DERMATOLOGA PERUANA - VOL.

9, SUPLEMENTO 1, DICIEMBRE - 1999

DETERMINACIN DE COMPATIBILIDAD E IDENTIDAD

La PCR puede ser utilizada para amplificar selectivamente una porcin del gen HLA
(human leukocyte antigen) DQalfa, o el receptor de LDL (low-density lipoprotein). En
ambos casos se trata de un locus muy polimrfico del genoma humano y para los que
existen algunos kits comerciales para su deteccin. Esto permite comprobar la correcta
identidad de los tejidos de pacientes en casos dudosos por no existir correlacin entre
los hallazgos histolgicos y el contexto clnico 173.

En trasplantes, la tipificacin de HLA tradicionalmente se realiza mediante anlisis

inmunolgicos. Sin embargo, la aplicacin de anlisis genticos permite una mayor
resolucin174.

VARIANTES DE PCR175,80:

RT-PCR (reaccin encadena de polimerasa-transcripcin inversa)

Se utiliza para la deteccin y amplificacin de ARN. Permite estudiar la expresin de

determinados genes (su traduccin a protenas). En primer lugar se extrae el ARNtotal
de las clulas en estudio y se separa la fraccin correspondiente al mensajero (ARNm).
Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por
cada molcula de ARNm se sintetiza una molcula de cADN monocatenaria que
posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la
rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus es un enzima recombinante y
termoestable que acta como transcritasa inversa y como ADN polimerasa
simultneamente). A partir de aqu se aplica la tcnica de PCR lo que permite una
deteccin de la expresin de ARNm mucho ms sensible que con Northern blot o con
hibridacin in situl76. La,80. secuencia del fragmento amplificado se determina
mediante secuenciacin automtica de ADN. Existen diversos kits comerciales, como
Gene Amp de ARN-PCR (Pekin-Elmer, Alemania) que pueden ser utilizados para RT-
PCR,50,80

Aplicacin en dermatologa

La RT-PCR puede ser aplicada al ARN extrado de mnimos volmenes de sangre o en

material archivado como extensiones en laminillas as como en secciones de tejidos.
Por ello, la RT-PCR es muy til para detectar la presencia de virus ARN (como el virus
del sarampin)177 y el anlisis citogentico molecular de translocaciones
cromosmicas176.

Esta tcnica se puede usar por ejemplo para detectar la expresin proteica de antgeno
especfico prosttico en clulas (deteccin de micrometstasis o clulas tumorales
circulantes)178.

Las translocaciones en los tumores de piel y partes blandas son detectadas mediante
RT-PCR (Tabla 6). En el liposarcoma mixoide y en sus variantes pobremente
diferenciadas, la translocacin t(12,16) origina un gen de fusin entre el gen CHOP
gene y el gen FUS; y en los lipomas, el gen HMGI-C se reordena por alteraciones
estructurales que afectan a la regin 12q 14-15, un hecho que puede ser utilizado en
el diagnstico diferencial de este tipo de tumores 179,180.

TABLA 6. Cambios cromosmicos de tumores en

Dermatologa
Tumor Anomala cromosmica

Translocacions

Leiomioma t(12;14)(q14-15;q23-24)
Liposarcoma mixoide t(12:16)(113;p11)
Lipoma 12q14-15
Liposarcoma mixoide t(12;16)
Lipoblastomas Reordenamientos 8q
Sarcoma de clulas claras
(melanoma maligno de partes t(12;22)(q13;q12,212)
blandas)
Tumor desmoplsico de clulas
t(12;22)(q13;q11,2 12)
redondas pequeas
Dermatofibrosarcoma
protuberans y fibroblastoma t(17;22)
de clulas gigantes
Linfoma anaplsico t(2;5)
Linfoma linfoblstico T t(1;14)
Deleciones u otros
cambios
Tumores lipomatosos atpicos Cromosomas en anillo
Alteraciones en 12q, 6p y
Lipomas intramusculares
13q
Lipomas fusocelulares y
Alteraciones en 16q
pleomrficos
Hibernomas Alteraciones en 11q
Carcinoma epidermoide
Trisoma 7
cutneo
Queratoacantoma Trisoma 7

Melanoma
prdidas en 6q, 9p
y 10q
Alteraciones en 7p, 7q
Linfomas T
14q

Los estudios genticos en el angiolipoma subcutneo, una lesin de partes blandas

caracterizada por ser generalmente mltiple, con predileccin por el sexo masculino y
a veces hereditario, demuestran que su cariotipo es siempre normal, lo que los
distingue claramente de los lipomas, lipomas fusocelulares y pleomrficos,
lipoblastomas e hibernomas, que casi siempre muestran alteraciones cromosmicas
clonales181.

TABLA 7. Gentica de algunas enfermedades

cutneas183,195
Cromosoma Enfermedad Gen
Epidermlisis
1q LAMB3 LAMC2
ampollosa juntural
Queratodermia de
1q21 loricrin
Vohwinkel
Epidermlisis
3p COL7A1
ampollosa
 DISTRFICA
3q21-q24 Hailey-Hailey Desconocido
Queratodermia
6p21 desmoplaquina
palmoplantar estriada
Enfermedad de
8qter Meleda(queratodermia Desconocido
palmoplantar)

9p21 Melanoma

Sndrome epitelioma
9q22.3
basocelular nevoide
Epidermlisis
10q BPAG2 COL17AL
ampollosa juntural
Nevus blanco en
12q Queratina 4(K4)
esponja
Queratodermia
palmoplantar focal,
12q11-q13 K6a
paquioniquia
congnita
Queratinas del pelo
12q13 Monilethrix
hHb1 yhHb6
12q14 Melanoma CDK4
12q23-q24.1 Enfermedad de Darier ATP2A2
Transglutaminasa-
14q11 Ictiosis lamelar
1(TGM1)
Cilindromas mltiples
16q12-q13 Desconocido
familiares
Aldehidodeshidrogenasa
grasa
17p11.2 Sjgren-Larsson (FALDH)
Nevus blanco en
17q K13
esponja
Queratodermia
palmoplantar focal,
17q12-q21 K16, K17
paquioniquia
congnita
Epidermlisis
17q ITGB4
ampollosa juntural
Queratodermia
17q25 palmoplantar-cncer envoplaquina
esofgico
17q Psoriasis Desconocido
Adherinas
Queratodermia
18q12.1 desmosmicas
palmoplantar esriada
(desmogleinas)
Epidermlisis Lamininina alfa 3, LAMA
18q11.2
ampollosa juntural 3
Wp22.3 Ictiosisligada a X Esteroide
Displasia ectodrmica
Xq13.1 estodisplasina
anhidrtica
Hipertricosis
Xq24-q27.1 congnita Desconocido
generalizada

En el dermatofibrosarcoma protuberans y el fibroblastoma de clulas gigantes se

observa una translocacin t(17,22), que origina una fusin entre el gen COLIAI del
cromosoma 17, que codifica la protena colgeno tipo I al (COLIA I), con el gen PDGFB
del cromosoma 22, que codifica la cadena B del factor de crecimiento derivado de
plaquetas. La protena quimrica resultante COIA1/PDGFB, tiene actividad PDGFB que
parece jugar un papel esencial en la oncognesis de estas dos neoplasias, y el distinto
comportamiento clnico de stas se debe a otros factores adicionales182.

En algunas familias con incidencia elevada de melanoma cutneo se ha localizado el

gen responsable en el cromosoma 9p21, que codifica la protena p16INKA4a, y acta
como un gen supresor de tumor pues es un inhibidor de la quinasa dependiente de
ciclina y complejos de ciclina (como CDK4-ciclina DI) que fosforilan la protena del
retinoblastoma. Tambin se ha descrito mutacin de CDK4 (que puede actuar como un
oncogn) en algunos melanomas183.

La identificacin de clulas tumorales circulantes en la sangre perifrica de pacientes

con melanoma es posible mediante la utilizacin de RT-PCR para analizar
transcripciones (ARNm) de protenas asociadas al melanoma (tirosinasa, Melan-A/
MART-1, MAGE-3, gp100, y p97). En el estadio II un 23,8% y en el estadio IV un
37,5% de los pacientes presentan muestras positivas para al menos uno de esos
marcadores en RT-PCR. Aunque el anlisis de la protena S-l00 en suero (LIA anlisis
de inmunoluminometra) parece ser ms sensible, RT-PCR podra ser til para la
deteccin de micrometstasis en tejidos184.
En las enfermedades congnitas o degenerativas de la piel se ha descrito numerosas
alteraciones cromosmicas (Tabla 7).

Una de las causas de sndrome hiper IgE, en pacientes con historia prolongada de
eccema, abscesos por estafilococos y neumona recurrente son las alteraciones
cromosmicas, como la pentasoma X, aunque el mecanismo de estos sndromes hiper
IgE es desconocida187.

El estudio de ARNm y de su expresin proteica se utiliza para conocer mejor los

mecanismos inmunolgicos y de la inflamacin. De esta forma, en sujetos atpicos, se
ha comprobado que la eotaxina juega un papel importante en la reclutacin de
eosinfilos en las primeras 6 horas, mientras que la eotaxina-2 y la protena
quimifilctica para monocitos-4 (MCP-4) participan a las 24 horas188. Por otra parte,
en la dermatitis atpica se observa una expresin elevada de ARNm de interleuquina-
4, sobre todo en las lesiones agudas, mientras que en las lesiones crnicas se observa
un mayor nmero de clulas positivas para ARNm de IL-5, factor estimulante de
colonias de granulocitos-macrfagos (GMCSF) e IL-12(p40), conclusiones similares se
obtienen tras el estudio mediante hibridacin in situ de los receptores de estas
citoquinas. Adems, se ha observado un marcado incremento de clulas positivas para
el ARNm de receptores GM-CSFRalfa y IL-2Rbeta2 en la piel con psoriasis189.

En el liquen plano, el estudio de ARNm de interleuquina 6 e interfern gamma ha

demostrado que estas citoquinas proinflamatorias se producen en el liquen piano tanto
por linfocitos T activados como por queratinocitos alterados, lo que podra hacer
perdurar la lesin190.

Tambin se ha empleado RT-PCR en el estudio de citoquinas (interleuquina{IL}-2, IL-4

y IL-10) en la dermatitis por hipersensibilidad de contacto, comprobndose un nivel
elevado en estas reacciones, mientras que en la dermatitis por mecanismo imtativo no
se detecta elevacin en el ARN de estas citoquinas191.

En sangre perifrica y en biopsias de piel, es posible estudiar el patrn de respuesta

inmunolgica en las reacciones asociadas a dao tisular en la lepra lepromatosa
mediante el estudio de citoquinas por ELISA y RT-PCR del ARNm de ciulas
mononucleares. As, se ha observado que los pacientes de lepra lepromatosa sin
reacciones tienen un patrn T helper2 (Th2) y Th0, mientras que los enfermos con
reacciones muestran una respuesta tipo Th 1, con presencia de interfern gamma y
ausencia de interleuquina 4 y IL-12 p4O192.

La psoriasis es una enfermedad cutnea mediada por clulas Th 1, que se ha asociado

a infecciones por estreptococo beta-hemoltico del grupo A, el cual presenta pptidos
(M6), cuyo ARN puede ser detectado mediante RTPCR, con secuencias de aminocidos
similares a las queratinas epidrmicas humanas193.

En el eritema nodoso, la expresin de genes de las citoquinas IL-2 e interfern-gamma

en biopsias de piel y en sangre perifrica indica una respuesta inmune tipo Th 1,
independientemente del agente causal194.

Utilizacin teraputica

En el estudio de nuevas dianas para la inmunoterapia del melanoma, se estudia la

expresin de ARNm de determinados antgenos, como el Melan-A196, para comprobar
que este producto sea especfico de clulas melnicas, lo que a su vez proporciona una
herramienta til de diagnstico, gracias al desarrollo de anticuerpos monoclonales
aplicables a tejido en fresco y fdado en parafina, muy tiles para detectar
micrometstasis en el estudio de ganglios linfticos centinelas197.

En el estudio de enfermedades inflamatorias de la piel, puede utilizarse RT-PCR para

valorar el efecto y mecanismo de accin de determinados frmacos. As, se ha
demostrado que los corticosteroides tpicos disminuyen la expresin de ARNm de E-
selectina, segregada por las clulas endoteliales en el proceso inflamatorio198.

El anlisis de citoquinas mediante RT-PCR en alopecia areata demuestra que el patrn

de citoquinas es Th1 y se modifica (aumento de IL-2, IL-8, IL- 10, y factor de necrosis
tumoral alfa) durante el tratamiento inmunoterpico tpico (difenilciclopropenona), por
lo que el tratamiento con IL-10 recombinante podra ser til en estos pacientes199.

PCR asimtrica

Produce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar los dos cebadores necesarios
a concentraciones molares distintas en una relacin entre 50/1 y 100/1. as se produce
ADN de doble cadena en cantidad exponencial hasta que se agota el cebador
minoritario y luego slo se produce la cadena que hibrida con el ADN que se encuentra
en exceso, producindose a partir de entonces de forma lineal. De esta forma el
producto de PCR contiene 10 a 20 veces ms de ADN monocatenario que de ADN
bicatenario. Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario se puede utilizar para
una secuenciacin directa con la tcnica de Sanger 200,80

PCR anclada

Permite la amplificacin de ADN o ARN cuando slo se conoce el extremo 3'de la

secuencia de inters. Por ejemplo, el extremo 5' de la regin a amplificar es
artificialmente creado aadiendo una cola de nucletido definida utilizando la enzima
terminal deoxinucleotidiltransferasa (Tdt). Esta cola, a su vez sirve de secuencia que
ahora puede ser reconocida por un iniciador 5'. A partir de aqu se realiza PCR
convencional201.
PCR anidada ( "meste" PCR)

Se realizan dos PCR consecutivas de 25 a 30 ciclos cada una. En la primera se utilizan

un par de cebadores llamados externos; en la segunda se usan cebadores
complementarios a secuencias de ADN contenidas en los fragmentos que se
amplificaron en la primera PCR (cebadores internos) que flanquean una regin central
que es la que queremos amplificar202,80 . La idea que persigue esta tcnica es que los
productos de la primera amplificacin son un molde ideal para la segunda
amplificacin, mucho mejor que el ADN genmico original203.

Dada su enorme sensibilidad, uno de los peligros de esta tcnica es la contaminacin,

por lo que su utilizacin es difcil en laboratorios de rutina204.

En el estudio de los genes IgH, el ADN genmico puede ser amplificado utilizando
oligonucletidos especficos para la regin variable (FR2A) y de unin (LJH). La
secuencia obtenida es comparada con la secuencia VH de lnea germinal utilizando
programas informticos como HUSAR84.

Aplicacin en dermatologa

Este sistema sirve para aumentar la sensibilidad y especificidad de la reaccin y se

utiliza cuando partimos de cantidades muy bajas de ADN problema.

Se ha diseado protocolos de consenso especficos para la deteccin de un amplio

espectro de HPVs cutneos no genitales o asociados a epidermodisplasia
verruciforme205.

En tejidos incluidos en parafina, el estudio de productos de PCR anidada obtenidos con

iniciadores que codifican una protena de 65 Kca comn a todas las micobacterias, se
ha observado que en un 80% de las lesiones cutneas de sarcoidosis, una enfermedad
granulomatosa sistmica, se identifica ADN de micobacterias. Mediante el anlisis del
patrn de enzima de restriccin en estos productos de PCR (PCR/REPA) se ha
subclasificado las micobacterias detectadas en estos tejidos y han sido M. tuberculosis
complex, M. avium-intracellulare y M. kansasii206.

Con la variante "anidada" de PCR-electroforesis en gel con gradiente de

desnaturalizacin se detecta hasta un 90% de clonalidad en el receptor TCR-gamma en
lesiones de micosis fungoides en todos los estudios207.

Sin embargo, puesto que en un 6% de las biopsias de piel con procesos inflamatorios
benignos (incluyendo pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda o parapsoriasis de
pequea placa entre otros) tambin presentan monoclonalidad de clulas T, debe
realizarse siempre una correlacin entre el estado de la clonalidad con las
caractersticas morfolgicas e inmunofenotpicas que ayuden a diferenciar los
infiltrados linfocitarios benignos de los linfomas cutneos207.

PCR semianidada ("semi-nested' PCR)

Es una PCR anidada en la que slo se utiliza uno de los cebadores internos. El mtodo
no aade mucha especificidad pero en ciertas aplicaciones aade la suficiente
especificidad para conseguir el producto PCR deseado203. De esta forma, para la
deteccin de genes IgH reordenados clonalmente puede utilizarse PCR semi-anidada
84.

"Drop-In/Drop-Out Nested" PCR

Esta tcnica se basa en incluir cebadores internos (anidados) con el punto de fusin
significativamente ms bajo que los cebadores externos, lo que evita que esos
cebadores internos se hibriden (annealing) durante la primera PCR. Con este mtodo
se evita la utilizacin de capas de aceite que de otra forma seran necesarias para
separar los reactivos de las dos PCRs203.

PCR mltiplex

Consiste en hacer diversas amplificaciones en el mismo tubo de reaccin colocando

mltiples parejas de cebadores. Las secuencias a detectar han de estar lo
suficientemente lejos unas de otras para que las amplificaciones no interfieran entre
s8O.

Esta tcnica se utiliza en la deteccin del gen de la distrofina en la distrofia muscular

de Duchenne; un gen enorme (de mas de 2 millones de pares de bases), que no es
adecuado para ser estudiado mediante anlisis indirecto, y que adems presenta una
marcada heterogeneidad en sus mutaciones208.

El anlisis de sonda fluorognica, desarrollado en 1997, es un mtodo sencillo que

puede ser aplicado a la deteccin de HPV y subtipos en varios tipos de muestras. La
tcnica se basa en la actividad 5'->3 exonucleoltica de la Taq polimerasa que
aumenta la seal de marcadores fluorescentes al liberarlos de las sondas especificas
para esos genomas durante PCR mltiple. Esa fluorescencia puede ser detectada en un
fluormetro automtico y se correlaciona con la cantidad de ADN de HPV presente en
la muestra antes de la amplificacin209.

"Touch-down" PCR

Es una reaccin de PCR en dos partes. En la primera parte, que dura 20 ciclos, se
empieza con una temperatura de hibridacin elevada y se va disminuyendo hasta la
temperatura de hibridacin ptica; esto evita la formacin de dmeros de cebadores en
las primeras fases. Luego, en la segunda parte, se hacen otros 20 ciclos ms a la
temperatura de hibridacin ptima para que se produzca cantidades masivas de ADN.
Se utiliza cuando se trabaja con cebadores degenerados porque es difcil calcular la
temperatura de hibridacin ptima8O, tambin es til cuando
no se ha determinado exactamente el grado de complementariedad del molde del
cebador, pero esta tcnica tiene algunos inconvenientes, como requerir una
programacin complicada, sobre todo en las mquinas equipadas para reducir
automticamente y progresivamente la temperatura en cada ciclo sucesivo203.

"Hot start" PCR

Consiste en empezar la PCR a una temperatura elevada. Antes de calentar la muestra

ya se puede formar dmeros y uniones inespecficas si la Taq polimerasa est presente.
Para evitarlo se aade la Taq polimerasa en ltimo lugar antes de comenzara ciclar, a
una temperatura de 95C80. Con la Amplitaq gold de Perkin-Elmers no es necesario
este paso porque slo se activa tras el Primer calentamiento16

PCR cuantitativa
Se utiliza un segundo objetivo dentro de la muestra que sirve de control interno para
la sntesis de cADN y se basa en la competencia de los iniciadores por las dos
secuencias objetivo. Es muy difcil y casi nunca se usa80

PCR "n situ"

Consiste en realizar la PCR directamente sobre cortes de tejido o extensiones

citolgicas de forma que, posteriormente, se puede detectar los productos de PCR
amplificados en el lugar donde se localiza el ADN (o ARN) original en la muestra, en
lugar de utilizar un gel o una membrana80 En realidad este trmino se ha utilizado
indistintamente para denominar dos tcnicas diferentes:

PCR-hibridacin in situ (PISH)

Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensin citolgica y

despus detectar el ADN amplificado mediante hibridacin in situ con sondas
complementarias marcadas colorimtricamente (avidina-biotina-peroxidasa).

Aunque tcnicamente compleja, es utilizada para detectar la infeccin latente de VIH

en cortes histolgicos, por ejemplo, en ganglios linfticos, msculo esqueltico, o
crvix, en individuos portadores asintomticos210.

Utilizando PCR hibridacin in situ podemos detectar una nica copia de genoma del
virus del papiloma humano (HPV) en una clula determinada. Esto permite localizar
clulas que contienen el virus en infecciones ocultas94. Utilizando PCR in situ, se ha
detectado en ADN del HPV en algunas lesiones no diagnsticas en vulva y pene que
fueron negativas para hibridacin in situ, frecuentemente por estar ocultas tras una
capa granulosa engrosada focalmente o por hiperqueratosis94.

Si el virus no puede ser detectado mediante PCR in situ, es muy improbable que est
presente en esa seccin tisular Sin embargo, su complejidad y la prdida de calidad del
tejido despus de sucesivos calentamientos y su elevado costo no hacen de la
hibridacin in situ una alternativa vlida en el trabajo diario.

El virus del sarampin tambin puede ser localizado en tejido gracias a esta
tcnica311.

PCR in situ (en sentido estricto)

Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensin citolgica utilizando
dNTPs (nucletidos) o cebadores marcados colorimtricamente o con fluorescencia.

En ambos casos es necesario utilizar termocicladores con bloque trmico adaptado a la

utilizacin de portas. Para evitar las uniones del ADN en el rea de inters se utiliza
irradiacin ultravioleta (y se procede como en la PCR convencional) o se combina PCR
con hibridacin in situ, como hemos visto ms arriba.

PCR de clula nica

Se ha utilizado en el anlisis preimplantacin del gen de la fibrosis qustica en una

clula nica extrada de un embrin de ocho clulas212, en el anlisis de esperma y en
el estudio de la expresin de genes en clulas de Reed-Sternberg213.
PCR-inmuno

Se emplean dos tecnologas, la deteccin basada en anticuerpos y PCR, La deteccin

del antgeno por el anticuerpo se ve enormemente potenciada por la conjugacin del
sistema de deteccin del anticuerpo con un fragmento de ADN que posteriormente es
amplificado mediante PCR. Esta tcnica recuerda a ELISA (anlisis inmuno absorbente
ligado a enzima) y permite detectar incluso 10 femtogramos de protena. Una variacin
de PCR-inmuno es el empleo de cromgenos unidos a uno de los cebadores o
iniciadores, y la posterior determinacin colorimtrica de la cantidad de producto
generado214.

TCNICAS PARA DETECCIN DE MUTACIONES PUNTUALES

El cribado de mutaciones puede incluir la deteccin de alteraciones especficas y

conocidas en la secuencia de nucletidos en lugares concretos previamente
determinados que contienen mutaciones, o puede realizarse la deteccin de
mutaciones dispersas en varios lugares dentro de un segmento de ADN. Se ha
empleado varias tcnicas para identificar mutaciones en lugares previamente
determinados, que con frecuencia se aplican tras la realizacin de PCR. Entre ellas,
destacamos la hibridacin de oligonucletidos especfica de alelo, la amplificacin
especfica de alelo (ya sea a travs de PCR con iniciadores que reconocen la secuencia
alterada en sus extremos 3'o mediante la reaccin en cadena de la ligasa), y
procedimientos que crean o destruyen los lugares de restriccin215.

La deteccin de mutaciones en lugares indeterminados del ADN puede ser realizada en

segmentos que contienen una secuencia conocida o cuando no se dispone de
informacin de la secuencia en la regin que se est estudiando; esto ltimo, por
supuesto, supone una complicacin considerable. Una solucin posible es el rastreo de
discordancias genticas (genomic mismatch scanning)215.

MTODOS DE CRIBADO PARA LA DETECCION DE MUTACIONES NO CONOCIDAS

(Rastreo del gen)

Segn el nivel de informacin de que dispongamos, podremos utilizar cada una de las
tcnicas aqu descritas (Tabla 8). En general, SSCP (polimorfismo estructural de
cadena simple) y DGGE (electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes) estn
indicadas para el cribado de mutaciones, es decir, para confirmar o no la existencia de
mutaciones. Por otro lado, EMC (mtodo de la rotura enzimtica) y CCM (mtodo de la
rotura qumica) son tiles para conocer cuntas mutaciones existen y dnde estn
localizadas. Por ltimo, la secuenciacin nos permite conocer cul es la mutacin203

En un gran nmero de enfermedades genticas se desconoce la secuencia de los genes

e incluso su localizacin en los cromosomas. Para ello, se hace uso de las variaciones
naturales que se producen en las secuencias de ADN (polimorfismos)216. Otros
mtodos estn basados en el anlisis de la secuencia del ADN. Un tercer grupo lo
constituyen los mtodos estructurales, basados en la movilidad alterada en
electroforesis que presenta el ADN mutado, que tienen una sensibilidad moderada para
detectar mutaciones raras en mezclas de fragmentos (alrededor de un 10% de
fragmentos con mutaciones). Por ltimo, se utiliza las tcnicas basadas en el
reconocimiento de discordancia de bases (sustancias qumicas o protenas que actan
en las bases no concordantes de ADN); puesto que estas tcnicas trabajan con
heterodplex de fragmentos mutados y normales de ADN, no pueden ser aplicadas a
fragmentos de ADN amplificados de clulas mutadas homocigotas, a diferencia de las
tcnicas estructurales. Esta limitacin puede ser obviada aadiendo ADN normal a la
mezcla de PCR203.

TABLA 8. Indicaciones de las tcnicas de rastreo del

gen
Nivel de Informacin
Mtodo
informacin buscada
Hay o no hay
Cribado SSCP, DGGE
mutacin?
Cuntas y dnde se
Rastreo EMC, CCM
localizan?
Cules son las
Identificacin Secuenciacin
mutaciones?

Secuenciacin

Consiste en la identificacin de la secuencia de bases de un determinado fragmento de

ADN. Se utiliza para corroborar mutaciones detectadas con otras tcnicas (PCR-SSCP
DGGE, ASO, etc.). Existen dos formas de secuenciar un producto de PCR.

Secuencia directa

Se purifica el producto de PCR separando el producto amplificado de otros elementos

presentes en la muestra (dmeros de oligonucletido, sales, dNTPs, iniciadores Y Taq
polimerasa)21. Una vez obtenida la cadena deseada, si el ADN es bicatenario hay que
desnaturalizarlo por calor o con lcali (este paso no es necesario si tenemos ADN
monocatenario como por ejemplo en el producto de PCR asimtrica217. La
secuenciacin directa es el estndar para la deteccin de sustituciones de una sola
base. Aunque la tcnica es algo complicada, hoy da puede ser automatizada218. Los
resultados de la secuenciacin directa pueden ser analizados: a. mediante la
evaluacin de los productos de PCR en electroforesis en gel; b. utilizando un escner
para estudiando la secuencia obtenida y valorndola con un software especfico; y c.
analizando la secuencia mediante un analizador de mutaciones es la posibilidad de
definir "regiones calientes": en la secuencia que se presentan al usuario para su
anlisis visual, independientemente del estado de mutacin que tengan. Esto es
especialmente til cuando se desea analizar una regin determinada, como mutaciones
especficas en una poblacin mixta de VIH219.

Secuenciacin indirecta

Se realiza tras la clonacin del producto amplificado. La cionacin del ADN consiste en
introducir una secuencia del genoma en un vector, que puede ser bien un lago viral o
bien un plsmido (los plsmidos estn constituidos por ADN circular extracromosmico
que est presente en las bacterias y que se replica de forma independiente del ADN
bacteriano, generalmente son los portadores de genes de resistencia a antibiticos2l.

En ocasiones para clonar grandes fragmentos de ADN se utilizan los cromosomas

artificiales de la levadura "YACs (yeast artificial chromosome)" en vez de los
plsmidos. En los YAC es posible clonar fragmentos de ADN 1000 veces mayores que
en los plsmidos21.

Los mtodos clsicos de secuenciacin son: enzimtico, que requiere un ADN molde de
cadena simple (como el bacterifago M 13 o el plsmido PUC) y aadiendo a la mezcla
del ensayo el fragmento mayor de la ADN polimerasa y los cuatro deoxinucletidos
trifosfato precursores marcados radioactivamente, y qumico, que mediante reactivos
qumicos (metilacin, cido frmico, piperidina , etc.) permite romper la cadena de
ADN de modo selectivo en cada una de las posiciones ocupadas por las cuatro bases
modificadas. Los vectores de clonacin facilitan la obtencin de ADN marcado21. Otro
mtodo es la secuenciacin quimioluminiscente, en el que la secuenciacin enzimtica
se lleva a cabo con un cebador estndar, no marcado, y tras la secuenciacin y
electroforesis se fijan los productos de la secuenciacin a una membrana de nylon, la
cual se hbrida con un oligonucletido biotinilado complementario al cebador utilizado.
Actual mente, estos protocolos estn controlados por secuenciadores automticos, que
proporcionan gran rapidez y comodidad, incrementando la eficiencia de la
secuenciacin21.

Aplicacin en dermatologa

Este mtodo permite disponer de un mtodo sensible y rpido para el cribado de

mutaciones de p53 en el estudio de cncer de piel inducido por radiacin UV220.

Ms de un 50% de pacientes con dermatitis atpica tienen test cutneo e IgE

especfica positivos para Malassezia furfur. Este hongo es capaz de producir un amplio
abanico de protenas que fijan IgE. Para valorar la participacin de estos componentes
en la enfermedad se ha clonado los alergenos de M. furfur, se ha secuenciado los
insertos y se ha elaborado protenas recombinantes en fagos Escherichia coli. De esta
forma se ha identificado dos genes: Mal f5, similar al identificado en Aspergillus
fumigatus, y Mal f6, muy parecido a la ciclofilina22l. En el caso de M furfur 2 y M furfur
3, sus secuencias son similares a las protenas de la membrana de peroxisoma de
Candida boidinii y un aiergeno de Aspergillus fumigatus, AsP f399.

La secuenciacin es el mtodo de eleccin para monitorizar cambios lentos en una

determinada secuencia a lo largo del tiempo, por ejemplo, la progresin de la
resistencia a AZT con el tiempo, debido a mutaciones del VIH-1203.

El gen que origina la enfermedad de Darier codifica una bomba de calcio, segn se ha
comprobado tras anlisis de secuencia en un cromosoma artificial de levadura que
inclua la regin crtica de la enfermedad. Tras un estudio posterior de Northern Blots y
RT-PCR se estudi la expresin de los genes en queratinocitos y se encontraron
defectos en ATP2A2 (o SERCA2, una ATPAsa Ca2+ lenta del retculo sarcoplsmico del
msculo estriado)222.

RFLP. Anlisis de fragmentos de restriccin mutacin, mediados por iniciadores o no

El RFLP (restriction fragment lenghth polymorphism) utiliza enzimas (endonucleasas)

de restriccin que rompen el ADN en determinadas secuencias, de existir una mutacin
en estas secuencias no se producira la rotura y el nmero de fragmentos observado
en electroforesis ser menor que de no existir la mutacin. Existe una modificacin en
la tcnica en la que, en el caso de que el fragmento que queremos detectar
mutaciones no haya ninguna secuencia susceptible de reconocimiento por ninguna
enzima de restriccin, se introduce la secuencia sensible a la rotura por el enzima de
restriccin en el iniciador de la PCR de forma que esta secuencia que de justo en la
vecindad de los posibles sitios de las mutaciones que buscamos. Como resultado de la
sustitucin de bases, de existir esta mutacin, el sitio de restriccin es irreconocible
por el enzima.
Cuando las sondas son probablemente dirigidas contra un gen o una regin cercana a
ste, que puede ser desconocido, pero se cree que se asocia con una determinada
enfermedad o locus, se habla de anlisis indirecto, anlisis de relacin o linkage
analysis. Un alelo se define como "relacionado" a un gen causante de una enfermedad
si se encuentra en individuos afectados con una frecuencia mayor que la esperada por
el azar La asociacin de una enfermedad con un haplotipo gentico relacionado se
denomina desequilibrio de relacin (linkage dysequilibrium)223.

Los estudios de anlisis de relacin han sido esenciales en el estudio de enfermedades

hereditarias, aunque slo pueden ser utilizados cuando existe polimorfismo en un
determinado locus. Otro requisito es que debe existir una familia con varios sujetos
afectados, y todos deben participar en el estudio. Por otra parte, otra limitacin es que
no todas las familias afectadas ofrecern datos relevantes para un determinado
marcador polimrfico relacionado223. Por ello, el diagnstico molecular est
evolucionando hacia otras tcnicas que permiten la deteccin directa pues los genes
especficos estn siendo clonados y caracterizados y se estn identificando las
mutaciones correspondientes.

Una ventaja de esta tcnica es que, si se conoce la localizacin cromosmica del gen
marcador, puede establecerse la localizacin cromosmica del lugar polimrfico (por
tanto del gen mutante con l relacionado). De esta forma ha sido posible localizar el
gen de la fibrosis qustica en el cromosoma 7, lo que en ltimo trmino ha permitido su
clonacin. La lista de enfermedades de un solo gen en el que el anlisis de relacin es
til contina creciendo y entre ellas se encuentran la distrofia muscular de Duchenne,
el sndrome del cromosoma Xfrgil, la enfermedad poiiqustica renal y la
neurofibromatosis224.

Aplicacin en dermatologa

Esta tcnica se ha empleado en el diagnstico de la anemia de clulas falciformes,

pues en el gen normal de la beta-globina (HbA) existen tres lugares que son
reconocidos especficamente por la enzima de restriccin Mst II225.

En la deteccin de portadores y en el diagnstico prenatal de enfermedades con

importante heterogeneidad en sus mutaciones, como la hemofilia A y B, cuyos genes,
adems son de gran tamao, lo que impide un examen rpido de todos sus exones, se
utiliza linkage analysis indirecto con RFLPs, lo que hace necesario disponer de
numerosos miembros de la familia226.

En la atriquia universal congnita o atriquia con lesiones papulosas (una forma

hereditaria de alopecia, en el que la prdida de pelo ocurre poco despus del
nacimiento y aos despus se sigue una erupcin papulosa difusa) el anlisis de
relacin usando marcadores microsatlites de la regin del gen de la prdida de pelo
(hairless) humano demuestra que el locus de la atriquia con lesiones ampulosas se
encuentra en la regin cromosmica 8p 12227,228. En esa misma regin se ha
detectado el gen responsable de la hipotricosis de Marie Unna, un trastorno
autosmico dominante que aparece en la infancia229. Existen otras formas
hereditarias de alopecia que no estn relacionadas con el gen de la prdida de pelo
humano del cromosoma 8230.

En la porfiria cutnea tarda espordica se ha estudiado la mutacin de un gen similar a

MHC clase I cuya mutacin se piensa que es la causa de la hemocromatosis. Con la
digestin por enzimas de restriccin de ADN genmico amplificado por PCR es posible
detectar esta mutacin en donantes de sangre sanos. La mutacin Cys282Ty aparece
en un 44% de los pacientes y un 11% de los controles, por lo que son necesarios
estudios posteriores sobre esta enfermedad231.

En la dermatitis atpica, el estudio mediante PCR-RFLP en sangre perifrica muestra

un predominio significativo (85%) de homocigotos para alelos acetiladores lentos (N-
acetiltransferasa 2, NAT2) entre los pacientes con dermatitis atpica, frente a un 54%
en sujetos sanos232. otros estudios describen una mayor frecuencia de acetiladores
rpidos en pacientes con dermatitis alrgica de contacto que en controles233.

El estudio W polimoffismo allico del gen quimasa de mastocitos (MCC, una proteasa
srica segregada por los mastocitos) indica que las variantes genticas del gen MCC se
asocian sobre todo al eccema atpico solitario, con IgE srica inferior a 500 IU/mL, y
no se asocian sobre todo al eccema atpico con enfermedad respiratoria y una IgE
srica superior a > 2000 IU/mL234.

En familias japonesas se ha observado que las diferencias en la actividad

transcripcional del gen de IL4 influye en la predisposicin a dermatitis atpica, al
estudiar el polimorfismo del gen
IL4235. En otros estudios, usando marcadores muy polimrficos, se observa vnculos
entre la dermatitis atpica y marcadores del cromosoma 11q13 (como D11S903 y el
gen del receptor IgE de gran afinidad {FCER 1 B Fc(epsilon) RI-b Leu 181}236,237.

Las tcnicas genticas son tiles para explicar cmo los defectos en la angiognesis
participan en ciertas anomalas vasculares. Las mutaciones en genes de los receptores
del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGFR-w y VEGFR-2) y los defectos
en el gen responsable de la produccin deVEGF son letales para el embrin en
desarrollo por causar errores en la diferenciacin endotelial normal y en la formacin
de vasos238. Por otra parte, las mutaciones de los genes de los receptores de la
tirosinquinasa Tie-1 y Tie-2 se asocian a malformaciones hereditarias venosas en
varias familias238.

La telangiectasia hemorrgica hereditaria o sndrome de Rendu-Osler-Weber es una

anomala vascular sistmica autosmica dominante, causada por mutaciones en genes
de algunas protenas expresadas por las clula endoteliales (protenas de unin al
factor del crecimiento transformante beta, endoglina y quinasa similar al receptor de
activina)238 .

En la cavernomatosis familiar cerebral asociada a angiomas cutneos, un trastorno

autosmico dominante, se ha identificado el gen causante en el cromosoma 7q,
mientras que el gen del sndrome de malformacin vascular autosmico dominante en
el que las lesiones predominantes son cutneas, se ha mapeado en el cromosoma
9p21239 . En el sndrome de Bean o de nevus vejiga de caucho azul, caracterizado por
mltiples hemangiomas azulados de la piel y el tracto gastrointestinal, el gen se ha
identificado en el cromosoma 9p240. En otras familias con hemangiomas infantiles,
que tambin se heredan de forma autosmica dominante con alta penetrancia, el
anlisis de relacin localiza el gen en el cromosoma 5q241.

El gen de la neurofibromatosis tipo I se localiza en el cromosoma 17 y el gen del tipo II

se ha situado en el cromosoma 22. En el sndrome von Hippel-Lindau el gen se ha
localizado en el cromosoma 3p25-26242.
En estudios genealgicos, el locus responsable del sndrome de Marfan ha sido
localizado en el cromosoma 15q21.I, que codifica la fibrilina 0. Las mutaciones en la
fibrilina 2 originan la aracnodactilia crontractural congnita, las fibrilinas son
microfibrillas que solas, o en combinacin con la elastina confieren las propiedades
biomecnicas al tejido conjuntivo. Dada la heterogeneidad del gen de la fibrilina I, el
diagnstico prenatal y presintomtico del sndrome de Marfan que es posible mediante
RT-PCR, est limitado a unas pocas familias243.

Tcnicas estructurales

-DGGE/TGGE Electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes /Electroforesis en

gel con gradiente de temperatura

La DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)/ TGGE (temperature gradient gel

electrophoresis) es el mtodo ms eficaz y utilizado. Se realiza una electroforesis del
ADN de doble cadena a travs en gel con concentraciones crecientes de un agente
desnaturalizante (urea o formamida) o en el que la temperatura es creciente. As, el
ADN de doble cadena se disocia dependiendo de su conformacin a una temperatura o
una concentracin de desnaturalizante diferente dependiendo de la existencia o no de
mutaciones. Esto hace que, de existir una mutacin en el fragmento de ADN estudiado
previamente amplificado por PCR, habr bandas diferentes a las que aparecen en la
electroforesis de ese mismo fragmento de ADN estudiado previamente amplificado por
PCR, habr bandas diferentes a las que aparecen en la electroforesis de ese mismo
fragmento de ADN normal. Este mtodo permite separar segmentos de ADN de menos
de 1 kb de longitud que contienen una nica mutacin244.

Una variante de esta tcnica es la electroforesis en gel en condiciones

desnaturalizantes constantes (CDGR), en la que la concentracin del agente
desnaturalizador qumico sea constante y cercana a la que separa las cadenas del
fragmento normal215

Los inconvenientes de esta tcnica es que slo permiten detectar fragmentos de ADN
de hasta 600 bp, requiere un equipo sofisticado y las condiciones exactas del gen a
menudo han de ser determinadas para cada fragmento examinado. La limitacin en el
tamao del fragmento de ADN puede evitarse utilizando electroforesis bidimensional,
en la que la separacin por tamao de fragmentos ocurre en la primera dimensin bajo
condiciones del gel constantes y la separacin por secuencia ocurre en la segunda
dimensin mediante DGGE215.

Algunos genes son resistentes al mtodo DGGE debido a su alto contenido en

nucletidos G+C. En estos casos puede utilizarse SSCP que es fcil de realizar. aunque
debe definirse cuidadosamente las condiciones de trabajo245.

Aplicacin en dermatologa

Mediante PCR con iniciadores especficos para segmentos Vgamma 1-8 y Vgamma9 del
gen del receptor de linfocitos T (TCR-gamma), en combinacin con electroforesis en
gel en condiciones desnaturalizantes (PCR-DGGE), se ha observado que un 66% de
micosis fungoides en estado en placa y un 100% de micosis fungoides en estadio
tumor o de linfomas cutneos de clulas T pleomrficos presentan reordenamientos
clonales del gen TCR-gamma, mientras ninguno de los pseudolinfomas cutneos de
clulas T, estudiados presentaban este reordenamiento246.
En los estudios comparativos entre las diversas tcnicas de electroforesis para la
demostracin de poblaciones clonales de clulas T en biopsias de piel y su diagnstico
diferencial con dermatosis inflamatorias, la electroforesis en gel con gradiente de
temperatura cargada con heterodplex (HD-TGGE) y el anlisis de fragmentos son ms
sensibles que la electroforesis en gel de poliacrilamida cargada con heterodplex en
geles MDE (mutation detection enhancement). Por su coste, la ms recomendable es
HD-TGGE247.

-SSCP Polimorfismo estructural de cadena simple

Bajo ciertas condiciones, los cidos nucleicos monocatenarios adoptan estructuras

tridimensionales secundarias en solucin. Estas estructuras varan dependiendo de la
composicin de las bases y pueden resultar alteradas por el cambio de una nica base.
Esto hace que, si existe mutacin en el ADN estudiado, la estructura tridimensional
que adopta ste sea diferente de la que adopta el ADN normal de control, por lo que
las bandas obtenidas en la electroforesis de ambos productos sern diferentes debido a
que la agarosa (o poliacrilamida) ofrecer distinta resistencia al paso del ADN
dependiendo de su estructura tridimensional (bajo condiciones no
desnaturalizantes215.

SSCP (single-strand conformation polymorfism) es una tcnica relativamente simple

que se utiliza en el cribado inicial de mutaciones. Si se observa una banda anormal,
sta puede ser extrada del gel y, posteriormente, secuenciada directamente los
productos amplificados mediante PCRIII. Permite analizar fragmentos de ADN de hasta
250-300 bp y con mltiples geles, permite detectar hasta el 95% de las
mutaciones215.

Aplicacin en dermatologa

Se utiliza para detectar mutaciones en toda la regin de codificacin del gen p53. Las
mutaciones de p53, estudiadas con PCR-SSCP se encuentran ms frecuentemente en
carcinomas epidermoides infiltrantes que en el carcinoma in situ (enfermedad de
Bowen) o microinfiltrante126. Tambin se asocian a linfomas cutneos primarios y a la
evolucin de micosis fungoides estadio placa a estadio tumoral143 y a la
transformacin histolgica del linfoma folicular en un linfoma difuso ms agresivo249.
Sin embargo, tanto SSCP como el anlisis de secuenciacin de ADN puede dar lugar a
falsos negativos debido a la presencia de clulas del estroma o clulas normales
residuales en la biopsia, aunque en el examen microscopico preliminar predomine la
presencia de clulas tumorales. Por otra parte, SSCP permite detectar mutaciones
puntuales en fragmentos que no son mayores de 300 bp250.

Tambin se utiliza en el estudio de gen supresor tumoral hptc (patched), cuyas

mutaciones se describen en el epitelioma basocelular y parecen ser ms frecuentes en
el epitelioma basocelular espordico (30%) que en el asociado a xeroderma
pigmentoso (11%). Adems, se ha comprobado la coexistencia de mutaciones en p53
y en hptc en un 50% de los epiteliomas basocelulares asociados a xeroderma
pigmentoso251.
Los estudios moleculares permiten asimismo estudiar el origen histogentico de
algunas clulas. De esa forma, el descubrimiento de polimorfismo de la molcula CDla
en clula de Langerhans de donantes en los receptores de trasplante de mdula sea,
parece indicar un origen en mdula sea de este tipo celular. Que a su vez podra
representar un dendrocito inmaduro. Otra prueba de dicho origen es la presencia de
cromosomas Y en las clulas de Langerhans en mujeres trasplantadas con la mdula
sea de donantes varones252.

- Anlisis de heterodplex

Se somete una mezcla de ADN control y de ADN a estudio a desNatluralizacin por

calor y a reacoplamiento (reannealing) posterior Si no existe mutacin slo se
producen homodplex (cadenas que emparejan todos sus nucletidos) pero si existe la
mutacin se producen tanto homodplex como heterodplex (cadenas que no
emparejan 100% puesto que algunos de sus nucletidos son distintos). Los
homodplex y los heterodplex tendrn distintas movilidades electroforticas. As, de
existir la mutacin aparecern dos bandas y de no existir slo una(253).
Se realiza en geles no desNatluralizantes y tiene la ventaja de no necesitar controlar
las condiciones del anlisis para cada fragmento de ADN. Por otro lado, el mtodo HET
detecta un nmero menor de mutaciones que DGGE y suele utilizar junto con otros
mtodos215.

Aplicacin en dermatologa

El cribado molecular de algunos genes, como el colgeno VII (COL7AI) en pacientes y

familiares puede realizarse mediante anlisis de heterodplex, que permite detectar
mas del 90% de las mutaciones de este gen. Este gen se encuentra alterado en la
epidermlisis ampollosa distrfica, pero no se identifica mutaciones en el sndrome de
Kindler un raro trastorno caracterizado por ampolla acrales en la infancia temprana y
poliquilodermia generalizada con marcada atrofia cutnea y en el que se desconoce el
lugar exacto de la dehiscencia253.
El gen de la laminina 5 se ha mapeado en el cromosoma 8. Su expresin est muy
reducida en la epidermlisis ampollosa juntural grave de Herlitz y generalmente se
detecta en la epidermlisis ampollosa juntural no let al254.

-Electroforesis con concentraciones de disolventes parcialmente desNatluralizantes

Esta tcnica es poco utilizada y permite detectar mutaciones en fragmentos de hasta

800 bp2l5.

Mtodos basados en los errores de acoplamiento

-Mtodo de la rotura por ARNasas

Bajo determiNatllas condiciones los puntos donde hay errores en el acoplamiento

(mismatches) entre heterodplexARN:ARN yARN:ADN pueden ser rotos por una
ARNasa. Tras la rotura los fragmentos se analizan por electroforesis con
desNatluralizacin en gel255. Pero este mtodo slo detecta un 50% de las
mutaciones215.

-Mtodo de la rotura qumica. CCM (chemical cleavage method)

Los nucletidos desemparejados en los heterodplex ADN:ADN o ADN:ARN son

modificados por agentes qumicos (hidroxilamina y tetrxido de osmio son peligrosos y
se han sustituido por carbodiimida) que no afectan a los nucletidos emparejados.
Luego los heterodplex son expuestos a piperidina que los rompe en los sitios donde
hay modificacin qumica256. La localizacin de la mutacin puede deducirse del
tamao de los fragmentos obtenidos. Esta tcnica puede detectar mutaciones en
fragmentos de ADN de hasta 1499 bp de longitud, con un 90 a 95% de eficiencia215.

-Mtodo de la rotura enzimtica. EMC (enzyme mismatch cleavage)

Se produce los heterodplex ADN:ADN por calor y reacoplamiento y se exponen a una

endonucleasa tras lo cual los fragmentos se analizan por electroforesis en gel. Se ha
utilizado las nucleasas de la haba mung y S1, pero este mtodo es muy dependiente
de la secuencia y no detecta muchas mutaciones215.

-EMC con resolvasas de bacterifagos

Es un mtodo sensible para la deteccin de mutaciones en heterodlplexs de ADN

ramificadas. Dos de estas enzimas, la T4 endonucleasa VII (T4E7) y la T7
endonucleasa I, (T7E1) rompen en ADN cerca de los sitios de discordancia de las
bases. Los productos de la rotura pueden ser analizados mediante electroforesis en gel
y permite analizar fragmentos de al menos 1500 bp. el mtodo permite detectar un
95% de las mutaciones y parece ser ms sensible que SSCP en el cribado de algunos
genes, como BRCA1215.

-CFLP (cleavage fragment lenght polymorphism) Polimorfismo de longitud de

fragmentos de rotura

Tras desNatluralizar los fragmentos de ADN de cadena simple stos se doblan sobre s
mismos formando unas estructuras tridimensionales secundarias que dependen de su
secuencia y que contienen numerosos pliegues y horquillas. La endonucleasa
"cleavage" I rompe el ADN en los puntos en los que comienzan esas horquillas, en el
punto 5 de la unin entre el ADN de cadena simple y el de doble cadena. Por lo tanto,
este enzima produce fragmentos que sern distintos en el segmento de ADN normal de
control y en el ADN problema de existir en ste un cambio en la secuencia
(inserciones, deleciones o mutaciones puntuales215.

-Deteccin de mutaciones por protenas que se unen a los errores de

acoplamiento (mismatch binding protein)

Se generan heterodplex por calor y posterior reacoplamiento entre cadenas de ADN

control normal y ADN mutado. Despus se incuban con protena MutS (que forma
parte del sistema de reparacin de ADN de la E. coli). Esta protena queda unida a los
puntos donde no hay acoplamiento entre los nucletidos enfrentados. Despus somete
esa mezcla a la accin de exonucleasas, como la MutS protege al ADN al que est
unida de la rotura por exonucleasas, el nmero y tamao de los fragmentos obtenidos
tras esta digestin ser diferente de no haber mutacin (en cuyo caso tendramos
homodplex a los que no se habra unido protena) que de haber mutacin (en ese
caso la protena protegera algunos puntos en los que, sin ella, podra haber actuado la
exonucleasa obtenindose menos fragmentos). Una variacin consiste en que la
protena se inmoviliza en membranas de nitrocelulosa; esto hace que aumente
significativamente la afinidad de la protena por el ADN no acoplado, lo que permite
detectar un mayor nmero de mutaciones y evaluar fragmentos de mayor tamao.
Adems, al detectarse las notaciones mediante unin en vez de mediante separacin
de fragmentos en electroforesis en gel, esta tcnica podra automatizarse215.

Tambin se ha utilizado la transfeccin del heterodplex de ADN a E. coli in vivo. Es

una tcnica compleja que permite analizar una secuencia amplia (hasta 10 kb) de
ADN215
-PTT Test de truncamiento de protenas

El PTT (protein truncation test) slo sirve para detectar mutaciones que implican la
aparicin de un codn (secuencia de 3 nucletidos) de fin de la traduccin proteica
(stop codon). Se realiza una PCR para amplificacin de un gen que codifica para una
determiNatlla protena utilizando iniciadores a los que se ha aadido secuencias de
iniciacin para clulas eucariotas y un promotor T7. Por lo tanto, los productos de PCR
(que contienen estas secuencias) se pueden someter a reacciones de transcripcin-
traduccin con lo que se consigue pptidos. El tamao de los pptidos ser menor en
el caso de que ADN contenga una mutacin que determine la aparicin de un codn de
fin puesto que la reaccin se detendr en este punto. El tamao de los pptidos se
determina mediante electroforesis de los mismos para protenas (Western blot)215.

- ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation oNatllNchips)

El ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation on ADN chips) consiste en fijar

sondas de oligonucletidos de secuencia conocida a una base slida (chip) y exponer
esta base a las secuencias diana marcadas para detectar si se unen a los
oligonucletidos (son complementarios) o no. Hay que disear un chip especial con los
oligonucletidos especficos para la secuencia que queremos buscar y para el cribado
de cada nucletido dada una secuencia consenso requiere la exposicin a cuatro
sondas distintas. Si el nmero de posibles alelos es muy elevado, puede utilizarse dot-
blotting inverso. En este caso, el panel de sondas de oligonucletidos es inmovilizado
en el filtro y se hibrida con un producto de PCR marcado. Entre las aplicaciones de esta
tcnica inversa se encuentran las pruebas de HLA y forensa, y el diagnstico de la
beta-talasemia y de la fibrosis qustica, en las que pueden existir mltiples
mutaciones257.

ASO, sobre todo mediante dot-blotting inverso258, y el PCR-SSP (sequence-specific

priming)259 se realiza para el cribado inicial de posibles donantes y son considerados
mtodos con una relativa baja resolucin en la tipificacin de HLA. Gracias a estas
tcnicas es posible identificar un posible donante con pelos enviado por correo. Como
mtodo de alta resolucin, para seleccionar el donante ms adecuado, se utiliza PCR-
RFLP

MTODOS PARA LA DETECCIN DE MUTACIONES CONOCIDAS (DIAGNSTICO

DIRECTO DEL GEN).

La secuenciacin de ADN no es un procedimiento definitivo para la deteccin de

mutaciones, pero es muy laboriosa. Por ello, se ha desarrollado tcnicas ms
eficientes, aunque no estn an totalmente automatizadas y requieren un instrumental
costoso. Por otra parte, muchas de estas tcnicas no ofrecen informacin sobre la
localizacin o la Natluraleza de la mutacin dentro de un fragmento de ADN
determiNatllo. Este ltimo inconveniente puede ser soslayado con los mtodos en los
que los heterodplexs de ADN son cortados en la posicin de los nuecletidos no
concordantesl 11.

ASO. Hibridacin con oligonucletidos especficos de alelo

El ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation) se emplea cuando la mutacin que

produce la enfermedad no altera los lugares de corte de ninguna enzima de restriccin
conocida. Se transfiere el ADN producto de LCR (o de reaccin en cadena de ligasa),
cortado en fragmentos y sometido a electroforesis desde un gel a una membrana de
nylon donde se inmoviliza, o bien se fija el producto de PCR directamente a una
membrana (dot-blot). Despus se procede a hibridar estas membranas con
oligonucletidos complementarios a la secuencia Natliva a una temperatura
determiNatlla. De existir una mutacin en el punto que buscarnos no se producir la
hibridacin260.

Aplicacin en dermatologa

Tambin se ha utilizado esta tcnica en el diagnstico de hemogloblinopatas como la

anemia de clulas falciformes261, aunque uno de los ejemplos ms demostrativos es
la deficiencia de alfa 1 -antitripsina, que a menudo se asocia a un solo cambio G-> A
en el gen de la alfa 1 -antitripsina, produciendo el alelo Z262.

Utilizando oligonucletidos especficos de secuencia y ADN genmico amplificado para

los alelos HLA-DQA1, DQB1, y DPB1, se ha observado una frecuencia elevada de DQB1
*03 y una frecuencia disminuida de DQB1 *06 en los pacientes de alopeca areata263.

-Amplificacin especfica de alelos ASA (Allele-specific amplification)

Se realiza dos PCR paralelas: una de ellas utilizando como iniciador 5' una secuencia
complementaria a la secuencia normal y la otra utilizando como iniciador 5' una
secuencia complementaria a la secuencia mutada que queremos detectar Si existe la
mutacin se producir amplificacin slo en el tubo que contiene el iniciador de la
secuencia mutada mientras que el iniciador de la secuencia normal no se habr unido
al ADN de muestra y por lo tanto no habr amplificacin y viceversa215.

-Extensin del iniciador de un solo nucletido. (Single nucleotide primer extension)

Minisecuenciacin

Su principio es similar al del ASA. Se basa en la extensin del extremo 3'del iniciador
por un nico nucletido marcado. La adicin de este nucletido (extensin) ocurre
cuando el nucletido marcado es complementario al nucletido adyacente al extremo
3' del iniciador en el ADN muestra. As, si hay mutacin no se une el nucletido y no se
detecta el marcaje215.

-ARMS. Sistema de mutacin refractario a amplificacin

Se utiliza dos cebadores idnticos en su secuencia excepto en su nucletido 3'. Uno

tiene el nucletido 3' complementario al gen salvaje, mientras que el otro cebador 3'
es complementario al gen mutado. La amplificacin slo ocurra con emparejamientos
perfectos, con lo que dependiendo de qu cebador origine una seal positiva,
podremos distinguir el gen salvaje del gen mutado264 , ARMS es un mtodo
especialmente sensible para la deteccin de mutaciones.

-OLA (oligonucleotide ligationassay) Prueba del enlace de oligonucletidos o LCR

(ligase chain reaction) Reaccin en cadena de la ligasa

Se utiliza dos pares de iniciadores, complementarios a lugares donde puede haber

mutaciones o polimorfismos en el ADN a estudio de modo que estos iniciadores se
acoplen con el ADN de forma que queden consecutivos
(es decir que el extremo 3' del primero se contine con el extremo 5' del segundo).
Cuando no hay mutacin los iniciadores se colocan consecutivos y se pueden ligar por
la accin de una ligasa tras lo cual es posible amplificar el ADN con PCR, pero si hay
mutacin los fragmentos no se acoplan 100% al ADN muestra y no estn consecutivos,
por lo tanto la ligasa no puede unirlos con lo que tampoco es posible la amplificacin
correcta con la PCR265.

Aplicacin en dermatologa

Junto con la PCR, se ha utilizado para el estudio de mutaciones del gen p53 en la
carcinognesis por rayos ultravioleta, observndose que en la piel normal expuesta a
esta radiacin pueden identificarse mutaciones del gen p53, sobre todo en los codones
245 y 247/248266.

INESTABILIDAD DE MICROSATLITES

Utilizando distintas tcnicas no se estudia la presencia o ausencia de mutaciones

puntuales o polimorfismos gnicos sino la situacin de un genoma anmalo (por
ejemplo de un tumor) comparndola con la situacin del genoma normal. Lo que se
compara entre ambos genomas son unas secuencias relativamente conservadas, que
aparecen en 10,0090 o 100,000 locus en cada genoteca y que se encuentran
constituidas por una repeticin sistemtica de entre 1 y 6 pares de bases
aproximadamente unas 100 veces, estas secuencias se denominan microsatlites. Se
estudia al menos 5 microsatlites distintos comparando el genoma tumoral con el
normal. Si se encuentran variaciones en la migracin de las bandas en electroforesis
(es decir diferencias en el tamao) entre el genoma tumoral y el normal en al menos
dos microsatlites se considera que existe una inestabilidad gnica en el tumor Esta
situacin se ha estudiado con relativa frecuencia en carcinomas de colon y tambin se
detecta en pacientes con enfermedad granulomatosa crnica, fibrosis qustica,
neurofibromatosis, distrofia miotnica, sndrome de Charcot-Marie-Toth, sndrome de
Kaliman o sndrome del cromosoma X frgil267.

Las ventajas del anlisis de microsatlites son utilizar muy poca cantidad de ADN,
tener una resolucin alta, ser muy reproducible, existir un gran nmero de sitios bien
localizados y muy informativos, ser ms sencilla que la tcnica de Southern, y permitir
el marcaje con mtodos radioactivos o no radioactivos25. Sin embargo, tambin tiene
algunos inconvenientes, como la necesidad de realizar muchas reacciones para
distinguir entre prdidas y ganancias allicas y examinar solamente una porcin muy
pequea del genoma25.

La prdida de heterocigosidad (LOH) o prdida de uno de los alelos en una regin en

particular es habitualmente detectada por Southern blot o por anlisis de
microsatlites25. La LOH es til para identificar alteraciones en regiones cromosmicas
grandes y para delimitar las regiones de inters en cromosomas determiNatllos, sin
embargo, no es un mtodo vlido para la identificacin de nuevos genes supresores25.

Aplicacin en dermatologa

Aunque se ha detectado la presencia de trisoma 7 en algunos estudios de

queratoacantoma y carcinoma epidermoide de piel76, en el queratoacantoma
espordico slo se identifica inestabilidad microsatlite en el locus 17p 12 (D17S520,
p53) en un 10% de los tumores estudiados y no se identifica prdida de
heterocigosidad, por lo que los eventos genticos parecen jugar un papel secundario
en la gnesis del tumor119,268,269,270.

En el sndrome Muir-Torre el anlisis de microsatlites de queratoacantoma, adenomas

sebceos, epiteliomas basocelulares y adenocarcinoma metastsico en la piel en estos
enfermos, muestran una marcada inestabilidad microsatlite271 . Estos pacientes
podran compartir mecanismos genticos de gnesis tumoral con los pacientes con
carcinoma colorrectal hereditario no asociado a poliposis273.

La prdida de heterocigosidad en el cromosoma 9q22,3 y las alteraciones en genes

supresores ubicados en esa regin parece ser un evento tardo en desarrollo del
carcinoma epidermoide de piel y no se identifica en la piel normal expuesta que
presenta mutaciones del gen p53, ni en las displasias, mientras que aparece en el 65%
de los carcinomas in situ y carcinomas epidermoides de piel273.

El anlisis de microsatlites y la prdida de heterocigosidad en ms de un brazo

cromosmico no sucede en el liquen plano oral, ni en las lesiones reactivas de la boca,
y s son frecuentes y gradualmente crecientes en las displasias epiteliales y en el
carcinomas epidermoide274 .

La prdida de heterocigosidad en los cromosomas 6q y 10q en el melanoma cutneo se

asocia a un peor pronstico clnico275.

La porfiria cutnea tarda espordica es una enfermedad cutnea que se asocia a

siderosis heptica. Los alelos microsatlites que definen el haplotipo hemocromatosis
ancestral (HLA-A3) se estudia en estos pacientes231.

La ictiosis congnita autosmica recesiva es un trastorno de la queratinizacin

clnicamente heterogneo. En los subtipos ictiosis lamelar y eritrodermia ictiosiforme
congnita no ampollosa se describe mutaciones en el gen de la transglutaminasa 1.
Los marcadores de microsatlite relacioNatllos con este gen permiten el estudio de
familias con estas enfermedades276.

La psoriasis es una dermatitis crnica inflamatoria que afecta a un 2% de la poblacin.

Mediante linkage analysis, se ha mapeado varios genes de susceptibilidad posibles,
sobre todo en las regiones cromosmicas 17q y 6p, pero tambin en 2p, 4q, 8q, l6qy
20p. Los estudios mediante microsatlites no han podido demostrar un vnculo
significativo con esos marcadores y s con marcadores para el cromosoma 1 cen-q21
(la molcula CD1d es codificada en esta regin)277. Mediante marcadores
microsatlites polimrficos se ha localizado el gen de psoriasis vulgar en un segmento
de 111 kb telomrico al gen HLA-C278. La mayora de las investigaciones se centran la
regin MHC clase 1, en el cromosoma 6, sobre todo en el alelo HLQ-Cw6279.

ACTIVIDAD DE TELOMERASA

La capacidad de crecimiento ilimitado de las clulas neoplsicas requiere la actividad

de la ribonucleoprotena telomerasa280,281,282. Sin esta enzima, los extremos de los
cromosomas(telmeros) se van acortando en cada divisin mittica. Cuando los
telmeros estn agotados, la clula deja de proliferar y comienza su senescencia. Las
clulas malignas contienen actividad de telomerasa para estabilizar sus telmeros50.

El oncogn c-myc induce telomerasa tanto clulas epiteliales283. La expresin de

telomerasa puede ser detectada por varios mtodos:

Protocolo de amplificacin de repeticin telomrica (TRAP)

Se emplea para determinar la actividad de telomerasa282. El resultado puede

expresarse en unidades relativas respecto al control positivo (100 unidades) y el
negativo (0 unidades).

RT-PCR (reaccin en cadena de polimerasa-transcripcin inversa)

Se utiliza para detectar el molde del ARN de telomerasa (hTR) en extractos de tejidos

Hibridacin in stu

Se aplica para localizar en hTR en cada clula, lo cual es necesario en tumores como la
enfermedad de Hodgkin en la que las clulas de Reed-Sternberg apenas constituyen un
1 % de la masa celular total50.

Se ha comprobado, sin embargo, que las clulas linfoides normales pueden expresar
telomerasa, por lo que los extractos de tejidos no son tiles para la determinacin de
la presencia de esta molcula en procesos linfoproliferativos50.
La actividad de telomerasa se detecta en 30% de lceras cutneas crnicas por
radiacin y puede ser un marcador para predecir el pronstico y el efecto del
tratamiento de estas lceras284.
La Tabla 8 refleja un resumen de las aplicaciones prcticas de algunas de las tcnicas
aqu estudiadas.

TABLA9. Estrategias de diagnsico molecular1

Estrategia Tcnicas(*) Ejemplos
Enfermedades infecciosas (diagnstico
epidemiologa)
- presencia o ausencia SB,NB,HIS,PCR
Determinacin de identidad: Transplantes de
tejidos.
Mutacin puntual de un Enfermedad hereditaria: geroderma pigmentoso,
RED,SB,PCR,ASO,SSCP,SEQ
gen queratodermia almoplantar.
anomala de una egin
de un gen (diferente a Enfermedad hereditaria: Enfermedad von
una mutacin puntual, SB,PCR,FISH Willebrand tipo II, sndrome de repeticin de
como inserciones o triconucletidos
deleciones)
Monosoma o trisoma FISH Congnito: sndrome de Down
Reordenamiento de un Tumores malignos linfoides; diagnsico,
SB, PCR
gen enfermedad mnima residual
Traslocacin de un gen SB, PCR, FISH Tumores malignos
NB, PCR
Creacin de un nuevo
leucemia aguda promieloctica, Tumores malignos: Leucemia mieloide crnica
gen
leucemia linfoctica aguda pre-B
* ASO, Hibridacin de oligonucletidos especfica de alelo; FISH, Hibridacin in situ-fluorescencia; HIS,
Hibridacin in situ; PCR, Reaccin en cadena de la polimerasa; NB Nothern blot; RED, Digestion con
endonucleasas de restriccin; SB, Southern blot; SEQ, Secuencia; SSCP, Polimorfismo estructural de cadena
simple

CONCLUSIONES

La existencia de tcnicas moleculares ms sencillas y el mejor conocimiento de los

mecanismos genticos de las enfermedades, a lo que sin duda ha contribuido la libre
disponibilidad de bases de datos de bibliografa mdica y de mutaciones, como
OMIM285 o Human Genome Organization (HOGO) Mutation Database Initiative286 han
permitido popularizar el empleo de estos nuevos mtodos en el diagnostico
dermatolgico.

En un futuro prximo, estarn disponibles de forma rutinaria nuevas tcnicas

aplicables a dermatologa que permitirn un mejor anlisis de los productos de KR,
como la cromatografa lquida de alto rendimiento, la electroforesis capilar o la PCR, la
electroforesis capilar o la KR sobre chips de oligonucletidos22. Los chips de
oligonucletidos para PCR son dispositivos fabricados mediante litografa fotogrfica
sobre chips de silicona, que contienen miles de oligonucletidos diferentes unidos a la
fase slida. Las mezclas de complejos de cidos nucleicos pueden ser analizados
mediante hibridacin del chip, y los pocillos positivos indican la presencia de una
secuencia complementaria en la mezcla287.

Tambin se extender el uso de nuevas tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos

que competirn con PCR, como la amplificacin de cidos nucleicos basada en
secuenciacin (NASBA) o la replicacin automantenida de secuencia (3SR). En ambos
casos la tecnologa se basa en la amplificacin isotrmica de un ARN diana gracias a la
actividad simultnea de transcriptasa inversa, ARN polimerasa y ARNsaH, que permite
obtener ARN de cadena simple amplificado. Estas tcnicas ya se han ensayado en la
deteccin de HPV VIH-1 y citomegalovirus288.

En aquellas lesiones en la que sea importante valorar la morfologa, las tcnicas de

hibridacin in situ yPCR in situ sern el complemento lgico de la inmunohistoqumica.
La hibridacin in situ, con los nuevos mtodos de amplificacin de seal y microscopia
confocal, se convertir en una herramienta de rutina para la deteccin de
determiNatllos cidos nucleicos en los tejidos.

La citogentica seguirn siendo un complemento ms de la morfologa y de la biologa

molecular, no slo a travs de la hibridacin in situ sino con la realizacin de estudios
con sondas que marcan las diversas regiones del cromosoma con diferentes colores
(Figura 3).

En todo caso, ser necesaria una estandarizacin en las tcnicas de biologa molecular
y en su interpretacin, para poder utilizar ampliamente estas herramientas con
resultados vlidos. Estos pasos sern facilitados principalmente FIGURA3

Figura 3. Estudio de bandas de

colores en el cromosomas 5.
 Cedido por el Dr. JM Hernndez.
Universidad de Salamanca, Espaa

por la evolucin tecnolgica (Figura 4), la automatizacin en todos los pasos289 y la

informatizacin de los datos obtenidos, incluyendo programas de control de calidad. Un
ejemplo de esta evolucin lo tenemos en el analizador avanzado de cidos nucleicos
(AAAN), que consiste en un dispositivo con diez mdulos de reaccin y una
computadora porttil. En la pantalla van apareciendo las reacciones efectuadas en
cada cmara, indicando nmero de ciclos, tiempo y estado de la deteccin289.
FIGURA 4

Figura 4. Analizador avanzado de cido

nucleido