Ensayos de toxicidad aguda con bulbos de cebolla

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Ensayo de toxicidad aguda con bulbos de cebolla Allium cepa L mediante la evaluacin de la inhibicin del crecimiento promedio de races
Mara Consuelo Daz Bez, Alicia Ronco y Yolanda Pica Granados

C LASIFIcAcIN

DEL ENSAYO :

IC

Principio de la prueba
Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp.) se rehidrata se produce una estimulacin del crecimiento de las clulas, lo cual permite la elongacin de las races de la planta. Sin embargo, cuando la hidratacin se lleva a cabo en presencia de sustancias txicas, la divisin celular de los meristemos radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las clulas. Este tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raz, y por tanto su elongacin (Fiskesj 1985, 1993, 1997).

Este ensayo apareci publicado originalmente en G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos toxicolgicos y mtodos de evaluacin de calidad de aguas. Estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones. IDRC, IMTA, Canad. 202 pp. Se reproduce con la autorizacin de la editorial.

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Intercalibrados

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El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparacin de la elongacin de las races de cebollas expuestas al compuesto txico contra la de cebollas no expuestas, luego de un perodo de 72 horas de prueba. La cuantificacin del efecto se realiza estableciendo el porcentaje de inhibicin del crecimiento de las races respecto a la longitud promedio de las races del control.

Material
Tubos de ensayo de vidrio de 10 cm de largo y 1.5 cm de dimetro (o recipientes de mayor tamao, dependiendo del tipo de bulbos a utilizar), gradillas o so-

portes para tubos, bistur y reglilla para hacer mediciones en cm o mm.

Reactivos y soluciones
Medio de crecimiento El medio de crecimiento que se utiliza en el desarrollo del ensayo se prepara de acuerdo con lo que se indica en la tabla 2.1.
Tabla 2.1. Medio de crecimiento para Allium sp. Masa de sal para disolver en un litro de agua destilada Reactivo Cantidad (mg) Ca(NO3)24H2O KNO3 MgSO47H2O KH2PO4 Fe EDTA3H2O Reactivo MnSO4 CuCl2 NaMnO4 ZnSO4 H3BO3 Elementos traza 236.1 202 246 136.1 67.6 Cantidad (mg) 0.55* 0.0645* 0.001* 0.0007* 0.23*

* Los componentes correspondientes a elementos traza deben ser adicionados a partir de una solucin stock.

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La solucin madre, preparada de acuerdo con lo indicado, se diluye 10 veces con agua destilada, y el pH se ajusta a 7.0 antes de utilizarla. Tambin se puede utilizar agua dura o agua de la llave como medio de crecimiento. En el caso de usar cualquiera de estas opciones, el control negativo y el agua utilizada para preparar las diluciones de los compuestos o las muestras debern ser los mismos.

Organismos de prueba
Para la elaboracin de las pruebas se deben seleccionar bulbos de Allium sp. (cebolla amarilla) de 1.5 cm de dimetro, secos y sin formacin de hojas o raz. stos pueden ser obtenidos del mercado local o adquiridos a travs de algn proveedor. Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la epidermis seca y removiendo, con un bistur o instrumento punzante, los restos de tejido y races del rea radicular (figura 2.1 (1)). No se deben daar las races primordiales. Con el fin de eliminar los restos de tejido, es conveniente colocar los bulbos en agua destilada por 2 horas y dejar secar. Almacenamiento de los bulbos de cebolla Se recomienda adquirir los bulbos en vsperas de la realizacin de pruebas o, en su defecto, almacenarlos en un lugar donde se puedan garantizar condiciones secas y una temperatura entre 10 y 20 C. En algunas regiones, los bulbos pueden mantenerse almacenados hasta por un ao; sin embargo, en zonas geogrficas donde la temperatura y la humedad son altas, el almacenamiento est limitado a unos pocos das. Control de calidad del material biolgico Dado que la prueba con cebollas no requiere mantenimiento de un cultivo, el control de calidad debe enfatizarse en la calidad de los lotes de material a utilizar. Por esa razn, debe darse especial importancia al almacenamiento del material, as como al control de hongos que pueden afectar la viabilidad de las cebollas y su normal desarrollo. Es por ello que se recomienda disponer de un nmero de cebollas por lo menos 3 o 4 veces mayor al requerido para las pruebas. Su almacenamiento debe hacerse en ambiente exento de humedad, a una temperatura entre 10 y 20 C.

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Figura 2.1. Esquema grfico de los pasos a seguir en la prueba con Allium cepa L. 1) limpieza y pelado de bulbos; 2) ubicacin de bulbos en tubos para exposicin a las soluciones de ensayo; 3) colocacin de tubos en soporte; 4) agregado de soluciones en los tubos durante el ensayo; 5) medicin de longitud del haz de races al finalizar el tiempo de exposicin de los bulbos

Procedimiento de la prueba
Control de calidad en las pruebas con A. cepa Un elemento importante en la elaboracin de las pruebas es el proceso de pelado de los bulbos. Durante este procedimiento debe evitarse el dao del anillo radicular. Igualmente, se debe trabajar con un alto nmero de rplicas para controlar la variabilidad de las pruebas. Se recomienda utilizar 12 rplicas por concentracin, con el fin de descartar por lo menos 2 de los valores

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ms extremos. En el caso que exista un bajo desarrollo radicular en ms de 2 bulbos del control, se considera que el lote de bulbos tiene problemas, por tanto los resultados no sern vlidos. Al igual que en todas las pruebas, se debe establecer la sensibilidad de los bulbos a los compuestos de referencia; se recomienda el empleo de Cu(II) a partir de sulfato de cobre y registrar registrar la sensibilidad mediante la confeccin de una carta control con por lo menos veinte pruebas. Resultados por encima o por debajo de la sensibilidad establecida son indicativos de problemas con el material biolgico utilizado. Preparacin de diluciones Generalmente, se sugiere el empleo de una serie de 5 concentraciones, un control negativo y 1 o 2 controles positivos; este ltimo contiene el compuesto de referencia mencionado en el prrafo anterior. Para su preparacin se emplea el mtodo de dilucin en forma secuencial aplicando un factor de 0.2 o 0.3. Cuando se va a llevar a cabo una evaluacin exploratoria, puede emplearse una serie de diluciones logartmicas (por ejemplo: 100; 10; 1; 0.1; 0.01), lo cual permitir establecer el intervalo de concentracin conveniente para la determinacin de la Concentracin Inhibitoria Media (CI50). Desarrollo de la prueba Cuando se trabaja con bulbos de dimetro pequeo, las pruebas se realizan en tubos de ensayo de 10 cm de longitud x 1.5 cm de ancho. En el caso de bulbos de mayor dimetro pueden utilizarse tubos o recipientes de mayor volumen, dependiendo del tamao de los mismos. Es importante destacar que la profundidad de los recipientes debe ser tal que, al trmino de la prueba, la elongacin mxima no alcance el fondo del recipiente (Fiskesj, 1985). En la prueba se utilizan 5 concentraciones de la muestra, un control negativo y 1 o 2 controles positivos, cada una con 12 rplicas. El ensayo se inicia con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y controles; este llenado debe hacerse hasta el borde del tubo. A continuacin se colocan los bulbos limpios sobre la boca del tubo, cuidando que la zona radicular quede inmersa en el lquido (figura 2.1 (2)). Los tubos se colocan en una gradilla, la cual se localiza sobre una mesa que no presente vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente

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(20 C) durante un perodo de 72 horas. Debe evitarse la iluminacin directa. Dos veces al da durante el perodo de prueba, se debe reponer el volumen perdido por evaporacin o absorcin. Para reponer este volumen se utiliza la muestra o dilucin correspondiente. Se recomienda inclinar el bulbo sin sacar las races del tubo, adicionando cuidadosamente el volumen con ayuda de una pipeta Pasteur (figura2.1 (3 y 4)). En la tabla 2.2 y en las figuras 2.1

y 2.2 se resumen las condiciones de prueba.

Figura 2.2. Ensayo de toxicidad con Allium cepa L.

Condiciones de la prueba Temperatura 20C Iluminacin indirecta Volumen de prueba 15-20 mL Control positivo Cu+2

Tiempo de prueba 72 h

Control negativo Agua dura o de la llave o medio de crecimiento 12 rplicas

Control positivo solucin de Cu (II) 12 rplicas 72 horas de incubacin

Soluciones de prueba 5 concentraciones 12 rplicas

Control negativo agua dura o de la llave o medio de crecimiento 12 rplicas

Control positivo solucin de Cu (II) 12 rplicas

Soluciones de prueba 5 concentraciones 12 rplicas

Registro de signos de fitotoxicidad Disminucin de la longitud de las races Medicin de elongacin, descarte valores extremos

Control negativo

Clculo del % de inhibicin del crecimiento de las races Clculo de la CI50

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Tabla 2.2. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con Allium cepa L. Tipo de ensayo Temperatura Calidad de luz Iluminacin Recipientes de prueba Nmero de rplicas Material biolgico Condicin de los bulbos Agua de dilucin Nmero de concentraciones Duracin de la prueba Efecto medido Control negativo Control positivo Resultado final Esttico 20 C, ambiente Fluorescente, blanco-fro Indirecta Tubos de Ensayo de 10 cm x 1.5 cm dimetro 12 Bulbos de aproximadamente 1.5 cm de dimetro Pelar los bulbos y la base, evitar daar el anillo radicular Agua de la llave o medio de crecimiento 5 72 horas Inhibicin de crecimiento de las races Agua de la llave o medio de crecimiento Cobre (II) a partir de una solucin de CuSO4 CL50

Expresin de resultados
Medicin Al trmino del perodo de exposicin se registra la longitud promedio de las races, medicin que se lleva a cabo con ayuda de una regla comn con escala en milmetros (figura 2.3). La medicin se lleva a cabo colocando la escala en el margen del tubo, se ubica el valor de longitud mnimo y mximo donde incide la mayora de las races y el punto medio se define como el promedio. Se efecta la estimacin en cada tubo y se obtiene el promedio matemtico de diez rplicas (los dos valores ms extremos se descartan). Para obtener el porcentaje de efecto de inhibicin se debe realizar la siguiente operacin: (longitud del control longitud de la muestra) x 100/longitud del control Con estos valores se construye una grfica de concentracin en funcin del porcentaje de inhibicin y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los siguientes mtodos: Probit, promedios mviles o Sperman y Karber.

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Figura 2.3. Elongacin de las races de bulbos de cebolla despus de un proceso de hidratacin

Bibliografa
Fiskesj, G. 1985. The Allium Test as Standard in Environmental Monitoring. Hereditas 102: 99-112. . 1993. The Allium Test in Wastewater Monitoring. Environmental Toxicology and Water Quality 8: 291-298. . 1997. Allium Test for Screening Chemicals; Evaluation of Cytological Parameters. En: W. Wancheng, J. W. Gorsuch y J. S. Hughes (eds.). Plants for Environmental Studies. CRC Press, Florida, pp. 308-329.