I.

RECUPERACION DE PRODUCTOS FINALES

El trmino recuperacin (downstream processing) es un trmino colectivo, til

para todas las etapas que se requieren a fin de recuperar los productos tiles de
cualquier tipo de proceso industrial. Cuando se discute la recuperacin del
producto se debe distinguir entre los conceptos de purificacin y concentracin.
Una etapa de recuperacin cambia la pureza y/o la concentracin de un
metabolito. En el proceso ideal de recuperacin se optimizan ambos parmetros.
En los primeros tiempos de la Microbiologa Industrial las tcnicas utilizadas en
la recuperacin de productos (extraccin, destilacin, dilisis, cristalizacin,
precipitacin, desecacin) se tomaron ms o menos directamente de la ingeniera
qumica sin ms que un intento aproximado para adaptarlas a los materiales
biolgicos. Sin embargo, gradualmente se comprendi que haba que
perfeccionar procesos especficos de purificacin para materiales biolgicos ya
que los bioproductos son frecuentemente compuestos muy lbiles cuyas
estructuras activas pueden sobrevivir solamente bajo condiciones definidas y
limitadas de pH, temperatura, fuerza inica, etc. Tambin result claro que no
existe una operacin nica, ideal o universal, ni siquiera secuencias de
operaciones que puedan ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias
deben ser combinadas de la forma ms adecuada para cada problema particular.
En muchos casos la primera etapa, al final de una fermentacin, es la separacin
de los slidos del lquido que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo
puede ser el producto final deseado, sin embargo, en la mayor parte de los
procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que est presente
intra o extracelularmente. Ejemplos de metabolitos intracelulares incluyen a los
cidos nucleicos, las vitaminas, enzimas y ciertos antibiticos como la
griseofulvina. Ejemplos de metabolitos extracelulares incluyen a los
aminocidos, el cido ctrico, alcohol, algunos enzimas (amilasas y proteasas) y
la mayor parte de los antibiticos (penicilina, estreptomicina). En unos pocos
casos se encuentran metabolitos tanto en las clulas como en el filtrado del
cultivo (vitamina B12).
Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, ste debe ser liberado de las
clulas antes de proceder a las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido
separado de las clulas, la seleccin de etapas adicionales de purificacin
depender del producto deseado. La transparencia resume varios procesos de

purificacin, ordenados de acuerdo con los principios de separacin para

partculas de varios tamaos, peso, carga, etc. Las ltimas etapas en la
recuperacin implican precipitacin, cristalizacin y/o desecacin.

A. Separacin de las partculas

La primera etapa en la recuperacin del producto es, por consiguiente, la

separacin de la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante
de cultivo. Para este propsito existen varios mtodos, que incluyen la
floculacin, flotacin, filtracin y centrifugacin.
1.- Floculacin y flotacin
Las clulas aisladas en el rango de tamao de 1 a 10 m sedimentan solo muy
lentamente y son difciles de precipitar incluso con la centrfuga. En estos casos
se recurre a la floculacin para producir grandes agregados que sedimentan
mucho ms rpidamente ya que la velocidad de sedimentacin de una partcula
aumenta con su dimetro (ley de Stokes).
En la mayor parte de los casos se aade un agente floculante como una sal
inorgnica, polielectrolitos orgnicos o hidrocoloides minerales. La floculacin
depende tanto del agente floculante empleado como de otros factores como la
naturaleza de las clulas, de los constituyentes inicos as como su
concentracin. La floculacin puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la
superficie de la clula pueden neutralizarse por iones de carga opuesta, e
irreversiblemente si se forman, entre las clulas, puentes de molculas
polimricas cargadas.
Si no se forma un flculo suficientemente denso, puede utilizarse la flotacin que
es el proceso reverso a la floculacin. La flotacin se consigue introduciendo gas
en el lquido. Las pequeas burbujas de gas adsorben y atrapan a las clulas y
suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser
recogidas y sacadas del biorreactor.
2.- Filtracin

Lo ms frecuente es que la primera etapa en el proceso de recuperacin se lleve a

cabo por algn tipo de proceso de filtracin. Los dos principales tipos de filtros
son los denominados filtros en profundidad y filtros en superficie; en ambos
casos la fuerza motriz es la presin, sea creada por sobrepresin o por vaco.
Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa, como
lana de vidrio o papel de filtro, llevndose a cabo el proceso de filtracin debido
a que las partculas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la
matriz. Las partculas que van a ser filtradas son frecuentemente ms pequeas
que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a
travs de los intersticios retorcidos del filtro. Los filtros en superficie son
membranas en las que el tamao de los poros es ms pequeo que las partculas
que van a ser filtradas. Las partculas son, por consiguiente, separadas sobre las
superficies de los filtros.
Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a travs de filtros profundos.
Por su parte, los cultivos bacterianos deben ser filtrados en superficie. En
cualquier caso, la velocidad de filtracin, es decir el volumen de filtrado que
puede ser recogido en un tiempo determinado, est influenciada por numerosos
factores, como el tamao de los microorganismos, su morfologa, la viscosidad
del fluido, temperatura, etc.
Uno de los inconvenientes de la filtracin en superficie es la colmatacin. Debido
a que este proceso de filtracin depende estrictamente del tamao de los poros y
del tamao de las partculas, a medida que el material celular se amontona sobre
el filtro se forma una capa que reduce la velocidad de filtracin.
Una mejora considerable en el flujo que pasa por el filtro se consigue
por filtracin en contracorriente, en la cual los slidos que no pasen a travs del
filtro son mantenidos en suspensin mediante un flujo turbulento a travs de la
membrana o ajustando palas mviles o mediante un impulsor en el interior del
filtro. El filtrado pasa a travs de la membrana y la biomasa se separa del filtro y
se transfiere con el material que se retiene. Con el mtodo de contracorriente
puede obtenerse un aumento de la velocidad de filtracin de 100 veces en
comparacin con la filtracin esttica.
Dependiendo del tamao de las partculas que sean filtradas se reconocen tres
tipos principales de procesos de filtracin:
Osmosis reversa, para partculas de 0,0001 a 0,001 m
Ultrafiltracin, para partculas de 0,001 a 0,1 m

Microfiltracin, para partculas de 0,1 a 10 m

Las posibilidades de los procesos de ultrafiltracin y smosis reversa se dan
generalmente en trminos del peso molecular del tamao de corte. La smosis
reversa implica generalmente a sustancias de pesos moleculares menores de
1.000 daltons y la ultrafiltracin a sustancias de pesos moleculares mayores de
1.000 daltons. El proceso de microfiltracin concierne principalmente a la
separacin de clulas o de fracciones celulares. Se utilizan membranas fabricadas
con steres de celulosa, polivinilfluoruros, policarbonatos, polisulfonas y
celulosa.
En los procesos clsicos de purificacin utilizados en la industria de antibiticos
(micelios de hongos y actinomicetos), la biomasa se separa del filtrado del
cultivo sobre un filtro de tambor rotatorio a vacoque consiste en un tambor
rotatorio en cuya parte exterior se enrolla un pao y el vaco se produce desde el
interior del tambor. Para aumentar la eficiencia del proceso de filtracin, se
utiliza una ayuda filtrante como tierra de diatomeas. Para mantener la eficiencia
de filtracin, se utiliza una cuchilla automtica para raspar continuamente del
filtro la biomasa junto con una fina capa del material de ayuda de filtracin.
Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser lavada a
medida que gira el tambor. Los filtros de tambor a vaco son especialmente
buenos para suspensiones que contengan una alta concentracin de slidos (2060% de volumen de micelio).
3.- Centrifugacin
Las bacterias son normalmente demasiado pequeas como para ser separadas con
filtros sencillos. Su separacin por centrifugacin tambin es difcil debido a las
pequeas diferencias en densidad entre las partculas y la suspensin.
La centrifugacin no slo se utiliza para separar partculas slidas de la fase
lquida sino tambin para la separacin de fluido/fluido. Si bien la
separacin fluido/partcula es de la mayor importancia, la
separacin fluido/fluido tambin es importante como es el caso en la produccin
de penicilina para la separacin del solvente que extrae el antibitico de la fase
acuosa mediante una contracorriente continua en dos etapas con acetato de amilo
o de butilo a 0-3C y pH: 2,5-3,0.
La separacin eficiente de las clulas por centrifugacin se ve favorecida por un
tamao grande de las partculas, una gran diferencia entre la densidad de las
partculas y el lquido, una baja viscosidad del lquido, un radio elevado del rotor

de la centrfuga y una alta velocidad angular. Tanto el tamao de las partculas, su

densidad as como la viscosidad del lquido normalmente no se pueden controlar.
Adems, el radio del rotor de la centrfuga no puede incrementarse
indefinidamente ya que el estrs mecnico incrementa con el cuadrado del radio
por lo que los lmites de seguridad se alcanzan fcilmente. Por todo esto y
cuando se trabaja con grandes volmenes se debe recurrir a centrfugas de flujo
continuo. En este tipo de centrfugas la separacin de partculas es ms eficiente
cuanto ms lento sea el flujo de la suspensin a clarificar ya que se incrementa el
tiempo que cada partcula est expuesta a la fuerza centrfuga.
En la transparencia se muestran esquemticamente algunos tipos de rotores:
cmara tubular, recipiente de cmara mltiple y centrfuga de rotor de discos.
Todos los diseos tienen desventajas individuales a las que deben ser aadidas las
generales del coste (incluyendo el mantenimiento), consumo de energa y
(exceptuando las que incorporan refrigeracin) elevacin de la temperatura.

B. Desintegracin de los microorganismos

En algunos casos la recuperacin de los productos requiere que los
microorganismos sean fragmentados por procedimientos qumicos, fsicos o
biolgicos. Un resumen de los mtodos utilizados en la desintegracin de los
microorganismos se encuentra en esta transparencia. La seleccin de un mtodo
depende principalmente de la naturaleza de las clulas. Aunque las membranas
celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredes celulares varan
ampliamente en lo rpidamente que pueden ser rotas. Las bacterias Gram + y los
hongos son mucho ms difciles de romper que las bacterias G- debido a la
composicin de la pared celular. Incluso dentro de un mismo microorganismo las
clulas varan significativamente en sensibilidad a la ruptura dependiendo de su
estado fisiolgico. Al mismo tiempo, la desintegracin debe ser llevada a cabo
sin destruir el producto que nos interesa. Por ejemplo, pueden utilizarse cidos
para romper muchos microorganismos pero no pueden ser utilizados si el
producto de inters es lbil a los cidos.
1.- Mtodos qumicos
Los mtodos qumicos utilizados para desintegrar clulas microbianas incluyen
tratamiento con lcalis o cidos, solventes orgnicos y detergentes.

La lisis bacteriana mediante el uso de lcalis puede llevarse a cabo a gran escala
y con bajo coste siempre y cuando el producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por
ejemplo, la hormona de crecimiento humano recombinante se libera fcilmente
de Escherichia coli por tratamiento con hidrxido sdico a pH: 11. El tratamiento
con solventes orgnicos es un tratamiento sencillo y barato que se utiliza en el
aislamiento de enzimas en levaduras. No obstante, se corre el riesgo de que el
tratamiento desnaturalice las protenas por lo que se debe chequear con
antelacin. Los detergentes permeabilizan las clulas bacterianas al solubilizar
las membranas celulares. Como consecuencia de esta actividad se originan
agujeros por los que salen al exterior las protenas y otras molculas.
desgraciadamente los detergentes son caros, desnaturalizan la mayora de las
protenas y a menudo aparecen como contaminantes en el proceso subsecuente de
purificacin. Para la extraccin de clulas de levadura se utiliza
la plasmlisis que se consigue mediante la adicin de una concentracin alta de
cloruro sdico.
2.- Mtodos biolgicos
Se utiliza la lisis enzimtica. Por ejemplo, la pared celular de las bacterias Gram
+ se hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared
celular de las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA. La pared
celular de las levaduras se hidroliza con una combinacin de uno o ms de los
enzimas (1,3)-glucanasa, (1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa. Los
tratamientos enzimticos son muy especficos y las condiciones para la lisis son
suaves. En la actualidad, los costes limitan el uso de los enzimas como agentes
lticos celulares en la industria. Una variante que se utiliza en levaduras es
la autolisis en la cual los enzimas autolticos endgenos de las levaduras llevan a
cabo la destruccin de su propia pared celular. La adicin de cloruro sdico,
acetato de etilo o cloroformo y la incubacin durante 24h a 45C aumenta la
velocidad del proceso autoltico.
3.- Mtodos fsicos
La desintegracin por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero
debido a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial. Otro
mtodo fsico incluye repetidos ciclos de congelacin y descongelacin pero en
este caso muchas de las clulas permanecen intactas. Industrialmente los mtodos
fsicos ms empleados de desintegracin celular suponen la accin mecnica.
Losmolinos de bolas llevan a cabo la ruptura de las clulas mediante la accin de
bolas de vidrio. Las clulas y las bolas de vidrio se mezclan juntas y se someten a

una alta velocidad de mezclado en una vasija de reaccin. La ruptura se produce

cuando una bola de vidrio fuerza una clula contra las paredes de la vasija. Con
este mtodo se consigue una velocidad mxima de ruptura de aproximadamente
el 80% de las clulas. Otro enfoque es el uso de homogeneizadores. En tales
artilugios el material biolgico se coloca bajo una fuerte presin hidrosttica
(alrededor de 500 atmsferas) y la presin se libera bruscamente permitiendo que
el lquido salga por una vlvula, lo que ocasiona la lisis celular.

C. Mtodos de aislamiento
Una vez que se han lisado las clulas, los restos celulares se retiran bien por
centrifugacin de gran capacidad a baja velocidad o por filtracin en membrana.
Al final obtenemos un lquido libre de clulas que es el que sufre los tratamientos
posteriores para aislar y en su caso purificar el producto de inters.
1.- Cromatografa
Algunas de las etapas ms caras en la recuperacin del producto implican el uso
de mtodos cromatogrficos. Tales mtodos son de especial valor para la
purificacin de materiales biolgicos sensibles y encuentran un amplio uso en la
preparacin de materiales farmacuticos, reactivos de diagnstico y reactivos
para investigacin. Los distintos mtodos cromatogrficos que existen segn su
mecanismo de separacin son: filtracin en gel (peso molecular), cromatografa
de adsorcin (interacciones hidrofbicas), cromatografa de intercambio
inico (carga), cromatografa de afinidad (actividad biolgica)
yelectroenfoque (punto isoelctrico).
2.- Extraccin
La extraccin, cuando se aplica a los bioproductos, tiene tanto la funcin
de separacin como la de concentracin. El caldo acuoso de fermentacin que
contiene el producto deseado se mezcla con un solvente inmiscible en el que se
disuelva preferentemente y del que pueda ser ms fcil y especficamente
recuperado. Una vez se ha concentrado el producto deseado en la fase solvente
puede ser adicionalmente purificado. La extraccin con solventes ha sido
utilizada ampliamente en la industria de antibiticos, como la penicilina,
utilizando solventes como el acetato de amilo o de butilo. Para la separacin de

enzimas en estado activo no pueden ser utilizados los solventes orgnicos pero s
pueden ser utilizados sistemas acuosos en fase mltiple preparados en una
solucin de sales con polmeros hidroflicos (polietilenglicol-dextrano). En
ambas fases el agua es el componente principal, pero ambas fases no son
miscibles por lo que los enzimas pueden separarse fcilmente sin prdida de
actividad.
3.- Cristalizacin y precipitacin
La cristalizacin a baja temperatura es una forma muy suave de purificacin. La
cristalizacin se utiliza principalmente para la purificacin de compuestos de
bajo peso molecular, como los antibiticos. Por ejemplo, la Penicilina G es
generalmente extrada del caldo de fermentacin con acetato de butilo y
cristalizada por adicin de acetato potsico en solucin etanlica.
4.- Desecacin
El secado del material biolgico es en muchos casos el mtodo final por el que
los productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejo y
almacenamiento. La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos
biolgicos significa que los nicos mtodos que pueden ser utilizados son los que
conducen a la eliminacin de agua con elevacin mnima de la temperatura. En
algunos casos, la termoestabilidad de los productos, como enzimas o
preparaciones farmacuticas, es mejorada por la adicin de azcares u otros
estabilizantes inertes. La liofilizacin es el mtodo de desecacin ms suave
debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos
productos farmacuticos son liofilizados como vacunas, fracciones de plasma,
hormonas y preparaciones de enzimas, as como ingredientes muy lbiles y caros
para diagnosis. Tambin se utiliza la liofilizacin cuando el producto final es un
cultivo microbiano vivo (cultivos para inoculacin en las industrias lcteas).

D. Rendimiento
Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las sustancias al
proceso y del nmero de etapas de purificacin. El promedio de prdidas
atribuidas a la purificacin est en torno al 20% pero en casos extremos, con
ciertos tipos de metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%. En la

transparencia se muestran los datos para la purificacin de cido glutmico donde

se observa la extensin en la que deben ser combinados y optimizados los
mtodos de recuperacin. El rendimiento final es slamente un factor, ya que el
coste de los productos qumicos, el equipo y los salarios deben ser considerados
en el clculo global.