MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE CEPAS

Conservación de cepas

Agotadas las fuentes nutritivas o bajo condiciones adversas, paraliza o atenúa su

metabolismo, entrando en un periodo de dormancia.

A este fenómeno descrito se le ha denominado microbiostasis o hipobiosis.

(desarrollo inhibido temporalmente).

Cuando las condiciones vuelven a ser favorables o existe una nueva fuente nutritiva
el microorganismo inicia nuevamente su desarrollo. La conservación de
microorganimos vivos in-vitro ha intentado copiar este procedimiento, a pesar de
ello puede decirse que no existe ningún método de conservación perfecto, cada uno
tiene sus ventajas e inconvenientes, dependiendo su elección de las circunstancias
concretas de cada laboratorio (Hernández S. D. & Loaiza, 2014)

Objetivo de la conservación de cepas

Los objetivos de la conservación de los cultivos se podrían resumir en los siguientes

aspectos:

Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus propiedades;
evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación

Preservar los niveles de su productividad inicial

Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las

células

Lograr que el cultivo pueda ser trasportando y manejado con facilidad. Esto último
puede ser un factor esencial en la selección de un método de preservación.

CONS ERVACIÓN DE CEPAS A LARGO PLAZO

Este método
A corto plazo, un método común es el subcultivo; que consiste en el repique
periódico del cultivo en un medio nutritivo fresco. Una vez desarrollados los cultivos,
se mantienen a 4⁰C durante lapsos que van entre 15 días y dos meses.

Sin embargo, esta técnica presenta algunos inconvenientes, entre los cuales están:
Incremento de la posibilidad de mutación con cada transferencia, riesgo de
contaminación y alteraciones en el medio de cultivo, durante la etapa en frío, que
produce una desecación gradual del mismo.

Otra técnica es el mantenimiento bajo una capa de aceite, consiste en cubrir

completamente el cultivo después de su desarrollo en un medio sólido, con una
capa de aceite mineral o vaselina estéril;

sin embargo, algunos autores sostienen que, en estas condiciones, los

microorganismos pueden seguir reproduciéndose y podrían aparecer mutaciones.
(Jazmin, 2013)

MÉTODOS DE ELECCIÓN DE MEDIO PLAZO

MÉTODOS DE ELECCIÓN O DE CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO

Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células

microbianas, pero éstas no han muerto.

Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de

generaciones sucesivas. Aun así, no se puede descartar algún cambio originado
por el método preparatorio en sí mismo. Los métodos de conservación
pertenecientes a este grupo son dos: congelación y liofilización.

CONGELACIÓN
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y
se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua
se congela.
De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay
crecimiento.

Cuando se quiere trabajar o recuperar las células así conservadas, se recuperan

subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los
puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y
además existe el peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no
deseada de la temperatura durante el almacenamiento.

También resulta ser el método más molesto para realizar el envío de las cepas. Los
cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas
por este método son los siguientes:

Edad de las células

En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la fase
estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que
presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a
condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso
de microorganismos que esporulan, en algunos pleomórficos e incluso en algunos
más sencillos.

Velocidad de congelación y descongelación

Temperatura de almacenamiento

Empleo de agentes citoprotectores

Estas sustancias protegen a los microorganismos durante el proceso de

congelación. Por lo que reduce la velocidad de congelación de los componentes de
la célula microbiana, pues estas sustancias tienen un punto de congelación bajo 0.
Tipos de congelación

Congelación ordinaria: Durante la congelación ordinaria se mantienen

temperaturas de -5 a -20°C; en este intervalo, los microorganismos permanecen
viables (es decir, una vez descongelados, los microorganismos conservan todas sus
funciones y características) por uno o dos años

(Drew, 1986). El método no se recomiendo para periodos de almacenamiento

mayores (Hernández A. , 2003)

Congelación Ultrafría: El cultivo por congelar se recoge directamente por

centrifugación de una suspensión de microorganismos, o se prepara raspando
muestra de la suspensión en un tubo con las condiciones adecuadas para su
crecimiento.

Luego, el cultivo se suspende en un medio con un citoprotector. La suspensión se

coloca en tubos especiales.

La congelación ultra fría se efectúa en congeladores mecánicos, a temperaturas

entre -50 y -80°C.

Congelación con nitrógeno líquido: El método de conservación por congelación

más recomendado es el que utiliza nitrógeno líquido, porque se logran temperaturas
de -150 a -196°C (Stanbury y Whitaker, 1987).

La velocidad de congelación debe ser 1 a 2°C/min hasta alcanzar una temperatura

de -30°C, luego 1°C/min hasta -56°C.

Después, se colocan las muestras directamente en nitrógeno líquido para acelerar

el proceso de congelación.

El metabolismo celular se detiene completamente a partir de los -130°C; por esta

razón, si el microorganismo soporta el proceso de congelación, su viabilidad
permanece durante muchos años.

Una de las principales ventajas de este método es que son innecesarias las
resiembras, por lo que se reducen al mínimo los riesgos de contaminación y los
cambios genéticos y bioquímicos en el microorganismo. Sin embargo, el costo del
equipo requerido es alto y es necesario mantener un suministro constante de
nitrógeno, lo que encarece el proceso. Además, es imprescindible tomar previsiones
en cuanto a fallas mecánicas y eléctricas para evitar perder toda una colección

LIOFILIZACIÓN

La liofilización está considerada como el método más adecuado para la

preservación de microorganismos.

La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por

sublimación del hielo bajo vacío.

Este proceso consta de tres etapas, la precongelación del producto para asegurar
una estructura completamente congelada;

el secado primario con el que se elimina la mayor parte del agua por sublimación;
y el secado secundario con el que se remueve el agua que queda ligada (Arencibia,
Rosario, & Gámez, 2008)

. Este proceso se realiza en tres fases: primero el producto es pre congelado para
asegurar una estructura inicial sólidamente congelada,

No toda el agua es retirada y lo que resta representa la humedad residual. Para

volver a su estado inicial los cultivos liofilizados necesitan ser re hidratados y
colocados en un medio de cultivo adecuado. (Barragán & Lesmes, 2009)

Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto como en la

congelación

Citoprotector: Glicerol al 15% porque provoca que los liófilos queden

viscosos

Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al

concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células microbianas.
La ventaja es que la mayoría de los organismos sobreviven al secado y el cultivo es
fácilmente mantenido aún a temperatura ambiente sin pérdida significativa de
viabilidad.

La liofilización es apropiada para la conservación de la mayoría de las bacterias,

encontrándose que las Gram-positivas sobreviven mejor que las Gram-negativas
cuando se las liofiliza y mantiene en condiciones similares.

Factores que influyen en la viabilidad

Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y

lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos hongos
filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados
y hay que recurrir a otros métodos

Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una

concentración del orden de 108 -109 células/ml en el caso de las bacterias y algo
inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras.

- Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir por
encima de –50ºC. 1. Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto
posible, aunque la concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad
de agua remanente que no es perjudicial. 1.2.

5.- Atmósfera del tubo. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al
vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del
tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células. 1.2.6

6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante,

preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC. Los liófilos se deben guardar en la
oscuridad.
También se emplea en la conservación de esporas, actinomicetos y muchos hongos
incluidas levaduras. Sin embargo, no es adecuada para células animales, algas y
hongos en fase de micelio.

(Alaníz, 2012)

(Wang, Díaz, & Álvarez, 2005)

La técnica consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las células

son usualmente más resistentes) re-suspendiendo las células con un medio
crioprotector, en el cual se obtenga una alta densidad celular.

Unas pocas gotas de suspensión celular son transferidas a una ampolla, la cual es
congelada a aproximadamente -40 °C y deshidratada mediante una sublimación en
vacío.

Este debe ser mantenido en 5-10 um mediante una bomba. El secado continúa
hasta llegar a valores de humedad del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada
bajo vacío.

Se debe evitar la formación de radicales libres que se producen por exposición de

las células al oxígeno, ya que están asociados con pérdida de viabilidad; de allí la
importancia de mantener el vacío.

El medio empleado en la liofilización es un factor importante en el proceso. Entre

los agentes recomendados están la leche descremada en concentraciones del 10
al 20%; suero equino, mezclas de suero, glucosa y extracto de levadura; suero fetal
bovino, etc. En algunos casos el efecto protector de la leche descremada es
mejorado por el agregado de solutos tales como ácido ascórbico o tiourea.

Normalmente la liofilización produce daños en las células, siendo los mismos en

algunos casos reversibles, por lo cual éstas necesitan un tiempo de recuperación
que es variable en función del tipo de daño producido.
En la reconstitución de un tubo liofilizado se logra incrementar la sobrevida de los
microorganismos si en lugar de agua destilada se agrega caldo nutritivo o el mismo
medio que se usó para el crecimiento inicial de las células; de esta forma al
mantenerse elevada la presión osmótica durante la rehidratación se logra que la
misma proceda en forma lenta.

Se encuentra con frecuencia que el crecimiento después de la rehidratación tiene

una fase de retardo extendida.

Se puede reducir esta fase si se emplea para el crecimiento un medio de igual

composición que el que da óptimo desarrollo, pero disminuyendo su concentración
original entre un 25 y un 50%. En general no es posible determinar para cada grupo
de organismos el método de conservación, por lo que se trata de emplear el más
adecuado. De todos, la liofilización es el más utilizado, aunque algunos organismos
muestran al tas tasas de mortandad. (Barragán & Lesmes, 2009)

Métodos alternativos

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien
por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste
los tratamientos de la conservación por estos métodos. Conviene tener en cuenta
que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda
conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

Conservación por transferencia periódica

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en

el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer
indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos
tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte
celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo
fresco.

Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar
las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las
células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales
y es posible que ya no conserven algunas de sus características.

Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar

los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras
como, por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción
de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando por picadura los
microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en
presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos; y
almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC.

A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral
estéril. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación
del medio de cultivo, que podría ser tóxico para las células al aumentar su
concentración.

Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo
los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados.

Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la

contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo
largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.

Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril

Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en
diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y
algunas bacterias.

Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se
quiere conservar.

Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados.

En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104 -105 células/ml en
el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan,
se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo.

En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar

diluida.

Los resultados obtenidos por la CECT en la conservación de microorganismos por

este método muestran altos porcentajes de viabilidad en periodos a veces
superiores a 5 años.

La estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena, pero no se ha

comprobado para caracteres específicos como la virulencia, el poder fermentativo,
etc.

MÉTODOS RESTRINGIDOS

En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que

es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy
determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo
los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.

Los cuatro métodos que se van a citar se basan en la paralización del crecimiento
por eliminación del agua disponible para las células.

Decantación en papel filtro

Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una

solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles).

También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación

líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido
congelación previa de las células.

El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un
vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura
disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células.

Desecación en el suelo, arena, silicagel, etc.

Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar.

Como resultado

Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante

bastante tiempo por este método. (García & Uruburu, s.f)

BOLITAS DE ALGINATO

Este es un procedimiento bastante eficaz.

Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se

hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas
y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua.

Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y

a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al
bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de
alginato.

Este es un método que se está utilizando incluso para la conservación de algas y

células vegetales

Sal gorda para halobacterias

Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan
desecar espontáneamente.

Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células

dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.

Higroscopicidad:
(Monjecitos, 2019)

Referencias
Alaníz, S. (Mayo de 2012). Métodos de conservación de Firopátogenos . Obtenido de Pv. Facultad
de Agronomía :
http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursometodosfito/13_Metodos_conservacion.pdf

Arencibia, A. D., R. F., & G. M. (2008). Métodos generales de conservación de microorganismos .

FINLAY EDICIONES, Centro de Productos Naturales, Centro de Química , 1-14.

Barragán, C. D., & L. H. (Noviembre de 2009). “COMPARACION DE DOS METODOS DE

CONSERVACION, LIOFILIZACION Y MICROSECADO SOBRE TRES ESPECIES BACTERIANAS”:
ELECCION DEL MEJOR MÉTODO. Obtenido de PONTIFICIA UNIVERSIDAD
JAVERIANA,DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA, BOGOTÁ D.C .

García, L. M., & U. F. (s.f). La conservación de cepas microbianas. ACTUALIDAD, SEM , 30:12-30:16.

Hernández, A. (2003). Microbiología Industrial. Universidad Estatal a distancia .

Hernández, S. D., & L. C. (2014). SELECCIÓN DE UN MÉTODO PARA LA CONSERVACIÓN Y

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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA. Obtenido de UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE
PEREIRA, FACULTAD DE TECNOLOGÍA, ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA:
http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/handle/11059/4316/57192H557.pdf?seq
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Jazmin. (07 de Agosto de 2013). PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS. Obtenido de METRÍX

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Monjecitos. (30 de Julio de 2019). Biología de la Levadura. Obtenido de Monjecitos:

https://www.monjecitos.com/2019/06/30

Wang, A. Z., D. R., & Á. M. (Septiembre-Octubre de 2005). Conservación de microorganismos: ¿qué

debemos conocer? Scielo: Revista Cubana de Higiene y Epidemiología. Obtenido de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1561-30032005000300006