CAPITULO 15.

ESTRUCTURA DEL RNA

15.1 15.2 15.3 15.4 15.5 Estructura primaria Estructura secundaria Duplexes hbridos ADN-ARN ARN de transferencia (estructura secundaria y terciaria) Interacciones aparareamiento codn-anticodn

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15.1 ESTRUCTURA PRIMARIA DEL ARN

El RNA es una cadena nucleotdica formada por enlaces fosfodiester 5->3. Esto es, algo identico a lo que se tena en el ARN. La diferencia fundamental, a parte de la existencia de uridina en lugar de timidina, es la existencia de ribosa, en lugar de 2deoxyribosa. La existencia de un grupo OH en 2 abre una posibilidad nueva. Esto es, porque no es el enlace fosfodiester 5->2, en lugar de 5->3?. La primera respuesta que se nos puede ocurrir es que el enlace fosfodiester es ms estable en 3 que no en 2. Esto es falso, se ha visto experimental, y tericamente que la unin 5->2 es incluso ms estable que la 5->3 y que puede formar hlices como las uniones 5->3. Por que entonces es el enlace 5->3 el que existe in vivo?. La verdad no se sabe muy bien, pero se especula que pueda ser un efecto evolutivo ligado al hecho de que las uniones 5->2 tienen una tendencia superior a formar hlices de orden superior (p.ej triples hlices) que las que tienen los enlaces 5->3 standard. Sealar que recientemente se han encontrado polmeros de RNA con unin 5>2. Un ejemplo es el 5->2 polyA RNA (3 a 8 A) que se da catalizado por la protena interfern. El interfern sabis que es una molcula proteica que se da como respuesta a la infeccin vrica, y que es responsable de la defensa antiviral del organismo. La sntesis del fragmento poliA (5->2) induce una interfern-induced ribonuclease que es la que rompe y degrada el RNAm vrico. Es decir, que el enlace 5->2 no es el ms abundante, pero es tericamente posible, y biolgicamente relevante. La similitud estructural a nivel de estructura primaria del RNA y el RNA es muy elevada, y los cambios de propiedades debido al cambio ribosa->deoxyribosa y T->U son pequeos. De hecho las diferencias de secuencia ms relevantes entre RNA y DNA es que la presencia de bases anmalas (no codificantes) en el ARN es mucho ms abundante que no en el DNA, especialmente en lo que hace referencia al RNA(t).

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15.2

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ARN

La presencia del grupo 2-OH introduce pequeas modificaciones en la preferencia conformacional del azcar, pero suficiente para que prevalezca la conformacin C3-endo (zona Norte), como ya se discuti en el captulo anterior. De hecho, el puckering de la ribosa en el RNA es ms rgido que el correspondiente de la 2deoxy-ribosa en el RNA y prcticamente el 100% de la poblacin est en regiones Norte, sin poblacin apreciable de regiones E y menos an W. Los enlaces glycosidicos estn en conformacin anti. La conformacin global del RNA se adapta muy bien a lo que conocemos como conformacin A. De hecho, la estructura del A-RNA es muy parecida a la del A-DNA, con forma de doble hlice y apareamientos del tipo Watson-Crick. Disposicin general de la hlice, surcos,..., son idnticos a los que se tenan en el A-DNA. En condiciones de alta fuerza inica la forma A cambia a una formar denominada A, esta es un hlice an ms compacta que la hlice A, ya que tiene 12 pares de bases por vuelta de hlice. El RNA aparece in vivo como una cadena sencilla, por lo que para adoptar estructuras de doble cadena debe replegarse sobre el mismo y seleccionar el trozo complementario que le de mxima estabilidad. Es por ello que en la estructura del RNA encontramos hairpins, regiones hairpins alternados, bulges, internal loops y todo tipo de estructuras anmalas comentadas ms adelante. De hecho, predecir la estructura secundaria del RNA es difcil, porque para un fragmento largo como es el RNA(m) hay muchos posible marcos de formacin de duplexes y no es trivial determinar cual es el que ha usado el RNA(m). El RNA tiene adems tendencia a formar estructuras 3-D muy fijas, lo que le permite tener una serie de funcionalidades propias de protenas (p.ej el RNA ribosomal, RNA de transferencia o los ribozimas). En este tipo de estructuras complejas juegan un papel clave los pseudoknots que son los que en muchos caos nos delimitan los giros y empaquetamientos de las estructuras (vase captulo anterior).

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Figura 1. Estructura tipo A caracterstica de un RNA.

Tambin sealar que se ha detectado la presencia de RNA en triples hlices, se han descrito sobre todo en motivos pirimidina y parecen tener una estructura similar a las de DNA, aunque an no hay ninguna descripcin a alta resolucin de las mismas. Una caracterstica interesante que diferencia a nivel de estructura secundaria a DNA y RNA es su flexibilidad. El DNA en la forma B es mucho ms flexible que el RNA o el DNA en la forma B. Por ejemplo, lo que tenis en la Figura 1 es un histograma de las poblaciones de diversas conformaciones de propeller twist en estructuras de A-DNA (izq), B-DNA (centro) y RNA. Los pefiles se han ajustado a Gaussianas normalizadas y podis ver como es mucho ms ancho el perfil para el BDNA que para el A-DNA o el RNA.

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Figura 1. Representacin en histograma de la poblacin de propeller twist en estructuras de A-DNA, B-DNA y RNA resueltas por rayos X y depositadas en PDB. Lo mismo se ve cuando se realizan dinmicas moleculares de DNA y en RNA. Esto lo podis ver por ejemplo en las Figura 2 y 3 donde se han representado las poblaciones de inclination y twist que eran visitadas por B-DNA y RNA en una dinmica de 10 ns de d(GCGCAATTGCGC)2 y r(GCGCAAUUGCGC)2.

Figura 2. Perfil de inclination visitado durante MD para RNA (grfica de la izquierda) y DNA (derecha).

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Figura 3. Perfil de twist visitado durante MD para RNA (grfica de la izquierda) y DNA (derecha).

15.3

DUPLEX DNA-RNA

El DNA y el RNA pueden formar duplexes (una hlice DNA, otra de RNA). Estas estructuras tienen una enorme importancia en la vida de la clula. i) Se forman cuando la transcriptasa reversa forma DNA a partir de RNA. ii) Cuando la RNA polimerasa forma RNAm a partir de DNA. iii) Se forman durante la replicacin de los primers en los fragmentos de Okazaki. La estructura del hbrido DNA-RNA es la de una doble hlice con las caractersticas generales de un A-RNA, o del A-RNA. Tpicamente se detectan 11-12 pares de bases por vuelta de hlice. Parece que no todos los azucares se encuentran en conformacin N, sino que al menos una parte de las deoxyribosas de la cadena de DNA se encuentran en conformacin S o E. Los complejos DNA-RNA son muy estables, de hecho ms estables incluso que los DNA-RNA Esta gran estabilidad tambin se intenta

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aprovechar con fines terapeticos en estrategas de RNA-antisense (Figura 3). La idea es similar a la comentada ms arriba para los antigene, pero ahora atacando directamente el RNAm. De hecho, la estrategia antisense saca ventaja de la existencia de un enzima la H-RNAase que degrada los hbridos DNARNA, rompiendo la cadena de RNA, pero no la de DNA. Este enzima protege a la clula de la formacin de complejos no productivos de RNA y resulta muy til en terapia antisense porque degradara el RNAm diana manteniendo el DNA forneo que hemos aadido, lo que producira que este DNA actuara como catalizador de la degradacin.

Figura 4. Esquema de la terapia antigene y antisense. La pega de todas estas estrategias antisense son varias, y muchas de ellas comunes con las estrategias anti-sense. Primero, no es fcil que el fragmento de DNA pase la membrana; segundo: el DNA se degrada con facilidad dentro de la clula; tercero no es siempre fcil seleccionar el trozo de RNA(m) diana del hbrido; por ltimo no es simple hacer estable en sangre el RNA. Existe en la actualidad un enorme esfuerzo tendente a generar RNA resistentes, y con mejor biodisponibilidad para ello se modifican los extremos 5 y 3 (punto de ataque de muchas nucleasas), y tambin se

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intenta crear RNA donde los fosfatos se sustituyen por otros grupos. Paralelamente se est trabajando mucho en el desarrollo de mtodos tericos de prediccin de estructura secundaria del RNA que nos permitan determinar la mejor regin para formacin del hbrido. En los ltimos 2 aos ha surgido una nueva estrategia antisense que parece tremedamente prometedora y con la que se consiguen bloquear todalmente la expresin de genes (knock-out). Se denomina RNA de interferencia y se basa en inyectar en la clula pequeos trozos de RNA de cadena doble complementaria una de ellas a un fragmento del RNA que se quiere inhibir. El mecanismo de funcionamiento del RNA(i) se desconoce cuando he redactado esto (2003), pero est claro que involucra un nmero elevado de enzimas.

15.4

RNA DE TRANSFERENCIA

Es uno de los RNA in vivo de los que se conoce su estructura secundaria y terciaria. Existen numerosos tRNA lgico si pensamos en los aminocidos diferentes que estos tienen que transportar. No obstante, todos ellos tienen una estructura general comn que es lo que explica que puedan integrarse en un proceso comn: la sntesis de protenas. Estructura Secundaria

En la actualidad se habla de familias de tRNA todas ellas son en general similares, con pequeas diferencias en algunas zonas. La forma general se ha asimilado a una hoja de trbol. En l distinguimos: El aceptor stem (tallo). Tiene 7 pares de bases y termina en el sitio de unin del aminocido que es SIEMPRE el triplete 5-CCA-3 donde el extremo 3 (A) esta con el 3OH sin fosforilar. Ese ser el punto de unin del aminocido.

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El T-stem de 5 pares de bases que termina en el T-loop un lazo donde no se forma la doble hlice. El extra loop o variable loop que es un fragmento muy variable de un RNA(t) a otro, varia en longitud (de 3 a 21 nucletidos) y composicin. El D-stem tiene entre 3 y 5 pares de bases y termina en el D-loop que tiene una longitud variable de 7 a 11 nucletidos. Finalmente el anticodon stem tiene 5 pares de bases y acaba siempre en el anticodon loop donde estn las 3 bases del codn que reconocen al triplete (codn) de bases del RNA(m).

Figura 5. Estructura del RNA(t) -9 -

Algunas caractersticas son comunes a los diferentes tRNA como es la estructura secundaria comn o la presencia de bases no codificantes como pseudouridina o dihydrouridina. Tambin el tamao es relativamente constante (entre 74 y 95), lo que contrasta con el resto de los cidos nucleicos. Son comunes en los diferentes tRNA la lngitud del tallo aceptor y anticodn, y gran parte de la secuencia del loop T (tambin llamando pseudoruidine loop). Otros detalles tales como el tamao del D stem (dihydrouridine stem), el tamao del loop estra, y la composicin concreta del dehydrouridine loop varan de una familia a otra. La diferencia de tamao entre diferentes RNAs se debe a los nucletidos extras en el D-loop y stem, as como en el extra loop. Todos los tRNA tienen una serie de nucletidos comunes. As, todos tienen en el extremo 3 la secuencia ----CCA sin fosfato en el extremo (3). El hidroxilo no esterificado del extremo 3 ser el que se une a un aminocido. Destacar, que aparte de estos existen otros nucletidos constantes, sobre todo los vitales para mantener la estructura terciaria del RNA que como se puede observar ya en la Figura 5 es muy definida. Por ltimo comentar que el RNA(t), al igual que los RNA(m) se procesa eliminndose fragmentos de cadena (splicing) y producindose otras modificaciones. Por ejemplo, el extremo CCA solo se inserta despus del procesado del RMA(t), antes era UU. Es decir que los RNA(t) tal como hemos descritos son RNA(t) maduros, justo los que hacen su funcin biolgica.

Estructura terciaria del tRNA El tRNA se repliega en el espacio dando una estructura terciaria en forma de L, que es estabilizada por interacciones de stacking entre las bases, interacciones de van der Waals, y puentes de hidrgeno, bsicamente del tipo Hoogsteen. Nota: estos puentes de hidrgeno son entre zonas alejadas de la cadena, no confundirlos con los A:U, o G:C que son de tipo Watson-Crick, y que son los que forman la estructura secundaria. De

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hecho, el RNA(t) tiene una enorme cantidad de pares no cannicos (vase Figura 6). Sealar finalmente que interacciones de grupos fosfatos y de grupos 2-OH parecen colaborar tambin a la estabilizacin, por ejemplo con interacciones del tipo 2-OH--N(Ade).

Figura 6. Esquemas de algunas de las interacciones existentes en RNA(t). Como consecuencia de todo el conjunto de interacciones comentado el tRNA adopta una estructura terciaria muy compacta y estable, pero con un grado de flexibilidad y de variabilidad conformacional dependiente de la secuencia, que es la que le posibilidad de ejercer las diversas funciones biolgicas (recordar que cada Aa se reconoce por un tRNA diferente).

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15.5

INTERACCIONES CODON-ANTICODON EL tRNA debe cargar un aminocido que es el que se corresponde con su

codn. Existen 20 aminocidos, y entre 60 y 70 tRNA, luego existirn varios tRNA que llevan el mismo aminocido. Esto es lo que se deriva de la degeneracin del cdigo gentico (Figura 7).

. Figura 7. Esquema del cdigo gentico usual La reaccin de adicin de un aminocido a un tRNA se realiza por medio de la acilacin en el extremo 3 (el CCA-OH). Esta reaccin esta catalizada por la aminoacil acil transferasas. Existen unas 20 diferentes amonoacil acil transferasas, tantas como diferentes aminocidos. Estos enzimas cuentan con al menos 2 dominios, uno lee el

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anticodon y el otro el aminocido. Tienen que ser muy especficos en cargar el Aa porque sino el error puede ser muy grave y pensad que no es trivial distinguir un aminocido de otro (pensar por ejemplo en Leu, Ile, Val.,...). Por eso estos enzimas tienen un mecanismo de doble lectura. Por ejemplo en la primera lectura miran que el residuo no sea ms grande de la cuenta, y en la segunda que no sea ms pequeo. El caso es que consiguen un nivel de fiabilidad muy elevada. El mecanismo de acilacin sugerido para el enzima se muestra en la Figura 8 y consta de: i) reaccin con ATP, ii) El aminocido activado por el ATP interacciona con el OH libre en el extremo 3 de la adenosina final del tRNA.

Figura 8. Esquema de la unin de un aminocido al RNA(t). Una vez tenemos cargado el tRNA con el aminocido que corresponde, el tRNA debe ser capaz de reconocer el triplete de bases del RNam (codon). Como ya sabis eso se realiza dentro del complejo sistema del ribosoma y ser un tema que os explicarn

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con gran detalle en otra asignatura (vase Figura 9). Bsicamente la idea es de ir poniendo el nuevo RNA(t) cargado en contacto con el pptido que se esta sintetizando. Eso facilitar la formacin del enlace peptdico y la liberacin del RNA descargado. El proceso seguir hasta que llegue un codon de finalizacin UAA, UAG y UGA que no tiene RNA(t) cargado y eso producir la liberacin del pptido y la disociacin del polisoma.

Figura 9. Esquema de la sntesis de protenas en un ribosoma.

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El reconocimiento codn-anticodn (3 bases mRNA con 3 bases del tRNA) se da por medio de puentes de hidrgeno:

Los 2 primeros nucletidos forman interacciones muy especficas tipo WatsonCrick. El apareamiento del tercer nucletido es ms flexible y no siempre es WatsonCrick. Adems es posible que el tercer nucletido del codon llegue a aparearse con un nucletido que no es complementario. Esto es totalmente coherente con el caracter del cdigo gentico, donde existen diversos codones que codifican para el mismo aminocido (vase Figura 7).

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