Aflatoxinas. Una revision

Aflatoxinas. Una revision Alexandre Ricardo Pereira Schuler Óscar Mauricio Bernal Gómez Mestre em Ciéncia (Química Orgánica)-UFRJ Coordenador do Curso de Gradua9a-o em Química Industrial da UFPE Zootecnista, Universidad Nacional de Colombia, Maestría en Nutrición, área de concentración: Ciencia de los alimentos, Recife- PE, Brasil esu en PALABRAS CLAVE: Micotoxinas, Toxicología, Degradación, Cáncer, Alimentos En el presente trabajo son discutidos desde el punto de vista teórico, los ultimos avances en el área de aflatoxinas: estructura, propiedades químicas, biosíntesis, activación del citocromo p-450, aflatoxina B1 y ácidos nucléicos, relación entre aflatoxina B1 y el gen p53; factores que favo- recen los brotes de aflatoxicosis, síntomas clínicos y efectos tóxicos. También son abordados los temas de detoxificación enzimática, métodos químicos, físicos y microbiológicos de degradación e inactivación de estos agentes. Aflatoxins. A review urnmary KEY WOR DS: Micotoxins, Toxicology, Degradation, Cancer, Foods In this report are discussed from a theoretical point of view, the newest advances in the aflatoxins area: structure, chemical properties, biosynthesis, p-450 citocrom activation, aflatoxin B1 and nucleic acids, the relationship between the aflatoxin B1 and the p53 gen, fac- tors that favor aflatoxicosis outbreaks, clinical symptoms and toxic effects. Topics such as enzymatic detoxification, chemical, physical and microbiological methods of degradation and inactivation of these agents are also addressed. Perspectivas en Nutrición Humana 65 INTRODUCCIÓN donde la incidencia de cáncer hepático es alta, las aflatoxinas están presentes, habitualmente, en la alimentación humana Los primeros estudios sobre aflatoxinas fueron hechos en 1960 en Inglaterra, debido a la muerte de aproximadamente 100.000 pavos, los cuales consumieron torta de maní que provenía de Brasil y Nigeria. Las aves morían en el período de una semana, siendo sus síntomas la pérdida del apetito, disminución de la movilidad, debilidad de las piernas y lesiones necróticas en el hígado (Martins, 1979). Cuatro años después de la identificacion de las aflatoxinas, se demostró su ocurrencia en varios alimentos, destinados no solamente para animales, sino también para humanos. En Malasia un levantamiento en varios productos como maní sin cáscara y tortas de maní, ajonjolí, coco, soya y maíz en un total de 69 muestras, indicó que apenas 25 de las mismas estaban exentas de aflatoxinas (Lim & Yeap, 1966). Investigaciones en el mundo entero revelaron que el maní y sus derivados son susceptibles a la acción de las micotoxinas. En Canadá en 1970, 26 % de las muestras presentaron una contaminación por encima del patrón establecido por la OMS, de 30 ppb de aflatoxinas B1 y Gl (Gelda & Luyt, 1977). En Argentina, 47 % de las muestras variaron entre 100 y 1.000 ppb de aflatoxinas totales (Varsavsky & Sumer 1977). Crowter citado por Fonseca (1969), describió su presencia en salvados con índice de toxicidad altos, llegando hasta 4.000 ppb de AFB, e 3.000 ppb de AFG1. 66 No 4, mayo de 2001 Oettle, 1965, citado por Butler (1974) formuló la hipótesis de la asociación entre la presencia de carcinoma hepático y el consumo de alimentos contaminados con aflatoxinas en áreas del África SubSahariana y en el Sudoeste Asiático; regiones del planeta con alta incidencia de esta enfermedad, sugiriendo que factores como hepatitis viral, infestación por parásitos, hemosiderosis, kwashiorkoro la ingestión de alcaloides tóxicos de la pirridolizina contribuyen con la aparición de las neoplasias del hígado. En Kenia, Suazilandia, Tailandia y Mozambique, donde la incidencia de cáncer hepático es alta, las aflatoxinas están presentes, habitualmente, en la alimentación humana. La carcinogenicidad de las aflatoxinas ha sido demostrada en varias especies animales. AFB, induce tumores malignos en rata, ratón doméstico, mono, pato, salmón y trucha; el hígado es el órgano blanco para este compuesto. Algunos tumores en el pulmón también fueron observados en ratón doméstico. En ratas aparecieron tumores renales e intestinales, cuando fueron tratados con AFB, . La AFB, produce efectos carcinogénicos en muchas especies después de exposiciones a dosis bajas (1 mg/kg). en la dieta). Las AFG1 e AFB, son también reportadas corno inductoras de tumores hepáticos en algunas especies animales. El objetivo de este trabajo es divulgar conocimientos científicos básicos sobre las aflatoxinas y proporcionar una alternativa de estudio que busca la disminución de los riesgos para la salud humana y animal; de la misma manera, intenta proporcionar una herramienta para disminuir las pérdidas económicas en la industria de alimentos concentrados y de los granos, en general. REVISIÓN DE LITERATURA Las micotarinas son metabo/t1os secundarios producidos por hongos ,olíncipalmente, en e/ fina/ de /a fase exponency á / y en inicio de /a fase estacionaria de crecímténto, si» embargo, no son sustancias metabólicamente esencyá/es para /os mícrorganismos (Butlef; 1974). E/ ter/77/170 /71/COialika llene SU 0/1.017 de/ griego "MYKOS" que signika hongo y de//al,» "TOXICOM" que sig/7/§Ca veneno. Las allatoxinas son producidas por hongos de/genero Aspergillus: A. flavus Link yA. parasiticus Speare (Bastos, COMU/7/C17clon personal, 1997). 1. BIOQUÍMICA DE LAS AFLATOXINAS A través de cromatografía de capa delgada, Sargeant e/ al (1961) determinaron las diferentes aflatoxinas y su fluorescencia en luz ultravioleta. Una fracción presentó fluorescencia azul (b/ue) y otra verde (green); fueron designadas como Aflatoxina B e Aflatoxina G, respectivamente. Independientemente, Van Der Zidjen eta/. 1962 y De longh eta! (1962), aislaron dos componentes fluorescentes con fórmulas empíricas similares. Hartley e/ al (1963) aislaron cuatro compuestos fluorescentes a la luz ultravioleta, utilizando el mismo método analítico, los cuales fueron designados como aflatoxina B„ B2, G, y G2 en orden decreciente de Rf. Butler, 1974, indica que vacas alimentadas con torta de maní contaminada con aflatoxinas excretaron un factor tóxico en la leche con el mismo efecto biológico que la aflatoxina B1, ese compuesto fue denominado toxina de la leche (mí/kiffi/2). Holzaptel el al (1965), identificaron otros dos compuestos de la orina de ovejas que fueron alimentadas con una ración contaminada con una mezcla de aflatoxinas, similares a la toxina de la leche y designadas como aflatoxinas M, e M2, respectivamente. 1.1 Estructura de las aflatoxinas Las aflatoxinas son cumarinas ligadas a una unidad bifurano más un anillo de pentanona (AFB) o lactona (AFG) (Steyn eta!, 1980). Las estructuras son presentadas en la recopilación de Butler (1974), (figura 1). 1.2 Propiedades químicas Las propiedades químicas de las aflatoxinas están resumidas en la tabla 1. Perspectivas en Nutrición Humana 67 Figura 1 Estructuras de las aflatoxinas. Simbología: B1: aflatoxina B1, B2: aflatoxina B2, Gl: aflatoxina G1, G2: aflatoxina G2, B2a: Aflatoxina B2a, G2a: aflatoxina G2a, M1: aflatoxina M1, M2: aflatoxina M2, GIVIi: aflatoxina Ghli y Aflatoxicol G, 92, (.) „III U. 1-4 O I o- C O OCH, Af I atox,r01 68 No.4, mayo de 2001 Propiedades químicas de las aflatoxinas Aflatoxina Fórmula Molecular Peso Molecular Punto de Fusión Absorción 362-363 ( C) nm 268-269 21,800 Emisión de Fluorescencia (nm) 61 Ci7F1120, 312 B2 Ci7F1140, 314 286-289 23,400 425 Gi C1711,207 328 244-246 16,100 450 G2 C1711,407 330 237-240 21,000 450 M1 M2 Ci7F11207 328 299 19,000 C171-11407 330 293 21,000 425 - GM1 Ci7F1120, 344 276 12,000 - B2a Ci7F11407 330 240 20,400 - G2. C1711140, 346 190 18,000 - Aflatoxicol C17111,0, 314 230-234 14,100 425 425 Fuente: Butler, 1974 1.3 Biosíntesis de las aflatoxinas Está propuesto que el primer paso para la generación de una cadena precursora de policetídeos de la AFB,, involucra la polimerización de una unidad de acetato y nueve unidades de malonato con la pérdida de CO2 a través de la Policétido Sintetasa PCS, de modo análogo a la biosíntesis de ácidos grasos (Bhartnagar e/ al, 1992; Dutton, 1988). Una hipótesis alternativa y más plausible es la síntesis de una unidad iniciadora de hexanato de 6 carbonos por una ácido-graso sintetasa AGS, cuando es extendida por la PCS sin más cetoreducción para generar un decátido de 20 carbonos, la norantrona (Townsend et a!, 1991). En este esquema, la norantrona es oxidada a antraquinona del ácido norsolorínico (NA) por una oxidasa hipotética. Las demás etapas propuestas están resumidas en la figura 2 (Trail e/ a! , 1995). Perspectivas en Nutrición Humana 69 Esquema de la biosíntesis de las aflatoxinas. McCormick etaL (1987) y Dutton etal. (1985) modificado porTrail etal. (1995) POLICETÍDEO --> NOR --> AVN —> AVF —> AVR --> 1, <--- — — —+-1, --> VERA —> ST —> OMST --> AFB1 —> AFG1 sl, --> VHA —> VAL --> VERB --> DHST —> DHOMST --> AFB2 --> AFG2 Donde: AVN: Averantina VERB: Versicolorina B AVE: Averufanina ST: Esterigmatocistina AVR: Averufina OMST: VHA: Versiconal Acetato Hemiacetal Orto - metil Esterigmatocistina DHOMST: Dihidro - Orto - metil VAL: Versiconal DHST: Dihidro - esterigmatocistina AFB1: Aflatoxina B, AFB2: Aflatoxina B2 AFG,: Aflatoxina G, AFG2: Aflatoxina G2 Las oxidasas de acción mixta se asocian con una hemoproteina llamada Citocromo P-450 (Guengerich, 1988). Muchas drogas xenobióticas y metabólitos celulares endógenos son químicamente modificados con procesos asociados con el Citocromo P-450 en los microsomos del retículo endoplasmático (Caldwell e/ al, 1983). Los microsomas son estructuras que sólo se obtienen experimentalmente, mediante procesos de centrif ugación diferencial de homogenizados de tejidos, y si bien concentran estructuras como membranas del No.4, mayo de 2001 Versicoiorina A Ácido Norsolorínico 1.4 Activación del Citocromo P- 450 por las aflatoxinas 70 VERA: NOR: esterigmatocistina retículo endoplásmico, los microsomas no existen como tales en la célula. El potencial reductor de las reacciones del Citocromo P-450 es mediado por la Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato (NADP) reducida. La hemoproteina oxidada se liga con un substrato y sufre una reducción electrónica con formación de un complejo de oxígeno molecular. El complejo aporta energía para la activación molecular del substrato con formación de intermediarios electrofílicos, que pueden reaccionar con sitios nucleofílicos en el ácido nucleico. Un epóxido pasa por los átomos de carbono del terminal furano, siendo considerada como la actividad intermediaria del Citocromo P-450 mediante oxidación, con la formación del subsecuente número de derivados estables que incluyen las aflatoxinas M1, P1, Qi e B2a. En presencia de agentes apropiados como ácido glucorónico, sulfatos y del glutatión, los derivados hidroxilados pueden formar complejos que son excretados. Si bien el sistema Citocromo P-450 funciona para detoxificar agentes xenobióticos como las aflatoxinas, éste también produ- ce un intermediario activo ligado al DNA. Fue demostrada una inequívoca relación entre Citocromo P450 y toxicidad de las aflatoxinas (Caldwell, 1985). El control del flujo de eventos en el complejo Citocromo P-450 entre detoxificación y activación del intermediario ligado al DNA representa una etapa verdaderamente excepcional, aunque existan algunas informaciones pertinentes, las funciones básicas vinculadas al proceso son en general ambiguas (Lillehoj, 1992), (figura 3). Figura 3 Complejo Microsomal Citocromo P-450 (Lillehoj, 1992) Inductor hidroxilado (inactivo) Núcleo Ribosomos Citocromo P-450 Inducto Enzimas Montaje Microsomal Membrana Mic osomo funcionando Fenobarbiton Sitio activo Sitio alostérico 5- Etapas estructurales de los compuestos biológicamente activos aportan una importante influencia en el proceso del Citocromo P-450. El encuadre de la molécula del substrato en el agregado microso- Sitio activo Sitio alostérico Benzo [a] pireno mal define los átomos de carbono disponibles para la oxidación. Han sido identificados un número de activadores e inhibidores microsomales, sustancias con impacto en la transcripción ¡traducción o montaje Perspectivas en Nutrición Humana 71 La AFE3 1 ha sido asociada al cáncer de hígado enzimático del agregado microsomal que pueden modificar la especificidad catalítica de la unidad. La actividad microsomal puede modificar ésta por alteraciones de tipo alostérico; por ejemplo, hormonas esteroides pueden funcionar como moduladores alostéricos de la actividad microsonnal o actuar como competidores para sitios de reacción xenobiótica. Recientemente ha sido identificada una familia de isoenzimas del Citocromo P-450 con variación asociada a la función. También fue encontrada la base genética, responsable en ratones, de la especificidad del Citocromo P-450 para la producción de cada uno de los conjugados DNAaflatoxina o el derivado aflatoxina M1. Patrones variados de especificidad también fueron observados con preparaciones de Citocromo P-450 y aflatoxinas en: 1- Enlaces covalentes con el DNA, 2- Mutación ¡reversión en Sahnonella yphimurium, y 3- Inducción errada de reparación S.O.S. bacteriana (Shimada eta 1987). 1.5 Aflatoxina B1 y ácidos nucleicos Entre las aflatoxinas, la que despertó mayor atención de los investigadores fue la AFI31, debido a que sus efectos tóxicos son cuantitativamente más importantes que los ocasionados por las otras; su acción inhibidora de la síntesis proteica, como también el hecho 72 No.4, mayo de 2001 de ser considerada un poderoso agente hepatotóxico, es reconocida como uno de los más potentes cancerígenos químicos (Lapa, 1983). Según Moule (1977), la referida toxina es un potente inhibidor de la síntesis del DNA bloqueando vívo la replicación, transcripción y traducción. El metabolismo celular es afectado en su conjunto, sin embargo, la síntesis de los ácidos nucleicos es afectada en primer plano (debido a la ingestión de pequeñas dosis), mientras que la síntesis de las proteínas es perjudicada más tardíamente. El RNA ribosomal es el más fuertemente inhibido, ya que constituye 80 'Yo del RNA celular total (Frayssinet & Lafarge, 1970). Respecto a la síntesis de DNA, ocurre una inhibición más lenta (Lapa, 1983). Clifford & Ress (1965) concluyeron que la AFEli al afectar la célula hepática se acumula en el núcleo, ligándose al DNA e inhibiendo la RNA-polimerasa; luego, ocurre una disminución de la síntesis de RNA. Esta inhibición se observa después de aproximadamente 15 minutos en la reducción de la síntesis proteica. También encontraron que la persistencia de la reducción del RNA mensajero es la causa de la degranulación del retículo endoplasmático. Dianzini (1976) afirmó que los inhibidores de la síntesis proteíca pueden provocar daños hepáticos y que la intensidad puede estar relacionada con la cantidad de aflatoxina, como lo indica la figura 4. Hgura 4 Metabolismo intracelular de la aflatoxina Bl(Lillehoj, 1992) Bloques de Transcripción de Núcleos Ligados al DNA Afl toxina M1 PI Qi 132, Sitios Ligados del Esteroide Viv B1 Retículo Interrnediario endoplásrnico—> Microsomo —› Reactivo —› NADPH2 NADP Aflatoxicol Daño en membrana Necrosis Mutagénesis Teratogénesis Carcinogénesis Epóxido Enlaces covalentes a sustancias conjugadas, ácidos nucleicos y/o proteínas Conjugados Excretados 1.5.1 Relación aflatoxina B1 y Gen p53 La AFB, ha sido asociada al cáncer de hígado, siendo conocido que la AFB, ejerce su acción carcinogénica causando un lugar de mutación en el gen p53. Dicha proteína fue llamada "Guardia del Genoma" debido a sus funciones supresoras de tumores; representa un papel crucial en la protección del cuerpo contra el crecimiento canceroso. La mutación del gen p53 es la lesión genética más común en cáncer humano. Se cree que el punto de mutación causado por las aflatoxinas es responsable de un gran porcentaje de carcinomas hepáticos humanos CHH (Urbanek, 1997). Para conocer mejor este fenómeno los investigadores estudian activamente las interacciones de la AFBi con el DNA. La forma activa de la aflatoxina B1 es el Epóxido E - 5 (figura 5). Perspectivas en Nutrición Humana 73 Figura 5 Epóxido E -5 activo de la AF131. (Urbanek, 1997) rt 15min 1 AFBrE En 1989, Harris eta/estudiaron el enlace de equilibrio de la AFEI, con el oligodeoxinucleótido d (ATGCAT), usando resonancia magnética nuclear, encontraron que los protones de la AFI31 fueron más afectados en la presencia del oli- godeoxinucleótido que en su ausencia. Los protones de las bases nucleotídicas resultaron también afectados, pero en un grado menor. Esto apoya la hipótesis de la intercalación de la AFI31 y las bases nucleotídicas en la propia doble hélice del DNA (figura 6). Figura 6 Enlace de equilibrio de la AFBicon el Oligodeoxinucleótido d(ATGCAT)2 (Harris eta1.1995) DNA Lignáo AFBi - N7 - Gua - DNA 74 No.4, mayo de 2001 En el mismo trabajo ellos presentaron experimentos de enlace competitivo con bromuro de etidio y actinomicina D (figura 7), dos conocidos agentes intercalantes, que transfieren la AF131 de su lugar de enlace. También estudiaron con resonancia magnética nuclear el enlace covalente de la AFBi y las uniones del oligonucleótido arriba citado. Ellos hallaron efectos nucleares Overhauserentre la unidad de AFB1 y la porción d(TGC) d(GCA) del oligodeoxinucleotídeo. Esta evidencia también conduce al modelo de intercalación de la AFB, ligada con el DNA. 2. EFECTOS FISIOLÓGICOS DE LAS AFLATOXINAS Todos los animales vertebrados son sensibles a la acción de las aflatoxinas, pudiendo ocurrir dos tipos de lesiones: agudas, que son provocadas por la ingestión de dosis relativamente elevadas que ocasionan lesiones hepáticas graves, como necrosis del parénquima, de efecto casi siempre letal; y crónicas, las cuales producen lesiones progresivas, severa depresión del crecimiento corporal, alteraciones histológicas y hepatomas, después de un periodo más o menos prolongado de ingestión de dosis subagudas (Edds, 1973). 2.1 Factores que favorecen los brotes de aflatoxicosis Los factores más importantes son el tenor de humedad del substrato, humedad relativa y temperatura; la temperatura óptima para el crecimiento de A. fiavuses 36 - 38 C, sin embargo, la máxima producción de aflatoxinas está entre 25 - 27 C, así como la sequía en la pre-cosecha de los granos, daños mecánicos hechos por insectos, estrés por humedad en las plantas, tiempo húmedo junto con altas temperaturas en la cosecha y variedades de granos susceptibles a la contaminación. La conjunción de estos factores puede haber sido la causa del más grave brote de aflatoxicosis en India en 1974, cuando una severa sequía seguida de abundantes lluvias no estacionales, antes de la cosecha de maíz, fue severamente contaminado con 15,6 ppm de aflatoxinas, causando la muerte de más de 100 personas (Krishnamachari et al, 1975). Otros autores indican una epidemia que involucró lesión hepática severa, la cual "resultó en la muerte de más de 100 personas y seria enfermedad en otras 400" (Singh, 1994). En Kenia, en 1981, sobre condiciones climáticas similares, el consumo de arroz contaminado produjo la muerte de 12 personas debido a aflatoxicosis aguda (Ngnindu el c7/, 1982). 2.2 Señales clínicas Durante el brote de aflatoxicosis aguda en humanos en India, los hombres fueron dos veces más afectados que las mujeres. Los síntomas presentados fueron: ictericia, antecedida de vómitos y anorexia, seguida típicamente por ascitis y edema de las extremidades Perspectivas en Nutrición Humana 75 inferiores. La mortalidad fue alta (397 afectados, 106 muertos) y la muerte ocurrió repentinamente, casi siempre precedida por hemorragia gastrointestinal masiva (Krishnamachari e/ al, 1975). Los pacientes que murieron en Kenia presentaron síntomas clínicos similares y los cambios patológicos en el hígado fueron característicos de hepatitis tóxica (Ngnindu et 1982). Los primeros síntomas clínicos en brotes de aflatoxicosis aguda en vacas, perros, gallinas y cerdos son inapetencia, reducción de la ganancia de peso y malestar general. En algunos animales ocurrió evidencia clínica de lesión hepática, manifestada por ictericia, hemorragia, edema y ascitis. La mortalidad es usualmente alta y la muerte puede ser precedida por síntomas nerviosos como ataxia y convulsiones (Maracas y Nelson, 1986). 2.3 Efectos tóxicos Las aflatoxinas son hepatotóxicas, teratogénicas, mutagénicas y carcinogénicas. Fueron establecidas Dosis Letales Medias LD50 (Tabla 1). Niveles bajos de AF131, 1,0 e 0,05 ppb, presentes en la dieta pueden causar cáncer hepático en ratas y trucha arco-iris, respectivamente. Las aflatoxinas exhiben efecto carné/7 esto es, pueden aparecer residuos de las mismas en carne, leche y huevos de los animales que consumieron alimentos contaminados (Stoloff, 1977). Las aflatoxinas también pueden deprimir el sistema inmune de los animales (Steyn, 1980). Tabla 2 Dosis letales medias LD50 para varias especies animales (Stoloff, 1977). 76 No.4, mayo de 2001 Especie (mg/Kg., oral) Conejo 0,3 Pato 0,3 Gato 0,6 Trucha 0,8 Perro 1,0 Cobayo 1,4 Oveja 2,0 Mono 2,2 Ratón doméstico 9,0 Hámster 10,2 Pollo 11,5 Rata 7,2 y 17,9, macho y hembra respectivamente Cáncer 1,0 y 0,05 ppb 3. AUTODETOXIFICACIÓN, DETOXIFICACIÓN, DEGRADACIÓN Y BIODEGRADACIÓN DE AFLATOX I NAS Después de la síntesis de aflatoxinas por Aspe/y/lbs fiavasy Aspergigus parasikusen un producto contaminado, su detoxificación no es fácil. Los pocos procesos conocidos son anti económicos y, a veces, tornan el producto inadecuado para el consumo humano (Martins, 1979). Por tales motivos se han utilizado métodos físicos, químicos y biológicos para la degradación de aflatoxinas con resultados contradictorios. 3.1 Detoxificación enzimática Ha sido demostrado que las biotransformaciones de las aflatoxinas son mediadas por enzimas microsomales, que tienen función de hidroxilasas mixtas en el retículo endoplasmático en organismos superiores (Rasic eta,' 1991). En preparaciones de microsomos del hígado de muchas especies animales, fue demostrada la transformacTncb hAFB,, la más hepatotóxica y hepatocarcinogénica, en un derivado 4-hidroxi (AFM1 ) y un producto análogo, la AFGM,, que se puede formar a partir de AFG,. Se reportó que AFBi y AFGi se metabolizan a sus respectivos derivados 2-hidroxi o hemiacetales por NADPH2 (Patterson, 1973). También se indica que la detoxificación enzimática de las aflatoxinas en el hígado de conejos, patos, cobayos, gallinas y ratones do- mésticos, sigue la ruta menor para la formación de AFM1 . Los microsomos del hígado humano son capaces de detoxificar AFI31 convirtiéndola en AF01. Una vez producida la AFOi no se oxida de modo apreciable en los microsomas del hígado humano y no es muy genotóxica. La hidroxilación 3a de la AFBi a Affli se considera un patrón potente indicativo de detoxificación (Raney eta'1992). Otros estudios también han demostrado que el ratón doméstico llega a ser resistente a los efectos carcinogénicos de la AFB, y que esto es una expresión de una isoenzima de la glutationa s-transferasa (GST), con alta actividad sobre el epóxido 8 - 9 de la AFBi (Borroz eta/, 1991). Daniels el al (1990) demostraron cambios del potencial de hepatocarcinogenicidad y hepatotoxicidad de la AFBi al transformarse en los metabolitos menos tóxicos AFM1 y AMI en microsomas de hígado y pulmón de conejo. Sistemas microbiales muestran similitudes con los sistemas animales. Hamid y Smith citados por Patterson (1973) demostraron claramente como está involucrado el sistema enzimático microsomal en la degradación de aflatoxinas en A. fiavas. La degradación de aflatoxinas por extractos libres de células de A. fiavusfue aumentada por NADPH el cual es consistente con la actividad de las enzimas en que este cofactor es necesario para acentuar la detoxificación de aflatoxinas en sistemas eucarióticos. Perspectivas en Nutrición Humana 77 El pH y temperatura fisiológicamente óptimos, conducen a la degradación enzimática de las aflatoxinas 78 No.4, mayo de 2001 Doyle & Marth (1978) reportaron que la 17-hidroxi-esteroide deshidrogenasa transforma AFB, en AFIR, (un derivado no tóxico). También observaron la máxima actividad degradativa de aflatoxinas por factores intracelulares de los hongos. El pH y temperatura fisiológicamente óptimos, conducen a la degradación enzimática de las aflatoxinas. Las peroxidasas aparentemente poseen un papel clave en la degradación o detoxificación de las aflatoxinas. El peróxido de hidrógeno, H202 aumenta la actividad degradativa de las aflatoxinas, cuando es adicionado a las proteínas obtenidas de micelio de A. parasíticas, demostrándose que la peroxidasa puede ser la enzima que posiblemente ayuda en la detoxificación de aflatoxinas. Otros estudios han indicado la acción de la peroxidasa microsomal en la detoxificación de aflatoxinas sin excluir la posibilidad del rol de la Citocromo P-450 Mono-Oxigenasa en la detoxificación enzimática de ellas (Hamid & Smith, 1987). 3.2 Procesos externos de degradación y biodegradación de las aflatoxinas 3.2.2 Métodos químicos Varios autores han utilizado diversos agentes químicos en la detoxificación de aflatoxinas es decir disminución o eliminación del poder toxigénico de estos agentes: permanganato de potasio, cloramina, amoniaco, hidróxido de sodio, hidróxido de calcio, ácido cromosulfúrico (Dvorak, 1990); cloro (Samarajeewa ela/, 1991); agentes oxidantes como peróxido de hidrógeno, peróxido de benzoilo; bases como metilamina y aldehídos como formaldehído (Natarajan, 1992); aceites de canela y de ajo (Sinha e/ a/, 1993); preservantes alimenticios como ácido sórbico, ácido propiónico (Finotti e/ a/, 1992); fungicidas como Dicloran , lprodione , Vinclozilin (Hasan, 1993); fitoalexina, una gliocelina de soya, (Song & Carral, 1993); extracto de ajo y bicarbonato de sodio, metabisulfito de sodio (Sing & Chand, 1993); clobentiazona y triciclazol (Wheeler el al, 1989); hidróxido de amónio (Mercado eta/, 1991); carvacrol (Akgul e/ a/, 1991); Xantoxina , Bercapten , Psoralene , Kellina , Visnagina ; Aluminosilicato hidratado de calcio y sodio (Huff ela/, 1992); ácido tánico, ácido cáfico y floroglucinol (Sinha eta/, 1990). 3.2.1 Métodos físicos La literatura cita varios factores físicos: radiación gamma y/o humedad (Uralova 6,15/, 1987); calor y/o radiación gama (Narvaiz el al, 1988); solamente radiación gamma (Patel e/a/, 1989); y luz de diferentes longitudes de onda (Shirivastava eta/, 1991). 3.2.3 Métodos microbiológicos 3.2.3.1 Degradación de las aflatoxinas por los propios hongos toxigénicos Los hongos productores de aflatoxinas como A. fiavusy A. paras/ticas presentan amplia distribución en Los hongos productores de aflatoxinas como A. flavus y A. parasiticus presentan amplia distribución en la naturaleza y contaminan muchos alimentos y materias primas la naturaleza y contaminan muchos alimentos y materias primas, volviéndolos no aptos para el consumo (por producción de aflatoxinas) y constituyen una amenaza para la salud humana y animal. Pueden competir entre ellos, ya sea por alteraciones de las condiciones de crecimiento, incluyendo modificaciones del pH y temperatura, para detoxificar toxinas por el propio organismo productor; también pueden detoxificar la propia toxina por manipulación. De hecho se han realizado estudios para demostrar la capacidad de A. fiavusy A. parasiticus (toxigénicos) en degradar aflatoxinas producidas por ellos mismos (Doyle & Marth, 1978). 3.2.3.2 Degradación de las aflatoxinas por cepas atoxigénicas de las mismas especies de hongos Doyle & Marth (1978) fueron pioneros en estudios de detoxificación de aflatoxinas con cultivos de A. parasikus, cepa toxigénica NRRL 2999 y atoxigénica NRRL 3315. Ellos compararon los dos cultivos y reportaron que la atoxigénica fue menos eficiente en detoxificar aflatoxinas. En otro trabajo se encontró que una variedad atoxigénica de A. flavus resultó más efectiva en la detoxificación de aflatoxinas producidas por las toxigénicas de A. flavus y A. parasiticus en condiciones diferentes de cultivo (Doyle & Marth, 1978). Nakazato eta! (1991) demostraron que AFI31 producida por los hongos toxigénicos A. flavus y A. parasiticus es transformada o metabolizada por todas las muestras de A. fiavus no toxigénicas; los metabólitos comunes fueron Af-A y Af-B. Linajes atoxigénicos de A. fiavusse pueden presentar potencialmente como agentes del control biológico logrando la detoxificación de maíz contaminado por aflatoxinas en la pre y pos cosecha. El uso de un linaje atoxigénico de A. flavus llevó a una reducción significativa en la AFE31 cuando fue inoculada con una toxigénica después de 16 horas de incubación, concluyéndose que las cepas atoxigénicas de A. fiavusse pueden usar en control biológico de contaminación por aflatoxinas (Cotty, 1990). Durante tres años se adelantó un estudio para evaluar la cepa de A. parasiticus(NRRL 13539), no productora de aflatoxinas, como un agente biocompetitivo en el control de contaminación por aflatoxinas en la pre cosecha de maní. Las concentraciones medias de aflatoxinas totales en los granos experimentados fueron de 11,1 y40 ppb para las cosecha de los años 1987, 1988, y 1989 respectivamente, comparando con los controles correspondientes que fueron de 531,96 y 241 ppb, respectivamente. Las poblaciones del suelo de agentes biocompetitivos no fueron mayores que las de cepas salvajes de A. ffavusy A. paraslcusen suelo no tratado (Domer eta 1987). Perspectivas en Nutrición Humana 79 3.2.3.3 Degradación de las aflatoxinas por otros microorganismos atoxigénicos Fueron estudiadas tres especies de Lactobacillus, las células demostraron ser efectivas para la prevención del crecimiento de los hongos aflatoxigénicos y los metabolitos bacterianos disminuyeron la cantidad de aflatoxina producida (Karunaratne eta 1990). El tratamiento independiente de quitosano o Bacjus sublills aplicados 48 horas después de la inoculación con Aspergillus //avus inhibió la producción de aflatoxinas (Cuero eta 1991). Fue investigada la influencia de R/7/opus e Neurospora spp en el crecimiento de A. fiavusy A. parasíkus, así como la acumulación de AFB1. Cuando fueron inoculados simultánea pero independientemente, Rhízopus e Neurospora s,op en maní tostado, el AsperOus creció en menor proporción y se observó la formación de micelios y de esporas diferentes de los patrones. La acumulación de AFB1 durante 6 semanas de incubación fue de 34 % en cultivos mixtos con Rlyopus sp,o y 1,7 'Yo en asociación con Neurospora en comparación con los cultivos control. Esto representa una evidencia de que la formación de metabolitos de Rhkopusy Neurosporadeterminó la inhibición del crecimiento del hongo y/o producción de AFB1. (Nout, 1989). Se hizo un estudio sobre el efecto del extracto del hongo Rlilzopus o'elemaren la carcinogenicidad de la AFB1 en ratas. En el grupo que 80 No 4, mayo de 2001 recibió R. de/emaradicionado con AFB1, los focos hiperplásicos y enzimo-patológicos disminuyeron. El resultado de este experimento mostró que R de/emartiene capacidad intensiva en la inhibición del daño tóxico y la carcinogenicidad en el hígado por la AFB1 demostrando ser capaz de retardar la aparición de focos alterados y de controlar su desarrollo, impidiendo el aumento de los procesos degenerativos. El Rde/emarse puede usar como un potente y eficiente controlador de la intoxicación por AFB1 (Zhu eta/, 1989). Cuatro géneros de hongos: AspergRus nigel; EUTOUM herbarium, RIÉopus sp,oy A. fiavusno productor de aflatoxinas, convirtieron la AFB1 en Aflatoxicol (AFL), un compuesto no tóxico, pero puede ser una reacción reversible y convertirse en un toxico tan fuerte como AFB1. Estos resultados sugieren que la interconversión de AFB1 y AFL es mediada por enzimas intracelulares de A. fiavusy de Rlllopus spp. En adición, la isomerización de AFL para AFB1 observada en el medio de cultivo también es sugerida por la disminución de pH (Nakazato eta 1990). En otro trabajo se sugiere que la enzima extraída del micelio de RIllopuspuede ser responsable de la actividad de interconversión, pudiendo ser una oxirreductasa dependiente del NADP, en la que la conversión oxidativa de AFL en AFB1 y la conversión reductora de AFB1 en AFL siguió los mismos patrones en fracciones obtenidas por permeación de gel y cromatografía de intercambio jónico (Nakasato eta/, 1991). Las conclusiones del estudio de Faraj e/ al (1993) muestran una inhibición mutua a 30°C con Indice de Dominancia (ID) de 2 entre A. fiavusy A. n¿qer, R oryzaee M raCe/770SUS. Combinaciones de A. fiavus con Al. racernosus, Alternarla a/terna/a y BacRus stearolherrnopillius mostraron poca diferencia con el cultivo puro de A. //avíos en la disminución de las cantidades de aflatoxina producida en granos de maíz después de 10 días de incubación a 30°C. Los tratamientos de 5 días a 30°C, seguido de 5 días a 40°C, respectivamente, presentaron una reducción mayor en la producción de aflatoxinas que aquel de 10 días a 30°C. Combinaciones entre A. fiavus con M. raceMOSUS y A. fiavus con Alternan» a/terna/a presentaron nivel similar de disminución de aflatoxinas que cultivos puros de A. fiavus, lo que sugiere que la temperatura de incubación tiene un papel importante en la biodegradación de aflatoxinas. Las asociaciones con R Oryzae, A. mpery BacSus stearothermophy/us resultaron, también, en mayores reducciones en los niveles de aflatoxinas. Bernal (1998) estudiando el efecto de los hongos Mucor racemosusy RI7opus oyzae sobre la producción de aflatoxinas encontró que el segundo fue más eficiente en su biodegradación que el primero, en agar extracto de malta a 23, 28 y 36 C. También demostró que los metabolitos producidos por M Racemosusy R Oyzae, actuan con mayor eficiencia sobre la AFB1, que sobre las AFB2, AFG1 y AFG2; inclusive pueden estimular su producción. Referencias Akgul A; Kivanc M; Sert S. Effect of Carvacrol on growth & toxin production by Aspergillus fiavus and Aspergjus parasiticus Sci Allm1991;11:361-370. Bastos STG. Comunica9áo pessoal, Prof essor Depto de Micologia. UniversidadeFederal de Pernambuco. Centro de Ciencias da Saúde. 1997. Bernal GOM. Influencia da Temperatura na produ9ao de aflatoxinas por AspergRus //ayas URM 2580 e na sua biodegrada9ao por Alucor racemosuse Rhúopus oryzae. Tese de Grau para obter o título de Mestre. Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciencias da Saúde. Curso de Mestrado em Nutri9ao, Recife, 1998. 62p. Bhatnagar D, Ehrlich KC, Cleveland TE. Oxidation reduction reactions. En: Boisynthesis of secundarymetabolites. New York: Town Publishers, 1992. p. 255-286. Borroz KI, Ramsdell HS, Eaton D L. 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