cantidades conocidas del antgeno. Ventajas: verstil, robusto, simple en su realizacin, emplea reactivos econmicos y consigue, mediante el uso de la fase slida, de una separacin fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre, es fcil de adaptar a analizadores automticos. Este se caracteriza por ser un mtodo cuantitativamente exacto por la medicin de la velocidad de la reaccin y la duracin de la reaccin en un instante fijo nico Desventajas: para adaptarlo a analizadores automticos se necesitan de reactivos muy purificas, lo que aumenta el costo de las pruebas. 2. Alcance En esta prctica el estudiante comprender y observar la aplicacin y la elaboracin de el ensayo de inmunoabsorbencia ligada a enzima (ELISA). 3. Objetivos Que el estudiante: Conozca los principios en los que se basa la prueba de ELISA Se familiarice con el equipo utilizado para la elaboracin del la prueba de ELISA. Conozca la importancia de este tipo de pruebas y su aplicacin en el mbito de la medicina.
4. Antecedentes Dispositivos Empleados En Elisa Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su capacidad de absorcin de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor
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capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS, High throughput system). Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados. Fases de un ensayo ELISA Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno.
2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas.
3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno frio frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno.
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4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra. Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales, o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes. La versin ms comn de ELISA es el ensayo sandwich. Ensayo directo: (Ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, etc.) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado, o bien se le ha aadido). Ensayo indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de antgenos. Ensayo sandwich: (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo antiantgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene
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una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo. Aplicaciones Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. Enzima Sustrato Tampn Estas enzimas son utilizadas en la etapa de deteccin, las cuales unen de manera covalente a mAbs (anticuerpos monoclonales), sin afectar la capacidad de unin a antgenos del anticuerpo, o bien, sin inhibir la actividad de la enzima. Una gran variedad de sustratos se puede incubar con estas enzimas para generar productos de color susceptibles de cuantificacin mediante espectrofotmetros con placas de microtitulacin. Las enzimas ms comunes empleadas en la etapa de deteccin son: peroxidasa de suero de caballo y la fosfatasa alcalina. A continuacin se describe la preparacin de las enzimas ms comunes:

HRP (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH 5; aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30% AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesio TMB (tetrametil benzidina) 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico 0.1M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30%
5. Materiales Alcohol al 70% Algodn Beaker con cloro al 5% Cloro al 5% Kit de reactivos para ELISA
6. Procedimiento Permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Organizar y etiqueta con el nmero necesario de tiras. Aadir 100 uL control positivo, control negativo y suero de paciente por duplicado en los pocillos.
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o Pozos B1,C1 y D1: Co Pozos E1 y F1: C+ o Pozos G1 y H1: Mx 1 Aadir 50 ul de conjugado en los pozos B1 al H2. Cubrir con cinta adhesiva. Mezcle suavemente. Incubar durante 90 minutos a 37C. Lavar llenando cada pozo con 350 uL de solucin de lavado. Repetir el procedimiento 5 veces Aadir 100 ul de cromgeno (sustrato) a los pozos A1 a H1. Mezcle suavemente. Cubrir con cinta adhesiva e incubar 30 minutos protegidos de la luz. Aada 50 ul de solucin de parada a los pozos A1 a H1. Si el cambio de color no parece uniforme, golpee suavemente la placa para que se mezcle bien.
7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad Aplique las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales, suero y manejo de reactivos. 8. Formato de presentacin de resultados Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos. Investigue los diferentes anlisis que se pueden realizar utilizando en ensayo de ELISA 9. Bibliografa 1. Parslow t, Stites d et al. Inmunologa bsica y clnica 10 Ed. 2002. Editorial El manual moderno Mxico. P.917 (Pg. 254 257). 10. Cuestionario 1. Indique cual es la funcin de los siguientes pasos en la prueba de ELISA Incubacin inicial de la muestra en el pocillo Lavados Adicin del conjugado Adicin del cromgeno
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2. Mencione por lo menos cinco aplicaciones de la tcnica de ELISA: Directa Indirecta Tipo sndwich
3. Que otros parmetros inmunolgicos se pueden determinar mediante una prueba de ELISA para hepatitis B a parte del antgeno de superficie
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UNIVERSIDAD MARIANO GLVEZ FACULTAD DE CIENCIAS MDICAS Y DE LA SALUD CARRERA DE MDICO Y CIRUJANO

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

usando indicadores biolgicos y todos los resultados deben ser archivados.

donde se manipula o se almacena material infectivo (ej: hipoclorito al 10%).

contenedores a prueba de derrames.

VENIPUNCIN Y MANEJO DE ESPECIMENES HEMATOLGICOS

Procedimiento en adultos Identifique correctamente al paciente. correctamente para la extraccin. Preprelo

Fig. 1 Neutrfilo en banda y neutrfilo segmentado

Fig. 2 Neutrfilos segmentados

Fig. 3 Granulacin txica

Fig. 4 Vacuolizacin del citoplasma

Fig. 5 Cuerpos de Dohle

Fig. 6 Palillo de tambor

Existe disminucin de neutrfilos (neutropenia) en:

Figura 10. Linfocitos grandes y pequeos

Figura 11. Linfocitos atpicos

Figura 12. Linfocitos en mitosis

Figura 13. Linfocitos vacuolados

Monocitos (Fig. 14)

LEUCOCITOS Neutrfilos segmentados Neutrfilos en banda Eosinfilos Basfilos Monocitos Linfocitos

Valores relativos (%) 55-65 3-5 0,5-4,0 0-0,5 4-8 25-35

Valores absolutos (%) 3000-5000 150-400 20-350 10-60 100-500 1500-400

Rosetn 4 Todos negativos

9. Formato de presentacin de resultados

Reacciones de Aglutinacin directa e indirecta (Grupo ABO y Rh)

Figura 2. Esquema de reaccin en la prueba de tipificacin directa de grupo sanguneo ABO

25 uL mx 25 uL mx 25 uL mx + + + 25 uL 25 uL 25 uL diluyente diluyente diluyente + + + ES ES ES ES: Eritrocitos sensibilizados

Figura 2. Interpretacin de resultados

Figura 1. Esquema de la prueba de inmunocromatografa

11. Bibliografa Inmunocromatografa. Disponible en http://es.scribd.com/doc/36487446/ INMUNOCROMATOGRAFIA-pba-rapida. http://www.socpemi.org/Doc/pruebasrapidas.pdf http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mariamc/lacteos/practica8.htm

ENSAYO INMUNOENZIMTICOS (ELISA)

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