Engenharia de Tecidos

Estado da arte

Carla Godinho Fernando Luciana Duarte

Estado da Arte
Nos ltimos quinze anos, no Brasil e em outros pases, tem se produzido um conjunto significativo de pesquisas conhecidas pela denominao estado da arte ou estado do conhecimento.

Engenharia de Tecidos
A Engenharia de tecidos compreende a combinao de biomateriais, clulas e fatores especficos do crescimento. um campo interdisciplinar onde o material cientistas e bilogos celulares formam um construto (ex vivo ou in situ), eventualmente implantado para o local lesionado pelos quadros clnicos.

 A regenerao do miocrdio aps um ataque cardaco um dos aspectos mais desafiadores em engenharia de tecidos. Clulas fontes adequadas e otimizados materiais biocompatveis devem ser identificados.

reas de controvrsias: fonte de clulas adequadas, biomateriais, meio ambiente e celular tempo de implante ps-infarto continuam a constituir obstculos na rea de MTE.

 Anversa e colegas relataram a presena de um grupo de "clulas progenitoras cardacas (CPCs), residente no centro, com marcadores especficos de clulas-tronco, Lin-, c-kit e Ki-67 e no incio cardaca marcador, como fatores de transcrio GATA-4 e Nkx2.5. Outros grupos identificaram outros CPCs potencial residente usando uma variedade de marcadores de superfcie celular e demonstraram na diviso celular in vitro e in vivo capacidade de regenerao do miocrdio.

 Requisitos para MTE:

Biocompatveis

Integridade mecnica
Biodegradvel

Cell "amigvel
Biomimticos Fabricao

Mtodos adotados no MTE Electrospinning

Electrospinning envolve um jato eletricamente carregadas de uma soluo de polmero produzida por uma alta tenso

Reatores Biolgicos
O conceito geral de um biorreator estimular o crescimento e desenvolvimento de clulas ou tecidos biolgicos em biomateriais como se estivessem sob as condies in vivo.

Cell folhas (sensvel temperatura)

Este mtodo foi inicialmente relatada por Shimizu et al. em 2002 e tem sido sugerido para MTE

 Engenharia situ
Andaime livre. Envolve a injeo direta da mistura de biomateriais e clulas para a regio infartada.

Biomateriais utilizados no MTE

A construo uma estrutura de suporte que consiste de um interligado de poros (porosidade 0,90%), com dimetros variando entre 300 e 500 mm para a sobrevivncia da clula. Isto ir permitir que as clulas de cmbio nutricionais e de remoo de secrees celulares, aumentam a penetrao de clulas e tecidos de vascularizao.

Amplas faixas de biomateriais, principalmente polmeros, tm sido sugeridos para o MTE, sendo sinttico e natural. O poli biodegradveis (a-hidrxi
cidos) polisteres alifticos, tais como poli 1-caprolactona, cido polilctico (PLA), cido poligliclico (PGA) e seus copolmeros so as principais classes de polmeros sugeridos para MTE.

 Exemplo que demonstra o sucesso do polmero elastomrico no MTE polietileno glicol (PEG), em que o batimento espontneo de PEG discos foi alcanada quando os cardiomicitos foram cultivados no material. Mais recentemente, Chen et al. caracterizaram um elastmero de Engenharia de tecidos do miocrdio MTE, feita a partir de (sebacato glicerol) poli, que j demonstrou resultados promissores na engenharia de tecidos moles para os nervos e vasos na engenharia de tecidos.Um outro grupo de materiais que esto sendo considerados o de poli (ethylenetephatalate) dmero copolmero gordos / bloco cido.

Protenas da MEC e derivativos, tais como colgeno tipo I e fibronectina so exemplos de polmeros naturais sugeridos para MTE.

 Apesar de certas bactrias produzem o polissacardeo alginato natural carregado negativamente. O alginato essencialmente derivado de algas marrons. Sua propriedade exclusiva de hidrogis formando na presena de ons clcio tem atrado a sua utilizao no MTE. A cola de fibrina um biopolmero formado pela polimerizao de fibrinognio monmeros. Este polmero natural s tem sido sugerido para engenharia in situ. Diferentes tipos de clulas tm sido investigadas com esse polmero, mioblastos esquelticos, clulas da medula ssea e clulas endoteliais.

Devido s propriedades mecnicas pobres do colgeno, os pesquisadores tm investigou a combinao de colgeno e polmeros sintticos

 Embora muitos biomateriais, com diferentes composies e propriedades, esto sendo continuamente sugeridos para o MTE, o desafio atual concentrar as investigaes sobre os materiais j disponveis, sobre a biocompatibilidade provado, a fim de melhorar seu desempenho para ensaios clnicos. H pouca dvida sobre qual tipo de clulas deve ser introduzida na regio do infarto; cardiomicitos tm mostrada para ajudar a regenerao e melhorar a funo cardaca. No entanto, a fonte dos cardiomicitos, quer os que residem no corao ou derivadas da medula ssea, embrionrias ou espermatognias, clulas tronco, para ser utilizado como fonte de clulas, deve ser determinado antes de que construes possam ser introduzidas nos coraes humanos.

Biomaterials e Scaffolds
Estes andaimes agem essencialmente como um modelo para formao de tecidos e normalmente so semeadas com clulas e, ocasionalmente, fatores de crescimento, ou submetidos a estmulos biofsicos na forma de um biorreator, um dispositivo ou sistema que se aplica diferentes tipos de processos mecnicos ou qumicos estmulos para clulas.

 Um certo nmero de consideraes so importantes na concepo ou a determinao da adequao de um andaime para uso em engenharia de tecidos: Biocompatibilidade Biodegradabilidade As propriedades mecnicas

Arquitetura do Andaime
A tecnologia de fabricao

 Normalmente, os trs grupos individuais de biomateriais, cermicas, polmeros sintticos ou polmeros naturais, so usados na fabricao de andaimes para engenharia de tecidos.

A fabricao de andaimes com materiais biolgicos com estruturas homogneas e reprodutvel representa um desafio. Alm disso, os andaimes tm geralmente pobres propriedades mecnicas, o que limita seu uso em, por exemplo, carga tendo aplicaes ortopdicas.

 Estudo de caso: os andaimes de colgeno sseo

O colgeno a protena mais comum no corpo e fornece resistncia e estabilidade estrutural para os tecidos do corpo, incluindo pele, vasos sanguneos, cartilagem, tendo e osso. Junto com a hidroxiapatita, o colgeno um dos dois principais componentes do osso. Tem relativamente pobres propriedades mecnicas. Estruturas base de colgeno so reforadas introduzindo um phase41 cermica e desenvolveram, assim, uma srie altamente porosa biomimtico de hidroxiapatita-colgeno (CHA) andaimes com base nas duas principais constituintes dos ossos. Estes andaimes no s possuem um aumento significativo de propriedades mecnicas em comparao com um andaime CG, mantendo a alta porosidade e poros interconectados, que tambm mostram permeabilidade melhor que beneficia a infiltrao de clulas e posterior vascularizao.

 O desafio da engenharia de tecidos imitar o que acontece na natureza.

A tarefa no campo da engenharia de tecido , portanto, a de tentar aproveitar a capacidade de regenerao inata. Uma maneira de faz-la poderia ser a de engenheiro do andaime em tal forma que o andaime se fornece sinais de regenerao para as clulas. O que pode negar a necessidade prolongada da cultura in vitro antes da implantao.

 Alm dos sinais biomecnicos, o comportamento celular fortemente influenciado por sinais biolgicos e bioqumicos da matriz extracelular. Portanto, a utilizao de andaimes com sistemas de liberao para fatores de crescimento, peptdeos de adeso e citocinas est recebendo considervel ateno.

Referncias Bibliogrficas
Biomaterials & scaffolds for tissue engineering
Fergal J. OBrien Department of Anatomy, Royal College of Surgeons in Ireland, 123 St. Stephens Green, Dublin 2, Ireland, and Trinity Centre for Bioengineering, Department of Mechanical Engineering, Trinity College Dublin, Dublin 2, Ireland E-mail: [email protected]

Myocardial tissue engineering

Hedeer Jawad, Alex R. Lyon, Sian E. Harding*, Nadire N. Ali, and Aldo R. Boccaccini Department of Materials, Imperial College London, Prince Consort Road, London SW7 2BP, UK, and National Heart and Lung Institute, Imperial College London, Dovehouse Street, London SW36LY, UK

OBTENO DE SUPORTE PARA ENGENHARIA DE TECIDOS UTILIZANDO-SE CIMENTO DE -TRIFOSFATO DE CLCIO (-TCP)

J. L. M. Machado; G. Benderovics; L. A. Santos Universidade Federal do Rio Grande do Sul

17 CBECIMat - Congresso Brasileiro de Engenharia e Cincia dos Materiais

UTILIZAO DE SCAFFOLDS PARA CRESCIMENTO CELULAR

Guiam o crescimento celular, Sintetizam uma matriz extracelular e outras molculas biolgicas, Facilitam a formao de tecidos e rgos funcionais. O objetivo deste trabalho foi a utilizao de cimento de -TCP na confeco desses suportes, atravs da variao da quantidade de lquido no cimento e da utilizao de microesferas de parafina como geradoras de poros. Foi analisada a porosidade aparente dos suportes e o tamanho de partcula do cimento sintetizado. A utilizao de esferas de parafina permitiu a formao de poros com tamanho tal que possibilitam potencialmente o crescimento tecidual e celular.

Conceito e dificuldades em obter Scaffolds

So os suportes nos quais so colocadas as clulas teciduais junto com fatores de crescimento, permitindo o crescimento do tecido at este substituir completamente o suporte Para cumprir essa funo o scaffold deve possuir propriedades como biocompatibilidade, alta porosidade e tamanho e formato de poros adequado para permitir o crescimento de tecidos (no caso de tecidos sseos esse tamanho entre 150 e 250m) e grande rea superficial, para que haja vascularizao. Deve possuir taxa de degradao, fazendo com que haja perda de resistncia mecnica, adequada para que os tecidos substituam o scaffold nem muito lentamente nem muito rapidamente.

UM BOM SCAFFOLD!!!!
A resistncia mecnica deve ser adequada, pois pode haver falha do material caso essa seja muito pequena, e interao com as clulas permitindo adeso, crescimento, migrao e diferenciao celular Para a aplicao como scaffolds, normalmente so utilizados polmeros absorvveis como o Poli (cido Gliclico) - [PGA], o Poli (cido Ltico) - [PLA], o Poli (cido Ltico co-cido Gliclico) [PLGA] que um copolmero dos dois primeiros, o Poli Pirrol [PPy] e a Poli Caprolactona [PCL]. Tambm existe a possibilidade de se fazer nanocompsitos de algum material polimrico com hidroxiapatita ou outro material cermico que pode ser algum fosfato de clcio ou um biovidro

Os cimentos sseos de fosfato de clcio (CPCs). Um cimento deste tipo pode ser preparado misturando um sal de fosfato de clcio com gua ou com uma soluo aquosa para que se forme uma pasta que possa reagir temperatura ambiente ou corporal dando lugar a um precipitado que contenha um ou mais fosfato de clcio, ocorrendo a pega pelo intercruzamento dos cristais deste precipitado. Apesar da existncia de diversos sistemas de CFC estudados, os baseados no alfa-fosfato triclcico (-TCP) so de especial interesse em funo da obteno durante a reao de pega de uma fase de hidroxiapatita deficiente em clcio, similar hidroxiapatita ssea: -Ca3(PO4)2 + H2O -> Ca9(HPO4)(PO4)5OH. Como todo cimento de pega hidrulica, a adio de quantidades crescentes de gua ao cimento aumenta a porosidade destes, permitindo a obteno de materiais com porosidade controlada

Crescimento tecidual de acordo com o tamanho dos poros

menor que 10 m sem crescimento 15 e 50 m crescimento fibrovascular 50 e 150 m formao de osteide acima de 150 m crescimento sseo

MTODOS PARA OBTENO DE CERMICAS POROSAS

Controle da sinterizao sol-gel; Replicao de estruturas polimricas porosas; Formao de espuma em suspenses cermicas; Incorporao de materiais volteis eliminados durante a queima, ou seja, a frao, tamanho e distribuio do volume de poros produzidos so determinados pela quantidade e tamanho da fase voltil, que pode ser naftaleno, cera, farinha, carvo, polmeros diversos.

PROJETO DE SHUM , A.W.T et al.

Realizaram um estudo criando estruturas a partir de microesferas de parafina, porm utilizando PLGA (cido Ltico co-cido Gliclico) ao invs de um material cermico As microeferas foram misturadas com uma soluo de piridina contendo o PLGA e ento prensadas. Para a obteno das microesferas de parafina foi aquecida uma soluo de PVA em gua (0,5% em massa) a uma temperatura entre 60 e 70C. Vinte gramas de parafina, tambm aquecida a essa temperatura, foram adicionadas a soluo sob forte agitao mecnica e, ento, a mistura colocada em um recipiente contendo gua fria Aps, as esferas foram colocadas em uma peneira de 100m e lavadas com gua destilada para retirar o PVA residual. Prepararam microesferas de PLLA com um mtodo parecido com o anterior, porm adicionando soluo Na2SO4 como agente coagulante, e a formao de esferas se tornou mais eficiente .

MATERIAIS E MTODOS
O cimento de fosfato triclcico foi sintetizado em laboratrio utilizando-se como precursores qumicos o carbonato de clcio [CaCO3] e o pirofosfato de clcio [- Ca2P2O7](13) a seco A mistura com Al2 O3 foi realizada por um perodo de tempo de 1h com a proporo em massa de 1:4 entre carga e meios de moagem. O tratamento trmico : uma etapa de calcinao, seguida de uma etapa de resfriamento brusco. A fase gama do pirofosfato de clcio [-Ca2P2O7] e carbonato de clcio [CaCO3], que foram mantidos em forno tipo mufla, sem controle de atmosfera, a temperatura de 1300C durante 15h. A moagem a mido foi efetivada utilizando lcool etlico absoluto [CH3CH2OH] Este frasco foi colocado em um gira-moinho e deixado sob agitao por 2h.

 composio resultante (cimento modo + lcool) foi ento peneirada apenas para se separar os meios de moagem e logo em seguida alocada em um bquer, por 72h em estufa a 90C para promover a evaporao total do lcool, restando apenas o p de cimento modo e seco. A frao lquida foi formulada com o objetivo de se obter uma soluo aquosa semelhante composio padro, utilizada na mistura convencional de cimentos de fosfato de clcio. A formulao mais difundida para a frao lquida corresponde a uma diluio de 2,5% de hidrogenofosfato disdico [Na2HPO4] em gua deionizada,sendo esta a utilizada.

Para a obteno de parafina na forma de microesferas utilizou-se uma soluo aquosa contendo 0,5g de poli (lcool vinlico) (PVA) e 1g de sulfato de sdio (Na2SO4) aquecida 100C e colocada sob agitao mecnica (400 rpm). A parafina foi adicionada juntamente soluo, aguardando-se a sua total fuso. Aps a formao de uma espuma consistente, foi desligado o aquecimento e resfria-se rapidamente com a adio de gua fria. A mistura foi ento colocada em uma torre de peneiras, e as esferas lavadas com gua destilada e separadas em trs faixas de granulometrias. As esferas foram secas ao ar temperatura ambiente e foram caracterizadas por microscopia eletrnica de varredura e uma fotomicrografia das esferas pode ser vista na Figura.

MICROESFERAS DE PARAFINA

 Para fins de comparao, peas de cimento foram fabricadas modificando-se a quantidade da fase lquida utilizada de 0,6mL 1,8mL para cada grama de cimento, variando-se de 0,3mL, e analisando a microestrutura por microscopia eletrnica de varredura, densidade seco e absoro de gua. A massa seca foi determinada aps secagem dos corpos-de-prova por um perodo de tempo no inferior a 24h em estufa a 100C.

 O cimento, a fase lquida e a parafina foram misturados nas seguintes propores: 1g de cimento, 0,6mL de fase lquida e 1,5g de esferas parafina; e obtidos corpos para anlise da microestrutura. Essa proporo foi seguida aps um estudo realizado no sentido de saber qual proporo obteria corpos com poros interconectados, mantendo resistncia mecnica para o manuseio. O tamanho de poros, a interconectividade entre os poros foram examinados por Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV Jeol 6505).

RESULTADOS E DISCUSSO
Como todo cimento de pega hidrulica, a adio de quantidades crescentes de gua ao cimento aumenta a porosidade destes, e isto pode ser verificado a partir dos valores densidade a seco, como mostra a Figura

 medida que aumenta a frao lquida no cimento, a densidade diminui, assim como aumenta a frao de vazios dentro do corpo. Pelos valores de Porosidade Aparente pode-se ter uma idia da quantidade de vazios

Como a porosidade aberta considerada um fator favorvel osteoconduo, permitindo o crescimento de osso no interior dos poros, pode-se dizer que todas as formulaes possuem tendncia de favorecerem este comportamento biolgico tendo em vista que todas as formulaes apresentaram porosidade aparente superior a 50%. A resistncia mecnica tambm diminuiu com o aumento da quantidade de fase lquida adicionada, sendo mostrada essa tendncia no grfico

Microestrutura extremamente porosa para as formulaes e tambm uma verificao do tamanho de poro. A Figura 5a mostra uma fotomicrografia de uma amostra de cimento com 0,6mL de fase lquida para cada grama de cimento. A Figura 5b, uma amostra de cimento com 1,8mL de fase lquida para cada grama de cimento.

As amostras feitas com parafina apresentaram estrutura de poro bastante homognea, devido ao formato das microesferas. A Figura 6a mostra uma fotomicrografia de uma amostra de cimento aps a extrao das esferas de parafina. A faixa de tamanho de esferas utilizada foi de 250 - 350m. A Figura 6b mostra uma fotomicrografia de uma amostra de cimento aps a extrao das esferas de parafina. A faixa de tamanho de esferas utilizada foi de 100 - 250m.

A partir dos resultados obtidos possvel inferir as seguintes concluses:

foi possvel obter cimento com composio de fosfato triclcico; foi possvel a obteno de esferas de parafina em diferentes faixas de granulometrias atravs de suspenso da parafina lquida em uma soluo contendo de poli (lcool vinlico) e sulfato de sdio em agitao mecnica e posterior resfriamento; obteve-se corpos porosos de cimento com a adio das esferas de parafina e posterior extrao das mesma aps a cura, utilizando-se um mtodo trmico; para os corpos feitos sem a adio de esferas de parafina, as formulaes segue a tendncia de diminuio da densidade e aumento na absoro de gua e porosidade aparente, com o aumento da fase lquida adicionada ao cimento; os corpos sem a adio de esferas de parafina obtiveram tamanho de poros relativamente pequenos, que, segundo a literatura, impossibilitam a formao tecidual; a formulao dos corpos porosos com esferas de parafina, se mostrou eficaz na obteno de interconectividade dos poros, apesar desta interconectivadade no ser acentuada; estudos in vitro e in vivo so necessrios para avaliar o potencial uso dos materiais obtidos como scaffolds.

PREPARAO DE POLMEROS COM PROPRIEDADE DE RESPOSTA A ESTMULO EXTERNO A BASE POLI N ISOPROPILACRILAMIDA PARA APLICAES EM ENGENHARIA DE TECIDOS Igor Alan Soares GOMES (PROBIC/FAPEMIG) Luana Moreira de OLIVEIRA (BIC-JR/FAPEMIG) Carlos IGNACIO (Orientador) Cinthia Brito FONSECA (Colaboradora) Helbert de Almeida ANDRADE (Colaborador) Curso de Engenharia de Materiais/UnilesteMG

A cicatrizao rpida de feridas um tema que tem atrado pesquisadores do mundo inteiro na busca de solues eficientes e baratas para trat-las. H no mercado uma grande variedade de curativos que tm como fim proteger as feridas de infeces e ressecamento durante a cicatrizao. Mas a incidncia elevada de feridas por segunda inteno e seus altos custos para a sade pblica esto mudando a idia de que um curativo tenha somente que proteger feridas. A estratgia usada tem sido a de acelerar os mecanismos de proliferao celular buscando propiciar melhores condies para a recuperao da pele. Nesse contexto os biomateriais, desempenham um papel importante, pois abrem um amplo leque de aplicaes.

A proposta deste trabalho consiste de investigar uma nova aplicao para o poli-n-isopropilacrilamida (PNIPAAm), na cicatrizao de feridas levando-se em considerao a possibilidade de se usar um material mais inteligente e de torn-lo de baixo custo, tendo vista que tratamentos e materiais para aplicaes biomdicas, em sua maioria, tornam-se inviveis devido a seu elevado custo. Foi usado um hidrogel polimrico, que possui uma interessante propriedade de transio que o torna um polmero hidroflico/hidrofbico quando atinge determinadas temperaturas. A idia central explorar os mecanismos de adeso do poli-n isopropilacrilamida e desenvolver um filme com multicamadas que, em contato com as novas clulas, testando seu mecanismo ligadesliga (on-off) . PNIPAAm ter um comportamento hidrofbico e as clulas em proliferao aderiro bem sua superfcie proporcionando boas condies para formao de novas camadas de tecido temperatura do corpo.

COMO FUNCIONA!!!
Quando for necessrio retirar curativo, a temperatura ser diminuda, tornando o polmero absorvedor de gua e sabendo se que nestas condies as clulas perdem a aderncia, a remoo do curativo tornar-se- fcil, possibilitando uma retirada sem danos ao novo tecido. Para obter um material, que servir como base do filme multicamadas, resistente e malevel suficientemente para ser utilizado em aplicaes biomdicas optamos neste projeto pelo poliuretano devido a sua elasticidade, facilidade de ser processado e de manuseio, transparncia, bioinrcia e custo relativamente baixo. Um problema do poliuretano a sua hidrofobicidade que impede a sua aderncia gua. Para solucionar este empecilho, foi realizada a graftizao (enxerto) da PNIPAAm na superfcie do poliuretano. O poli-n-isopropilacrilamida apresenta como principal caracterstica, extrema facilidade para absoro de gua e outras substancias, como exudato de feridas.

O filme composto basicamente por poliuretano termorgido. Gros de poliuretano so dissolvidos em um determinado solvente e aps completa dissoluo, a mistura foi submetida a vcuo e espalhada na superfcie de um vidro com auxilio de um basto de vidro. Sua espessura ficou em torno de 120 μm e muito importante, pois ela influencia nos resultados.

GRAFTIZAO ( ENXERTO) DE PNIPAAm

Tratamento superficial no filme, o tratamento por Efeito Corona. O filme foi submetido a um equipamento que promove uma diferena de potencial e emite gs oznio na superfcie do filme para que possam liberar radicais em sua superfcie. Aps o ataque da superfcie, o filme foi lavado em gua deionizada, que apresenta nveis elevados de pureza. Aps a lavagem foi realizada a graftizao. O filme tratado foi colocado em um balo de trs bocas contendo uma soluo de PNIPAAm, um agente de ligao cruzada, o MBAAm, APS e TEMED e gua destilada. Aqueceu-se a soluo a 50C durante 1 hora, foi submetido a trs enxges. Uma gotcula de gua deionizada foi colocada sobre a superfcie do filme. Medido o ngulo da gota com a superfcie do filme verificou-se a modificao na tenso superficial do poliuretano. Foi realizada tambm anlise de espectroscopia por infravermelho com reflexo total atenuada (FTIR-ATR) da superfcie do filme multicamadas

Ficou clara a aderncia (graftizao) do PNIPAAm superfcie do filme, pois esta pde ser verificada visivelmente e ao se tocar na amostra ficou clara a diferena entre a superfcie tratada e uma outra sem tratamento. Os resultados da modificao da superfcie do poliuretano foram os esperados. Basta agora realizar testes de biocompatibilidade para aplicaes biomdicas

1- O Hidrogel um gel estril, formulado com base hidroflica enriquecida com leo de origem vegetal. O produto indicado para promover o desbridamento autoltico e conferir proteo s feridas secas, superficiais ou profundas, com necrose ou fibrina. Para efetuar a remoo do Curatec Hidrogel, irrigar o leito da ferida com soluo fisiolgica. 2-A prata a maior tendncia mundial no tratamento de feridas por seu excelente poder bactericida, rpida cicatrizao, reduo de odor e fcil aplicao. 3- Curatec Filme Transparente Rolo consiste de um filme de poliuretano no-estril coberto por um adesivo hipoalergnico que proporciona uma cobertura protetora da pele.