Analisis Mostos Vino

19.2.
2010
ES
Diario Oficial de la Unin Europea
C 43/1
II
(Comunicaciones)
COMUNICACIONES QUE PROCEDAN DE LAS INSTITUCIONES, RGANOS Y ORGANISMOS DE LA UNIN EUROPEA
COMISIN EUROPEA
Lista y descripcin de los mtodos de anlisis contemplados en el artculo 120 octies, prrafo primero, del Reglamento (CE) no 1234/2007 del Consejo (1) [publicadas de conformidad con el artculo 15, apartado 2, del Reglamento (CE) no 606/2009 de la Comisin, de 10 de julio de 2009 (2)] (2010/C 43/01) El cuadro que figura ms abajo recoge la lista de mtodos de anlisis aplicables para el control de los lmites y exigencias fijados en la normativa comunitaria en relacin con la produccin de productos vitivincolas. En la tercera columna se encuentra, respecto a cada uno de los parmetros, la referencia del mtodo de anlisis correspondiente descrito en el Compendio de los mtodos internacionales de anlisis de los vinos y de los mostos de la OIV (Recueil des mthodes internationales d'analyse des vins et des mots), en la ltima edicin (2009) disponible a fecha de la presente publicacin. Respecto a cada parmetro, solo se describen los mtodos de referencia (tipo I o tipo II en la clasificacin de la OIV), salvo los parmetros para los que actualmente no existe ningn mtodo de tipo I o II validado. La descripcin de los mtodos se recoge en el anexo de la Comunicacin. Recordatorio: El Compendio de la OIV establece en su anexo A, seccin I, la definicin de los distintos tipos de mtodos de anlisis y, en particular, el tipo I (Mtodo de referencia criterio), el tipo II (Mtodo de referencia) y el tipo IV (Mtodo provisional). Los mtodos de anlisis del plomo y del cadmio se describen ahora en el Reglamento (CE) no 333/2007 de la Comisin, de 28 de marzo de 2007 (anexo C-3) (3). Por otra parte, el Reglamento (CE) no 401/2006, de 23 de febrero de 2006 (4), establece criterios generales para los mtodos de anlisis de la ocratoxina A en su anexo II.4, por lo que no es necesario describir ningn mtodo de ensayo de esta sustancia que sea especfico de los productos vitivincolas.
LISTA DE MTODOS DE ANLISIS
No Parmetro Mtodo del Compendio de la OIV Tipo
1 2 3 4
Densidad absoluta/relativa ndice refractomtrico Extracto seco total Relacin isotpica

18O/16O
AS-2-01-MASVOL AS-2-02-SUCREF AS-2-03-EXTSEC del agua del vino AS-2-09-MOUO18
I I I II
(1 ) (2 ) (3 ) (4 )
DO DO DO DO
L L L L
299 de 16.11.2007. 193 de 24.7.2009, p. 1. 88 de 29.3.2007, p. 29. 70 de 9.3.2006, p. 12.
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No
Parmetro
Mtodo del Compendio de la OIV
Tipo
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
ndice de Folin Contenido en azcar (= glucosa + fructosa) Contenido en sacarosa (medido por HPLC) Resonancia magntica nuclear Deuterio del etanol del vino Grado alcohlico volumtrico en % (GAV) Relacin isotpica Acidez total Acidez voltil cido ctrico cido srbico pH de los mostos cido ascrbico CO2 en g/l CO2 en g/l (manometra) Sobrepresin de CO2 Lisozima Sulfato de potasio Hierro Cobre Sulfitos (SO2) o dixido de azufre total
13C/12C
AS-2-10-INDFOL AS-311-02-GLUFRU AS-311-03-SUCRES AS-311-O5-ENRRMN (en revisin) AS-312-01-TALVOL AS-312-06-ETHANO AS-313-01-ACITOT AS-313-02-ACIVOL AS-313-09-ACIENZ AS-313-14-ACISOR AS-313-15-PH AS- 313-22 ACASCO AS-314-01-DIOCAR AS-314-04-CO2MAN AS-314-02-SURPRES AS-315-14-LYSOZY AS-321-05-SULFAT AS-322-05-FER AS-322-06-CUIVRE AS-323-04-DIOSU
IV II II I I II I I II IV I II II II I IV II IV IV II
del etanol del vino
La descripcin de algunos mtodos de anlisis est siendo objeto de actualizacin por parte de las instancias de la OIV. Estas descripciones se publicarn en una prxima Comunicacin de la Comisin en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edicin 2010 del Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV.
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ANEXO NDICE 1. DENSIDAD ABSOLUTA A 20 C Y DENSIDAD RELATIVA A 20 C (OIV-AS2-01-MASVOL) Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. EVALUACIN MEDIANTE REFRACTOMERA DEL CONTENIDO EN AZCARES DE MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS Y MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS2-02-SUCREF) Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. EXTRACTO SECO TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Materias secas totales Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . 4. DETERMINACIN DE LA RELACIN ISOTPICA 18O/16O DEL AGUA DEL VINO (OIV-AS-2-09-MOUO18) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5. NDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) Mtodo de tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. GLUCOSA Y FRUCTOSA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. DETERMINACIN DE AZCARES POR HPLC (SACAROSA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) Mtodo de tipo II 8. DETECCIN DEL AUMENTO DEL GRADO ALCOHLICO NATURAL DE MOSTOS DE UVA, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS Y DE VINOS POR APLICACIN DE LA RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DEL DEUTERIO (OIV-AS-311-05-ENRRMN) Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9. GRADO ALCOHLICO VOLUMTRICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) Mtodos de tipo I . . . . . . . . . . . . . . 10. DETERMINACIN DE LA RELACIN ISOTPICA 13C/12C POR ESPECTROMETRA DE MASA ISOTPICA DEL ETANOL DEL VINO O DEL ETANOL OBTENIDO POR FERMENTACIN DE MOSTOS, MOSTOS CON CENTRADOS O MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06-ETHANO) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11. ACIDEZ TOTAL (OIV-AS-313-01-ACITOT) Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12. ACIDEZ VOLTIL (OIV-AS-313-02-ACIVOL) Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13. CIDO CTRICO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14. CIDO SRBICO (OIV-AS-313-14-ACISOR) Mtodo de tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15. pH (OIV - AS-313-15-PH) Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16. DETERMINACIN SIMULTNEA DE CIDO L-ASCRBICO Y DE CIDO D-ISOASCRBICO POR HPLC Y DETECCIN UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17. DIXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18. DETERMINACIN DEL DIXIDO DE CARBONO EN EL VINO POR MTODO MANOMTRICO (OIV - AS314-04-CO2MAN) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19. MEDICIN DE LA SOBREPRESIN DE LOS VINOS ESPUMOSOS Y DE AGUJA (OIV - AS-314-02-SURPRES) Mtodo de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20. DETERMINACIN DE LA LISOZIMA EN EL VINO POR HPLC (OIV-AS-315-14) Mtodo de tipo IV 73 21. SULFATOS (OIV- AS-321-05-SULFAT) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22. HIERRO (OIV - AS-322-05-FER) Mtodo de tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23. COBRE (OIV - AS 322-06) Mtodo de tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24. DIXIDO DE AZUFRE (OIV - AS-323-04-DIOSU) Mtodo de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8 10 11 12 14 17
18 19
20 27 30 33 36 39 41 45 47 48 51 54 55 56 58
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1 DENSIDAD ABSOLUTA A 20 C Y DENSIDAD RELATIVA A 20 C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) MTODO DE TIPO I 1. DEFINICIONES La densidad absoluta es la proporcin entre la masa de un determinado volumen de vino o mosto a 20 C y ese volumen. Se expresa en gramos por mililitro y su smbolo es 20 C. La densidad relativa a 20 C o densidad 20 C/20 C es la relacin, expresada en nmero decimal, entre la masa de cierto volumen de vino o de mosto a 20 C y la masa del mismo volumen de agua a la misma temperatura. C Su smbolo es d20 20 C 2. PRINCIPIO DE LOS MTODOS La densidad absoluta y la densidad relativa a 20 C se determinan en la muestra problema: bien por picnometra: mtodo de referencia, bien por densimetra con balanza hidrosttica o por densimetra electrnica. Nota: En determinaciones muy precisas, debe corregirse la accin del dixido de azufre sobre la densidad absoluta: 20 C = 20 C 0,0006 S 20 C = densidad absoluta corregida 20 C = densidad absoluta observada S 3. = dixido de azufre total en g/l
TRATAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA Si el vino o el mosto contiene cantidades importantes de dixido de carbono, eliminar la mayor cantidad posible de este agitando 250 ml de vino en un frasco de 1 000 ml o filtrando a baja presin sobre 2 g de algodn colocado en una alargadera.
4. 4.1.
MTODO DE REFERENCIA Material Material corriente de laboratorio, y en particular:
4.1.1.
Picnmetro (1), de vidrio pyrex, con una capacidad de 100 ml aproximadamente y termmetro mvil esme rilado, graduado en dcimas de grado, de 10 a 30 C. Este termmetro debe estar contrastado (figura 1).
Figura 1 Picnmetro y su frasco tara Este picnmetro lleva un tubo lateral de 25 mm de longitud y 1 mm, como mximo, de dimetro interior, terminado en una parte cnica esmerilada. El tubo lateral puede estar cubierto por un tapn receptor constituido por un tubo cnico esmerilado terminado en una parte alargada. Dicho tapn sirve de cmara de dilatacin.
(1) Puede utilizarse cualquier picnmetro de caractersticas equivalentes.
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Las dos partes esmeriladas del aparato deben estar realizadas con gran cuidado. 4.1.2. Frasco tara, del mismo volumen exterior (con una precisin superior a 1 ml) que el picnmetro y de masa igual a la del picnmetro lleno de lquido de densidad 1,01 (solucin al 2 % (m/v) de cloruro sdico). Recipiente termosttico que se ajuste exactamente al cuerpo del picnmetro. 4.1.3. Balanza de dos platos de una capacidad de 300 g por lo menos y una sensibilidad de una dcima de miligramo o balanza monoplato de una capacidad de 200 g por lo menos y una sensibilidad de una dcima de miligramo. 4.2. Calibrado del picnmetro El calibrado del picnmetro supone la determinacin de las caractersticas siguientes: la tara en vaco, el volumen a 20 C, la masa del agua a 20 C. 4.2.1. Utilizacin de una balanza de dos platos Poner el frasco tara en el plato izquierdo de la balanza y el picnmetro limpio, seco y con su tapn receptor en el plato derecho, equilibrar colocando al lado del picnmetro pesas marcadas (sea su masa p gramos). Llenar con cuidado el picnmetro con agua destilada a temperatura ambiente y colocar el termmetro; secar cuidadosamente el picnmetro y colocarlo dentro del recipiente termosttico; agitar por inversin hasta que el termmetro seale una temperatura constante. Enrasar exactamente hasta el borde superior del tubo lateral. Secar dicho tubo, colocar el tapn receptor; leer la temperatura t C con cuidado y, en su caso, corregir la inexactitud de la escala del termmetro. Pesar el picnmetro lleno de agua; se denominar p' a la masa en gramos con la que se consigue el equilibrio. Clculos Tara del picnmetro vaco: Tara en vaco= p + m m= masa de aire contenida en el picnmetro m= 0,0012 (p p) Volumen a 20 C: V20 C= (p + m p) Ft Ft= factor tomado de la tabla I para la temperatura t C V20 C debe conocerse con una aproximacin de 0,001 ml. Masa de agua a 20 C: M20 C= V20 C 0,998203 0,998203= densidad absoluta del agua a 20 C. 4.2.2. Utilizacin de una balanza monoplato Determinar: la masa del picnmetro limpio y seco: P la masa del picnmetro lleno de agua a t C: P1, siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1, la masa del frasco tara T0.
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Clculos Tara del picnmetro vaco: Tara en vaco= P m m = masa de aire contenida en el picnmetro m= 0,0012 (P1 P) Volumen a 20 C: V20 C= [P1 (P m)] Ft Ft= factor tomado de la tabla I para la temperatura t C. El volumen a 20 C debe conocerse con una precisin de 0,001 ml. Masa de agua a 20 C: M20 C= V20
C
0,998203
0,998203 = densidad absoluta del agua a 20 C. 4.3. 4.3.1. Tcnica de una medida Utilizacin de una balanza de dos platos Pesar el picnmetro lleno con la muestra problema preparada (punto 3) siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1. Sea p la masa en gramos con la que se consigue el equilibrio a t C. Masa del lquido contenido en el picnmetro = p + m p. Densidad absoluta aparente a t C: t C = (p + m p)/V20 C Calcular la densidad absoluta a 20 C utilizando una de las tablas de correccin que figuran a continuacin, en funcin de la naturaleza del lquido estudiado: vino seco (tabla II), mosto natural o concentrado (tabla III), vino dulce (tabla IV). La densidad 20 C/20 C del vino se expresa dividiendo la densidad absoluta a 20 C por 0,998203. 4.3.2. Utilizacin de una balanza monoplato Pesar el frasco tara; sea su masa T1. Calcular dT = T1 T0 Masa del picnmetro vaco en el momento de la medida = P m + dT Pesar el picnmetro lleno con la muestra problema preparada (punto 3) siguiendo las indicaciones que figuran en el punto 4.2.1. Sea P2 su masa a t C. Masa del lquido contenido en el picnmetro a t C = P2 (P m + dT) Densidad absoluta aparente a t C: t
C
= (P2 (P m + dT))/V20 C
Calcular la densidad absoluta a 20 C del lquido estudiado: vino seco, mosto natural o concentrado y vino dulce, tal como se indica en el punto 4.3.1. La densidad 20 C/20 C se obtiene dividiendo la densidad absoluta a 20 C por 0,998203. 4.3.3. Repetibilidad de la densidad absoluta: para los vinos secos y semisecos: r = 0,00010 para los vinos dulces: r = 0,00018 4.3.4. Reproducibilidad de la densidad absoluta: para los vinos secos y semisecos: R = 0,00037 para los vinos dulces: R = 0,00045
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TABLA I Factores F por los que hay que multiplicar la masa del agua contenida en el picnmetro de vidrio pyrex a t C para calcular el volumen del picnmetro a 20 C [Remitirse a la tabla I del anexo II del mtodo AS2 - 01 descrito en el Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV] TABLA II Correcciones c de temperatura sobre la densidad absoluta de vinos secos y de vinos secos de los que se ha eliminado el alcohol, medida en un picnmetro de vidrio pyrex a t C para referir el resultado a 20 C [Remitirse a la tabla II del anexo II del mtodo AS2 - 01 descrito en el Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV] 20 = t (c/1 000) si t C es inferior a 20 C + si t C es superior a 20 C
TABLA III Correcciones c de temperatura sobre la densidad absoluta de mostos naturales y concentrados, medida a t C mediante un picnmetro de vidrio pyrex, para referir el resultado a 20 C [Remitirse a la tabla III del anexo II del mtodo AS2 - 01 descrito en el Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV] 20 = t (c/1 000) si t C es inferior a 20 C + si t C es superior a 20 C
TABLA IV Correcciones c de temperatura sobre la densidad absoluta de vinos de 13 % vol. o ms que contengan azcar residual, medida con un picnmetro de vidrio pyrex a t C para referir el resultado a 20 C [Remitirse a la tabla IV del anexo II del mtodo AS2 - 01 descrito en el Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV] 20 = t (c/1 000) si t C es inferior a 20 C + si t C es superior a 20 C
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2 EVALUACIN MEDIANTE REFRACTOMERA DEL CONTENIDO EN AZCARES DE MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS Y MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV - AS2 - 02-SUCREF) MTODO DE TIPO I 1. PRINCIPIO DEL MTODO El ndice de refraccin a 20 C, expresado de modo absoluto o como porcentaje en masa de sacarosa, se lleva a la tabla correspondiente para obtener el contenido en azcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo de mosto, mosto concentrado y mosto concentrado rectificado. 2. 2.1. MATERIAL Refractmetro de tipo Abb El refractmetro utilizado deber estar provisto de una escala que indique: el porcentaje en masa de sacarosa, con precisin de 0,1 %, o bien el ndice de refraccin con cuatro decimales. El refractmetro deber estar provisto de un termmetro, cuya escala estar graduada como mnimo de + 15 C a + 25 C, y de un dispositivo de circulacin de agua que permita realizar las mediciones a una temperatura de 20 C 5 C. Debern seguirse estrictamente las instrucciones sobre el manejo de este instrumento, en particular las con cernientes al calibrado y a la fuente luminosa. 3. 3.1. PREPARACIN DE LA MUESTRA Mostos y mostos concentrados Puede pasarse el mosto a travs de una gasa seca doblada en cuatro; tras haber eliminado las primeras gotas de filtrado, efectuar la determinacin con el producto filtrado. 3.2. Mostos concentrados rectificados Utilizar, segn su concentracin, el mosto concentrado rectificado o bien la solucin obtenida aadiendo agua a 200 g de mosto concentrado rectificado exactamente pesados hasta llegar a 500 g. 4. PROCEDIMIENTO Llevar la muestra a una temperatura prxima a 20 C. Colocar una pequea porcin de la muestra en el prisma inferior del refractmetro procurando que, estando los prismas en estrecho contacto entre s, aqulla cubra uniformemente la superficie del vidrio, y efectuar la medicin con arreglo a las instrucciones de manejo del aparato utilizado. Medir el porcentaje en masa de sacarosa con una precisin de 0,1 % o anotar el ndice de refraccin con cuatro decimales. Efectuar al menos dos determinaciones de cada muestra preparada. Anotar la temperatura t C. 5. 5.1. 5.1.1. 5.1.2. CLCULO Correccin de temperatura Aparatos graduados en porcentaje en masa de sacarosa. Utilizar la tabla I para la correccin de temperatura. Aparatos graduados en ndices de refraccin; llevar el ndice medido a t C a la tabla II para obtener (columna 1) el valor correspondiente del porcentaje en masa de sacarosa a t C. Mediante la tabla I se corregir este valor expresndolo a 20 C. Contenido en azcares de mostos y mostos concentrados Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 C a la tabla II para obtener el contenido en azcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo. El contenido en azcares se expresar en azcar invertido con un decimal. 5.3. Contenido en azcares de mosto concentrado rectificado Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 C a la tabla III para obtener el contenido en azcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo. El contenido en azcares se expresar en azcar invertido con un decimal. Si la medicin se ha efectuado con el mosto concentrado rectificado diluido, se multiplicar el resultado por el factor de dilucin. 5.4. ndice de refraccin de mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 C a la tabla II para obtener el ndice de refraccin a 20 C. Este ndice se expresar con cuatro decimales. Nota: El grado alcohlico volumtrico en potencia de mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados puede determinarse utilizando el cuadro de correspondencias que figura en el anexo I del Reglamento (CE) no 1623/2000 de la Comisin, de 25 de julio de 2000 (DO L 194 de 31.7.2000).
5.2.
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TABLA I Correccin que deber efectuarse cuando el porcentaje en masa de sacarosa se determine a una temperatura diferente de 20 C [Remitirse a la tabla I del anexo del mtodo AS2 - 02 descrito en el Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV] TABLA II Tabla del contenido en azcar, en gramos por litro y en gramos por kilogramo, de mostos y mostos concentrados, determinado mediante un refractmetro graduado bien en porcentaje en masa de sacarosa a 20 C o bien en ndice de refraccin a 20 C. Tambin se indica la densidad absoluta a 20 C. [Remitirse a la tabla II del anexo del mtodo AS2 - 02 descrito en el Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV] TABLA III Tabla del contenido en azcar, en gramos por litro y en gramos por kilogramo, de mostos concentrados rectificados, determinado mediante un refractmetro graduado en porcentaje en masa de sacarosa a 20 C o en ndice de refraccin a 20 C. Tambin se indica la densidad absoluta a 20 C. [Remitirse a la tabla III del anexo del mtodo AS2 - 02 descrito en el Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV]
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3 EXTRACTO SECO TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) MATERIAS SECAS TOTALES MTODO DE TIPO I 1. DEFINICIN El extracto seco total o materias secas totales es el conjunto de todas las substancias que no se volatilizan en determinadas condiciones fsicas. Estas condiciones fsicas deben establecerse de tal forma que las substancias que componen el extracto sufran el mnimo de alteraciones. El extracto no reductor es el extracto seco total menos los azcares totales. El extracto reducido es el extracto seco total menos los azcares totales que excedan de 1 g/l, el sulfato potsico que exceda de 1 g/l, el manitol, si lo hubiere, y todas las substancias qumicas que se puedan haber aadido al vino. El resto del extracto es el extracto no reductor menos la acidez fija expresada en cido tartrico. El extracto se expresa en gramos por litro y debe determinarse con una precisin de 0,5 g. 2. PRINCIPIO DEL MTODO [La descripcin de este mtodo de anlisis est siendo objeto de actualizacin por parte de las instancias de la OIV. Esta descripcin se publicar en una prxima Comunicacin de la Comisin en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edicin 2010 del Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV. A ttulo indicativo, a la espera de dicha publicacin, cabe remitirse al captulo 4 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisin.]
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4 DETERMINACIN DE LA RELACIN ISOTPICA 18O/16O DEL AGUA DEL VINO (OIV-AS-2-09-MOUO18) MTODO DE TIPO II (p.m.) [La descripcin de este mtodo de anlisis est siendo objeto de actualizacin por parte de las instancias de la OIV. Esta descripcin se publicar en una prxima Comunicacin de la Comisin en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edicin 2010 del Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV. A ttulo indicativo, a la espera de dicha publicacin, cabe remitirse al captulo 43 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisin.]
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5 NDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) MTODO DE TIPO IV 1. DEFINICIN El ndice de Folin-Ciocalteu es el resultado de la aplicacin del mtodo que se describe a continuacin. 2. PRINCIPIO El conjunto de los compuestos fenlicos del vino se oxida con el reactivo de Folin-Ciocalteu. Este ltimo est constituido por una mezcla de cido fosfotngstico (H3PW12O40) y cido fosfomolbdico (H3PMo12O40) que se reduce, en la oxidacin de los fenoles, a una mezcla de xidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23). La coloracin azul producida posee una absorcin mxima en torno a 750 nm y es proporcional al porcentaje de compuestos fenlicos. 3. REACTIVOS Los reactivos deben ser de calidad analtica. El agua utilizada ser agua destilada o agua de pureza equivalente. 3.1. Reactivo de Folin-Ciocalteu Este reactivo se encuentra en el comercio listo para su empleo. Puede prepararse de la forma siguiente: disolver en 700 ml de agua destilada 100 g de tungstato de sodio (Na2WO42 H2O) y 25 g de molibdato de sodio (Na2MoO42 H2O); aadir 50 ml de cido fosfrico al 85 % (20 = 1,71 g/ml) y 100 ml de cido clorhdrico concentrado (20 = 1,19 g/ml). Llevar a ebullicin bajo reflujo durante 10 horas, aadir a continuacin 150 g de sulfato de litio (Li2SO4H2O), algunas gotas de bromo y hervir de nuevo durante 15 minutos. Enfriar y completar hasta 1 litro con agua destilada. 3.2. 4. Carbonato de sodio (Na2CO3) anhidro en solucin al 20 % (m/v). MATERIAL Material corriente de laboratorio, y en particular: 4.1. 4.2. 5. 5.1. Matraces aforados de 100 ml. Espectrofotmetro que permita trabajar a 750 nm. PROCEDIMIENTO Vinos tintos En un matraz aforado de 100 ml (punto 4.1), introducir respetando el orden siguiente: 1 ml de vino diluido al 1/5, 50 ml de agua destilada, 5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu (punto 3.1), 20 ml de solucin de carbonato de sodio (punto 3.2). Enrasar a 100 ml con agua destilada. Agitar para homogeneizar. Esperar 30 minutos, para que se estabilice la reaccin. Determinar la absorbancia a 750 nm en una cubeta de 1 cm con relacin a un testigo preparado con agua destilada en lugar del vino. Si la absorbancia leda no est prxima a 0,3, conviene modificar la dilucin del vino. 5.2. Vinos blancos Operar de la misma forma con 1 ml de vino sin diluir. 5.3. 5.3.1. Mostos concentrados rectificados Preparacin de la muestra Utilizar una solucin cuyo contenido en azcares sea del 25 % (m/m) (25 Brix), preparada del modo indicado en el captulo pH (punto 4.1.2).
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5.3.2.
Medida Proceder como en el caso de los vinos tintos (punto 5.1) con 5 ml de muestra preparada de acuerdo con el punto 5.3.1, midiendo la absorbancia en relacin con un testigo preparado con 5 ml de solucin de azcar invertido al 25 % (m/m).
6. 6.1.
EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Modo de clculo El resultado se expresa en forma de ndice obtenido al multiplicar la absorbancia por 100 en el caso de los vinos tintos diluidos al 1/5 (o por el factor correspondiente a la dilucin empleada) y por 20 en el caso de los vinos blancos. En el caso de los mostos concentrados rectificados, la absorbancia hay que multiplicarla por 16.
6.2.
Repetibilidad La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultneamente o inmediatamente una despus de otra por el mismo analista no debe ser superior a 1. La buena repetibilidad de los resultados depende de la utilizacin de un material (matraces aforados y cubetas del espectrofotmetro) rigurosamente limpio.
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6 GLUCOSA Y FRUCTOSA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) MTODO DE TIPO II 1. DEFINICIN La glucosa y la fructosa pueden determinarse por separado mediante un mtodo enzimtico, con vistas nicamente a calcular la relacin glucosa/fructosa. 2. PRINCIPIO Se fosforilan la glucosa y la fructosa con adenosina-trifostato (ATP) mediante una reaccin enzimtica cata lizada por la hexocinasa (HK), dando como resultado glucosa-6-fosfato (G6P) y fructosa-6-fosfato (F6P): glucosa + ATP G6P + ADP fructosa + ATP F6P + ADP En un primer momento, el glucosa-6-fosfato se oxida a gluconato-6-fosfato mediante el nicotinamida-adeninadinucletido-fosfato (NADP) en presencia de la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH). La cantidad de nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato reducido (NADPH) que se origina corresponde a la cantidad de glucosa-6-fosfato y, por lo tanto, a la de glucosa: G6P + NADP+ gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ El nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato reducido se determina por su absorcin a 340 nm. Una vez finalizada esta reaccin, el fructosa-6-fosfato se transforma en glucosa-6-fosfato por la accin de la fosfoglucosa-isomerasa (PGI): F6PG6P El glucosa-6-fosfato reacciona nuevamente con el nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato para dar gluco nato-6-fosfato y nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato reducido, que es el que se determina. 3. MATERIAL Espectrofotmetro que permita efectuar medidas a 340 nm, mximo de absorcin del NADPH. Por tratarse de medidas absolutas (no existe curva de calibrado, sino referencia al coeficiente de extincin del NADPH), deben controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato. En su defecto, utilizar un espectrofotmetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o 365 nm. Cubetas de vidrio o cubetas desechables de 1 cm de camino ptico. Pipetas para ensayos enzimticos de 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 ml. 4. 4.1. REACTIVOS Solucin 1: Amortiguador (trietanolamina 0,3 M; pH = 7,6; 4 x 10-3 M en Mg2+): disolver 11,2 g de clorhidrato de trietanolamina ((C2H5)3NHC1) y 0,2 g de MgSO4 7 H2O en 150 ml de agua bidestilada; aadir alrededor de 4 ml de solucin 5 M de hidrxido sdico (NaOH) para obtener un pH igual a 7,6 y llevar a 200 ml. Esta solucin amortiguadora se conserva 4 semanas a + 4 C. 4.2. Solucin 2: Solucin de nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato (11,5 x 103 M aproximadamente): disolver 50 mg de nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato disdico en 5 ml de agua bidestilada. Esta solucin se conserva 4 semanas a + 4 C. 4.3. Solucin 3: Solucin de adenosina-5-trifosfato (81 x 103 M, aproximadamente): disolver 250 mg de adenosina-5-trifosfato disdico y 250 mg de hidrogenocarbonato sdico (NaHCO3) en 5 ml de agua bides tilada. Esta solucin se conserva 4 semanas a + 4 C. 4.4. Solucin 4: Hexocinasa/glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa: mezclar 0,5 ml de hexocinasa (2 mg de protena/ml, es decir 280 U/ml) y 0,5 ml de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (1 mg de protena/ml). Esta solucin se conserva un ao a + 4 C.
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4.5.
Solucin 5: Fosfoglucosa-isomerasa (2 mg de protena/ml, es decir 700 U/ml). La suspensin se utiliza sin dilucin. Esta solucin se conserva un ao a + 4 C. Observacin: El conjunto de reactivos necesarios para esta determinacin se comercializa ya preparado.
5. 5.1.
PROCEDIMIENTO Preparacin de la muestra En funcin de la cantidad estimada de glucosa + fructosa por litro, efectuar las diluciones siguientes:
Medida a 340 nm y 334 nm Medida a 365 nm Dilucin con agua Factor F de dilucin
Hasta 0,4 g/l Hasta 4,0 g/l Hasta 10,0 g/l Hasta 20,0 g/l Hasta 40,0 g/l Por encima de 40,0 g/l 5.2. Determinacin
Hasta 0,8 g/l Hasta 8,0 g/l Hasta 20,0 g/l Hasta 40,0 g/l Hasta 80,0 g/l Por encima de 80,0 g/l
1 + 9 1 + 24 1 + 49 1 + 99 1 + 999
10 25 50 100 1 000
Regulando el espectrofotmetro a la longitud de onda de 340 nm, efectuar las medidas con respecto al aire (sin cubeta en el camino ptico) o con respecto al agua. Temperatura de 20 a 25 C. En dos cubetas de 1 cm de camino ptico, introducir:
Testigo Determinacin
Solucin 1 (4.1) (a 20 C) Solucin 2 (4.2) Solucin 3 (4.3) Muestra problema Agua bidestilada
2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml
2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml 0,20 ml
0,20 ml
Mezclar y, transcurridos 3 min. aproximadamente, leer la absorbancia de las soluciones (A1). Desencadenar la reaccin, aadiendo: Solucin 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml
Mezclar; esperar 15 min.; medir la absorbancia y verificar el cese de la reaccin cuando hayan pasado 2 min. (A2). Inmediatamente despus, aadir: Solucin 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml
Mezclar; leer al cabo de 10 min.; comprobar el cese de la reaccin despus de 2 min. (A3). Determinar las diferencias de absorbancia: A2 A1 correspondiente a la glucosa, A3 A2 correspondiente a la fructosa, tanto en relacin con el testigo como con la determinacin.
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Deducir la diferencia de absorbancia del testigo (AT) y la de la muestra (AM) y establecer: para la glucosa: AG = AM AT para la fructosa: AF = AM AT Observacin: El tiempo necesario para la accin de las enzimas puede variar de un lote a otro. Aqu solo se ha dado a ttulo indicativo. Se recomienda determinarlo con cada lote. 5.3. 5.3.1. Expresin de los resultados Clculo La frmula general para el clculo de las concentraciones es la siguiente: C = ((V x PM)/( d v 1 000)) A (g/l) V = volumen contenido en la cubeta (ml) v = volumen de la muestra (ml) PM = masa molecular de la sustancia que va a determinarse d = camino ptico de la cubeta (cm) = coeficiente de absorcin del NADPH a 340 nm = 6,3 (mmol1 l cm1) V = 2,92 ml para la determinacin de la glucosa V = 2,94 ml para la determinacin de la fructosa v = 0,20 ml PM = 180 d = 1. Se obtiene: para la glucosa: C (g/l) = 0,417 AG para la fructosa: C (g/l) = 0,420 AF Si al preparar la muestra se ha efectuado una dilucin, multiplicar el resultado por el factor F. Observacin: Si las medidas se han tomado a longitudes de onda de 334 o 365 nm, se obtiene: medida a 334 nm: = 6,2 (mmol1 l cm1) para la glucosa: C (g/l) = 0,425 AG para la fructosa: C (g/l) = 0,428 AF medida a 365 nm: = 3,4 (mmol1 l cm1) para la glucosa: C (g/l) = 0,773 AG para la fructosa: C (g/l) = 0,778 AF 5.3.2. Repetibilidad (r) r = 0,056 xi 5.3.3. Reproducibilidad (R) R = 0,12 + 0,076 xi xi = contenido en glucosa o fructosa en gramos por litro.
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7 DETERMINACIN DE AZCARES POR HPLC (SACAROSA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) MTODO DE TIPO II (p.m.) [La descripcin de este mtodo de anlisis est siendo objeto de actualizacin por parte de las instancias de la OIV. Esta descripcin se publicar en una prxima Comunicacin de la Comisin en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edicin 2010 del Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV. A ttulo indicativo, a la espera de dicha publicacin, cabe remitirse al captulo 6, punto 3, del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisin.]
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8 DETECCIN DEL AUMENTO DEL GRADO ALCOHLICO NATURAL DE MOSTOS DE UVA, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS Y DE VINOS POR APLICACIN DE LA RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DEL DEUTERIO (OIV-AS-311-05-ENRRMN) MTODO DE TIPO I (p.m.) [La descripcin de este mtodo de anlisis est siendo objeto de reexamen por parte de las instancias cientficas de la OIV. Esta descripcin se publicar en una Comunicacin de la Comisin en cuanto la Asamblea General de la OIV haya adoptado un texto definitivo. A ttulo indicativo, a la espera de dicha decisin de la OIV, cabe remitirse al captulo 8 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisin.]
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9 GRADO ALCOHLICO VOLUMTRICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) MTODOS DE TIPO I (p.m.) [Las descripciones de estos mtodos de anlisis estn siendo objeto de actualizacin por parte de las instancias de la OIV. Se publicarn en una prxima Comunicacin de la Comisin en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edicin 2010 del Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV. A ttulo indicativo, a la espera de dicha publicacin de la OIV, cabe remitirse al captulo 3 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisin.]
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10 DETERMINACIN DE LA RELACIN ISOTPICA 13C/12C POR ESPECTROMETRA DE MASA ISOTPICA DEL ETANOL DEL VINO O DEL ETANOL OBTENIDO POR FERMENTACIN DE MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS O MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06-ETHANO) MTODO DE TIPO II 1. MBITO DE APLICACIN El mtodo permite la medicin de la relacin isotpica 13C/12C del etanol del vino y del etanol obtenido por fermentacin de productos derivados de la vid (mosto, mosto concentrado, mosto concentrado rectificado). 2. REFERENCIAS NORMATIVAS ISO: 5725:1994 Fidelidad de los mtodos de ensayo: Determinacin de la repetibilidad y de la reproducibilidad de un mtodo de ensayo normali zado por ensayos interlaboratorios. Belemnita de Viena Pee-Dee (RPDB = 0,0112372).
V-PDB:
Mtodo OIV AS-311-O5-ENRRMN Deteccin del aumento del grado alcohlico natural de mostos, mostos concentrados, mostos concentrados rectificados y vinos por aplicacin de la resonancia magntica nuclear del deuterio (FINE-RMN) 3. TERMINOLOGA Y DEFINICIONES
13C/12C:
Relacin de los istopos del carbono 13 (13C) y 12 (12C) en una muestra dada. Contenido en carbono 13 (13C) expresado en partes por mil (). Fraccionamiento isotpico natural especfico estudiado por resonancia magntica nuclear. Belemnita de Viena Pee-Dee. La PDB, referencia primaria para la medicin de las variaciones naturales de los contenidos isotpicos en carbono 13, era un carbonato de calcio procedente de un rostro de belemnita del Cretcico, de la formacin Pee-Dee de Carolina del Sur (EE.UU.). Su relacin isotpica 13C/12C o RPDB es RPDB = 0,0112372. La PDB est agotada desde hace mucho tiempo, pero sigue siendo la referencia pri maria para expresar las variaciones naturales de los contenidos isotpicos en carbono 13, frente a la que se calibran los materiales de referencia, disponibles en el Organismo Internacional de la Energa Atmica (OIEA) de Viena (Austria). Las determinaciones isotpicas de la presencia natural de carbono 13 se expresan entonces, por convencin, respecto a la VPDB. Relacin masa/carga.
13C: FINE-RMN:
V-PDB:
m/z: 4. PRINCIPIO
En la fotosntesis, la asimilacin del gas carbnico por los vegetales se efecta segn dos tipos principales de metabolismo, que son los metabolismos C3 (ciclo de Calvin) y C4 (Hatch y Slack). Estos dos mecanismos de fotosntesis presentan un fraccionamiento isotpico diferente. De esta manera, los productos de las plantas, como los azcares y el alcohol obtenido por su fermentacin, presentan contenidos en carbono 13 ms elevados si proceden de plantas C4 que si proceden de plantas C3. La mayora de los vegetales, como la vid y la remolacha, pertenecen al grupo C3, mientras que la caa de azcar y el maz pertenecen al grupo C4. La medicin del contenido en carbono 13 permite, as pues, la deteccin y evaluacin del azcar de origen C4 (azcar de caa o isoglucosa de maz) aadido a los productos derivados de la uva (mostos de uva, vinos, etc.). La combinacin de la informacin sobre el contenido en carbono 13 con la obtenida mediante FINE-RMN permite igualmente la cuantificacin de la adicin de mezclas de azcares o de alcoholes procedentes de plantas C3 y C4. El contenido en carbono 13 se determina en el gas carbnico resultante de la combustin completa de la muestra. La concentracin de los principales isotopmeros de masa 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 y 12C17O16O) y 46 (12C16O18O), resultado de las diferentes combinaciones posibles de los istopos 18O, 17O, 16O, 13C y 12C, se determina a partir de las corrientes inicas medidas en tres colectores diferentes de un espectrmetro de masa de relacin isotpica. Las aportaciones de los isotopmeros 13C17O16O y 12C17O2 pueden despreciarse debido a su escassima proporcin. La corriente inica correspondiente a m/z = 45 se corrige para tener en
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cuenta la aportacin de 12C17O16O, que se calcula en funcin de la intensidad de la corriente medida correspondiente a m/z = 46, considerando las concentraciones relativas de 18O y 17O (correccin de Craig). La comparacin con una referencia calibrada frente a la referencia internacional V-PDB permite calcular el contenido en carbono 13 en la escala relativa de 13C. 5. REACTIVOS Las sustancias y los materiales fungibles dependen del equipo (6) utilizado por el laboratorio. Los sistemas generalmente utilizados se basan en el analizador elemental. Este puede estar diseado para la introduccin de muestras colocadas en cpsulas metlicas hermticamente cerradas, o para la inyeccin de muestras lquidas a travs de una membrana mediante una jeringa. Segn el tipo de instrumentacin utilizado, pueden utilizarse las siguientes sustancias de referencia, reactivos y materiales fungibles: Sustancias de referencia disponibles en el OIEA:
Nombre Material 13C frente a V-PDB (9)
IAEA-CH-6 IAEA-CH-7 NBS22 USGS24
sacarosa polietileno aceite grafito
10,4 31,8 29,7 16,1
disponibles en el IRMM (Instituto de Materiales y Medidas de Referencia) de Geel (B):

Nombre Material 13C frente a V-PDB (9)
CRM/BCR 656 CRM/BCR 657 CRM/BCR 660
alcohol de vino glucosa solucin hidroalcohlica (gradua cin alcohlica 12 % vol.)

13C/12C
26,93 10,75 26,72
Muestra patrn de trabajo con una relacin internacionales.
conocida, calibrada frente a materiales de referencia
La lista indicativa de materiales fungibles que figura a continuacin corresponde a los sistemas de flujo continuo: helio para anlisis (CAS 07440-59-7), oxgeno para anlisis (CAS 07440-44-7), dixido de carbono para anlisis, utilizado como gas de referencia secundaria del contenido en carbono 13 (CAS 00124-38-9), reactivo de oxidacin para el horno del sistema de combustin, como por ejemplo xido de cobre (II) para anlisis elemental (CAS 1317-38-0), desecante para eliminar el agua producida por la combustin, por ejemplo anhidrona para anlisis elemental (perclorato de magnesio) (CAS 10034-81-8) (innecesario en los equipos dotados de un sistema de eliminacin del agua por separacin mediante el fro o mediante un capilar con permea bilidad selectiva). 6. 6.1. EQUIPO Y MATERIAL Espectrmetro de masa de relacin isotpica (EMRI) Espectrmetro de masa de relacin isotpica (EMRI), que permita determinar el contenido natural relativo en del gas CO2 con una precisin interna del 0,05 o mejor, expresado en valor relativo (punto 9). La precisin interna se define aqu como la diferencia entre dos medidas de la misma muestra de CO2. El espectrmetro de masa, destinado a la medicin de relaciones isotpicas, est equipado generalmente con un colector triple para medir simultneamente las intensidades correspondientes a m/z = 44, 45 y 46. El espectrmetro de masa de relacin isotpica debe estar equipado con un sistema de introduccin doble para medir en alternancia la muestra problema y una muestra de referencia, o bien utilizar un sistema integrado que efecte la combustin cuantitativa de las muestras y separe el dixido de carbono de los dems productos de combustin antes de la medicin en el espectrmetro de masa.
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6.2.
Equipo de combustin Equipo de combustin capaz de convertir cuantitativamente el etanol en dixido de carbono y de eliminar todos los dems productos de combustin, incluida el agua, sin ningn fraccionamiento isotpico. El equipo puede ser un sistema de flujo continuo integrado en la instrumentacin de espectrometra de masa (punto 6.2.1), o bien un sistema autnomo de combustin (punto 6.2.2). El equipo debe permitir la obtencin de una precisin al menos equivalente a la indicada en el punto 11.
6.2.1.
Sistemas de flujo continuo Estn constituidos por un analizador elemental o por un cromatgrafo de gases dotado de un sistema de combustin en lnea. En caso de sistemas equipados para la introduccin de muestras contenidas en cpsulas metlicas, se utiliza el material de laboratorio siguiente: microjeringa o micropipeta aforada con puntas apropiadas, balanza con escala de lectura de 1 g al menos, pinzas para encapsular, cpsulas de estao para muestras lquidas, cpsulas de estao para muestras slidas. Nota: A fin de limitar los riesgos de evaporacin de las muestras de etanol, es posible poner en las cpsulas un material absorbente (por ejemplo, chromosorb W 45-60 mesh) del cual se habr comprobado previamente, mediante un ensayo en blanco, que no lleva ninguna cantidad significativa de carbono que pueda alterar los resultados. Si se emplea un analizador elemental dotado de inyector para lquidos o en caso de sistema de preparacin por cromatografa-combustin, se utiliza el material de laboratorio siguiente: jeringa para lquidos, frascos provistos de cierres estancos y de membranas inertes. Los materiales de laboratorio indicados en las listas anteriores se dan a ttulo de ejemplo y pueden sustituirse por otros materiales de caractersticas equivalentes segn el tipo de equipo de combustin y de espectrometra de masa utilizado por el laboratorio.
6.2.2.
Sistemas autnomos de preparacin En este caso, las muestras de dixido de carbono procedentes de la combustin de las muestras problema y de referencia se recogen en ampollas que se instalan a continuacin en el doble sistema de entrada del espec trmetro para efectuar el anlisis isotpico. Pueden utilizarse varios tipos de equipos de combustin descritos en la bibliografa: sistema cerrado de combustin llenado con gas oxgeno circulante, analizador elemental con flujo de helio y de oxgeno, ampolla sellada, de cristal, rellena de xido de cobre (II) como agente de oxidacin.
7.
PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PROBLEMA El etanol debe extraerse del vino antes de la determinacin isotpica. Esta extraccin se efecta mediante destilacin del vino, como se describe en el punto 3.1 del mtodo de FINE-RMN (OIV - MA-E-AS311-05ENRRMN). Cuando se trate de mosto de uva, de mosto de uva concentrado y de mosto de uva concentrado rectificado, los azcares deben fermentarse en primer lugar para convertirse en etanol, como se describe en el punto 3.2 del mtodo de FINE-RMN (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).
8.
PROCEDIMIENTO Todas las etapas preparatorias deben efectuarse evitando que se pierda por evaporacin cualquier cantidad significativa de etanol, lo que podra cambiar la composicin isotpica de la muestra.
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La descripcin que figura a continuacin hace referencia a los procedimientos utilizados generalmente para la combustin de muestras de etanol por medio de sistemas automatizados de combustin presentes en el comercio. Para la preparacin del dixido de carbono a fines de anlisis isotpico pueden convenir otros mtodos, siempre que garanticen que la muestra de etanol se convierte cuantitativamente en dixido de carbono, sin ninguna prdida de etanol por evaporacin. Procedimiento experimental basado en la utilizacin de un analizador elemental: a) Encapsulado de las muestras: utilizar cpsulas, pinzas y placa de preparacin limpias, con ayuda de las pinzas, tomar una cpsula de dimensiones apropiadas, introducir el volumen necesario de lquido en la cpsula mediante la micropipeta, Nota: Para obtener 2 mg de carbono hacen falta 3,84 mg de etanol absoluto o 4,17 mg de destilado con un grado alcohlico de 92 % m/m. Debe calcularse de la misma manera la cantidad adecuada de destilado segn la cantidad de carbono necesaria en funcin de la sensibilidad del equipo de espectrometra de masa. cerrar la cpsula con ayuda de las pinzas, cada cpsula debe cerrarse de forma totalmente hermtica; en caso contrario, hay que eliminar la cpsula defectuosa y preparar una nueva, preparar dos cpsulas de cada muestra, poner las cpsulas en el lugar adecuado sobre la placa del introductor automtico de muestras del analizador elemental; cada cpsula debe identificarse cuidadosamente con un nmero de orden, poner sistemticamente cpsulas que contengan referencias de trabajo al principio y al final de la serie de muestras, introducir regularmente muestras de control en la serie de muestras. b) Control y ajuste del equipo de anlisis elemental y de espectrometra de masa: ajustar la temperatura de los hornos del analizador elemental y los flujos de gas de helio y de oxgeno para una combustin ptima de la muestra, verificar la ausencia de fugas en el sistema de anlisis elemental y de espectrometra de masa (por ejemplo, controlando la corriente inica de m/z = 28, correspondiente al N2), ajustar el espectrmetro de masa para medir las intensidades de las corrientes inicas correspondientes a m/z = 44, 45 y 46, verificar el sistema con ayuda de muestras de control conocidas antes de comenzar las mediciones de las muestras. c) Desarrollo de una serie de mediciones: Se introducen sucesivamente las muestras situadas en el introductor automtico de muestras del analizador elemental (o del cromatgrafo). El dixido de carbono de cada combustin de una muestra se eluye hacia el espectrmetro de masa que mide las corrientes inicas. El ordenador acoplado al equipo registra las intensidades de corriente inica y calcula los valores correspondientes a cada muestra (punto 9). 9. CLCULO El objetivo del mtodo consiste en medir la relacin isotpica 13C/12C del etanol extrado a partir del vino o a partir de productos derivados de la uva previa fermentacin. La relacin isotpica 13C/12C puede expresarse mediante su desviacin respecto a una referencia de trabajo. La desviacin isotpica del carbono 13 (13C) se calcula entonces en una escala delta por mil (/1 000) comparando los resultados obtenidos con la muestra problema frente a los de la referencia de trabajo, calibrada anteriormente respecto a la referencia primaria internacional (V-PDB). Los valores 13C se expresan respecto a la referencia de trabajo segn la frmula siguiente:
13C muest/ref
= 1 000 (Rmuest-Rref)/Rref
13C/12C
donde Rmuest y Rref son, respectivamente, las relaciones isotpicas carbono utilizado como gas de referencia.
de la muestra y del dixido de
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Los valores 13C se expresan entonces respecto a la referencia V-PDB segn la frmula siguiente: 13Cmuest/V-PDB = 13Cmuest/ref + 13Cref/V-PDB + (13Cmuest/ref 13Cref/V-PDB)/1 000 donde 13Cref/V-PDB es la desviacin isotpica, determinada previamente, de la referencia de trabajo respecto al V-PDB. Durante la medicin en lnea, pueden observarse pequeas desviaciones debidas a la variacin de las condi ciones instrumentales. En este caso, las 13C de las muestras deben corregirse en funcin de la diferencia entre el valor 13C medido con la referencia de trabajo y su verdadero valor, calibrado previamente frente al V-PDB, comparando con uno de los materiales de referencia internacionales. Puede aceptarse que, entre dos mediciones de la referencia de trabajo, son lineales la desviacin y, por tanto, la correccin que debe aplicarse a los resultados de las muestras. La referencia de trabajo debe medirse al principio y al final de todas las series de muestras. Despus puede calcularse la correccin respecto a cada muestra por medio de una interpolacin lineal. 10. CONTROL Y GARANTA DE CALIDAD Controlar que el valor 13C de la referencia de trabajo no difiere en ms del 0,5 del valor admitido. En caso contrario, habr que controlar los ajustes del equipo de espectrometra y, eventualmente, proceder a un reajuste. Con cada muestra, verificar que la diferencia de resultados entre las dos cpsulas medidas sucesivamente es inferior al 0,3 . El resultado final correspondiente a una muestra dada es el valor medio de las dos cpsulas. Si la diferencia es superior al 0,3 , debe repetirse la medicin. El control de la correccin de la medicin puede basarse en la intensidad de la corriente inica correspondiente a m/z = 44, que es proporcional a la cantidad de carbono inyectado en el analizador elemental. En condiciones tpicas, la intensidad de esta corriente inica debera ser prcticamente constante con las muestras analizadas. Una desviacin significativa debe hacer sospechar una evaporacin de etanol (por ejemplo, en caso de cpsula mal sellada) o bien una inestabilidad del analizador elemental o del espectrmetro de masa. 11. CARACTERSTICAS DEL MTODO (PRECISIN) Se realiz un primer estudio en colaboracin (punto 11.1) con destilados de alcoholes de origen vnico, y de alcoholes de caa y de remolacha, as como diferentes mezclas de estos tres orgenes. Dado que dicho estudio no tena en cuenta la etapa de destilacin, se ha prestado atencin asimismo a datos complementarios procedentes de otros ensayos interlaboratorios realizados con vinos (punto 11.2) y, especialmente, de grupos de ensayos de aptitud (punto 11.3) para las mediciones isotpicas. Los resultados demuestran que los diferentes sistemas de destilacin utilizados en condiciones satisfactorias y, en particular, los aplicables en las mediciones FINE-RMN no introducen variabilidad significativa en las determinaciones de 13C del etanol del vino. Los parmetros de fidelidad observados respecto a los vinos son casi idnticos a los obtenidos en el estudio en colaboracin (punto 11.1) con los destilados. 11.1. Estudio en colaboracin sobre los destilados Ao del estudio interlaboratorios: 1996 Nmero de laboratorios: Nmero de muestras: Analito: 20 6 muestras con ocultacin doble 13C del etanol
Cdigo de las muestras
Alcohol de origen vnico
Alcohol de remolacha
Alcohol de caa
A & G B & C D & F E & I H & K J& L
80 % 90 % 0% 90 % 100 % 0%
10 % 10 % 100 % 0% 0% 0%
10 % 0% 0% 10 % 0% 100 %
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Muestras
A/G
B/C
D/F
E/I
H/K
J/L
Nmero de laboratorios seleccionados previa eliminacin de los resultados anmalos Nmero de resultados aceptados Valor medio (13C) Sr2 Desviacin tpica de la repetibilidad (Sr) Lmite de repetibilidad r (2,8 Sr) SR2 Desviacin tpica de la reproducibilidad (SR) Lmite de reproducibilidad R (2,8 SR)
19
18
17
19
19
19
38 25,32 0,0064 0,08 0,22 0,0389 0,20 0,55
36 26,75 0,0077 0,09 0,25 0,0309 0,18 0,49
34 27,79 0,0031 0,06 0,16 0,0382 0,20 0,55
38 25,26 0,0127 0,11 0,32 0,0459 0,21 0,60
38 26,63 0,0069 0,08 0,23 0,0316 0,18 0,50
38 12,54 0,0041 0,06 0,18 0,0584 0,24 0,68
11.2.
Estudio interlaboratorios con dos vinos y un alcohol Ao del estudio interlaboratorios: 1996 Nmero de laboratorios: 14 estudiaron la destilacin de los vinos, y 7 de ellos tambin efectuaron la medicin de 13C del etanol de los vinos 8 efectuaron la medicin de 13C de la muestra de alcohol 3 (vino blanco de graduacin 9,3 % vol., vino blanco de graduacin 9,6 % vol. y alcohol de graduacin 93 % m/m). 13C del etanol
Nmero de muestras: Analito:
Muestras
Vino tinto
Vino blanco
Alcohol
Nmero de laboratorios Nmero de resultados aceptados Valor medio (13C) Varianza de la reproducibilidad SR2 Desviacin tpica de la reproducibilidad (SR) Lmite de reproducibilidad R (2,8 SR)
7 7 26,20 0,0525 0,23 0,64
7 7 26,20 0,0740 0,27 0,76
8 8 25,08 0,0962 0,31 0,87
Los laboratorios participantes utilizaron diferentes sistemas de destilacin. Las determinaciones isotpicas de 13C realizadas en un solo laboratorio con el conjunto de los destilados devueltos por los participantes no mostraron ningn valor anmalo ni significativamente distinto de los valores medios. La varianza de los resultados (S2 = 0,0059) es comparable a las varianzas de la repetibilidad Sr2 del estudio en colaboracin sobre los destilados (punto 11.1). 11.3. Resultados de los ejercicios de los grupos de aptitud para los ensayos isotpicos Desde diciembre de 1994 se organizan regularmente ejercicios internacionales de aptitud para las determina ciones isotpicas de los vinos y alcoholes (destilados de graduacin 96 % vol.). Los resultados permiten a los laboratorios participantes controlar la calidad de sus anlisis. La explotacin estadstica de los resultados permite apreciar la variabilidad de las determinaciones en condiciones de reproducibilidad y, de esta manera, estimar los parmetros de varianza y de lmite de reproducibilidad. Los resultados obtenidos con las determi naciones de 13C del etanol de los vinos y destilados se resumen en el cuadro siguiente:
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Fecha
Vino N SR S R2 R N SR
Destilados SR2 R
Diciembre 1994 Junio 1995 Diciembre 1995 Marzo 1996 Junio 1996 Septiembre 1996 Diciembre 1996 Marzo 1997 Junio 1997 Septiembre 1997 Diciembre 1997 Marzo 1998 Junio 1998 Septiembre 1998 Media ponderada
6 8 7 9 8 10 10 10 11 12 11 12 12 11
0,210 0,133 0,075 0,249 0,127 0,147 0,330 0,069 0,280 0,237 0,127 0,285 0,182 0,264 0,215
0,044 0,018 0,006 0,062 0,016 0,022 0,109 0,005 0,079 0,056 0,016 0,081 0,033 0,070 0,046
0,59 0,37 0,21 0,70 0,36 0,41 0,92 0,19 0,78 0,66 0,36 0,80 0,51 0,74 0,60
6 8 8 11 8 11 9 8 11 11 12 13 12 12
0,151 0,147 0,115 0,278 0,189 0,224 0,057 0,059 0,175 0,203 0,156 0,245 0,263 0,327 0,209
0,023 0,021 0,013 0,077 0,036 0,050 0,003 0,003 0,031 0,041 0,024 0,060 0,069 0,107 0,044
0,42 0,41 0,32 0,78 0,53 0,63 0,16 0,16 0,49 0,57 0,44 0,69 0,74 0,91 0,59
N: nmero de laboratorios participantes
11.4.
Lmites de repetibilidad y de reproducibilidad As pues, los datos de los diferentes ejercicios interlaboratorios presentados en los cuadros anteriores permiten establecer para el presente mtodo, incluyendo igualmente la etapa de destilacin, los lmites de repetibilidad y de reproducibilidad siguientes: Lmite de repetibilidad r: 0,24 Lmite de reproducibilidad R: 0,6.
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11 ACIDEZ TOTAL (OIV - AS-313-01-ACITOT) MTODO DE TIPO I 1. DEFINICIN La acidez total es la suma de los cidos valorables cuando se lleva el pH a 7 aadiendo una solucin alcalina valorada. El dixido de carbono no se incluye en la acidez total. 2. PRINCIPIO DEL MTODO Valoracin potenciomtrica o valoracin en presencia de azul de bromotimol como indicador del final de la reaccin, mediante comparacin con un patrn de coloracin. 3. 3.1. REACTIVOS Solucin amortiguadora de pH 7,0: Fosfato monopotsico (KH2PO4): 107,3 g Solucin M de hidrxido sdico (NaOH): 500 ml Agua csp: 1 000 ml. Tambin pueden utilizarse soluciones amortiguadoras de referencia comerciales. 3.2. 3.3. Solucin 0,1 M de hidrxido sdico (NaOH). Solucin de azul de bromotimol de 4 g/l: Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S) ................................................................................................ ................... Alcohol neutro 96 % vol. ................................................................ .......................................................................... Una vez solubilizado, aadir: Agua sin CO2 ..................................................................................... .......................................................................... Solucin M de hidrxido sdico csp coloracin verde-azulada (pH 7) ................................................................ ..................................................... 7,5 ml 200 ml 4g 200 ml
Agua csp ................................................................ ................................................................................................ ......... 1 000 ml 4. 4.1. 4.2. 4.3. MATERIAL Trompa de vaco. Matraz Kitasato de 500 ml. Potencimetro con escala graduada en unidades de pH y electrodos. El electrodo de vidrio debe conservarse en agua destilada. El electrodo de calomelanos y cloruro potsico saturado debe conservarse en una solucin saturada de cloruro potsico. Generalmente se emplea un electrodo combinado, que se conserva en agua destilada. Vasos de precipitados de 50 ml de capacidad (en caso de vinos) y de 100 ml de capacidad (en caso de mostos concentrados rectificados). PROCEDIMIENTO Preparacin de la muestra Vinos Eliminacin del dixido de carbono. Colocar aproximadamente 50 ml de vino, en un matraz Kitasato; agitar y, al mismo tiempo, hacer el vaco con una trompa de agua. La agitacin debe durar de 1 a 2 minutos 5.1.2. Mostos concentrados rectificados Verter 200 g de mosto concentrado rectificado, exactamente pesado, en un matraz aforado de 500 ml. Enrasar con agua. Homogeneizar.
4.4. 5. 5.1. 5.1.1.
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5.2. 5.2.1.
Valoracin potenciomtrica Calibrado del pH-metro La calibracin del pH-metro se efecta a 20 C, siguiendo las indicaciones del aparato que se utilice, mediante la solucin amortiguadora de pH 7,00 a 20 C.
5.2.2.
Tcnica de una medicin En un vaso de precipitados (punto 4.4) verter 10 ml, si se trata de vino, o 50 ml, en caso de mosto concentrado rectificado, de muestra preparada como se indica en el punto 5.1. Aadir 10 ml de agua destilada, aproximadamente, y verter con una bureta la solucin 0,1 M de hidrxido sdico (punto 3.2) hasta que el pH sea igual a 7 a 20 C. La adicin de licor alcalino debe efectuarse despacio, agitando continuamente la solucin. Se denominar n al nmero de mililitros de NaOH 0,1 M vertidos.
5.3. 5.3.1.
Valoracin con indicador (azul de bromotimol) Ensayo previo: obtencin del patrn de coloracin En un vaso de precipitados (punto 4.4), verter 25 ml de agua destilada y hervida, 1 ml de solucin de azul de bromotimol (punto 3.3) y 10 ml, si se trata de vino, o 50 ml, en caso de mosto concentrado rectificado, de muestra preparada como se indica en el punto 5.1. Aadir la solucin 0,1 M de hidrxido sdico (punto 3.2) hasta obtener una coloracin verde-azulada. Aadir 5 ml de la solucin amortiguadora de pH 7 (punto 3.1).
5.3.2.
Determinacin En un vaso de precipitados (punto 4.4), verter 30 ml de agua destilada y hervida, 1 ml de solucin de azul de bromotimol (punto 3.3) y 10 ml, si se trata de vino, o 50 ml, en caso de mosto concentrado rectificado, de muestra preparada como se indica en el punto 5.1. Aadir la solucin 0,1 M de hidrxido sdico (punto 3.2) hasta obtener una coloracin idntica a la obtenida en el ensayo previo (punto 5.3.1). Se denominar n al nmero de mililitros de solucin de hidrxido sdico 0,1 M utilizados.
6. 6.1. 6.1.1.
EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Modo de clculo Vino La acidez total, expresada en miliequivalentes por litro, ser: A = 10 n El resultado se dar con 1 decimal. La acidez total, expresada en gramos de cido tartrico por litro, ser: A = 0,075 A El resultado se dar con 1 decimal.
6.1.2.
Mosto concentrado rectificado Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de mosto concentrado rectificado: a = 5 n Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de azcares totales: A = (500 n)/P P = contenido porcentual (m/m) en azcares totales. El resultado se dar con 1 decimal.
6.2.
Repetibilidad (r) para la valoracin con indicador (5.3) r = 0,9 meq por litro r = 0,07 g de cido tartrico por litro para los vinos blancos, rosados y tintos.
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6.3.
Reproducibilidad (R) para la valoracin con indicador (5.3) Para los vinos blancos y rosados: R = 3,6 meq por litro R = 0,3 g de cido tartrico por litro. Para los vinos tintos: R = 5,1 meq por litro R = 0,4 g de cido tartrico por litro.
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12 ACIDEZ VOLTIL (OIV-AS-313-02-ACIVOL) MTODO DE TIPO I 1. DEFINICIN La acidez voltil est constituida por los cidos pertenecientes a la serie actica que se encuentran en los vinos, bien en estado libre, bien en forma de sal. 2. PRINCIPIO DEL MTODO Valoracin de los cidos voltiles separados del vino por arrastre de vapor de agua y rectificacin de los vapores. Previamente, debe eliminarse el dixido de carbono del vino. La acidez del dixido de azufre (tanto libre como combinado) destilado en dichas condiciones debe restarse de la acidez del destilado. Debe restarse, asimismo, la acidez del cido srbico eventualmente aadido al vino. Observacin: El cido saliclico, utilizado en algunos pases para estabilizar los vinos antes del anlisis, se encuentra en parte en el destilado. Es necesario valorarlo y restarlo de la acidez. El mtodo de esta determinacin se encuentra en el apartado 7 del presente captulo. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. REACTIVOS cido tartrico cristalizado (C4H6O6) Solucin 0,1 M de hidrxido sdico (NaOH) Solucin de fenolftalena al 1 % en alcohol neutro de 96 % vol. cido clorhdrico (20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diluido 1/4 (v/v) Solucin 0,005 M de yodo (I2) Yoduro potsico cristalizado (KI) Engrudo de almidn de 5 g/l: Desler 5 g de almidn en unos 500 ml de agua. Llevar a ebullicin agitando y mantener hirviendo durante 10 minutos; aadir 200 g de cloruro sdico. Una vez fro, llevar a 1 litro. 3.8. 4. 4.1. Solucin saturada de borato sdico (Na2B4O7 10 H2O), es decir, aproximadamente 55 g/l a 20 C. MATERIAL Aparato de arrastre de vapor de agua, compuesto de: 1) Un generador de vapor de agua; el vapor de agua producido debe estar exento de dixido de carbono. 2) Un borboteador. 3) Una columna rectificadora. 4) Un refrigerante. Este aparato debe responder a los tres ensayos siguientes: a) Poner en el borboteador 20 ml de agua hervida; recoger 250 ml de destilado y aadirles 0,1 ml de solucin 0,1 M de hidrxido sdico (punto 3.2) y 2 gotas de la solucin de fenolftalena (punto 3.3); la coloracin rosa debe permanecer estable durante 10 segundos, por lo menos (vapor de agua exento de dixido de carbono). b) Poner en el borboteador 20 ml de solucin 0,1 M de cido actico. Recoger 250 ml de destilado. Valorar con la solucin 0,1 M de hidrxido sdico (punto 3.2). El volumen empleado debe ser al menos igual a 19,9 ml. (cido actico arrastrado 99,5 %).
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c) Poner en el borboteador 20 ml de solucin M de cido lctico. Recoger 250 ml de destilado y valorar su acidez con una solucin 0,1 M de hidrxido sdico (punto 3.2). El volumen empleado debe ser inferior o igual a 1,0 ml. (cido lctico destilado 0,5 %). Todo aparato o tcnica que satisfaga estos tres ensayos constituye un aparato o tcnica oficial internacional. 4.2. 4.3. 5. 5.1. Trompa de vaco. Matraz Kitasato. PROCEDIMIENTO Preparacin de la muestra: eliminacin del dixido de carbono. Poner alrededor de 50 ml de vino en un matraz Kitasato; agitar y, al mismo tiempo, hacer el vaco por medio de la trompa de agua. La agitacin debe durar de 1 a 2 minutos 5.2. Arrastre por vapor de agua Echar en el borboteador 20 ml de vino desprovisto de dixido de carbono como se indica en el punto 5.1. Aadir unos 0,5 g de cido tartrico (punto 3.1). Recoger, al menos, 250 ml de destilado. 5.3. Valoracin Valorar con la solucin 0,1 M de hidrxido sdico (punto 3.2) en presencia de 2 gotas de solucin de fenolftalena (punto 3.3). Se denominar n ml al volumen utilizado. Aadir 4 gotas de cido clorhdrico diluido 1/4 (punto 3.4), 2 ml de engrudo de almidn (punto 3.7) y algunos cristales de yoduro potsico (punto 3.6). Valorar el dixido de azufre libre con la solucin 0,005 M de yodo (punto 3.5). Se denominar n ml al volumen utilizado. Aadir la solucin saturada de borato sdico (punto 3.8) hasta que reaparezca la coloracin rosa. Valorar con la solucin 0,005 M de yodo (punto 3.5) el dixido de azufre combinado. Se denominar n ml al volumen utilizado. 6. 6.1. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Modo de clculo La acidez voltil, expresada en miliequivalentes por litro, con 1 decimal, ser: A = 5 (n 0,1 n 0,05 n) La acidez voltil, expresado en gramos de cido actico por litro, con 2 decimales, ser: 0,300 (n 0,1 n 0,05 n) 6.2. Repetibilidad (r) r = 0,7 meq por litro r = 0,04 g de cido actico por litro. 6.3. Reproducibilidad (R) R = 1,3 meq por litro R = 0,08 g de cido actico por litro. 6.4. Caso de un vino con adicin de cido srbico Dado que el cido srbico es arrastrado por el vapor de agua en un 96 % para un volumen de destilado de 250 ml, su acidez debe restarse de la acidez voltil, sabiendo que 100 mg de cido srbico corresponden a una acidez de 0,89 miliequivalentes o de 0,053 g de cido actico y conociendo el contenido en cido srbico (mg/l) determinado previamente. 7. 7.1. DETERMINACIN DEL CIDO SALICLICO QUE SE HALLA EN EL DESTILADO UTILIZADO PARA VALO RAR LA ACIDEZ VOLTIL Principio Una vez efectuada la determinacin de la acidez voltil y la correccin del dixido de azufre, la presencia de cido saliclico se caracteriza por la aparicin, previa acidificacin, de una coloracin violeta tras haber aadido una sal de hierro III.
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La determinacin del cido saliclico que se halla en el destilado con los cidos voltiles se efectuar con un segundo destilado cuyo volumen sea igual al del utilizado para determinar la acidez voltil. El cido saliclico se determinar en dicho destilado mediante un mtodo colorimtrico de comparacin y el resultado se restar de la acidez voltil. 7.2. 7.2.1. 7.2.2. 7.2.3. 7.2.4. 7.3. 7.3.1. Reactivos cido clorhdrico (HCl) (20 = 1,18 a 1,19 g/ml). Tiosulfato sdico (Na2S2O3 5 H2O) 0,1 M. Solucin de sulfato de hierro III y de amonio (Fe2(SO4)3 (NH4)2SO4 24 H2O) al 10 % (m/v). Solucin de salicilato sdico (NaC7H5O3) 0,01 M, con 1,60 g/l de salicilato sdico. Procedimiento Caracterizacin del cido saliclico en el destilado de la acidez voltil Inmediatamente despus de haber efectuado la determinacin de la acidez voltil y la correccin del dixido de azufre libre y combinado, verter en el matraz Erlenmeyer 0,5 ml de cido clorhdrico (punto 7.2.1), 3 ml de solucin 0,1 M de tiosulfato sdico (punto 7.2.2) y 1 ml de solucin de sulfato de hierro III y de amonio (punto 7.2.3). En presencia de cido saliclico, aparece una coloracin violeta. 7.3.2. Determinacin del cido saliclico En el matraz Erlenmeyer anterior, indicar mediante una seal de referencia el volumen del destilado. Vaciar y enjuagar el matraz. Someter una nueva muestra de 20 ml de vino al arrastre por vapor de agua y recoger el destilado en el matraz Erlenmeyer hasta la seal de referencia. Aadir 0,3 ml de cido clorhdrico puro (punto 7.2.1) y 1 ml de solucin de sulfato de hierro III y de amonio (punto 7.2.3). El contenido del matraz Erlenmeyer adquiere una coloracin violeta. En un matraz Erlenmeyer idntico al que lleva la seal de referencia, verter agua destilada hasta el mismo nivel que el del destilado. Aadir 0,3 ml de cido clorhdrico puro (punto 7.2.1) y 1 ml de solucin de sulfato de hierro III y de amonio (punto 7.2.3). Verter con una bureta la solucin de salicilato sdico 0,01 M (punto 7.2.4) hasta que se obtenga una coloracin violeta de la misma intensidad que la del matraz Erlenmeyer que contiene el destilado de vino. Se denominar n al nmero de mililitros utilizados. 7.4. Correccin de la acidez voltil Restar el volumen 0,1 nml del volumen n ml de solucin de hidrxido sdico 0,1 M utilizado para valorar la acidez del destilado en la determinacin de la acidez voltil.
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13 CIDO CTRICO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) MTODO DE TIPO II 1. PRINCIPIO DEL MTODO El cido ctrico se transforma en oxalacetato y acetato en una reaccin catalizada por la citrato-liasa (CL): Citrato oxalacetato + acetato En presencia de malato-deshidrogenasa (MDH) y de lactato-deshidrogenasa (LDH), el oxalacetato y su derivado de descarboxilacin, el piruvato, se reducen a L-malato y L-lactato por el nicotinamida-adenina-dinucletido reducido (NADH): Oxalacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+ Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+ La cantidad de NADH oxidado a NAD+ en estas reacciones es proporcional al citrato presente. La oxidacin de NADH se mide mediante la disminucin de su absorbancia a la longitud de onda de 340 nm. 2. 2.1. REACTIVOS Amortiguador de pH 7,8 (glicilglicina 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 10-3 M): Disolver 7,13 g de glicilglicina en 70 ml, aproximadamente, de agua bidestilada. Ajustar el pH a 7,8 con 13 ml, aproximadamente, de solucin de hidrxido de sodio 5 M; aadir 10 ml de solucin de cloruro de cinc ZnCl2, de 80 mg en 100 ml, y llevar a 100 ml con agua bidestilada. La solucin permanece estable por lo menos 4 semanas a + 4 C. 2.2. Solucin de nicotinamida-adenina-dinucletido reducido (NADH) (aprox. 6 103 M): Disolver 30 mg de NADH y 60 mg de NaHCO3 con 6 ml de agua bidestilada. Solucin de malato-deshidrogenasa / lactato-deshidrogenasa (MDH/LDH), (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml): Hacer una mezcla de 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml) / 0,4 ml de solucin de sulfato de amonio (3,2 M) y 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Esta solucin se mantiene estable durante 1 ao, por lo menos, a + 4 C. 2.4. Citrato-liasa CL (5 mg de protena/ml): Disolver 168 mg de liofilizado en 1 ml de agua helada. La solucin es estable por lo menos durante 1 semana a + 4 C y durante 4 semanas congelada. Antes de proceder a la determinacin, se recomienda comprobar la actividad de la enzima. 2.5. Polivinil-polipirrolidona (PVPP) Observacin: El conjunto de reactivos necesarios para esta determinacin se comercializa ya preparado. 3. 3.1. MATERIAL Un espectrofotmetro que permita efectuar medidas a 340 nm (mximo de absorcin del NADH). En su defecto, fotmetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o a 365 nm. Dado que se trata de medidas absolutas de absorbancia (no se utiliza curva de calibrado, sino el coeficiente de extincin del NADH), deben controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato. 3.2. 3.3. 4. Cubetas de vidrio o cubetas desechables de 1 cm de camino ptico. Micropipetas que permitan tomar volmenes comprendidos entre 0,02 ml y 2 ml. PREPARACIN DE LA MUESTRA La determinacin del citrato se suele efectuar directamente sobre el vino sin decoloracin previa y sin dilucin, siempre que el contenido en cido ctrico sea inferior a 400 mg/l. Si no, proceder a la dilucin del vino de forma que la concentracin de citrato se site entre 20 y 400 mg/l (cantidad de citrato en la muestra comprendida entre 5 g y 80 g).
2.3.
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En caso de vino tinto rico en compuestos fenlicos, se recomienda tratarlo previamente con PVPP: Poner en suspensin en el agua alrededor de 0,2 g de PVPP y dejar reposar 15 minutos. Pasar por filtro de pliegues. Aadir a 10 ml de vino colocado dentro de un Erlenmeyer de 50 ml, la PVPP hmeda tomada del filtro con esptula. Agitar durante 2 o 3 minutos y filtrar. 5. PROCEDIMIENTO Se ajusta la longitud de onda del espectrofotmetro a 340 nm y se realizan las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm, habiendo ajustado el cero de absorbancia con respecto al aire (sin cubetas en el camino ptico). Introducir en cubetas de 1 cm: Solucin testigo Solucin 2.1 Solucin 2.2 Muestra Agua bidestilada Solucin 2.3 1,00 ml 0,10 ml 2,00 ml 0,02 ml Solucin de la muestra 1,00 ml 0,10 ml 0,20 ml 1,80 ml 0,02 ml
Mezclar; transcurridos unos 5 minutos, leer las absorbancias de las soluciones testigo y de la muestra (A1). Aadir: Solucin 2.4 0,02 ml 0,02 ml
Mezclar; esperar a que finalice la reaccin (unos 5 minutos) y leer las absorbancias de las soluciones testigo y de la muestra (A2). Determinar las diferencias de absorbancias (A1 A2) de las soluciones testigo y de la muestra. Restar la diferencia de absorbancias de la solucin testigo (AT) de la diferencia de absorbancias de la solucin de la muestra (AM): A = AM AT Observacin: El tiempo necesario para la accin de las enzimas puede variar de un lote a otro. Aqu solo se ha dado a ttulo indicativo. Se recomienda determinarlo con cada lote. 6. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS El contenido en cido ctrico se expresa en miligramos por litro (mg/l) sin decimales. 6.1. Modo de clculo La concentracin en miligramos por litro viene dada por la frmula general: C V v = = = ((V PM)/( d v)) A volumen total de la solucin en ml (aqu, 3,14 ml) volumen de la muestra en ml (aqu, 2 ml) masa molecular de la sustancia que va a determinarse (aqu, cido ctrico anhidro = 192,1) camino ptico de la cubeta en cm (aqu, 1 cm) coeficiente de extincin del NADH; a 340 nm, 6,3 mmol
1
PM = d = = =
l cm 1.
Se obtiene: C = 479 A Si se ha efectuado una dilucin durante la preparacin de la muestra, multiplicar el resultado por el factor de dilucin. Observacin: a 334 nm, C = 488 A ( = 6,2 mmol 1 l cm 1) y, a 365 nm, C = 887 A ( = 3,4 mmol 1 l cm 1)
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6.2.
Repetibilidad (r) Contenido en cido ctrico inferior a 400 mg/l: r = 14 mg/l Contenido en cido ctrico superior a 400 mg/l: r = 28 mg/l
6.3.
Reproducibilidad (R) Contenido en cido ctrico inferior a 400 mg/l: R = 39 mg/l. Contenido en cido ctrico superior a 400 mg/l: R = 65 mg/l.
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14 CIDO SRBICO (OIV-AS-313-14-ACISOR) MTODO DE TIPO IV 1. 1.1. PRINCIPIO DE LOS MTODOS Mtodo de determinacin por espectrofotometra de absorcin en el ultravioleta El cido srbico (cido trans,trans-hexa-2,4-dienoico) separado por destilacin con arrastre de vapor de agua se determina en el destilado mediante espectrofotometra de absorcin en el ultravioleta. Las sustancias que interfieren con la medida de la absorcin en el ultravioleta se eliminan por evaporacin a sequedad de la muestra del destilado, ligeramente alcalinizado por una solucin de hidrxido de calcio. Los contenidos inferiores a 20 mg/l deben confirmarse por cromatografa en capa fina (sensibilidad: 1 mg/l). 1.2. Mtodo de determinacin por cromatografa de gases El cido srbico extrado en ter etlico se determina por cromatografa en fase gaseosa en presencia de un patrn interno. 1.3. Mtodo de deteccin de trazas por cromatografa de capa fina El cido srbico extrado en ter etlico se separa por cromatografa en capa fina y se evala su concentracin en forma semicuantitativa. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. MTODO DE DETERMINACIN POR ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA Reactivos cido tartrico (C4H6O6) cristalizado. Solucin de hidrxido de calcio (Ca(OH)2), aproximadamente 0,02 M. Solucin de referencia de cido srbico de 20 mg por litro. Disolver 20 mg de cido srbico (C6H8O2) en 2 ml aproximadamente de solucin 0,1 M de hidrxido de sodio. Verter en un matraz aforado de 1 000 ml y enrasar con agua. Tambin es posible disolver 26,8 mg de sorbato de potasio (C6H7KO2) en agua y completar con agua hasta 1 000 ml. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3. 2.3.1. Material Aparato de destilacin con arrastre de vapor de agua (vase Acidez voltil). Bao de agua a 100 C. Espectrofotmetro que permita efectuar medidas a la longitud de onda de 256 nm con cubetas de cuarzo de 1 cm de camino ptico. Procedimiento Destilacin Introducir en el borboteador del aparato de arrastre de vapor de agua 10 ml de vino, aadir entre1 y 2 g de cido tartrico (punto 2.1.1). Recoger 250 ml de destilado. 2.3.2. Curva patrn Preparar mediante diluciones con agua a partir de la solucin de referencia (punto 2.1.3) cuatro soluciones de referencia diluidas que contengan respectivamente 0,5, 1, 2,5 y 5 mg de cido srbico por litro; medir con el espectrofotmetro sus respectivas absorbancias a 256 nm respecto al agua destilada. Trazar la curva de absorbancias en funcin de la concentracin de las soluciones. La variacin es lineal. 2.3.3. Determinacin Introducir en una cpsula de 55 mm de dimetro 5 ml de destilado, aadir 1 ml de solucin de hidrxido de calcio (punto 2.1.2). Evaporar hasta sequedad en un bao de agua hirviendo. Recoger el residuo con algunos mililitros de agua destilada, arrastrar cuantitativamente a un matraz aforado de 20 ml y enrasar con el agua de lavado. Medir la absorbancia a 256 nm con el espectrofotmetro en comparacin con una solucin testigo obtenida diluyendo hasta 20 ml con agua 1 ml de solucin de hidrxido de calcio (punto 2.1.2). Llevar el valor de la absorbancia medida a la recta patrn y deducir la concentracin en cido srbico C de la solucin. Observacin: En la prctica corriente, esta evaporacin a sequedad puede no ser necesaria. Medir directamente la absorbancia en el destilado diluido a 1/4 frente a agua destilada.
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2.4. 2.4.1.
Expresin de los resultados Modo de clculo La concentracin en cido srbico del vino expresada en miligramos por litro es igual a: 100 C C = concentracin en cido srbico de la solucin analizada mediante espectrofotometra, expresada en miligramos por litro.
3. 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.2. 3.2.1.
MTODO DE DETERMINACIN POR CROMATOGRAFA DE GASES Reactivos ter etlico ((C2H5)2O) destilado en el momento de su utilizacin. Solucin del patrn interno: solucin de cido undecanoico (C11H22O2) en etanol al 95 % vol., de 1 g por litro. Solucin acuosa de cido sulfrico (H2SO4) (20 = 1,84 g/ml) diluido 1/3 (v/v). Material Cromatgrafo de gases equipado con un detector de ionizacin de llama y una columna de acero inoxidable (4 m 1/8 de pulgada) previamente tratada con dimetil-dicloro-silano y rellena con fase estacionaria, com puesta por una mezcla de succinato de dietilenglicol (5 %) y cido fosfrico (1 %) (DEGS-H3PO4) o por una mezcla de adipato de dietilenglicol (7 %) y cido fosfrico (1 %) (DEGA-H3PO4), sobre un soporte slido de Gaschrom Q 80 100 mallas. Para el tratamiento con dimetil-dicloro-silano (DMDCS), pasar por la columna una solucin con 2 o 3 g de DMDCS en tolueno, lavar inmediatamente la columna con metanol y a continuacin pasar una corriente de nitrgeno, despus hexano y de nuevo una corriente de nitrgeno. Rellenarla a continuacin. Condiciones operativas: Temperatura del horno: 175 C. Temperatura del inyector y del detector: 230 C. Gas portador: nitrgeno (flujo 20 ml/min).
3.2.2.
Microjeringa de 10 microlitros de capacidad graduada en 0,1 microlitros. Observacin: Puede conseguirse igualmente una buena separacin con otros tipos de columnas, como la co lumna capilar (por ejemplo, FFAP). El modo operatorio descrito arriba se da a ttulo de ejemplo.
3.3. 3.3.1.
Procedimiento Preparacin de la muestra problema Introducir 20 ml de vino en un tubo de vidrio con una capacidad de unos 40 ml y provisto de un tapn esmerilado; aadir 2 ml de solucin del patrn interno (punto 3.1.2) y 1 ml de solucin diluida de cido sulfrico (punto 3.1.3). Tras agitar el tubo invirtindolo varias veces, aadir al contenido 10 ml de ter etlico (punto 3.1.1). Extraer el cido srbico en la fase orgnica agitando el tubo durante 5 minutos. Dejar decantar.
3.3.2.
Preparacin de la solucin de referencia Seleccionar un vino cuyo extracto etreo produzca un cromatograma que no presente ningn pico en la zona de elucin del cido srbico; aadir a este vino cido srbico hasta la concentracin de 100 mg por litro. Tratar, segn el procedimiento descrito en el punto 3.3.1, 20 ml de la muestra as preparada.
3.3.3.
Cromatografa Inyectar sucesivamente en el cromatgrafo, con una microjeringa, 2 l de la fase etrea obtenida en el punto 3.3.2 y 2 l de la fase etrea obtenida en el punto 3.3.1. Registrar los cromatogramas respectivos: comprobar la identidad de los tiempos de retencin respectivos del cido srbico y del patrn interno. Medir la altura (o el rea) de cada uno de los picos registrados.
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3.4. 3.4.1.
Expresin de los resultados Modo de clculo La concentracin de cido srbico del vino analizado, expresada en miligramos por litro, es igual a: 100 (h/H) (l/i) H = altura del pico del cido srbico en la solucin de referencia, h = altura del pico del cido srbico en la muestra problema, l = altura del pico del patrn interno en la solucin de referencia, i = altura del pico del patrn interno en la muestra problema. Nota: La concentracin de cido srbico puede determinarse del mismo modo a partir de las medidas de la superficie de los picos respectivos.
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15 PH (OIV-AS-313-15-PH) MTODO DE TIPO I 1. PRINCIPIO Medida de la diferencia de potencial entre dos electrodos sumergidos en el lquido que se estudia. Uno de los dos electrodos tiene un potencial que es una funcin definida del pH del lquido, mientras que el otro tiene un potencial fijo y conocido y constituye el electrodo de referencia. 2. 2.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. MATERIAL pH-metro graduado en unidades de pH que permita efectuar medidas con una precisin mnima de 0,05 unidades. Electrodos Electrodo de vidrio, que deber conservarse en agua destilada. Electrodo de referencia de calomelanos y cloruro potsico saturado, que se conservar en una solucin saturada de cloruro potsico. O electrodo combinado, que deber conservarse en agua destilada. REACTIVOS Soluciones amortiguadoras: Solucin saturada de tartrato cido de potasio. Solucin con un contenido mnimo de 5,7 g/l de tartrato cido de potasio (C4H5KO6) a 20 C. Esta solucin puede conservarse hasta 2 meses en presencia de 0,1 g de timol por cada 200 ml. 8 3,57 a 20 C > > > > < 3,56 a 25 C > > > > : 3,55 a 30 C
2.2.3. 3. 3.1. 3.1.1.
pH
3.1.2.
Solucin 0,05 M de ftalato cido de potasio. Solucin con 10,211 g/l de ftalato cido de potasio (C8H5KO4) a 20 C (plazo mximo de conservacin: 2 meses). 8 3,999 a 15 C > > > > > > > > < 4,003 a 20 C > > 4,008 a 25 C > > > > > > : 4,015 a 30 C
pH
3.1.3.
Solucin con:
Fosfato monopotsico (K H2 PO4) ................................................................................................ .........................
3,402 g
Fosfato dipotsico (K2HPO4) ................................................................ .................................................................... 4,354 g Agua csp................................................................................................ ........................................................................... (Duracin mxima de la solucin: 2 meses) 8 6,90 a 15 C > > > > > > > > < 6,88 a 20 C > > 6,86 a 25 C > > > > > > : 6,85 a 30 C 1l
pH
Observacin: Tambin pueden utilizarse soluciones amortiguadoras de referencia comerciales.
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4. 4.1. 4.1.1.
PROCEDIMIENTO Preparacin de la muestra problema Mosto y vino Utilizar directamente el mosto o el vino.
4.1.2.
Mosto concentrado rectificado Diluir este mosto con agua a fin de obtener una concentracin de 25 0,5 % (m/m) en azcares totales (25 Brix). Si P es el contenido porcentual (m/m) en azcares totales del mosto concentrado rectificado, pesar una masa igual a 2 500/P y completar hasta 100 g con agua. El agua utilizada debe tener una conductividad inferior a 2 microsiemens por centmetro.
4.2.
Puesta a cero del aparato Se efectuar antes de cada medida, siguiendo las instrucciones dadas para el aparato utilizado.
4.3.
Calibrado del pH-metro El calibrado se efecta a 20 C siguiendo las indicaciones dadas para el aparato utilizado, con las soluciones amortiguadoras de pH 6,88 y 3,57 a 20 C. Utilizar la solucin amortiguadora de pH 4,00 a 20 C para controlar el calibrado de la escala.
4.4.
Medida Introducir el electrodo en la muestra analizada, cuya temperatura deber estar comprendida entre 20 y 25 C y tan prxima a 20 C como sea posible. Leer directamente el valor del pH. Efectuar al menos dos determinaciones de cada muestra. Tomar como resultado la media aritmtica de las determinaciones.
5.
EXPRESIN DE LOS RESULTADOS El pH del mosto, del vino o de la solucin al 25 % (m/m) (25 Brix) del mosto concentrado rectificado se expresar con dos decimales.
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16 DETERMINACIN SIMULTNEA DE CIDO L-ASCRBICO Y DE CIDO D-ISOASCRBICO POR HPLC Y DETECCIN UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) MTODO DE TIPO II 1. INTRODUCCIN El cido ascrbico es un antioxidante presente de forma natural en toda una serie de productos alimentarios. La cantidad normal de cido ascrbico de la uva va disminuyendo a lo largo de la elaboracin de los mostos y de la vinificacin. Puede aadirse a los mostos y a los vinos dentro de ciertos lmites. El mtodo descrito se ha validado en el marco de ensayos interlaboratorios, mediante anlisis de muestras de vino con cantidades aadidas de cido L-ascrbico y de cido D-isoascrbico, de 30 mg/l a 150 mg/l y de 10 mg/l a 100 mg/l, respectivamente. 2. MBITO DE APLICACIN Este mtodo es adecuado para la determinacin simultnea de cido L-ascrbico y de cido D-isoascrbico (cido eritrbico) en el vino mediante cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR o HPLC (siglas de su nombre en ingls)) y deteccin UV en una banda de 3 a 150 mg/l. En caso de contenido superior a 150 mg/l, hay que efectuar una dilucin de la muestra. 3. PRINCIPIO Las muestras se inyectan directamente en el sistema de HPLC previa filtracin por membrana. Los analitos se separan en una columna de fase inversa y se someten a deteccin UV a 266 nm. La cuantificacin del cido Lascrbico y del cido D-isoascrbico se efecta con relacin a un patrn externo. Observacin: Las columnas y las condiciones de funcionamiento se dan a ttulo de ejemplo. Con otros tipos de columnas puede conseguirse igualmente una buena separacin. 4. 4.1. 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.1.5. 4.1.6. 4.1.7. 4.1.8. 4.1.9. 4.1.10. 4.2. 4.2.1. REACTIVOS Y PRODUCTOS Reactivos n-octilamina, pureza 99,0 % Acetato de sodio trihidratado, pureza 99,0 % cido actico puro, al 100 % cido fosfrico, aproximadamente al 25 % cido oxlico, pureza 99,0 % Ascorbato-oxidasa cido L-ascrbico, ultra 99,5 % cido D-isoascrbico, pureza 99,0 % Agua bidestilada Metanol, p. a. 99,8 % Preparacin de la fase mvil Soluciones para la fase mvil Preparar las soluciones siguientes para la fase mvil: 4.2.1.1. 4.2.1.2. 4.2.1.3. 4.2.1.4. 12,93 g de n-octilamina en 100 mlde metanol 68,05 g de acetato de sodio trihidratado en 500 ml de agua bidestilada 12,01 g de cido actico puro en 200 ml de agua bidestilada Solucin amortiguadora de pH 5,4: 430 ml de solucin de acetato de sodio (4.2.1.2) y 70 ml de solucin de cido actico (4.2.1.3)
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4.2.2.
Preparacin de la fase mvil Aadir 5 ml de solucin de n-octilamina (4.2.1.1) a unos 400 ml de agua bidestilada en un vaso. Ajustar el pH de esta solucin a 5,4 - 5,6, aadiendo gota a gota cido fosfrico al 25 % (4.1.4). Aadir 50 ml de la solucin amortiguadora (4.2.1.4), introducir el conjunto en un matraz aforado de 1 000 ml y enrasar con agua bidestilada. Antes de utilizarse, la fase mvil debe filtrarse por membrana (celulosa regenerada de 0,2 m) y, si es posible, desgasificarse con helio (durante unos 10 minutos) segn las necesidades del sistema de HPLC utilizado.
4.3.
Preparacin de la solucin patrn Observacin: Todas las soluciones patrn (solucin madre 4.3.1 y soluciones de trabajo 4.3.2) deben prepararse cada da y, de preferencia, guardarse en refrigerador hasta el momento de su inyeccin.
4.3.1.
Preparacin de la solucin madre (1 mg/ml) Preparar una solucin acuosa de cido oxlico al 2 % y eliminar el oxgeno disuelto borboteando nitrgeno. Pesar con exactitud 100 mg de cido L-ascrbico y 100 mg de cido D-isoascrbico en un matraz aforado de 100 ml y enrasar con solucin acuosa de cido oxlico al 2 %.
4.3.2.
Preparacin de las soluciones de trabajo Para obtener las soluciones de trabajo, diluir la solucin madre (4.3.1) hasta las concentraciones deseadas con la solucin de cido oxlico al 2 %. Se recomienda obtener concentraciones entre 10 mg/l y 120 mg/l. Por ejemplo, llevar 100 l, 200 l, 400 l, 800 l y 1 200l a 10 ml, lo que corresponde a 10, 20, 40, 80 y 120 mg/l.
5.
MATERIAL Instrumental habitual de laboratorio y, en particular, el siguiente:
5.1. 5.2. 5.3. 6.
Bomba de HPLC Inyector con bucle de 20 l Detector de UV MUESTREO Las muestras de vino se pasan por un filtro de membrana de 0,2 m de dimetro de poro, antes de inyectarlas. En caso de contenido superior a 150 mg/l, hay que efectuar una dilucin de la muestra.
7. 7.1.
PROCEDIMIENTO Condiciones para la utilizacin del sistema de HPLC Inyectar en el aparato de cromatografa 20 l de la muestra filtrada por membrana. Precolumna: Columna: por ejemplo, Nucleosil 120 C18 (4 cm x 4 mm x 7 m) por ejemplo, Nucleosil 120 C18 (25 cm x 4 mm x 7 m)
Volumen de inyeccin: 20 l Fase mvil: Caudal: Deteccin de UV: Ciclo de lavado: vase el punto 4.2.2, gradiente isocrtico 1 ml/min 266 nm al menos 30 ml de agua bidestilada, seguidos de 30 ml de metanol y de 30 ml de acetonitrilo.
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7.2.
Identificacin/confirmacin La identificacin de los picos se efecta comparando los tiempos de retencin de los patrones y de las muestras. Con el sistema cromatogrfico que se describe como ejemplo, los tiempos de retencin son de 7,7 min para el cido L-ascrbico y de 8,3 min para el cido D-isoascrbico (ver la figura 1, cromatograma A). Para confirmar un resultado positivo, estas muestras deben tratarse con una esptula de ascorbato-oxidasa y medirse de nuevo (ver la figura 1, cromatograma B). Debido a la degradacin del cido L-ascrbico y del cido D-isoascrbico provocada por la ascorbato-oxidasa, no debera encontrarse ninguna seal al tiempo de retencin del cido L-ascrbico ni del cido D-isoascrbico. En caso de deteccin de picos parsitos, es necesario tener en cuenta su superficie para calcular la concen tracin de los analitos.
Figura 1 Ejemplo de cromatograma de un vino blanco: A, antes del tratamiento con ascorbato-oxidasa; B, despus del tratamiento. Observacin: Se recomienda analizar las muestras tratadas con ascorbato-oxidasa al final de una secuencia, seguido del ciclo de lavado para eliminar de la columna los restos de ascorbato-oxidasa; en caso contrario, el cido L-ascrbico y el cido D-isoascrbico podran ser transformados por los restos de ascorbato-oxidasa en la determinacin por HPLC y el resultado podra verse afectado. 8. CLCULOS Preparar una curva de calibracin a partir de las soluciones de trabajo (4.3.2). Segn el mtodo del patrn externo, la cuantificacin del cido L-ascrbico y del cido D-isoascrbico se realiza midiendo las superficies de los picos y comparndolas con la concentracin correspondiente en la curva de calibracin. Expresin de los resultados Los resultados se expresan con un decimal en mg/l de cido L-ascrbico y de cido D-isoascrbico (por ejemplo, 51,3 mg/l). En caso de contenido superior a 150 mg/l, hay que tener en cuenta la dilucin. 9. FIDELIDAD El mtodo se ha comprobado dentro de una prueba interlaboratorios organizada en 1994 por la antigua Oficina Federal de Sanidad (Bundesgesundheitsamt) de Alemania, con participacin de 27 laboratorios. El pro grama de la prueba interlaboratorios segua el artculo 35 de la Ley alemana relativa a los productos alimen ticios, aceptado por la OIV hasta la introduccin del nuevo protocolo (OENO 6/2000).
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El estudio comprenda cuatro muestras diferentes de vino (dos vinos blancos y dos vinos tintos), con cinco repeticiones de cada muestra. Como no era posible preparar muestras con una estabilidad suficiente de los analitos (velocidades de degradacin diferentes), se decidi enviar a los participantes cantidades definidas de sustancias patrn puras y las muestras de vino. Se dio a los laboratorios la consigna de transferir cuantitati vamente los patrones a las muestras de vino y de analizar estas inmediatamente. Se analizaron muestras con 30 150 mg/l de cido L-ascrbico y 10 - y 100 mg/l de cido D-isoascrbico. En el anexo publicado por la OIV se recogen los resultados pormenorizados del estudio. La evaluacin se realiz segn la norma DIN/ISO 5725 (versin 1988). Las desviaciones tpicas de la repetibilidad (sr) y de la reproducibilidad (sR) eran adecuadas para las concep ciones de cido L-ascrbico y de cido D-isoascrbico. El parmetro de precisin real puede calcularse mediante las ecuaciones siguientes: cido L-ascrbico sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: concentracin de cido L-ascrbico (mg/l) cido D-isoascrbico sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 x: concentracin de cido D-isoascrbico (mg/l) Ejemplo: 50 mg/l de cido D-isoascrbico sr = 1,0 mg/l sR = 5,2 mg/l 10. 10.1. OTRAS CARACTERSTICAS DEL ANLISIS Lmite de deteccin Se estima que el lmite de deteccin de este mtodo es de 3 mg/l para el cido L-ascrbico y para el cido Disoascrbico. 10.2. Exactitud La recuperacin media calculada a partir de la prueba interlaboratorios realizada con cuatro muestras (ver el anexo publicado en el Compendio de la OIV) fue de: 100,6 % para el cido L-ascrbico 103,3 % para l cido D-isoascrbico.
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17 DIXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) MTODO DE TIPO II 1. 1.1. PRINCIPIO DEL MTODO Caso de vinos tranquilos (sobrepresin de CO2 0,5 x 105 Pa) (1) El volumen de vino tomado de la muestra y llevado a una temperatura prxima a los 0 C se vierte en un exceso suficiente de solucin valorada de hidrxido de sodio para lograr un pH de 10 a 11. Se valora con una solucin cida en presencia de anhidrasa carbnica. El contenido en dixido de carbono se deduce del volumen empleado para pasar de pH 8,6 (forma de carbonato cido) a 4,0 (cido carbnico). Una valoracin testigo efectuada en las mismas condiciones con el vino desprovisto de CO2 permite tener en cuenta el volumen de solucin de hidrxido de sodio consumido por los cidos del vino. 1.2. Caso de vinos de aguja y vinos espumosos Se lleva la muestra de vino problema a cerca de su punto de congelacin. Despus de tomar un cierto volumen que servir de testigo una vez desprovisto de CO2, se alcaliniza el resto de la botella para fijar todo el CO2 en forma de Na2CO3. Se valora con una solucin cida en presencia de anhidrasa carbnica. El contenido en dixido de carbono se deduce del volumen de solucin cida empleado para pasar de pH 8,6 (forma de carbonato cido) a pH 4,0 (cido carbnico). Una valoracin testigo efectuada en las mismas condiciones con el vino desprovisto de CO2 permite tener en cuenta el volumen de solucin de hidrxido de sodio consumido por los cidos del vino. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.1.1. 2.1.1.2. 2.1.2. 2.1.2.1. 2.1.2.2. 2.1.2.3. 2.1.3. DESCRIPCIN DEL MTODO Vinos tranquilos (sobrepresin de dixido de carbono 0,5 x 105 Pa) Material Agitador magntico pH-metro Reactivos Solucin de hidrxido de sodio (NaOH), 0,1 M Solucin de cido sulfrico (H2SO4), 0,05 M Solucin de 1 g/l de anhidrasa carbnica Procedimiento Enfriar la muestra de vino hasta los 0 C, aproximadamente, as como la pipeta de 10 ml que sirva para la toma de muestra. En un vaso de precipitados de 100 ml, poner 25 ml de solucin de hidrxido de sodio (punto 2.1.2.1); aadir 2 gotas de solucin acuosa de anhidrasa carbnica (punto 2.1.2.3). Introducir 10 ml de vino con ayuda de la pipeta enfriada a 0 C. Poner el vaso de precipitados en el agitador magntico, colocar el electrodo y la varilla magntica y llevar a cabo una agitacin moderada. Cuando el lquido est a la temperatura ambiente, verter lentamente la solucin de cido sulfrico (punto 2.1.2.2) hasta llegar a pH 8,6. Seguir despus vertiendo cido sulfrico (punto 2.1.2.2) hasta pH 4,0. Sea n ml el volumen utilizado entre pH 8,6 y 4,0. Por otro lado, eliminar el CO2 de unos 50 ml de la muestra de vino, agitando bajo vaco durante tres minutos y calentando el matraz en un bao de agua a 25 C aproximadamente. Aplicar el procedimiento anterior a 10 ml de vino desprovisto de CO2: sea n ml el volumen utilizado. 2.1.4. Expresin de los resultados 1 ml de solucin valorada de cido sulfrico 0,05 M corresponde a 4,4 mg de CO2. La cantidad de CO2 en gramos por litro de vino se expresa mediante la frmula: 0,44 (n n) indicando 2 decimales. Observacin: En el caso de vinos con bajo contenido de CO2 (CO2 < 1 g/l), no es necesaria la adicin de anhidrasa carbnica para catalizar la hidratacin del CO2.
(1) 105 pascal (Pa) = 1 bar.
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2.2. 2.2.1. 2.2.1.1. 2.2.1.2. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. 2.2.3.
Vinos de aguja y vinos espumosos Material Agitador magntico pH-metro Reactivos Solucin de hidrxido de sodio (NaOH) al 50 % (m/m) Solucin de cido sulfrico (H2SO4), 0,05 M Solucin de 1 g/l de anhidrasa carbnica Procedimiento Trazar una marca, al nivel del llenado, sobre la botella de vino problema y enfriarla hasta el inicio de la congelacin. Dejar que la botella se caliente ligeramente, agitando, hasta que desaparezcan los cristales de hielo. Destapar rpidamente y apartar en una probeta graduada de 45 a 50 ml de vino que servirn para la determinacin testigo. El volumen exacto de esta muestra, v ml, se determinar mediante lectura sobre la probeta, cuando el vino est a la temperatura ambiente. Aadir, inmediatamente despus de haber tomado la muestra anterior, 20 ml de solucin de hidrxido de sodio (punto 2.2.2.1) a la botella si tiene una capacidad de 750 ml. Esperar a que el vino est de nuevo a temperatura ambiente. En un vaso de precipitados de 100 ml, poner 30 ml de agua destilada hervida y 2 gotas de solucin de anhidrasa carbnica (punto 2.2.2.3). Aadir 10 ml de vino alcalinizado. Poner el vaso en el agitador magntico, colocar el electrodo y la varilla magntica y llevar a cabo una agitacin moderada. Verter lentamente la solucin de cido sulfrico (punto 2.2.2.2) hasta pH 8,6. Seguir despus vertiendo cido sulfrico (punto 2.2.2.2) hasta pH 4,0. Sea n ml el volumen utilizado entre pH 8,6 y 4,0. Por otro lado, eliminar el CO2 de los v ml de vino apartados para la determinacin testigo, agitando bajo vaco durante tres minutos y calentando el matraz en un bao de agua a 25 C aproximadamente. Tomar 10 ml de vino desprovisto de CO2 en 30 ml de agua destilada hervida, aadir 2 o 3 gotas de solucin de hidrxido de sodio (punto 2.2.2.1) para llevar el pH a 10-11. Aplicar despus el procedimiento anterior. Sea n ml el volumen de cido sulfrico 0,05 M empleado.
2.2.4.
Expresin de los resultados 1 ml de solucin de cido sulfrico 0,05 M corresponde a 4,4 mg de CO2. Vaciar la botella del vino alcalinizado y determinar con una aproximacin de 1 ml el volumen inicial de vino, llenndola con agua hasta la marca, sea V ml. La cantidad de CO2 en gramos por litro de vino se expresa mediante la frmula siguiente: 0,44 (n n) x ((V v + 20)/(V v)) indicando 2 decimales.
2.3.
Clculo de la sobrepresin terica La sobrepresin a 20 C, Paph20, expresada en pascales, viene dada por la frmula: Paph20 = ((Q)/(1,951 10-5(0,86 0,01 A)(1 0,00144 S))) - Patm siendo: Q: A: S: Patm: contenido en gramos de CO2 por litro de vino grado alcohlico del vino a 20 C contenido en azcares del vino en gramos por litro presin atmosfrica expresada en pascales.
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18 DETERMINACIN DEL DIXIDO DE CARBONO EN EL VINO POR MTODO MANOMTRICO (OIV-AS314-04-CO2MAN) MTODO DE TIPO II (p.m.) [La descripcin de este mtodo de anlisis est siendo objeto de actualizacin por parte de las instancias de la OIV. Esta descripcin se publicar en una prxima Comunicacin de la Comisin en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edicin 2010 del Compendio de mtodos internacionales de anlisis de la OIV].
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19 MEDICIN DE LA SOBREPRESIN DE LOS VINOS ESPUMOSOS Y DE AGUJA (OIV - AS-314-02SURPRES) MTODO DE TIPO I 1. PRINCIPIO Tras la estabilizacin trmica y agitacin de la botella, se mide la sobrepresin por medio de un afrmetro (calibre de presin). La sobrepresin se expresa en pascales (Pa) (mtodo de tipo I). Este mtodo tambin es aplicable a los vinos espumosos gasificados y a los vinos de aguja gasificados. 2. MATERIAL El aparato que se utiliza para medir la sobrepresin en las botellas de vinos espumosos y de aguja se llama afrmetro. Tiene distintas presentaciones que dependen del cierre de la botella (cpsula metlica, corona, tapn de corcho o de plstico). 2.1. Botellas con cpsula o corona Consta de tres partes (figura 1): La parte superior (o tornillo porta agujas), compuesta por un manmetro, una rueda de ajuste manual, un tornillo sinfn que se desliza en la parte media y una aguja que atraviesa la cpsula. La aguja tiene una perforacin lateral que comunica la presin al manmetro. Una junta que queda sobre la cpsula de la botella garantiza la hermeticidad del conjunto. La parte media (o tuerca), que sirve para centrar la parte superior. Se atornilla a la parte inferior de forma que el aparato quede fuertemente sujeto a la botella. La parte inferior (o estribo), provista de un espoln que se desliza bajo el anillo de la botella y sujeta todo el aparato. Existen anillos adaptados a cada tipo de botella. 2.2. Botellas con tapn Consta de dos partes (figura 2): La parte superior es idntica a la del aparato precedente, aunque la aguja es ms larga. Esta ltima est formada por un tubo largo y hueco en cuyo extremo se halla una punta que permite perforar el tapn. La punta es amovible y cae dentro de la botella una vez que se ha perforado el tapn. La parte inferior, formada por la tuerca y una base que se coloca sobre el tapn. La base tiene cuatro tornillos de ajuste con los que se sujeta el aparato al tapn.
Figura 2: Afrmetro para tapones
Figura 1: Afrmetro para cpsulas
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Observaciones sobre los manmetros que llevan estos dos tipos de aparato: Pueden ser mecnicos con tubo de Bourdon o numricos con sensor piezoelctrico. En el primer caso, el tubo de Bourdon debe ser obligatoriamente de acero inoxidable. Deben estar graduados en pascales (smbolo Pa). Para los vinos espumosos, lo ms prctico es utilizar como unidad 105 pascales (105 Pa) o el kilopascal (kPa). Pueden ser de distintas clases. La clase de un manmetro es la precisin de la lectura respecto de la escala completa expresada en porcentaje (ejemplo: manmetro 1 000 kPa clase 1 significa presin mxima de utilizacin de 1 000 kPa y lectura con precisin de 10 kPa). Para mediciones precisas se recomienda la clase 1. 3. PROCEDIMIENTO La medicin debe efectuarse con botellas cuya temperatura lleve estabilizada 24 horas, como mnimo. Para efectuar la lectura, se perfora la corona o el tapn de corcho o plstico y se agita vigorosamente la botella hasta alcanzar una presin constante. 3.1. Botellas con cpsula o corona Deslizar el espoln del estribo bajo el anillo de la botella. Apretar la tuerca hasta que el conjunto quede ajustado a la botella. Enroscar la parte superior en la tuerca. Para evitar prdidas de gas, debe perforarse la cpsula lo ms rpidamente posible hasta que la junta quede en contacto con la cpsula. A continuacin, se agita con fuerza la botella hasta alcanzar una presin constante para efectuar la lectura. 3.2. Botellas con tapn Colocar una punta en el extremo de la aguja. Disponer el aparato sobre el tapn. Ajustar los cuatro tornillos al tapn. Enroscar la parte superior (la aguja perfora entonces el tapn). La punta debe caer dentro de la botella para que la presin se transmita al manmetro. Efectuar la lectura despus de agitar la botella hasta alcanzar una presin constante. Recuperar la punta despus de la lectura. 4. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS La sobrepresin a 20 C (Paph20) se expresa en pascales (Pa) o kilopascales (kPa). Deber concordar con la precisin del manmetro (por ejemplo: 6,3 105 Pa o 630 kPa y no 6,33 105 Pa o 633 kPa si se utiliza un manmetro de 1 000 kPa de escala completa y de clase 1). Cuando la temperatura de medicin no sea de 20 C, conviene corregir el resultado multiplicando la presin medida por el coeficiente que corresponda (vase la tabla 1). Tabla 1 Relacin entre la sobrepresin Paph20 de un vino de aguja o espumoso a 20 C y la sobrepresin Papht a una temperatura t
C C
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1,85 1,80 1,74 1,68 1,64 1,59 1,54 1,50 1,45 1,40 1,36 1,32 1,28
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
1,24 1,20 1,16 1,13 1,09 1,06 1,03 1,00 0,97 0,95 0,93 0,91 0,88
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5.
CONTROL DE LOS RESULTADOS Mtodo de determinacin directa de parmetros fsicos (mtodo criterio de tipo I) Verificacin de los afrmetros Los afrmetros deben verificarse peridicamente (al menos una vez al ao). La verificacin se realiza con un banco de calibracin. ste permite comparar el manmetro con un manme tro de referencia, de clase superior, conectado a los patrones nacionales y montado en paralelo. En el control, se comparan los valores indicados por los dos aparatos para presiones crecientes y, despus, para presiones decrecientes. Si hay alguna diferencia entre ambos, se efectan las correcciones necesarias mediante un tornillo de regulacin. Todos los laboratorios y organismos autorizados estn equipados con bancos de calibracin de este tipo. Tambin los constructores de manmetros disponen de ellos.
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20 DETERMINACIN DE LA LISOZIMA EN EL VINO POR HPLC (OIV-AS-315-14) MTODO DE TIPO IV 1. INTRODUCCIN Es preferible utilizar para la lisozima un mtodo analtico que no est basado en la actividad enzimtica. 2. MBITO DE APLICACIN Este mtodo permite la cuantificacin de la lisozima (mg de protena/l) presente en los vinos blancos y tintos, independientemente de la actividad enzimtica (que podra verse afectada por una desnaturalizacin parcial o por fenmenos de complejacin o de coprecipitacin) de la matriz. 3. DEFINICIN La cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR o, en ingls, HPLC) ofrece un enfoque analtico basado en interacciones de tipo estrico, polar o de adsorcin entre la fase estacionaria y el analito y, en consecuencia, sin relacin con la actividad enzimtica real de la protena. 4. PRINCIPIO El anlisis se efecta mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) a la que se asocia un detector espectrofotomtrico y un detector espectrofluorimtrico. El contenido de lisozima en la muestra de vino se calcula en funcin de la superficie del pico cromatogrfico utilizando el mtodo del patrn externo. 5. 5.1. REACTIVOS Disolventes y soluciones Acetonitrilo (CH3CN) para anlisis HPLC cido trifluoroactico (TFA) puro Agua desionizada para anlisis HPLC Solucin patrn: cido tartrico 1 g/l, alcohol etlico al 10 % v/v con el pH ajustado a 3,2 con tartrato de potasio neutro 5.2. Eluyentes A: CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 % B: CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 % 5.3. Soluciones de referencia De 1 a 250 mg/L de lisozima patrn disuelta en la solucin modelo mediante agitacin continua durante un mnimo de 12 horas. 6. 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 7. MATERIAL Aparato de HPLC con sistema de bombeo capaz de efectuar un gradiente de elucin Recinto para columna termosttica (horno) Detector espectrofotomtrico asociado a un detector espectrofluorimtrico Bucle de inyeccin de 20 L Columna polimrica de fase inversa con grupos funcionales fenilo (dimetro de los poros = 1 000 , lmite de exclusin = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7,5 cm 4,6 mm ID, por ejemplo Precolumna del mismo material que la columna, Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm 3,2mm ID, por ejemplo PREPARACIN DE LA MUESTRA Las muestras de vino se acidifican con HCl (10 M) diluido al 1/10 y se pasan, cinco minutos tras la adicin, por un filtro de poliamida cuyos poros tienen un dimetro de 0,22 m. El anlisis cromatogrfico se efecta inmediatamente despus de la filtracin. 8. 8.1. 8.2. CONDICIONES DE FUNCIONAMIENTO Flujo de eluyente: 1 ml/min Temperatura de la columna: 30 C
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8.3. 8.4. 8.5.
Deteccin espectrofotomtrica: 280 nm Deteccin espectrofluorimtrica: ex = 276 nm ; em = 345 nm ; Ganancia (Gain) = 10 Programa del gradiente de elucin
Tiempo (min) Sol A % Sol B % Gradiente
100
0 isocrtico
100
0 lineal
10
65
35 isocrtico
15
65
35 lineal
27
40,5
59,5 lineal
29
100 isocrtico
34
100 lineal
36
100
0 isocrtico
40 8.6. 9.
100
Tiempo de retencin media de la lisozima: 25,50 minutos CLCULO Las soluciones de referencia que contienen las concentraciones siguientes de lisozima se analizan por triplicado: 1, 5, 10, 50, 100, 200, y 250 mg/l. En cada cromatograma, se llevan a un diagrama las reas bajo el pico correspondiente a la lisozima, en funcin de sus concentraciones respectivas, con el fin de obtener las rectas de regresin lineal expresadas por la frmula y = ax+b. El coeficiente de determinacin r2 deber ser > 0,999.
10.
CARACTERSTICAS DEL MTODO Con el fin de evaluar la aptitud del mtodo para el objetivo formulado, se ha efectuado un estudio de validacin teniendo en cuenta la linealidad, los lmites de deteccin y de cuantificacin, y la precisin del mtodo. Este ltimo parmetro se ha determinado definiendo el nivel de precisin y de exactitud del mtodo.
Banda de linealidad (mg/l) Coeficiente de Pendiente de determinacin LD (mg/l) la recta (r2) Repetibilidad (n = 5) DTR % Patr.1 V.T.2 V.B.3 Reproducibilidad (n = 5) DTR % Patr.1
LC (mg/l)
UV FL D
5-250 1-250
3 786 52 037
0,9993 0,9990
1,86 0,18
6,20 0,59
4,67 2,61
5,54 2,37
0,62 0,68
1,93 2,30
Cuadro 1: Datos relativos a las caractersticas del mtodo: Patr.1: solucin patrn; V.T.2: vino tinto; V.B.3: vino blanco.
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10.1.
Linealidad del mtodo Segn los resultados obtenidos gracias al anlisis de regresin lineal se ha visto que el mtodo es lineal en las bandas indicadas en el cuadro 1.
10.2.
Lmite de deteccin y de cuantificacin El lmite de deteccin (LD) y el lmite de cuantificacin (LC) se han calculado como la seal equivalente al triple y al dcuplo, respectivamente, del ruido de fondo cromatogrfico en condiciones de trabajo con una matriz real (cuadro 1).
10.3.
Precisin del mtodo Los parmetros que se han tomado en consideracin son la repetibilidad y la reproducibilidad. El cuadro 1 indica los valores de estos parmetros (expresados como porcentaje de desviacin tpica de las medidas repetidas con diferentes concentraciones) que se han obtenido con la solucin patrn, con vino blanco y con vino tinto
10.4.
Exactitud del mtodo Se ha calculado el porcentaje de recuperacin con las soluciones patrn que contienen 5 et 50 mg/L de lisozima, a las que se ha aadido una cantidad determinada de esta sustancia, como se indica en el cuadro siguiente:
[C] inicial no minal (mg/l) Adicin (mg/l) [C] terica (mg/l) [C] obtenida (mg/l) Desviacin t pica Recuperacin %
UV 280 nm FD UV 280 nm FD
50 50 5 5
13,1 13,1 14,4 14,4
63,1 63,1 19,4 19,4
62,3 64,5 17,9 19,0
3,86 5,36 1,49 1,61
99 102 92,1 97,7
Figura 1. Cromatograma de vino tinto con lisozima pura (se ha aadido al vino una solucin patrn con 1 000 mg/l de lisozima para obtener una concentracin final de 125 mg/l de lisozima). A: detector de UV a 280 nm; B: detector de UV a 225 nm; C: detector de FLD ( ex 276 nm; em = 345 nm).
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21 SULFATOS (OIV-AS-321-05-SULFAT) MTODO DE TIPO II 1. 1.1. PRINCIPIO DE LOS MTODOS Mtodo de referencia Precipitacin del sulfato de bario y pesada. El fosfato de bario precipitado en las mismas condiciones es eliminado por lavado del precipitado con cido clorhdrico. En caso de mostos o vinos ricos en dixido de azufre, est indicado un desulfitado previo por ebullicin al abrigo del aire. 1.2. Mtodo rpido de ensayo Clasificacin de los vinos en varias categoras por el mtodo llamado de los lmites, basado en la precipitacin del sulfato de bario mediante una solucin valorada de in bario. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.2. 2.2.1. MTODO DE REFERENCIA Reactivos cido clorhdrico, solucin 2 M. Cloruro brico en solucin de 200 g/l de BaCl22 H2O. Procedimiento Caso general En un tubo de centrfuga de 50 ml, introducir 40 ml de la muestra problema; aadir 2 ml de cido clorhdrico 2 M y 2 ml de solucin de cloruro brico de 200 g/l; agitar con la varilla de vidrio; lavar la varilla con un poco de agua destilada y dejar en reposo durante 5 minutos. Centrifugar durante 5 minutos y decantar con precaucin el lquido sobrenadante. Lavar a continuacin el precipitado de sulfato brico de la forma siguiente: aadir 10 ml de cido clorhdrico 2 M, poner el precipitado en suspensin y centrifugar durante 5 minutos. Separar con precaucin el lquido sobrenadante. Repetir 2 veces el lavado del precipitado en las mismas condiciones con 15 ml de agua destilada cada vez. Trasvasar cuantitativamente el precipitado, lavando con agua destilada, a una cpsula de platino tarada y colocarla en un bao Mara a 100 C hasta evaporacin a sequedad. El precipitado desecado se calcina varias veces brevemente sobre una llama hasta la obtencin de un residuo blanco. Dejar enfriar en un desecador y pesar. Sea m la masa en miligramos de sulfato de bario obtenida. 2.2.2. Caso particular: mostos sulfitados y vino con un contenido elevado de dixido de azufre. Proceder previamente a la eliminacin del dixido de azufre. En un matraz Erlenmeyer de 500 ml, provisto de un embudo de decantacin y de un tubo de salida de vapor, introducir 25 ml de agua y 1 ml de cido clorhdrico puro (20 = 1,15 1,18 g/ml). Hervir para expulsar el aire e introducir por el embudo de decantacin 100 ml de vino, manteniendo la ebullicin. Continuar la ebullicin hasta que el volumen del lquido contenido en el matraz se reduzca a unos 75 ml y trasvasarlo cuantitativamente, despus de enfriar, a un matraz aforado de 100 ml. Enrasar con agua. Proceder a la valoracin de los sulfatos con una porcin de 40 ml como se indica en el punto 2.2.1. 2.3. 2.3.1. Expresin de los resultados Clculos El contenido en sulfatos, expresado en miligramos por litro de sulfato de potasio, K2SO4, es: 18,67 m El contenido en sulfatos de mostos o vinos se expresa en miligramos por litro de sulfato de potasio, sin decimales. 2.3.2. Repetibilidad Hasta 1 000 mg/l: r = 27 mg/l Alrededor de 1 500 mg/l: r = 41 mg/l 2.3.3. Reproducibilidad Hasta 1 000 mg/l: R = 51 mg/l Alrededor de 1 500 mg/l: R = 81 mg/l
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22 HIERRO (OIV-AS-322-05-FER) MTODO DE TIPO IV 1. PRINCIPIO DE LOS MTODOS MTODO DE REFERENCIA El hierro se determina directamente por espectrofotometra de absorcin atmica, previa dilucin del vino y eliminacin del alcohol. MTODO USUAL Despus de la mineralizacin del vino con perxido de hidrgeno, el hierro que se encuentra en forma de hierro III se reduce al estado de hierro II y se determina por la coloracin roja que se produce con la ortofenantrolina. 2. 2.1. 2.1.1. MTODO DE REFERENCIA Reactivos Solucin patrn concentrada de hierro III, de 1 g/l. Utilizar una solucin patrn comercial de 1 g/l. Esta solucin puede prepararse disolviendo 8,6341 g de sulfato de hierro III y de amonio (FeNH4(SO4)212 H2O) en agua destilada ligeramente acidificada con cido clorh drico M y llevando el volumen a 1 litro. 2.1.2. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3. 2.3.1. Solucin patrn diluida de hierro, de 100 miligramos por litro. Material Rotavapor con bao Mara termosttico. Espectrofotmetro de absorcin atmica provisto de mechero alimentado con aire y acetileno. Lmpara de ctodo hueco de hierro. Procedimiento Preparacin de la muestra Eliminar el alcohol del vino mediante reduccin a la mitad del volumen de la muestra en un rotavapor (5060 C). Llevarlo de nuevo a su volumen inicial con agua destilada. Si fuera necesario, efectuar una dilucin previa a la determinacin. 2.3.2. Calibrado En una serie de cinco matraces aforados de 100 ml, echar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solucin de hierro de 100 miligramos por litro (punto 2.1.2) y completar hasta 100 ml con agua destilada. Las soluciones preparadas tendrn un contenido de hierro de 1, 2, 3, 4 y 5 mg por litro. Estas soluciones se conservarn en frascos de polietileno. 2.3.3. Determinacin Seleccionar la longitud de onda a 248,3 nm. Regular el cero de la escala de absorbancias con agua destilada. Aspirar directamente la muestra diluida en el quemador del espectrofotmetro, y seguidamente hacer lo mismo con las soluciones patrn preparadas como se indica en el punto 2.3.2. Tomar las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado. 2.4. 2.4.1. Expresin de los resultados Modo de clculo Trazar la curva de variacin de la absorbancia en funcin de la concentracin de hierro de las soluciones patrn. Llevar a esta curva el valor medio de la absorbancia obtenida con la muestra de vino diluido y determinar la concentracin en hierro C. La concentracin en hierro, expresada en miligramos por litro de vino con 1 decimal, ser: C F F = factor de dilucin
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23 COBRE (OIV-AS-322-06) MTODO DE TIPO IV 1. PRINCIPIO DEL MTODO Empleo de la espectrofotometra de absorcin atmica. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. MATERIAL Cpsula de platino. Espectrofotmetro de absorcin atmica. Lmpara de ctodo hueco de cobre. Gas de alimentacin: aire/acetileno o protxido de nitrgeno /acetileno. REACTIVOS Cobre metlico. cido ntrico concentrado al 65 % (HNO3, 20 = 1,38 g/ml). cido ntrico diluido al 1/2 (v/v). Solucin de cobre de 1 g/l. Utilizar una solucin patrn de cobre comercial de 1 g/l. Esta solucin puede prepararse pesando 1 000 g de cobre metlico y transfiriendo este cuantitativamente a un matraz aforado de 1 000 ml. Aadir cido ntrico diluido al 1/2 (punto 3.3) en cantidad estrictamente suficiente para disolver el metal, aadir 10 ml de cido ntrico concentrado (punto 3.2) y enrasar con agua bidestilada. 3.5. Solucin de cobre de 100 mg/l. Tomar 10 ml de la solucin 3.4, introducirlos en un matraz aforado de 100 ml y enrasar con agua bidestilada. 4. 4.1. PROCEDIMIENTO Preparacin de la muestra y determinacin del cobre Tomar 20 ml de la muestra, introducirlos en un matraz aforado de 100 ml y enrasar con agua bidestilada. Modificar la dilucin en caso necesario. Leer con el espectrofotmetro de absorcin atmica la absorbancia de la muestra diluida, a la longitud de onda de 324,8 nm, tras haber regulado el cero de la escala de absorbancias con agua destilada. En caso necesario, preparar una dilucin adecuada con agua bidestilada. 4.2. Determinacin de la curva patrn Tomar 0,5, 1 y 2 ml de la solucin del punto 3.5 (100 mg de cobre por litro), introducirlos en sendos matraces aforados de 100 ml y enrasar con agua bidestilada; las soluciones obtenidas contendrn respectiva mente 0,5, 1 y 2 mg/l de cobre. Con los valores de absorbancias de estas soluciones, medidas como se especifica en el punto 4.1, trazar la curva patrn. 5. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Trasladar a la curva patrn la absorbancia leda con la muestra de vino diluido y determinar la concentracin C en mg/l. Si F es el factor de dilucin, el contenido en cobre del vino ser, en miligramos por litro, F x C. El resultado se dar con 2 decimales. Comentarios: (a) Las soluciones para determinar la curva patrn y las diluciones de la muestra deben elegirse en cualquier caso en funcin de la sensibilidad del aparato utilizado y de la concentracin del cobre presente en la muestra.
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(b) Cuando en la muestra hay concentraciones muy bajas de cobre, el procedimiento es el siguiente: poner 100 ml de muestra en una cpsula de platino, concentrar por evaporacin en un bao Mara a 100 C hasta que adquiera una consistencia de jarabe, aadir, gota a gota, 2,5 ml de cido ntrico concentrado (punto 3.2) intentando cubrir todo el fondo de la cpsula. Incinerar con precaucin el residuo en una placa calentadora elctrica o sobre una pequea llama; introducir a continuacin la cpsula en un horno de mufla regulado a 500 C 25 C y mantenerla all una hora aproximadamente. Cuando se haya enfriado, humedecer las cenizas con 1 ml de cido ntrico concentrado (punto 3.2), triturndolas con una pequea varilla de vidrio, evaporar e incinerar de nuevo como en el caso anterior. Poner otra vez la cpsula en el horno durante 15 minutos; repetir tres veces, como mnimo, este tratamiento con cido ntrico concen trado. Solubilizar las cenizas aadiendo en la cpsula 1 ml de cido ntrico concentrado (punto 3.2) y 2 ml de agua bidestilada; pasar a un matraz aforado de 10 ml. Lavar la cpsula tres veces con 2 ml de agua bidestilada cada vez y enrasar con agua bidestilada. Proceder a la determinacin como se indica en el punto 4.1, utilizando los 10 ml de solucin; tener en cuenta el factor de concentracin a la hora de expresar los resultados.
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24 DIXIDO DE AZUFRE (OIV-AS-323-04-DIOSU) MTODO DE TIPO II 1. DEFINICIONES Se denomina dixido de azufre al dixido de azufre presente en el mosto o en el vino en las formas siguientes: H2SO3 y HSO3, cuyo equilibrio es funcin del pH y de la temperatura: H2SO3 H+ + HSO3 H2SO3 representa el dixido de azufre molecular. Se denomina dixido de azufre total al conjunto de las distintas formas de dixido de azufre presentes en el vino en estado libre o combinado con sus componentes. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.1.1. DIXIDO DE AZUFRE LIBRE Y TOTAL Principio de los mtodos Mtodo de referencia Vinos y mostos Arrastre del dixido de azufre con una corriente de aire o de nitrgeno; fijacin y oxidacin por borboteo en una solucin diluida y neutra de perxido de hidrgeno. Valoracin del cido sulfrico formado con una solucin valorada de hidrxido sdico. El dixido de azufre libre se extrae del vino por arrastre en fro (a 10 C). El dixido de azufre total se extrae del vino por arrastre en caliente (a 100 C aproximadamente). 2.1.1.2. Mostos concentrados rectificados Se extrae el dixido de azufre total por arrastre en caliente (aproximadamente 100 C) del mosto concentrado rectificado previamente diluido. 2.1.2. Mtodo rpido de ensayo (vinos y mostos) Determinacin del dixido de azufre libre por valoracin yodomtrica directa. Determinacin del dixido de azufre combinado por valoracin yodomtrica tras hidrlisis alcalina. La suma del dixido de azufre libre y combinado permite obtener el dixido de azufre total. 2.2. 2.2.1. 2.2.1.1. Mtodo de referencia Material El material utilizado debe ajustarse al esquema que figura a continuacin, principalmente en lo que se refiere al refrigerante.
Figura 1 Las dimensiones estn indicadas en milmetros. Los dimetros internos de los 4 tubos concntricos que constituyen el refrigerante son: 45, 34, 27 y 10 mm.
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El tubo de conduccin de los gases al borboteador B termina en una pequea esfera de 1 cm de dimetro que lleva, en su mayor crculo horizontal, 20 agujeros de 0,2 mm de dimetro. Tambin puede terminar en una placa de vidrio fritado que permita la formacin de gran nmero de pequeas burbujas, realizando as un buen contacto entre las fases gaseosa y lquida. El flujo de gas que debe recorrer el aparato ha de ser de 40 l/h aproximadamente. El frasco situado a la derecha del aparato se destina a limitar de 20 a 30 cm de agua la depresin producida por la trompa de agua. Para poder regular dicha depresin de forma que el caudal sea el correcto, conviene colocar un medidor de flujo de tubo semicapilar entre el borboteador y el frasco. 2.2.1.2. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. Microbureta Reactivos cido fosfrico al 85 % (H3PO4) (20 = 1,71 g/ml) Solucin de perxido de hidrgeno de 9,1 g de H2O2/l (3 volmenes). Reactivo indicador: Rojo de metilo................................................................ ................................................................................................ ... 100 mg Azul de metileno ................................................................................................ .............................................................. 50 mg Alcohol de 50 % vol. ......................................................................... ............................................................................. 100 ml 2.2.2.4. 2.2.3. 2.2.3.1. Solucin de hidrxido de sodio (NaOH), 0,01 M Determinacin del dixido de azufre libre Procedimiento El vino debe mantenerse a 20 C en un frasco lleno y cerrado durante 2 das antes de la determinacin. En el borboteador B, colocar de 2 a 3 ml de solucin de perxido de hidrgeno (punto 2.2.2.2) y 2 gotas de reactivo indicador; neutralizar a continuacin la solucin de perxido de hidrgeno con la solucin 0,01 M de hidrxido de sodio (punto 2.2.2.4). Acoplar el borboteador al aparato. En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de muestra y 15 ml de cido fosfrico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato. A continuacin, hacer borbotear el aire (o el nitrgeno) durante 15 minutos. El dixido de azufre libre arrastrado se oxida a cido sulfrico. Retirar el borboteador del aparato y valorar el cido formado con la solucin de hidrxido sdico 0,01 M (punto 2.2.2.4). Sea n el nmero de mililitros utilizados. 2.2.3.2. Expresin de los resultados Dixido de azufre libre en mg/l sin decimales 2.2.3.2.1. Clculo Dixido de azufre libre en miligramos por litro: 6,4 n. 2.2.4. 2.2.4.1 Determinacin del dixido de azufre total Procedimiento
2.2.4.1.1. En el caso del mosto concentrado rectificado, utilizar la solucin obtenida diluyendo la muestra problema al 40 % (m/v), tal y como se indica en el captulo Acidez total, en el punto 5.1.2. En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de esta solucin y 5 ml de cido fosfrico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato. 2.2.4.1.2. Vinos y mostos Muestras en las que se suponga que el contenido en SO2 total sea 50 mg/l. En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de muestra y 15 ml de cido fosfrico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato. Muestras en las que se suponga que el contenido en SO2 total sea 50 mg/l. En el matraz A de 100 ml del aparato de arrastre introducir 20 ml de muestra y 5 ml de cido fosfrico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato.
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Introducir en el borboteador B de 2 a 3 ml de solucin de perxido de hidrgeno (punto 2.2.2.2), neutralizarla como se ha hecho anteriormente, llevar a ebullicin el vino contenido en el matraz A con una pequea llama de 4 a 5 cm de altura que debe lamer directamente el fondo del matraz. No colocar bajo el matraz ninguna tela metlica, sino depositarlo sobre un disco perforado con un agujero de 30 mm de dimetro. Se evita as la pirogenacin de las materias extractivas del vino sobre las paredes del matraz. Mantener la ebullicin durante el paso de la corriente de aire (o de nitrgeno). En 15 minutos el dixido de azufre total habr sido arrastrado y oxidado. Valorar con la solucin 0,01 M de hidrxido de sodio (punto 2.2.2.4) el cido sulfrico formado. Sea n el nmero de mililitros utilizados. 2.2.4.2. Expresin de los resultados El dixido de azufre total se expresa en miligramos por litro (mg/l) o en miligramos por kilogramo (mg/kg) de azcares totales, sin decimales. 2.2.4.2.1. Clculo Vinos y mostos Dixido de azufre total en miligramos por litro: Muestras con bajo contenido en dixido de azufre (muestra de 50 ml): 6,4 n Otras muestras (muestra de 20 ml): 16 n Mostos concentrados rectificados Dixido de azufre en miligramos por kilo de azcares totales (con 50 ml de muestra preparada) (punto 2.2.4.1.1): (1600 n)/(P) P = contenido en % (m/m) de azcares totales 2.2.3.4.2. Repetibilidad (r) Contenido < 50 mg/l (muestra de 50 ml), r = 1 mg/l Contenido > 50 mg/l (muestra de 20 ml), r = 6 mg/l 2.2.3.4.3. Reproducibilidad (R) Contenido < 50 mg/l (muestra de 50 ml), R = 9 mg/l Contenido > 50 mg/l (muestra de 20 ml), R = 15 mg/l

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19.2.

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COMUNICACIONES QUE PROCEDAN DE LAS INSTITUCIONES, RGANOS Y ORGANISMOS DE LA UNIN EUROPEA

Densidad absoluta/relativa ndice refractomtrico Extracto seco total Relacin isotpica

AS-2-01-MASVOL AS-2-02-SUCREF AS-2-03-EXTSEC del agua del vino AS-2-09-MOUO18

299 de 16.11.2007. 193 de 24.7.2009, p. 1. 88 de 29.3.2007, p. 29. 70 de 9.3.2006, p. 12.

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Mtodo del Compendio de la OIV

del etanol del vino

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MTODO DE REFERENCIA Material Material corriente de laboratorio, y en particular:

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2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml

2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml 0,20 ml

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IAEA-CH-6 IAEA-CH-7 NBS22 USGS24

sacarosa polietileno aceite grafito

10,4 31,8 29,7 16,1

disponibles en el IRMM (Instituto de Materiales y Medidas de Referencia) de Geel (B):

CRM/BCR 656 CRM/BCR 657 CRM/BCR 660

alcohol de vino glucosa solucin hidroalcohlica (gradua cin alcohlica 12 % vol.)

26,93 10,75 26,72

Muestra patrn de trabajo con una relacin internacionales.

conocida, calibrada frente a materiales de referencia

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de la muestra y del dixido de

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Cdigo de las muestras

Alcohol de origen vnico

A & G B & C D & F E & I H & K J& L

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38 25,32 0,0064 0,08 0,22 0,0389 0,20 0,55

36 26,75 0,0077 0,09 0,25 0,0309 0,18 0,49

34 27,79 0,0031 0,06 0,16 0,0382 0,20 0,55

38 25,26 0,0127 0,11 0,32 0,0459 0,21 0,60

38 26,63 0,0069 0,08 0,23 0,0316 0,18 0,50

38 12,54 0,0041 0,06 0,18 0,0584 0,24 0,68

Nmero de muestras: Analito:

7 7 26,20 0,0525 0,23 0,64

7 7 26,20 0,0740 0,27 0,76

8 8 25,08 0,0962 0,31 0,87

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N: nmero de laboratorios participantes