LANASEVE Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

Elaborado por: Jefe de Seccin Revisado por: Encargada de Calidad de Seccin

Rige a partir de: 20/09/10 Versin 01

Cdigo: IA-MBA-PT- 014 Pgina 1 de 5

Aprobado por: Jefe de Seccin

1. Objetivo Disponer de un mtodo para realizar el recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva 2. Alcance Para aplicar en muestras de alimentos. 3. Responsabilidad y autoridad Jefe de Seccin: debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. Analistas de laboratorio: deben realizar el ensayo segn lo descrito en este procedimiento. 4. Definiciones No aplica 5. Abreviaturas y/o Siglas ufc: unidad formadora de colonia 6. Referencias y/o Bibliografa AOAC Oficial Method 2003.07: 3M TM PetrifilmTM Staph Express Count Plate Method for the Enumeration of Staphylococcus aureus in Selected Types of Processed and Prepared Foods AOAC Oficial Method 2003.08: 3MTM PetrifilmTM Staph Express Count Plate Method for the Enumeration of Staphylococcus aureus in Selected Dairy Foods AOAC Oficial Method 2003.11: 3M TM PetrifilmTM Staph Express Count Plate Method for the Enumeration of Staphylococcus aureus in Selected Types of Meat, Seafood, and Poultry Instrucciones Petrifilm Recuento Staph Express IA-MBA-PE-009-RE- 008 Hoja de trabajo IA-MBA-PE-012-RE-014 Control interno para anlisis de Staphylococcus aureus IA-MBA-PE-015 Control de calidad de reactivos IA-MBA-PO-004 Control de Equipo

Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

Rige a partir de: 20/09/10 Versin 01

Cdigo: IA-MBA-PT- 014 Pgina 2 de 5

Aprobado por: Jefe de Seccin

7. Descripcin del procedimiento 7.1 Fundamento Terico Las placas Petrifilm Recuento Staph Express es un medio de cultivo deshidratado listo para usar; el medio modificado de Baird Parker contiene un cromgeno en la placa el cual es selectivo y permite diferenciar a S.aureus. Posteriormente las colonias se les realiza una prueba de coagulacin con plasma de conejo. 7.2 Equipo, materiales , reactivos y medios de cultivo 7.2.1 Equipo Balanza sensibilidad 0,1 g Contador de Colonias Quebec Incubador 35 C 1 C Stomacher Vortex 7.2.2 Materiales Bolsas plsticas para stomacher 7 x 11 pulg (ancho x largo) con cierre de alambre Pipetas estriles de 1 ml o 2 ml. Esparcidor plano de Petrifilm 7.2.3 Medios de cultivo y reactivos Placas de Petrifilm 3M Recuento Staph Express Buffer Butterfield Caldo infusin cerebro corazn Plasma de conejo 7.2.4 Cepas de referencia Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

Rige a partir de: 20/09/10 Versin 01

Cdigo: IA-MBA-PT- 014 Pgina 3 de 5

Aprobado por: Jefe de Seccin

7.3 Procedimiento 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.3.6 En una bolsa de stomacher estril, pesar 25 gramos de la muestra. Agregar 225 ml de buffer Butterfield para realizar una dilucin 1/10 (10 -1) Homogenizar en stomacher por 2 minutos. Hacer diluciones seriadas 10-2 hasta 10-5 Sembrar estas diluciones, rotular con la identificacin de la muestra, dilucin y la fecha del anlisis Poner las placas en una superficie plana y lisa. Levantar la lmina superior y colocar 1 ml de la dilucin en el centro de la placa de Petrifilm Staph Express sin hacer burbujas, tocar suavemente la superficie de la placa con la pipeta para depositar la ltima gota. Dejar caer la lmina superior suavemente 7.3.7 7.3.8 Colocar el esparcidor plano en el centro de la placa y presionar suavemente para distribuir la muestra de manera uniforme. Esperar por 1 minuto para permitir que solidifique el gel. Dentro de los 10 minutos posteriores a la inoculacin de las placas, incubar en posicin horizontal con el lado transparente hacia arriba; a 35 C 1 C por 24 2 horas (Se puede colocar hasta 20 placas de Petrifilm una sobre otra. 7.3.9 Contar las colonias rojo-violetas. No contar las colonias azul-verdosas. 7.3.10 Seleccionar las placas que tengan de 25 a 250 colonias tpicas. 7.3.11 Se puede realizar estimaciones en placas con ms de 150 colonias, contando el nmero de colonias en uno o ms cuadros representativos y obtener el promedio, multiplicar dicho nmero por 20 para obtener el recuento total por placa. 7.3.12 Si solo se obtienen placas con recuentos menores a 25 colonias, se debe tomar el, resultado de la dilucin menor. 7.3.13 Si se observa un rea de crecimiento rosado en toda la placa indica que a la muestra debe de realizarse ms diluciones. 7.3.14 A las colonias sospechosas (colonias rojo-violetas) realizar la prueba de coagulasa, levantar la lmina superior y tomar una colonia del gel e inocular un tubo de 3 ml de caldo infusin. 7.3.15 Incubar el tubo a 35 C por 24 horas.

Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

Rige a partir de: 20/09/10 Versin 01

Cdigo: IA-MBA-PT- 014 Pgina 4 de 5

Aprobado por: Jefe de Seccin

NOTA: a) Durante el pipeteo se debe ajustar el volumen poniendo la punta de la pipeta en contacto con la pared del contenedor y no dentro de la muestra. b) La pipeta se debe insertar no ms de 2,5 cm dentro de la muestra. c) Se debe agitar los tubos en vortex por 15 segundos antes de hacer cada dilucin y antes de tomar la alcuota para realizar el anlisis. 7.4 Prueba coagulasa 7.4.1 7.4.2 7.4.3 Agregar 0,1 ml del cultivo de caldo infusin cerebro corazn a 0,3 ml de plasma de conejo en un tubo de prueba de 10 x 75 mm e incubar a 35 C o 37 C. Examinar el tubo despus de 4 horas a 6 horas de incubacin, si la prueba es negativa reexaminar a las 24 horas de incubacin. Considerar la prueba de coagulasa positiva si el volumen del cogulo ocupa ms de la mitad del volumen original de lquido. 7.5 Reporte de resultado 7.5.1 7.5.2 7.5.3 El resultado obtenido se registra en el formulario IA-MBA-PE-009-RE- 008 Hoja de trabajo Si el conteo es entre 25 a 250 ufc, reportar el nmero de colonias contadas por mililitro o gramo por el recproco de la dilucin; reportar con dos cifras significativas. Si no hay presencia de colonias tpicas, reportar como menos de 1 x 10 1 ufc/g o ufc/ml

7.6. Control de Calidad 7.6.1 7.6.2 Se deben usar cultivos de referencia de S.aureus como control positivo y S .epidermidis como control negativo La concentracin del inculo de los controles positivos debe estar aproximadamente entre 100 a 1000 ufc /ml, registrar los resultados en IA-MBA-PE-012-RE-014 Control interno para anlisis de Staphylococcus aureus 7.6.3 Cada lote de plasma de conejo se controla con las cepas de referencia de acuerdo al procedimiento IA-MBA-PE-015 Control de calidad de reactivos.
Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

Rige a partir de: 20/09/10 Versin 01

Cdigo: IA-MBA-PT- 014 Pgina 5 de 5

Aprobado por: Jefe de Seccin

7.7 Puntos Crticos de Control Control de temperatura de la incubadora, se debe mantener el registro de la temperatura ptima del equipo, as como las medidas correctivas en caso de alguna variable segn IA-MBA-PO-004 Control de Equipo. 8. Anexos No aplica

Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada