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La conservacin de cepas microbianas
Mara Dolores Garca Lpez y Federico Uruburu Fernndez Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de Valncia. 46100 Burjassot (Valncia). E-mail: [email protected] - http://www.uv.es/cect.

os tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiologa son: que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservacin; que durante el tiempo de conservacin sobrevivan al menos el 70-80% de las clulas, y por ltimo, que estas clulas permanezcan genticamente estables. Los dos primeros objetivos no son muy difciles de conseguir cuando se conoce bien la tcnica microbiolgica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios mtodos de conservacin para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utilizacin general. Vamos a resumir estos mtodos agrupndolos en tres apartados, que son: Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo, mtodos alternativos y mtodos restringidos. 1.- Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo.

on los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas microbianas, pero stas no han muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas. An as no se puede descartar algn cambio originado por el mtodo preparatorio en si mismo. Los mtodos de conservacin pertenecientes a este grupo son dos: congelacin y liofilizacin. 1.1.- Conservacin por congelacin. Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y adems existe el peligro de que algn fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. Tambin

resulta ser el mtodo ms molesto para realizar el envo de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas conservadas por este mtodo son los siguientes: 1.1.1.- Edad de las clulas: En la mayora de los casos conviene utilizar clulas maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algn estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomrficos e incluso en algunos ms sencillos. 1.1.2.- Velocidad en la congelacin y descongelacin: Aunque hay programas de congelacin bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rpidas, tanto para la congelacin como para la descongelacin, por lo que para descongelar conviene poner las clulas a 37C. 1.1.3.- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo ms baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las clulas microbianas, sumergidos en nitrgeno lquido, que tiene una temperatura de 195C, o bien en la fase gaseosa del nitrgeno lquido, con una temperatura de 140C. En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los ms aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de 70C. Aquellos que slo alcanzan temperaturas entre 20C y 40C, como ocurre con la mayora, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentracin de solutos que existen en la suspensin celular, su punto de congelacin baja. El dao que se produce en las clulas es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se aade un crioprotector no inico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentracin inica. Para la conservacin en armarios congeladores, las clulas se almacenan en criotubos (tubos de

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plstico esterilizables resistentes a la congelacin que cierran hermticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasin. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto tambin se puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas de tipo abalorio que se impregnan con la solucin celular a congelar), ya que para tomar una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto. Este mtodo no se debe emplear para la conservacin de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el gnero bacteriano Clostridium, ya que al estar las clulas en una superficie hay un mayor contacto con el oxgeno y puede afectarse la viabilidad. 1.1.4.- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del dao que se pueda producir en las clulas microbianas en el momento de la congelacin. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con ms frecuencia es el glicerol, a una concentracin del 15 al 20%. Tambin se pueden utilizar el dimetilsulfxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su eleccin influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar. 1.2.- Conservacin por liofilizacin. Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilizacin, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad gentica es alta, pero a veces no tanto como en la congelacin, porque la liofilizacin se consigue por sublimacin del hielo de las clulas. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las clulas y despus eliminarla mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay muchos modelos en el mercado. Las clulas microbianas as conservadas se someten a un tratamiento ms complejo que en el caso de la congelacin, pues la liofilizacin se hace en dos etapas y se aade la sublimacin del agua a la congelacin previa. Sin embargo, este es un mtodo muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez conseguidos los lifilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18-20C), con lo cual su envo es muy cmodo. Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilizacin son lgicamente los mismos que influyen en la congelacin, a los que

30:13 habr que aadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratacin. Sin embargo, antes de pasar a explicar stos, tenemos que hacer unas breves consideraciones sobre los que antes hemos mencionado para el caso de la congelacin. La congelacin puede hacerse rpida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en nitrgeno lquido. Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporacin y a su higroscopicidad, que provoca que los lifilos queden muy viscosos. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfxido, porque es algo txico, y al concentrarse por la evaporacin del agua puede daar a las clulas microbianas. Por lo tanto, para la liofilizacin se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayora de las bacterias y la leche descremada para hongos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser ms convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el glutmico-glutamato para las bacterias lcticas, mezclas de glucosa con caldo hgado o chopped meat (sin carne) para bacterias anaerobias, etc. Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin como medio de conservacin son: 1.2.1.- Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilizacin y lgicamente sern aquellos que contengan ms agua en su interior. Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros mtodos. 1.2.2.- Concentracin celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentracin del orden de 108-109 clulas/ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras. 1.2.3.- Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C. 1.2.4.- Grado de deshidratacin alcanzado. Debe ser lo ms alto posible, aunque la concentracin de solutos puede conllevar una pequea cantidad de agua remanente que no es perjudicial. 1.2.5.- Atmsfera del tubo. Las clulas liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vaco para evitar, tanto la rehidratacin como la presencia de algn gas dentro del tubo, como el oxgeno que puede daar a las clulas. 1.2.6.- Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18C y sin bajar de los 0C. Los lifilos se deben guardar en la oscuridad.

30:14 2.- Mtodos alternativos.

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ralmente txicos; y almacenando los cultivos a 4C-8C. A veces tambin se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estril. Con esto se consigue tambin evitar en la medida de lo posible la desecacin del medio de cultivo, que podra ser txico para las clulas al aumentar su concentracin. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por ltimo, otro inconveniente que tiene la transferencia peridica es que la contaminacin de los cultivos resulta ms fcil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y tambin por la posibilidad de entrada de caros en los mismos. 2.2.- Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril. Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentracin celular no debe ser superior a 104-105 clulas/ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua de mar diluida. Los resultados obtenidos por la CECT en la conservacin de microorganismos por este mtodo muestran altos porcentajes de viabilidad en periodos a veces superiores a 5 aos. La estabilidad para caracteres morfolgicos y fisiolgicos es Universidad de Valencia y Director del Departamento de Microbiologa y Ecologa. Sus investigaciones han sido sobre ultraestructura, identificacin y conservacin de hongos filamentosos y levaduras y microbiologa de la elaboracin de vinos. Mara Dolores Garca ha trabajado como investigadora en el Centraalbureau voor Schimmelcultures de Baarn y en la Universidad de Utrecht (Holanda), en la Universidad de Salamanca y en la Universidad del Pas Vasco en Lejona. Actualmente es Profesora Titular de Microbiologa de la Universidad de Valencia. Sus trabajos versan sobre identificacin y conservacin de actinomicetos, hongos filamentosos y levaduras.

on los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservacin por estos mtodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos. 2.1.- Conservacin por transferencia peridica. La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas clulas no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos txicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor mtodo para conseguir la estabilidad gentica, puesto que al estar las clulas creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las clulas que se estn guardando sern descendientes lejanas de las clulas iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus caractersticas. Si se va a utilizar este mtodo es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inculo; rebajando la proporcin de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxgeno es ms rpido y origina productos geneFederico Uruburu Fernndez y Mara Dolores Garca Lpez obtuvieron su Doctorado en Farmacia por la Universidad Complutense de Madrid, e iniciaron su trabajo de investigacin en Centro de Investigaciones Biolgicas del CSIC. Son responsables de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT) de la Universidad de Valencia, de la que el primero ha sido fundador y es Director. Federico Uruburu ha trabajado tambin en el Instituto de Fermentaciones Industriales del CSIC (Madrid), en el Instituto Politcnico Nacional Suizo (Zurich), en la Universidad de Salamanca y en la Universidad del Pas Vasco en Lejona. Actualmente es Catedrtico de Microbiologa en la

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buena, pero no se ha comprobado para caracteres especficos como la virulencia, el poder fermentativo, etc. 3.- Mtodos restringidos.

30:15 tneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecacin no es total, pero las clulas dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.

n este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilizacin o la congelacin, como por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro mtodos que vamos a citar se basan en la paralizacin del crecimiento por eliminacin del agua disponible para las clulas. 3.1.-Desecacin en papel de filtro. Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann n 3) que se impregna con una solucin muy densa de clulas y se deja secar al aire (en condiciones estriles). Tambin es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecacin lquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelacin previa de las clulas. El vaco producido por el liofilizador deseca las clulas, pero hay que evitar que un vaco excesivo provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelacin incontrolada de las clulas. 3.2.- Desecacin en suelo, arena, silicagel, etc. Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este mtodo. 3.3.- Desecacin en bolitas de alginato. ste es un procedimiento bastante eficaz. Las clulas se encuentran en una matriz de alginato y la eliminacin del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertnicas sucesivas y posterior desecacin al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados hermticamente y a temperaturas de entre 4C y 18C, pudindose guardar incluso a 80C debido al bajo contenido en agua de las clulas y la proteccin que suministra el soporte de alginato. Este es un mtodo que se est utilizando incluso para la conservacin de algas y clulas vegetales. 3.4.- Desecacin en sal gorda para halobacterias. Para su conservacin por este mtodo se mezclan las clulas con sal y se dejan desecar espon-

or ltimo, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el mtodo empleado en la conservacin de las cepas microbianas, cuando stas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservacin o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las clulas que se han estado guardando, porque stas vienen de una situacin de estrs ms o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilizacin) y por lo tanto no son adecuadas para ningn tipo de prueba. Primero habra que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrndolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo ms posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivndolas en medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportar determinados mtodos de conservacin mejor que otros, o ser necesario tomar precauciones especiales en su conservacin. Como ya dijimos al comienzo, no existe un mtodo general de conservacin de los microorganismos, aunque no resulta difcil determinar el ms aconsejable en cada caso. La mayora de microorganismos de inters sanitario pueden conservarse a largo plazo con los mtodos generales de congelacin y/o liofilizacin, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos por alguno de los mtodos alternativos si se hace en las condiciones adecuadas y bien controlados por un microbilogo. Con lo anteriormente expuesto pretendemos contestar a las numerosas preguntas que se plantean a la CECT sobre esta cuestin. Este artculo se ha confeccionado no solamente mediante una consulta bibliogrfica que se puede ampliar con la completa bibliografa que se incluye al final, sino tambin gracias a la experiencia adquirida por el personal de la CECT a lo largo de los aos, y los autores agradecen su informacin y consejos. Finalmente, la CECT organiza cada ao en el mes de Septiembre un curso terico-prctico de 40 horas de duracin repartidas en cinco das consecutivos sobre el tema "Conservacin y control de cepas microbianas". Las plazas disponibles son 15, y en l los alumnos pueden aprender con ms detalle lo que antes hemos resumido. La informacin sobre este curso y ms detalles sobre la CECT se pueden consultar en su pgina web (http://www.uv.es/cect).

30:16 BIBLIOGRAFA
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