Fator Neurotrófico Derivado Do Cérebro (BDNF)

PONTIFÍCIA UNIVERSIADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
EVOLUÇÃO E MODELAGEM MOLECULAR DO

FATOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO CÉREBRO (BDNF) EM
MAMÍFEROS
FABÍOLA SALENE MATTEI
Porto Alegre
2010
EVOLUÇÃO E MODELAGEM MOLECULAR DO
FATOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO CÉREBRO (BDNF) EM
MAMÍFEROS
FABÍOLA SALENE MATTEI
Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Biologia Celular e
Molecular da Faculdade de Biociências
da Pontifícia Universidade Católica do
Rio Grande do Sul.
Orientador: Eduardo Eizirik

Co-orientador: Osmar Norberto de Souza
Porto Alegre
2010
"I believe that the study of science, the learning of the scientific method
by all people, will ultimately help the people of the world in the solution of
our great social and political problems."
Linus Pauling
AGRADECIMENTOS
Bernadete Baseggio Mattei
João Maximino Mattei
Rodolfo Devino Baseggio Mattei
“Sou parte da história de vocês, na imensa narrativa de suas vidas. Portanto esta
sub-parte Pós-Graduação, também é, concomitantemente, esforço e dedicação de
vocês! Amo vocês.”
Eduardo Eizirik
Osmar Norberto de Souza
“Ao conhecimento brilhante e orientações nestes dois anos. Levo na minha

bagagem estes conhecimentos científicos distintos, ambos abrangentes e, sobretudo
o crescimento pessoal.”
i
LISTA DE FIGURAS E TABELA
Figura 1. Alinhamento das seqüencias de aminoácidos das Neurotrofinas.....8
Figura 2. Anotação da seqüência protéica do BDNF em humanos...............12
Figura 3. Esquema da estrutura neurotrófica madura típica...........................14
Tabela 1. Modelos protéicos cristalográficos disponíveis...............................15
Figura 4. Interação do BDNF com outras proteínas.......................................17
ii
LISTA DE SIGLAS
antiBDNF: BDNF opposite strand (fita oposta do BDNF)
BDNF: Brain derived neurotrophic factor (Fator neurotrófico derivado do cérebro)
BLAST: Basic local alignment search tool (Ferramenta básica de alinhamento local)
IDRs: Intrinsic disorder regions (Regiões intrínsecas desordenadas)
LTD: Long-term depression (Depressão de longa duração)
LTP: Long-term potentialization (Potencialização de longa duração)
mtDNA: Mitochondrial DNA (DNA mitocondrial)
MeCP2: Methyl CpG binding protein 2 (Proteína de ligação Metil CpG 2)
NATs: Natural antisense transcritpts (Transcritos antisensos naturais)
NGF: Nerve growth factor (Fator de crescimento do nervo)
NT-3: Neurotrophin 3 (Neurotrofina 3)
NT-4: Neurotrophin 4 (Neurotrofina 4)
p75NTR: p75 neurotrophic receptor (receptor neurotrófico p75)
matBDNF: C-terminal form of BDNF (Forma C-terminal do BDNF)
proBDNF: N-terminal domain of BDNF (Domínio N-terminal do BDNF)
proNGF: N-terminal domain of NGF (Domínio N-terminal do NGF)
rRNA: Ribosomal RNA (RNA ribossomal)
Trk: Tyrosine kinase receptor (receptor tirosina cinase)
TrkB: Tyrosine kinase receptor B (receptor tirosina cinase B)
iii
RESUMO
O fator neurotrófico conhecido como BDNF tem atraído considerável atenção na

literatura científica, pelo seu envolvimento em processos cruciais de desenvolvimento e
regulação do sistema nervoso. Entretanto, muitos aspectos desta molécula são ainda
desconhecidos, enquanto outros foram investigados apenas em humanos e
organismos-modelo. Neste contexto, ferramentas de bioinformática podem ser muito
úteis para realizar análises comparativas enfocando aspectos evolutivos, estruturais e
funcionais. Este projeto objetivou uma caracterização de padrões de conservação e
variação desta molécula através da comparação das seqüências codificantes deste
gene em diferentes linhagens de mamíferos, assim como uma investigação de aspectos
estruturais através da construção de um modelo 3D do BDNF consistente com dados
experimentais. Os resultados revelam padrões bastante interessantes de conservação e
variação de sequência em diferentes linhagens, incluindo fortes evidências da
ocorrência de seleção natural negativa (indicando restrição à mudança devido à
relevância funcional) tanto no domínio maduro como no domínio pro. Além disso,
observou-se evidência de seleção positiva (indução de mudanças possivelmente
adaptativas) em diferentes linhagens, em todos os casos afetando diretamente o
domínio pro. Estes resultados indicam que o domínio pro apresenta grande relevância
funcional, e salientam a importância de focar esforços de investigação experimental
nesta porção do BDNF.
Palavras-Chave: ProBDNF, forma homodimérica, seleção natural, mamíferos.
ABSTRACT
The neurotrophic factor known as BDNF has attracted considerable attention in the
scientific literature, due to its involvment in critical processes related to the development
and regulation of the nervous system. However, many aspects of this molecule are still
unknown, while others have only been investigated in humans and model organisms. In
this context, bioinformatic tools can be very useful to perform comparative analyses
focusing on evolutionary, structural and functional aspects of this protein. This study
aimed to characterize the patterns of conservation and variability in this molecule
through the comparison of coding sequences in different mammalian lineages, as well
as to investigate structural aspects by constructing a novel 3D model of a BDNF
homodimer that is consistent with experimentally validated data. Our results revealed
very interesting patterns of conservation and variability in different lineages, including
strong evidence for the occurrence of negative natural selection (indicating constraints to
evolutionary change implying functional relevance) in both the mature and the pro
domains. In addition, we observed evidence of positive selection (induction of changes
that are likely adaptive) in different lineages, in every case directly affecting the pro
domain. These results indicate that the pro domain presents great functional relevance,
and highlight the importance of focusing research efforts on this portion of BDNF.
Key-words: ProBDNF, homodimeric form, natural selection, mammals.
iv
ÍNDICE
Agradecimentos…………………………………………..………...................................i
Lista de Figuras e Tabelas........................................................................................ii
Lista de Siglas...........................................................................................................iii
Resumo......................................................................................................................iv
Capítulo 1 – Introdução e Objetivos.........................................................................6
1. 1. BDNF como membro da família das neurotrofinas.........................................6
1.2. Estrutura e expressão do gene BDNF.............................................................8
1.3. Proteína BDNF................................................................................................9
1.4. Sinalização mediada pela proteína BDNF.....................................................15
1.5. Alinhamento de seqüências e caracterização molecular evolutiva................18
1.6. Modelagem molecular por homologia............................................................21
1.7. Objetivos........................................................................................................23
Capítulo 2 – Artigo Científico..................................................................................24
2.1. Informação suplementar.............................................................................32
Capítulo 3 – Considerações Finais.........................................................................58
Referências...............................................................................................................60
5
Capítulo 1 – Introdução e Objetivos.
1. 1. BDNF como membro da família das neurotrofinas.
O Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é um membro da família de
proteínas homólogas conhecidas como neurotrofinas, e tem um papel central no
desenvolvimento, fisiologia, e patologia do sistema nervoso; como também em processos
relacionados à plasticidade cerebral como a memória, e o aprendizado (Yamada et al.,
2002). Neurotrofinas, que em mamíferos, incluem o Fator de crescimento nervoso (NGF),
a Neurotrofina 3 (NT-3), a Neurotrofina 4 (NT-4), e o BDNF, têm sido caracterizadas em
rotas funcionais distintas, porém paralelas (Hallböök, 1999). O BDNF foi o segundo fator
trófico a ser identificado e caracterizado (Barde et al., 1982), antecedido pelo NGF; esse
último apresenta-se como molécula-modelo para os estudos neurotróficos. Os primeiros
estudos que abrangeram a filogenia molecular envolvendo as neurotrofinas relataram uma
seqüência de eventos para a formação dos genes neurotróficos: duas duplicações
lideraram a formação desta família; após um episódio inicial de duplicação, um dos genes
descendentes deu origem ao par BDNF e NT-4, enquanto o outro ao par NT-3 e NGF
(Hallböök, 1999; Lanave et al., 2007). Só após o segundo evento de duplicação houve a
diferenciação dos pares, caracterizada pela especialidade individual de cada gene
neurotrófico. Do mesmo modo, o alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos,
revela cerca de 40% de similaridade entre os membros das neurotrofinas (Figura 1), e
estudos iniciais demonstraram que as regiões conservadas e variáveis nestas seqüências
estão agrupadas em blocos (Robinson et al., 1995; Butte et al., 1998; Robinson et al.,
1999).
1
Figura 1. A Figura representa as quatro sequências protéicas da família das neurotrofinas utilizadas para
os experimentos de raios-X. Legenda: Precursor NGF-beta (241 aa); Precursor BDNF (247 aa); Precursor
NT-3 (257 aa); Precursor NT-4 (210 aa), com suas respectivas identificações nos bancos de dados (gi:
sequence identifiers; an: acession number); * região nas seqüências alinhadas de identidade de
aminoácido; : região nas seqüências alinhadas de similaridade de aminoácidos; . região nas seqüências
alinhadas de aminoácidos não-relacionados. O formato das seqüências utilizado para o alinhamento foi
Pearson, e a matrix blosum.
As ações celulares das neurotrofinas são mediadas através de dois tipos de
receptores: um receptor tirosina cinase (Trk) de alta afinidade, e um receptor pan-
neurotrófico de baixa afinidade (p75NTR). A comparação das análises filogenéticas entre
as neurotrofinas e os seus receptores Trks identificou a co-evolução entre estes locos,
fato que aumenta a especificidade entre as interações receptor-ligante (Halböök et al.,
1998). Embora os efeitos tróficos de longa duração (potenciação e depressão) das
neurotrofinas dependam da regulação gênica, os receptorers ativados pelos seus
membros também exercem uma ampla gama de ações rápidas, incluindo efeitos
morfogenéticos e quimiotrópicos nos neurônios em desenvolvimento, assim como a
modulação da excitabilidade neural, e a transmissão sináptica (Poo, 2001).
2
1.2. Estrutura e expressão do gene BDNF.
Em relação ao contexto cromossômico, o BDNF (Gene ID: 627) localiza-se no
braço curto do cromossomo 11 humano perto de dois pseudogenes, ambos inferidos:
ribosomal protein S25 pseudogene 1 (Balasubramanian et al., 2009) e chromobox
homolog 3 pseudogene 1 (Park et al., 1998); este último envolvido na estrutura e
organização da cromatina. O primeiro gene, localizado a 49kb downstream ao BDNF, é o
LIN-7 (GeneID: 55327), que codifica para uma proteína pequena descoberta em
Caenorhabditis elegans. Lanktree e colaboradores (2008) encontraram associação entre
polimorfismos analisando o BDNF e o LIN-7 com a desordem de déficit de atenção /
hiperatividade (ADHD). Já o gene localizado upstream ao BDNF é um membro citosólico
da classe de proteínas heat shock, conhecido como HSP90AA2 (GeneID: 3324); essa
classe se associa com outras chaperonas, e tem um papel importante no enovelamento
de novas proteínas, e/ou na estabilidade de proteínas desnaturadas depois de condições
de estresse (Ammirante et al., 2007)
Análises comparativas iniciais incentivaram o estudo com este gene, e ainda
apresentam importância para a caracterização sequencial deste gene em inúmeras outras
espécies, destacando os mamíferos, foco desse estudo, com mais de 203 sequências
descritas, e depositadas em bancos de dados. Atualmente o estudo da estrutura gênica e
padrões de expressão em roedores e primatas estão sendo explorados. Neste contexto, a
estrutura do gene BDNF, estudada em roedores (Aid, et al., 2007), demonstrou que
camundongo e rato têm oito exons 5´, e um exon 3´, sendo que este último codifica para a
proteína BDNF madura. Pruunsild e colaboradores, no mesmo ano, realizaram um amplo
estudo do gene BDNF em humanos, e constataram a presença de onze exons, e nove
promotores funcionais que determinaram à expressão tecido-específica dos transcritos,
como predominantemente localizada no Sistema Nervoso Central; também, neste estudo,
3
foram detectados transcritos no Sistema Nervoso Periférico - assim como associado a um
amplo padrão de expressão, por exemplo, no coração, rim, músculo, próstata, placenta,
estômago e, testículo - similar ao padrão de expressão do mRNA observado para
roedores.
1.3. Proteína BDNF.
A proteína BDNF foi originalmente purificada a partir de cérebro de porco,
representando o segundo fator neurotrófico a ser purificado, depois do NGF, datando
quase 30 anos (Barde, 1982). O estudo comparou esta proteína purificada com o NGF –
fator trófico até então bem caracterizado – e constatou propriedades antigênicas e
funcionais diferentes. O nível de expressão da proteína BDNF em humanos é regulado
durante o desenvolvimento, mas persiste em muitas partes do cérebro adulto, sendo mais
abundante no sistema nervoso, em comparação a outros tecidos, no referido período
(Katoh-Semba et al., 1997). A clonagem e os estudos de expressão inicial desse gene
(Leibrock et al., 1989) contribuíram para o interesse de inúmeros trabalhos posteriores,
que se dedicaram à análise da expressão protéica em diversos tecidos, e a traçar
prováveis rotas para sua sinalização, visto sua grande importância para a pesquisa em
neurociências.
Entre as distintas isoformas identificadas em humanos, àquela denominada como
isoforma a perfaz a maioria das pesquisas. Esta isoforma constitui-se em uma pré-
proproteína (Uniprot p23560), de 247 aminoácidos (Figura 2A), que é transportada
através de vesículas para o retículo endoplasmático. A forma longa do proBDNF (sem o
peptídeo sinal de direcionamento) (Figura 2B) possui dois motivos de clivagem; o primeiro
origina uma forma curta do proBDNF (Figura 2C), e o segundo uma forma madura (Figura
2D), ambas independentes (Mowla et al., 2001; Lanave et al., 2007). Em relação à
4
primeira clivagem, a forma longa do pro-BDNF é processada intracelularmente através da
54
proteinase SKI-1, na qual reconhece o motivo consenso RGLT↓SL59 de resíduos não-
57
básicos, e cliva exatamente no aminoácido T, originando a forma curta do proBDNF.
(Seidah et al., 1999). A segunda clivagem, não-dependente do primeiro processamento,
ocorre extracelularmente através da enzima plasmina em uma região de resíduos

125
básicos, no motivo consenso RVRR128↓ (Lee et al., 2001; Pang et al., 2004; Gray &
Ellis, 2008), para constituir o peptídeo maduro de 119 aminoácidos. Outro trabalho
importante para a identificação de regiões peculiares na seqüencia peptídica do proBDNF
foi a descoberta de um motivo não contínuo no domínio maduro (16I - 18

E- 105
I- 106
D) que
é necessário para o direcionamento do proBDNF a uma rota regulada. Na ausência deste
motivo, o BDNF é direcionado para uma via constitutiva (Lou et al, 2005).
Figura 2. O BDNF é traduzido em uma pré-proproteína, constituída de um pré-prodomínio, um pro-domínio e uma forma madura C-
terminal. A) Pré-proprodomínio com o peptídeo sinal (18 primeiros aminoácidos) para direcionamento ao retículo endoplasmático,
mostrando as posições relativas às clivagens (57 e 128) e um sítio para glicosilação na posição 121. B) Pro-domínio com
características de uma proteína secretória de 229 aminoácidos de comprimento. C) proBDNF curto com 190 aminoácidos de
comprimento, gerada no retículo endoplasmático. A clivagem pelo pró-hormônio convertase S1P/SKI-1ocorre na posição 57T, no
motivo consenso 54RGLT↓SL59. D) Forma madura com 119 aminoácidos de comprimento. A clivagem pela plasmina ocorre na posição
128
R, no motivo consenso 125RVRR↓128. Esquematizada na figura, está à localização aos pares dos seis resíduos de cisteína que
formam as três pontes dissulfeto.
5
A utilização do proNGF recombinante para elucidar a relação da sua porção pro –
peptídica com o domínio maduro foram importantes a fim de obter uma co-relação com o
proBDNF. Neste sentido, Rattenholl e colaboradores, em 2001, demonstraram o efeito da
pro-seqüência do NGF na formação das pontes dissulfeto e no enovelamento do domínio
maduro in vitro (Rattenholl et al., 2001a). Em relação à formação estrutural, análises
físico-químicas revelaram que a região pro do NGF forma um dímero, assim como o
domínio maduro e, indicaram uma quantidade limitante de estrutura secundária na porção
pro (Rattenholl et al., 2001b). Kliemannel e colaboradores (2004), em pesquisa
subseqüente, sugeriram que a região pro do NGF parece estruturar-se quando se liga a
parte madura, adotando uma estrutura terciária definida. Considerando o enfoque nas
características hidrofóbicas, identificaram-se os aminoácidos necessários para associação
intramolecular dos domínios pro e maduro do NGF (W -83 - A-63 na região pro; W 121 na
região madura) e, relataram-se propriedades estruturais desta ligação baseada
principalmente na superfície exposta ao solvente (Kliemannel et al, 2007). Paiardini e
colaboradores (2008), mensurando esforços para obter uma delimitação estrutural para a
porção pro-peptídica, indicaram que a porção N-terminal do proNGF e do proBDNF, são,
na maior parte, regiões desordenadas intrinsecamente (IDRs). Com base nesta inferência,
da presença de região com padrão de desordem, Paoletti e colaboradores, em 2009,
obtiveram um modelo do proNGF em camundongo, através da metodologia de SAXS 1, e
coletaram informações em relação à estrutura tridimensional (3D), e à dinâmica do
proNGF, fornecendo relações entre a estrutura molecular, movimento em nível atômico, e
sua função.
1
SAXS (Small-Angle X-ray Scattering), método estrutural aplicável a partículas nativas em solução; é adequado,
particularmente, ao estudo de sistemas menos estruturados. Metodologia comumente usada para pesquisar processos,
como por exemplo, relacionados ao enovelamento/não-enovelamento de proteínas, ou rotas não totalmente elucidadas
(Bernadó et al., 2007).
6
Em relação ao processamento, dois importantes estudos foram relatados: no
primeiro, Nomoto e colaboradores, (2007), indicaram que especialmente a parte C-
terminal do proNGF e do proBDNF afeta muito a constituição do domínio maduro, por
estar envolvida no processamento das neurotrofinas; com o segundo estudo, demonstrou-
se que a endositose, assim como a clivagem são pré-requisitos para a produção da forma
processada, capaz de induzir a ativação do receptor Trk, e inferiu-se que sob condições
fisiológicas, as pro-neurotrofinas não se ligam ou ativam diretamente tais receptores
(Boutilier et al, 2008).
A estrutura protéica madura do BDNF contém seis resíduos de cisteína, que
formam três pontes disulfeto (Robinson et al., 1995). Os referidos resíduos de cisteína, na
qual participam da estruturação característica desta proteína, são extremamente
conservados em todas as neurotrofinas. O matBDNF apresenta uma topologia na forma
de dímero, com uma interfase dimérica formada por interações hidrofóbicas conservadas,
identificadas pela comparação em estudo de superposição (Robinson et al., 1995; Butte et
al., 1998; Robinson et al., 1999). A estrutura secundária de um monômero do matBDNF é
formada por sete folhas-β, das quais quatro, formam dois pares de folhas-β antiparalelas
retorcidas, dispostas longitudinalmente. Estes dois pares de folhas-β antiparalelas estão
unidos por três loops do tipo grampo (P-hairpin) (loop 1, loop 2, e loop 4), e um loop longo
(loop 3) (Figura 3).
7
Figura 3. Topologia de um monômero do matBDNF. O esquema
mostra os quatro loops, assim como, os dois pares de folhas- β
antiparalelas (identificados pelas letras A à D). N e C terminais estão
indicados. Os elementos de estrutura secundária típico desta família
são constituídos de sete folhas- β. Fonte: Butte, 2001.
A porção madura foi o foco de trabalhos iniciais e, inicialmente não se dispunha de
informações sobre o pró-dominio, em comparação a atual gama de estudos investigando
a importância da região pro no direcionamento para uma rota distinta da forma madura,
assim como no auxílio do enovelamento adequado da forma madura. A esta prévia falta
de suporte para as pesquisas com o pro-BDNF intacto, corrobora a atual situação que
apenas o domínio maduro (região C-terminal do pro-peptídeo), e uma região do gene
(referente ao promotor III) foram submetidos à técnica de cristalização de raios-X, que
traduz as prováveis configurações dos átomos no cristal (Tabela 1).
Em relação ao domínio maduro, houve a publicação em bancos de dados
protéicos de complexos cristalográficos heterodiméricos do BDNF com outras duas
neurotrofinas: BDNF/NT-3 (Robinson et al., 1995), e BDNF/NT-4 (Robinson et al., 1999).
Estes estudos experimentais identificaram os resíduos do BDNF necessários à ligação
aos receptores TrkB (também conhecido como NTRK2) e p75NTR. Os estudos com os
8
complexos de heterodímeros comprovaram sua existência in vitro, mas a atividade
biológica in vivo ainda não está estabelecida (Robinson et al., 1995; Butte et al., 1998;
Robinson et al., 1999). Esses estudos corroboram a idéia que populações neurais
específicas sofram a ação do BDNF complexado com outras neurotrofinas para reforçar
ou intensificar a sinalização em uma região. Em relação à preferência de formação dos
complexos diméricos in vivo, destaca-se um estudo que conduziu um ensaio da atividade
biológica, em neurônios; este estudo concluiu que houve maior atividade se considerado o
BDNF como homodímero (duas unidades simétricas) (Junkbluth et al., 2005). Entretanto,
no contexto estrutural, ainda não existe um modelo cristalográfico que englobe dois
monômeros do pro-BDNF intacto, assim como do domínio maduro, ou simplesmente da
porção pro.
Tabela 1. Estruturas cristalográficas disponíveis com uma porção do gene BDNF, e a porção madura da proteína (matBDNF -
resíduos 8-116).
Código de Descrição Resolução da Referência

Acesso estrutura (Â)
3C2I Domínio de ligação da 2.50 Ho et al. (2008)
molécula MeCP2 em
complexo com uma
seqüência metilada do
2
bdnf
1B8M / 1HCF Heterodímero do 2.75 Robinson et al.,
matBDNF com a NT-4. (1999)
1BND Heterodímero do 2.30 Robinson et al.,
matBDNF com a NT-3. (1995)
Levando em consideração todos os estudos com o domínio maduro, e a região pro
do NGF, e também do BDNF, ainda se discute algumas questões relevantes. O
mecanismo pela qual o pro-BDNF é processado na via intracelular é desconhecido até o
momento, mas tendo o conhecimento da atividade biológica distinta das formas
secretadas processada e não processada, sugere-se que seja um processo regulado
(Gray & Ellis, 2008). Em relação à estabilidade dimérica do pro-peptídio, há uma hipótese
2
Seqüência do bdnf compreendendo os nucleotídeos 1 a 40:
Região 5´ TCTGGAACGGAATTCTTCTAATAGAAGAATTCCGTTCCAG 3'.
9
que esta região adota uma estrutura terciária estável dimérica, por estabilizar o padrão
dissulfeto em ambos os monômeros do domínio maduro; e este enovelamento seria
considerado transitório quando envolvesse somente a formação de pontes dissulfeto em
um monômero (Kliemannel et al, 2004).
1.4. Sinalização mediada pela proteína BDNF.
Nos últimos anos, houve maior interesse em relação ao fato que o proBDNF e o
matBDNF são direcionadas para rotas celulares diferentes, através da interação a
receptores distintos. O proBDNF possui maior afinidade ao p75NTR, e juntamente com o
co-receptor sortilina, favorece uma rota pró-apoptótica (Teng et al., 2005). A ligação do
matBDNF com o receptor TrkB é responsável pelo controle do desenvolvimento e a
manutenção dos seus alvos-celulares, refletindo uma sinalização anti-apoptótica
(Reichardt, 2006). O matBDNF é preferencialmente direcionado para uma rota regulada, e
o proBDNF secretado sinaliza para uma via constitutiva (Labmann & Brigadski, 2009). A
Figura 4 mostra a interação do BDNF com algumas proteínas, e o tipo de evidência para
estas associações, se de cunho experimental ou não.
Importantes estudos, porém com resultados conflitantes, mostraram uma possível
relação para o proBDNF e o matBDNF, com relevantes implicações para o
direcionamento de rotas. Assim, quando foi estudado a detecção do proBDNF e matBDNF
no hipocampo de camundongo sugeriu-se que, o proBDNF é um intermediário transitório,
na qual é rapidamente convertido a matBDNF (Matsumoto et al., 2008). Já Yang e
colaboradores (2009), utilizando a quantificação do BDNF em neurônios de camundongo,
sugeriram que o proBDNF não é um intermediário na rota biosintética; a eficiência na
10
clivagem do proBDNF é regulada ao longo do desenvolvimento, e sua ação pode ser mais
forte durante o período pós-natal.
Figura 4. A figura mostra um esquema da interação do BDNF com outras proteínas. Legenda: TH:
Tirosina 3-Monooxigenase; GDNF: fator neurotrófico derivado da glia; S1P: Precursor da Protease
serínica sítio 1; NTRK1: Precursor do receptor do NGF de alta afinidade (também conhecido como
TRKA); NGFR: Receptor do NGF; NTRK2: precursor do receptor dos fatores BDNF e NT4; SORT1:
Precursor da sortilina (também conhecido como NTR3 – receptor da neurotensina tipo 3); TRKC:
precursor do Receptor do fator NT3; NTF3: Neurotrofina tipo 3; NTF4: Neurotrofina tipo 4 (também
conhecido como NTF5 – Neurotrofina tipo 5). A cor das linhas representa o tipo de evidência para a
associação: Experimentos (em rosa), informações em bancos de dados (em azul), mineração de
dados (verde-musgo) e, homologia (roxo claro). Fonte: Webserver SMART. Disponível em:
www.ebi.ac.uk/embl.
Já vem de longo conhecimento que este peptídeo constitui o principal regulador da
transmissão sináptica e plasticidade em várias regiões do SNC. A versatilidade do
matBDNF é enfatizada por sua contribuição a uma faixa de respostas adaptativas neurais,
incluindo LTP, certas formas de plasticidade de curto prazo, bem como na regulação
homeostática da excitabilidade intrínseca neural (Kovalchuk et al., 2002; Pang et al.,
2004). Já, o oposto ocorre com o proBDNF, que quando administrado exogenamente,
induziu a apoptose em neurônios da periferia (Teng et al., 2005), e facilitou a depressão
11
de longo-termo (LTD) no hipocampo (Woo, et al., 2005). Estudos mais recentes e
consistentes sobre o proBDNF mostraram que, a estimulação neural de baixa freqüência
induziu, predominantemente, a secreção do proBDNF em neurônios do hipocampo, e o
aumento extracelular do matBDNF acontecia com a estimulação de alta freqüência
(Negappan, et al., 2009). Dois SNPs raros, resistentes a clivagem para a forma madura –
R125M e R127L – mostraram que, o proBDNF exerceu funções distintas, induzindo a
apoptose, nos neurônios cerebelares, e reduzindo o número de fibras colinérgicas, nos
neurônios colinérgicos basais e hipocampais (Hoshimizu, H., et al, 2009).
A função do BDNF foi relatada no envolvimento de algumas doenças neurológicas
incluindo a doença de Alzheimer (Ferrer et al., 1999), esquizofrenia (Pillai, 2008),
Parkinson (Howells et al., 2000) e Epilepsia (Binder et al., 2001). Outros trabalhos
demonstraram o envolvimento do BDNF em distúrbios do humor (Hong et al., 2003; Jiang
et al., 2005), e também no metabolismo diferenciado na dependência de tóxicos (Bolamos
& Nestter, 2004). Um SNP funcional e amplamente relatado na literatura, comum na
seqüência do BDNF, é uma substituição da valina (Val) pela metionina (Met) no códon 66
(Val66Met) na pro-proteína. Esta mutação foi primeiramente relacionada à redução na
anatomia do cérebro e à memória episódica pobre (Egan et al., 2003), e posteriormente,
um estudo com variante BDNFMet em ratos, relacionou-a também à fenótipos de
comportamentos depressivos e ansiedade (Chen et al., 2006). Ambos os estudos
constataram que essa variante foi expressa em níveis normais no cérebro, mas sua
secreção para os neurônios foi diminuida. Em relação a associação baseada em análise
familiar, variações no BDNF – Val66Met e -270C/T - foram associadas à susceptibilidade
a anorexia e bulimia nervosa, mostrando um efeito no balanço energético (Mercader, et
al., 2007).
12
1.5. Alinhamento de seqüências e caracterização molecular evolutiva.
O alinhamento de seqüências nucleotíticas e protéicas, com graus de identidade,
homologia e similaridade diversos, é uma ferramenta que compara duas ou mais
seqüências por meio de buscas por uma série de caracteres ou padrões de caracteres
que estão na mesma ordem. O alinhamento é utilizado para diferentes tipos de
abordagens, tais como, obtenção de padrões de conservação e variação, estudos de
comparação entre diferentes espécies, busca pela correta resolução taxonômica, assim
como busca por motivos seqüenciais que envolvam aspectos funcionais. O alinhamento
pode ser constituído de seqüências de um mesmo segmento gênico ou de seu produto,
ou até mesmo incluir vários genes ou proteínas. Os recursos computacionais que
realizam os alinhamentos permitem aperfeiçoar os dados, através do tratamento com
gaps (representados pelo símbolo -), através da obtenção de escores para avaliar o
resultado do alinhamento, e também, através da obtenção de valores de probabilidade
atribuídos na matriz de substituição de blocos de aminoácidos conservados conhecida
como matriz Blosum (Lesk, 2008). Esta última é o método mais indicado para
alinhamentos locais, e possui a vantagem de ser isenta de extrapolações. As seqüências
sujeitas ao alinhamento são encontradas catalogadas em bancos de dados, e a busca
pelas referidas seqüências é feita utilizando algoritmos, como por exemplo, BLAST
(Ewens & Grant, 2001). Este método permite comparar a seqüência-alvo com uma
biblioteca ou um banco de dados de seqüências baseado na similariedade entre elas, e
se utiliza do alinhamento local (localiza fragmentos de seqüências que são mais
similares). BLAST é o programa mais usado em bioinformática, e tem a vantagem de ser
rápido;
13
Uma porção do gene BDNF tem sido usada como marcador filogenético em
diversos estudos de mamíferos, o que levou a um acúmulo de dados sobre estes locos.
Como conseqüência houve uma crescente gama de publicações de seqüências do BDNF
em diversas espécies, que não foram objetos de análises detalhadas. Atualmente, a
filogenia de algumas famílias ou espécies dentro do grande grupo não está bem resolvida.
Sendo assim, as informações da correta classificação taxonômica são essenciais para
futuros estudos de genômica comparativa entre as famílias, e para auxiliar futuros estudos
das espécies não incluídas em abordagem molecular.
Tendo em vista estas considerações, Kullander e colaboradores, em 1997,
conduziram um estudo com seqüências gênicas do BDNF (256 bp) pertencentes a
espécies de quatro ordens da infraclasse dos marsupiais (Metatheria), estabelecendo a
correta classificação entre elas. Juntamente com outras analises utilizando os outros
membros das neurotrofinas e, o estudo da ordem Monotremata (Prototheria), foi
demonstrado que estas seqüências são bem adequadas para analises filogenéticas dos
mamíferos, podendo resolver a relação basal entre eles (Kullander et al., 1997). Já em
2001, Murphy e colaboradores resolveram boa parte da relação inter-ordem dos
placentários (Eutheria), analisando uma grande demanda de seqüências nucleares,
dentre elas o BDNF, a qual tem colaborado para estudos de interpretação do padrão
biogeográfico e processos evolucionários, envolvidos na grande gama de diversificação
desta infraclasse (Murphy et al., 2001). Dentro dos mamíferos placentários, os morcegos
(ordem Quiróptera) perfazem mais que 20% dos mamíferos existentes (Miller-Butterworth,
et al, 2007); a taxonomia e a filogenia do gênero Miniopterus foram abordadas em
estudos incluindo caracteres morfológicos, de sítios de restrição de rRNA, de mDNA, e de
íntrons nucleares, na qual o posicionaram diferentemente em relação a famílias de
morcegos (Kawai et al. 2002; Van Den Bussche & Hoofer, 2004; Eick et al. 2005). Após
14
um crescente esforço, através da análise das seqüências de representantes das famílias
de morcegos, com base em 16 genes nucleares, entre eles o BDNF, houve a confirmação
que o gênero Miniopterus pertence à família Minipteridae (Miller-Butterworth, et al, 2007).
Outro grupo representativo dos mamíferos inclui os Mustelídeos, pertencente à família
mais rica em espécies dentro da ordem carnívora e, compreende 59 espécies classificado
em 22 gêneros, também abordado nesta pesquisa; a extensa diversidade e característica
evolucionária de radiação adaptativa têm contribuído para a dificuldade na resolução de
sua história filogenética (Givnish & Sytsma,1997). Sendo assim, utilizando-se da análise
de 22 segmentos gênicos, entre eles o BDNF, os mustelídeos foram consistentemente
classificados dentro de quatro maiores clados e três linhagens monotípicas (Koepfli, et al.,
2008). Através da análise desse quadro de classificação houve a inferência que esta
família sofreu dois períodos de diversificação coincidindo com a maior mudança paleo-
ambiental e biótica que ocorreram durante o Neogêneo (Koepfli, et al., 2008).
Estes foram alguns exemplos de grupos avaliados nas análises de padrões de
nucleotídeos e de aminoácidos nesta pesquisa, sendo que trabalhos na qual abordaram
as questões de correta taxonomia e filogenia descritos acima são complementares para
as análises comparativas. Os padrões das seqüências alinhadas podem ser analisados
através de diferentes enfoques, como por exemplo, a proporção de códons conservados e
variados, e a indicação do tipo de seleção natural atuante nos diferentes códons. A
seleção negativa implica graus diferenciados de restrição a mudanças, e na seleção
positiva ocorrem taxas de mudanças que seriam maiores que as encontradas ao acaso,
permitindo variabilidade e adaptação. Ambos os tipos de seleção apresentam relevância
funcional, sendo que o tipo mais comum de ser detectado ao longo do DNA é aquela que
em que a proteína não perde a identidade funcional (seleção negativa). O padrão de
seleção natural mapeado é obtido com base em modelos estatísticos de substituição de
15
códons, que diferem no número de substituições não-sinônimas por códon não sinônimo
sobre o número de substituições sinônimas por códon sinônimo (dN/dS) conhecido como
estimativa de ômega (ω). O modelo M0 assume o mesmo valor de ômega para todos os
códons; M1 assume um valor de ω igual a 0, indicando códons conservados, e também
outro valor de ω igual a 1, que indica códons neutros; M2 assume ω>1, inferindo a
ocorrência de seleção natural positiva; M3, M7 e M8 selecionam códons conservados,
neutros e, positivos. Estes modelos também diferem quanto à distribuição em relação à
classe de códons, podendo ter distribuição normal (modelos M1 e M2), distribuição
discreta (M0 e M3), e distribuição beta (M7 e M8). Os modelos aos pares são usados para
calcular o teste de razão de verossimilhança (Likelihood Ratio Test – LRT) e indicar qual
ou quais dos modelos melhor representa o conjunto de dados amostrados.
1. 6. Modelagem molecular por homologia.
Algumas proteínas-moldes, por possuírem considerável grau de similaridade na
seqüência primária de aminoácidos, e por adotarem um padrão de conformação estrutural
conservado (Nayeem et al., 2006) são utilizadas para modelar proteínas-alvo, na qual se
quer determinar a estrutura tridimensional. Este procedimento para a construção de
modelos estruturais é conhecido como modelagem molecular por homologia ou
modelagem comparativa (Martí-Renom et al., 2000; Deane & Blundell, 2003). A seqüência
protéica alvo é submetida a um alinhamento com proteínas que já dispõem de estruturas
tridimensionais definidas, disponíveis no banco de dados de proteínas PDB (Protein Data
Bank) (Berman et al., 2000), a fim de escolher a(s) estruturas tridimensionais - template(s)
- mais apropriada(s) aos objetivos de uma pesquisa. Estes três primeiros procedimentos:
identificação, seleção, e alinhamento da seqüência-alvo com o(s) template(s) podem ser
16
conduzidos através de uma busca no banco de dados protéico online do National Center
of Biological Information (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), utilizando o algoritmo psi-
blast para a procura por seqüências homólogas, e a matriz de substituição bluson45 para
o alinhamento de seqüências de proteínas. Outros softwares mais específicos que o
BLAST são então utilizados para a obtenção de um alinhamento ótimo, como o programa
online T-coffee (www.ebi.ac.uk/t-coffee).
O template escolhido(s) é então submetido a técnicas de otimização de distâncias
geométricas a fim de satisfazer as restrições espaciais baseado no alinhamento
molde/alvo. Este método de construção de modelos é implantado em softwares como, por
exemplo, Modeller, na qual é o mais utilizado para pesquisas em modelagem (Sali &
Blundell, 1993). A determinação das regiões estruturalmente conservadas das proteínas-
templates e da proteína recém modelada é realizada através de métodos de ajuste dos
quadrados mínimos (“least-squares fitting methods”) pela sobreposição de uma proteína
sobre a outra (Da Silva & Silva, 2007).
As etapas de escolha de um molde, alinhamento e construção do modelo devem
ser repetidas, quantas vezes sejam necessárias para a construção de um modelo
satisfatório (Martí-Renom et al., 2000). Possíveis correções na geometria e na estrutura
modelada podem ser detectadas através de campos de força empíricos, e corrigidas por
métodos como minimização de energia ou dinâmica molecular. Estes parâmetros são
implementados, por exemplo, no programa SANDER do pacote AMBER 9.0 (Pearlman et
al., 1995). Após este processo de otimização do modelo torna-se importante a
subseqüente avaliação dos níveis de qualidade e confiabilidade dos modelos gerados,
tendo como base para os cálculos, estruturas tridimensionais resolvidas (Da Silva & Silva,
2007). Em relação à qualidade, é avaliada a exatidão de parâmetros estereoquímicos,
como por exemplo, comprimento das ligações, ângulos entre as ligações, ângulos
17
torsionais, e quiralidade dos aminoácidos (Höltje, et al., 2003); estes parâmetros podem
ser mensurados utilizando o programa Procheck (Laskowski et al., 1993). Já a
confiabilidade dos modelos gerados pode ser avaliada através dos softwares VERIFY3D
(Luethy et al., 1992), Errat (Colovos & Yeates, 1993), e, vizualizados através dos
softwares Swiss-PdbViwer (Guex & Peitsch, 1997; Schwede, et al, 2003), e PyMOL
(DeLano, 2002).
Finalmente, esta revisão bibliográfica acerca de pontos relevantes sobre o BDNF
ajudou o direcionamento desta pesquisa para uma caracterização e elucidação de
aspectos desta sequência. Estudos conjuntos enfocando as análises comparativas e
estruturais, e suas implicações com características funcionais de uma proteína, podem
contribuir para elucidar aspectos desconhecidos desta molécula. Neste contexto, análises
comparativas das sequências codificantes do BDNF, podem ajudar a compreender em
maiores detalhes aspectos evolutivos, assim como, redirecionar os estudos com esta
sequência. Nesta pesquisa, foi conduzida uma caracterização comparativa, focando em
regiões conservadas e variadas, e padrões de seleção natural (positiva, negativa, ou
neutra). Esta análise foi relacionada a uma caracterização estrutural paralela para abordar
a conformação estrutural das diferentes porções do BDNF (pro e maduro).
18
1.7. Objetivos.
2.1 Objetivos Gerais
2.1.1. Caracterizar a diversidade molecular, padrões de conservação e história
evolutiva do gene BDNF em mamíferos através da comparação de seqüências
representando múltiplas espécies e diferentes linhagens deste grupo.
2.1.2. Caracterizar aspectos estruturais da proteína BDNF de mamíferos utilizando
simulações computacionais, e relacionando-os aos padrões observados nas análises
evolutivas.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1. Investigar padrões de variabilidade em nível de nucleotídeos e aminoácidos
ao longo da região codificadora do gene BDNF em > 100 espécies de mamíferos
representando diferentes linhagens.
2.2.2. A partir destas análises comparativas, identificar e caracterizar regiões com
altos níveis de conservação ou variabilidade acentuada, e investigar seu potencial
envolvimento em aspectos funcionais das formas protéicas resultantes através de
análises estruturais.
2.2.3. Caracterizar a estrutura 3D do pró-domínio do BDNF através de um estudo
de modelagem molecular estática.
19
Capítulo 2 – Artigo Científico
ProBDNF matters: Evolutionary and structural bioinformatics provide novel insights

on mammalian Brain-Derived Neurotrophic Factor
Fabíola S. Mattei, Osmar N. Souza, Eduardo Eizirik
Submetido ao periódico Nature Neuroscience
20
Brief Communication
Nature Neuroscience
Draft, 20 April 2010.
ProBDNF matters: Evolutionary and structural bioinformatics provide novel

insights on mammalian brain-derived neurotrophic factor
Fabíola S. Mattei1,2, Osmar Norberto de Souza2, Eduardo Eizirik1
1
Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, PUCRS. Porto
Alegre, RS 90619-900, Brazil.
2
Laboratório de Bioinformática, Faculdade de Informática, PUCRS. Porto Alegre, RS
90619-900, Brazil.
Abstract
Multiple studies have addressed the function of brain-derived neurotrophic factor, yet most
have only included data from humans or model organisms. Here we apply bioinformatics
approaches to model the structure of human proBDNF and to analyze the evolution of this
protein in mammals. We show that strong selective constraint occurs on both the pro and
mature domains of the protein, and find evidence of adaptive evolutionary change in the
former.
Main text
A great many recent studies have focused on the structure and function of the
brain-derived-neurotrophic factor (BDNF), including its implication in human disorders and
analyses of its developmental and regulatory roles in the nervous systems of model
animals1-5. Although this molecule has been clearly implicated in many important functions,
several aspects of its biological roles remain poorly understood. In particular, the precise
role of proBDNF (the longer, pre-cleavage form of the protein) is still contentious6-8, with
limited data available on this molecule relative to the mature form of the peptide
(matBDNF). In addition, very little is still known with respect to the structure and function of
BDNF in non-model species, so that a potential wealth of comparative information on this
important molecule remains virtually untapped.
21
Comparative molecular data may clarify patterns of conservation at the DNA or
protein levels, indicating regions that may be under strong evolutionary constraint (i.e.
negative selection), implying functional relevance, as well as others that bear signatures of
adaptive change (i.e. positive selection)9. In this context, a powerful approach to
understand biological function of target molecules is to combine methods that detect the
strength and pattern of natural selection at each codon with three-dimensional models of
protein structure associated with experimentally validated information on active motifs.
Such a combined approach has not yet been applied to BDNF, despite the interest in
characterizing in detail its structure and function. Moreover, although various structural
aspects of BDNF have been characterized (e.g. refs. 10,11), no current model of its
structure includes the pro domain, hampering assessments of the biological impact of
protein variants affecting this region of the molecule.
In parallel with the efforts to characterize BDNF structure and function, partial or
complete DNA sequences from the gene encoding this protein have been used in many
phylogenetic studies. The first of those studies, published by our group in 2001, addressed
the relationships among placental mammals12, and led to an intriguing observation
regarding the structure of BDNF: two different mammalian lineages (caviomorph rodents
such as guinea pigs, and cetartiodactyls such as cows and pigs) exhibited up to 11 extra
serine residues (relative to the human sequence) inserted at the same position in the
protein (near the cleavage site yielding a shorter proBDNF – see Table S1; Figs. S1, S4),
rendering the resulting peptide potentially very different from those of model organisms.
This finding led us to investigate in detail the levels of sequence variation in BDNF across
mammals, to perform site-by-site analyses of natural selection, and to construct a novel
structural model of a complete proBDNF peptide onto which to map the detected patterns
of constraint and modification.
We specifically aimed to address five questions: (i) how much selective constraint
(i.e. functional relevance) can be detected across proBDNF? (ii) is there any evidence of
positive selection at any site? (iii) what is the 3D structural distribution of amino acid sites
inferred to be under selection? (iv) are the detected serine expansions located near any
functionally relevant site? (v) is there evidence for different evolutionary forces acting upon
BDNF in different mammalian groups?
To address these issues we undertook a two-pronged approach, which led us to
construct a novel 3D model of homodimeric proBDNF, and to perform multiple
comparative analysis of BDNF sequence variation across mammals (see Supplementary
22
Methods). Briefly, our modeling effort used coordinates from two templates: 2ia8 was
selected to model the pro domain, and 1b8m was used for the mature portion (see Fig. S2;
Tables S2-S3). Our models were consistent with SAXS experiments of proNGF13.
Furthermore, we superimposed the validated mature domain onto different models obtaing
in modeling (n=10), and confirmed the flexibility of the pro domain, which is best
represented as a random coil (Fig. 1; Fig.S3).
The evolutionary analysis of natural selection employed BDNF DNA sequences
from 153 different mammalian species (Tables S4-S9), which were sorted into six different
data sets: (i) data set 1 contained all available complete coding sequences for BDNF
(n=20); (ii) data set 2 was more inclusive, incorporating complete or partial sequences
(spanning > 489 bp) from 94 different species; (iii – vi) specific data sets focused on the
orders Carnivora (n= 84), Cetartiodactyla (n= 28), Chiroptera (n= 28), and Rodentia (n=
15), whose current sampling allowed for detailed comparative analyses. Preliminary
analysis of sequence variation indicated that both the mature and pro regions of BDNF
contained a substantial portion of conserved sites at the DNA and protein levels (Table
S10). Even though conservation was more extreme in the mature portion of the protein,
68% of the amino acids in the pro domain were completely identical across all major
mammalian lineages (data set 1), indicating considerable constraint in this domain as well.
We then performed codon-by-codon analyses of natural selection, employing several
maximum likelihoods and Bayesian approaches (see Supplementary Methods for details).
After selecting the model that provided the best fit to the data (Table S11), we analyzed
the ratio of nonsynonymous (amino acid changing) to synonymous (silent) substitutions
(ω= dN/dS) for each codon in each data set. Ratios significantly below 1 indicate negative
selection (functional constraint), while those significantly above 1 indicate positive
selection.
Many codons in both the pro and mature domains were inferred to be under very
strong negative selection (Fig. 1; Tables S12-S13). All the amino acid sites that have been
experimentally implicated in BDNF function (e.g. cleavage sites and the human codon 66,
involved the well-known Val/Met polymorphism2,5) had ratios close to zero, corroborating
their strong constraint and validating our approach. Many other sites showed similar levels
of constraint, including those adjacent to the observed serine expansions. This indicates
that those sites are functionally relevant, and that the insertion of multiple extra residues in
that region may lead to biologically meaningful consequences. This suggests that
experimental analysis of BDNF in mammals bearing those insertions (e.g. guinea pig, cow,
23
pig) may provide novel insights onto the function and regulation of this molecule.
Moreover, the full set of codons observed to be under extreme negative selection may be
used to help design experiments that assay their activity directly. Many of these sites are
located in the pro domain, supporting the view that this portion has important biological
functions.
Another interesting result was the detection of five codons in BDNF that may be
under positive selection (Figs. 1 and S4; Tables 1, S12, S13), implying that they have
undergone adaptive change in at least some of the sampled species. Remarkably, all of
these sites were located in the pro domain, indicating that this portion of the protein has
been influenced by recent adaptive evolution in different mammalian lineages. Site 84
yielded the most consistent pattern, which was detected in most data sets, particularly in
data set two (Table 1), whose sample size provided the most power. Differences among
taxon-specific data sets indicate that some sites may have undergone distinct selective
regimes in different mammalian lineages, possibly due to contrasting evolutionary
pressures affecting the regulation and development of their nervous system. Two
interesting examples are codons 51 and 53 (both located near the cleavage site for a short
proBDNF): the former bears very strong evidence of positive selection in Cetartiodacyla
and negative selection in the other taxa; the latter shows signs of positive selection in
rodents, and negative selection in others. Interestingly both of these orders contain
serine/threonine expansions in that region of the protein (see Tables S1, S12-S13). These
and other results outlined here open up new research avenues allowing further dissection
of the biological roles of BDNF in mammals.
References
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12. Murphy, W. et al. Nature 409, 614 – 618 (2001).
13. Paolleti, F. et al. Proteins 75, 990 – 1009 (2009).
24
Table 1. Detection of specific amino acid sites in BDNF likely to be under positive selection in at least one of
our mammalian data sets. For each of the five sites in each of the data sets, we indicate the probability of
belonging to a category with ω > 1, as well as the mean posterior estimate of ω, which were calculated with
model M8 and the BEB option in the CODEML program (see Supplementary Methods for details). Site
numbers and the respective amino acids follow the observed states in the human sequence (see Tables S12-
S13 for a complete list of values for all sites).
Data set Selected Probability Mean posterior

amino acid a of positive ω (+ SE) b
selection b,c
Data set 1 47Asn 0.02072 0.332 + 0.261
51 Ala 0.12969 0.535 + 0.429
53 Ser 0.00765 0.124 + 0.182
80 Asn 0.52648 1.092 + 0.489
84 Asn 0.72621 1.320 + 0.501
Data set 2 47 Asn 0.00006 0.371 + 0.138

51 Ala 0.00027 0.336 + 0.154
53 Ser 0.77941 1.329 + 0.331
80 Asn 0.59787 1.205 + 0.369
84 Asn 0.98596 1.496 + 0.101
Cetartiodactyla 47 Asn 0.00427 0.082 + 0.144

51 Ala 0.95891 2.423 + 1.195
53 Ser 0.01884 0.121 + 0.311
80 Asn 0.09573 0.353 + 0.595
84 Asn 0.81383 2.094 + 1.218
Rodentia 47 Asn 0.02816 0.274 + 0.296

51 Ala 0.00476 0.117 + 0.164
53 Ser 0.84950 1.636 + 0.736
80 Asn 0.07289 0.466 + 0.362
84 Asn 0.88530 1.651 + 0.629
Chiroptera 47 Asn 0.61496 1.169 + 0.464

51 Ala 0.07566 0.370 + 0.391
53 Ser 0.37821 0.871 + 0.535
80 Asn 0.14180 0.568 + 0.432
84 Asn 0.78233 1.346 + 0.399
Carnivora 47 Asn 0.24152 0.662 + 0.578

51 Ala 0.00613 0.086 + 0.150
53 Ser 0.00289 0.077 + 0.115
80 Asn 0.46473 1.038 + 0.626
84 Asn 0.04190 0.219 + 0.336
a
Underlined sites indicate amino acids detected as likely being under positive selection in a given data set.
b
Values in bold indicate evidence of positive selection (probability > 0.9, or posterior mean >1).
c
The probability of the site being under negative selection is 1 minus the value indicated here (e.g. 0.97928 for
site 47 in data set 1 – see Table S11 for the mean ω of each site category in each data set).
25
Figure Legend
Figure 1. Three-dimensional structure of a human proBDNF monomer, modeled using pdb templates 1b8m
subunit A and 2ia8. The top portion of each panel corresponds to the mature domain of BDNF, while the
intermediate loop and the bottom portion contain the pro domain. Colors indicate the ω value (i.e. the non-
synonymous to synonymous ratio of nucleotide substitution) for each codon, calculated using data set 1 and
the M8 model (see Supplementary Methods for details). A. Codons exhibiting the lowest ω values (0.053 to
0.06), implying the strongest selective constraint, are shown in black; all others are shown in gray. The arrow
represents the point where serine/threonine expansions have been observed in two mammalian lineages,
exactly where cleavage occurs to form a shorter proBDNF molecule (see Tables S1 and S12). B. Codons
exhibiting the highest values of ω (1.0 to 1.32), implying evidence of positive selection, are shown in black;
all other residues are shown in gray. Arrows indicate three other sites (Asn47, Ala51, and Ser53) bearing ω
values > 1 in other data sets (see Tables 1, S12 and S13).
Figure 1
26
Online Supplementary Information – Mattei et al. 2010
Summary for Supplementary Information
1. Supplementary methods…………………………………………….....2
2. References for the Supplementary methods …………………...…4
3. Supplementary Tables……………………….....................................5
3.1. Table S1. Summary of serine/threonine insertions………….......5
3.2. Tables S2 and S3. Summary of structural model parameters….6
3.3. Table S4 – S9. Data set composition.…………............................7
3.3.1. Supplementary references for tables S4 – S9………..…….17
3.4. Table S10. Proportion of conserved sites…...............................18
3.5. Table S11. Parameters of Likelihood Ratio Tests…...................19
3.6. Tables S12-S13. Full list of posterior probabilities and ω

values for all codon sites……………………...22
4. Supplementary Figures..................................................................34
4.1. Figure S1. Sequence of human BDNF isoform a……………….34
4.2. Figure S2. Alignment of templates and target-sequence……...35
4.3. Figure S3. Structure of a proBDNF homodimer .……………….36
4.4 Figure S4. Location of positively selected amino acids…...........37
27
Supplementary Methods
ProBDNF Homodimer Model Construction and Evaluation
A proBDNF structural model was constructed using a comparative molecular modeling

technique1 supported by the swiss-pdbViewer version 3.72 and Pymol version 0.99rc63
visualization software packages. We initially generated the mature BDNF homodimer from
the crystallographic structure of a BDNF/NT4 heterodimer (pdb ID: 1b8m), using
information on the mature BDNF monomer (chain A), and applying the copy and translate
technique. To create a complete 3D model, we conducted an online screening procedure
with psi-blast algorithms (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) to search for the best available
templates that covered the target-sequence of human proBDNF isoform a (gi:219842314),
using the protein data bank (PDB), the blosum45 matrix, and threshold 0.5. After selection,
the two templates (pdb ID: 1b8m subunit A, and 2ia8) were used for modeling the
proBDNF. The optimal alignment was performed with the program T-coffee
(www.ebi.ac.uk/t-coffee). ProBDNF models were constructed using the software
Modeller4, which builds 3D models by meeting specific constraints in the target-sequence,
based on alignments with the template sequences. Finally, all generated models were
evaluated using Prochek 5 (Tables S2-S3).
Comparative Sequence Analysis
Mammalian BDNF coding sequences (CDS) were obtained from GenBank entries
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), using the BLAST algorithm applied to the nucleotide
collection database. Sequences from 153 species were retrieved, including complete CDS,
partial CDS or full mRNAs. Species names, sequence lengths, GenBank accession
numbers and the original reference are presented in Tables S4-S9. These sequences
were aligned using the CLUSTALW algorithm6, manually inspected, and sorted by
sequence length or taxonomic assignment, representing different mammalian lineages.
Sequences with ambiguous characters were eliminated from the analysis. All analyses
were conducted excluding the signal peptide (first 18 codons). The alignments sorted by
length were divided into two groups: i) data set 1, which included species with complete
coding sequences; and ii) data set 2, which was selected to represent 24 mammalian
lineages (with each sequence spanning at least 489 bp). The alignments sorted by taxon
28
represented mammalian orders which currently present a reasonable sample of available
species: Carnivora, Cetartiodactyla, Chiroptera and Rodentia. Data sets were organized
using the package MEGA 4.07, which was also employed to run exploratory analyses of
sequence conservation.
Natural Selection Analysis
More detailed molecular evolutionary studies were conducted with the CODEML program
within the PAML4 package8, which provides log-likelihood (lnL) values for different models
of codon evolution and posterior probabilities for distinct selection regimes (negative,
neutral, positive) at each site. Specifically, we provided the program with unrooted
Neighbor-Joining trees estimated in MEGA with Maximum Composite Likelihood
distances, including all codon positions. All positions containing alignment gaps and
missing data were eliminated in a pairwise fashion (pairwise deletion option).
We conducted Likelihood Ratio Tests (LRT) to assess model fitting. These tests employ as
focal statistics twice the difference between the log likelihoods (lnL) of contrasted models:
M1 vs. M2, and M7 vs. M8 (only nested models should be compared with this approach),
with a χ2 null distribution and degrees of freedom equal to the difference in the number of
parameters9. The M7-M8 comparison is a stringent test of positive selection, compared
with M1-M2. The M0-M3 comparison, however, is more a test of variable selective
pressure among sites than a test of positive selection10.
The omega (ω) parameter was estimated using the option NSsites. This specifies models
that allow the dN/dS ratio (ω) to vary among sites11,12. We analyzed six NSsites models
which differed with respect to proportion of site classes (p) and their respective mean ω
value. Moldels were as follows: MO (one-ratio) assumes the same ω ratio for all sites; M1
(Nearly Neutral) assumes ω=0 (conserved sites) and ω=1 (neutral sites); M2 (Positive
selection) allows conserved sites, neutral sites and positive sites, the latter with ω>1
(independent); M3 (Discrete) assumes these same site classes, but following a discrete
distribution, with both the proportion of classes and ω parameters estimated from the data;
M7 (beta) and M8 (beta&ω>1) assume a beta distribution of ω values, with M8 allowing
the presence of positively selected sites. An empirical Bayes (EB) approach was then
used to calculate the posterior probability of each codon belonging to a specific site class.
29
References for the supplementary methods
1. Martí-Renom, M., Stuart, A., Fiser, A. et al.. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct, 29, 291 – 325 (2000).
2. Guex, N., Peitsch, M. Electrophoresis, 18, 2714 – 23, 1997.
3. DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System (2002) DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA.
4. Sali, A., Blundell, T. J. Mol. Biol. 234, 779 – 815 (1993).
5. Laskowski R A, MacArthur M.W, Moss D. S, Thornton J. M. J. App. Cryst. 26, 283 – 291 (1993).
6. Thompson, J., Higgins, D., Gibson, T. Nucleic Acids Research. 22, 4673 – 80 (1994).
7. Tamura K.; Dudley J.; Nei, M; Kumar, S. Mol Biol Evol. 24, 1596 – 99 (2007).
8. Yang, Z. Mol Biol Evol. 24, 1586 -91 (2007).
9. Yang, Z. Mol. Biol. Evol. 15, 568 – 73 (1998).
10. Anisimova, M.; Bielawski, J.; Yang, Z. Mol Biol Evol. 18, 1585 – 92 (2001).
11. Nielsen, R.; Yang, Z. Genetics. 148, 929 – 936 (1998).
12.Yang, Z., Nielsen, R, Goldman, N, Pedersen, A. Genetics. 155, 431 – 449 (2000).
30
Supplementary Tables.
Table S1. Serine and/or threonine insertions in BDNF sequences of selected

mammalian species. All sequences have amino acid position 58 (numbering
according to the human sequence) as the starting point, after which some
species exhibit inserted sequences coding for multiple extra residues.
Species Taxon S / T insertion
Balaena mysticetus Cetartiodactyla S58S
Eubalaena japonica Cetartiodactyla S58S
Balaenoptera acutorostrata Cetartiodactyla S58S
Balaenoptera_borealis Cetartiodactyla S58S
Balaenoptera_edeni Cetartiodactyla S58S
Balaenoptera_musculus Cetartiodactyla S58S
Balaenopeta_physalus Cetartiodactyla S58S
Eschichtius_robustus Cetartiodactyla S58S
Megaptera_novaeangliae Cetartiodactyla S58S
Caperea_marginata Cetartiodactyla S58S
Delphinus_tropicalis Cetartiodactyla S58S
Souza_chinensis Cetartiodactyla S58S
Stenella_coeruleoalba Cetartiodactyla S58S
Mesoplodon_densirostris Cetartiodactyla S58S
Lipotes_vexillifer Cetartiodactyla S58S
Neophocaena_phocaenoides Cetartiodactyla S58S
Physeter_catodon Cetartiodactyla S58S
Pontoporia_blainvillei Cetartiodactyla S58S
Tursiops_aduncus Cetartiodactyla S58S
Tursiops_truncatus Cetartiodactyla S58S
Sus_scrofa Cetartiodactyla S58SSSSS
Okapia_johnstoni Cetartiodactyla S58SSS
Bos_taurus Cetartiodactyla S58SSS
Tragelaphus_eurycerus Cetartiodactyla S58SSS
Hippopotamus_amphibius Cetartiodactyla S58S
Rhinolophus_creaghi Chiroptera S58S
Hipposideros_commersoni Chiroptera S58S
Macroderma_gigas Chiroptera S58S
Macroderma_lyra Chiroptera S58S
Craseonycteris_thonglongyai Chiroptera S58S
Rhinopoma_hardwickei Chiroptera S58S
Cavia_porcellus Rodentia S58SSSSSSSS
Cavia_tschudii Rodentia S58SSSSSSSS
Agouti_taczanowskii Rodentia S58SSSSSSSSSSS
Hydrochaeris_hydrochaeris Rodentia S58SSSSSSSS
Hystrix_brachyurus Rodentia S58SSSSS
Erethizon_dorsatum Rodentia S58SS
Dinomys_branickii Rodentia S58SS
Mus_musculus Rodentia T58TS
Rattus_norvegicus Rodentia T58TS
Cricetulus_griseus Rodentia T58S
31
Table S2. Number of residues changed and total
number of residues. Information of one proBDNF
monomer (229 residues), extracted from the program
Procheck 3.3.
Residues number of residues changed Number of residues

ALA 0 13
CYS 0 6
ASP 0 13
GLU 0 16
PHE 0 4
GLY 0 17
HIS 0 4
ILE 0 8
LYS 0 16
LEU 0 19
MET 0 7
ASN 0 9
PRO 0 10
GLN 0 7
ARG 0 19
SER 0 17
THR 0 17
VAL 0 16
TRP 0 3
TYR 0 8
Table S3. Modeling information on one proBDNF monomer (229

residues), extracted from the program Procheck 3.3.
Parameter Results
Average value of CA – N –C - CB 34.52 +- 1.32
Distorted main-chain bonds 2
Distorted main-chain angles 1
Distorted planar group 0
Neighbouring contacts 771
Number of hidrogen bonds 126
Potential contact atoms 1803
unusual CA-CA distance for contact number 389
distance 16.1
Phi-psi and chi1-chi2 distributions
Ramachandran Plot Statistics (for 200 residues)
[A,B,L]1 89.0%
[a,b,l,p]2 9.5%
[~a,~b,~l,~p]3 1.5%
[XX]4 0.0%
Number of end-residues (excl. Gly and Pro) 2
Number of glycine residues 17
Number of proline residues 10
1 3
Residues in most favored regions Residues in generously allowed regions
2 4
Residues in additional allowed regions Residues in disallowed region
32
Table S4. Sequences of Data Set 1 analyzed in this study.
Order Species GenBank accession no. Length (bp) Reference

Carnivora Ailuropoda melanoleuca U56638 744 Unpublished
Carnivora Ailurus fulgens U56639 744 Unpublished
Carnivora Canis familiaris XM_850457 1144 Annotation
Carnivora Felis catus NM_001009828 744 Murphy et al, 2001a
Carnivora Helarctos malayanus AF002240 744 Direct submission
Carnivora Procyon lotor AF003188 744 Direct submission
Carnivora Selenarctos thibetanus DQ093584 744 Unpublished
Carnivora Ursus arctos AF002239 744 Direct submission
Cetartiodactyla Bos taurus NM_001046607 1207 Arab et al., 1997
Cetartiodactyla Lipotes vexillifer AY700119 747 Direct submission
Cetartiodactyla Sus scrofa NM_214259 1184 Leibrok et al., 1989
Didelphimorphia Monodelphis domestica XM_001368353 786 Vischer, 1997
Monotremata Ornithorhynchus anatinus XM_001511930 819 Genome
Perissodactyla Equus caballus NM_001081787 744 Murphy et al, 2001a
Primates Homo sapiens EF689015 4016 Pruunsild et al., 2007
Primates Pan troglodytes NM_001012441 744 Dorus et al., 2004
Rodentia Cavia porcellus AB012097 768 Direct submission
Rodentia Mus musculus NM_001048142 4009 Maisonpierre et al., 1990
Rodentia Rattus norvegicus BC087634 1625 Strausberg et al., 2002
Rodentia Spermophilus citellus AY646114 925 Unpublished
33
Table S5. Additional sequences included in Data Set 2 (analyzed jointly with those listed on Table S4).

Cetartiodactyla Megaptera novaeangliae AY011486 561 Murphy et al, 2001a
Cetartiodactyla Tursiops truncatus AY011487 561 Murphy et al, 2001a
Cetartiodactyla Okapia johnstoni AY011492 567 Murphy et al, 2001a
Cetartiodactyla Hippopotamus amphibius AY011488 561 Murphy et al, 2001a
Cetartiodactyla Tragelaphus eurycerus AY011490 567 Murphy et al, 2001a
Cetartiodactyla Lama glama AY011489 558 Murphy et al, 2001a
Carnivora Canis simensis DQ240363 489 Pollinger et al., 2005
Perissodactyla Tapirus indicus AY011495 558 Murphy et al, 2001a
Carnivora Leopardus pardalis AY011497 558 Murphy et al, 2001a
Carnivora Panthera onca AY011498 558 Murphy et al, 2001a
Pholidota Manis pentadactyla AY011501 558 Murphy et al, 2001a
Eulipotyphla Condylura cristata AY011449 555 Murphy et al, 2001a
Eulipotyphla Sorex araneus AY011450 558 Murphy et al, 2001a
Eulipotyphla Talpa altaica AY011448 555 Murphy et al, 2001a
Eulipotyphla Erinaceus concolor AY011447 555 Murphy et al, 2001a
Eulipotyphla Solenodon paradoxus AY530070 558 Roca et al., 2004
Chiroptera Craseonycteris thonglongyai AY834531 561 Teeling et al., 2005
Chiroptera Cynopterus brachyotis AY834508 558 Teeling et al., 2005
Chiroptera Emballonura atrata AY834514 558 Teeling et al., 2005
Chiroptera Hipposideros commersoni AY834511 561 Teeling et al., 2005
Chiroptera Miniopterus fraterculus EF397711 558 Miller-Butterworth et al., 2007
Chiroptera Natalus stramineus AY834529 558 Teeling et al., 2005
Chiroptera Megaderma lyra AY059688 561 Murphy et al., 2001b
Chiroptera Myotis daubentoni AY834523 558 Teeling et al., 2005
Chiroptera Eptesicus fuscus EF397712 558 Miller-Butterworth et al., 2007
Chiroptera Noctilio albiventris AY834520 533 Teeling et al., 2005
Chiroptera Pteronotus parnellii AY834525 557 Teeling et al., 2005
Chiroptera Pteropus giganteus AY011483 558 Murphy et al, 2001a
Chiroptera Artibeus jamaicensis AY011482 558 Murphy et al, 2001a
Dermoptera Cynocephalus variegatus AY011474 558 Murphy et al, 2001a
Chiroptera Nycteris thebaica AY011485 558 Murphy et al, 2001a
Chiroptera Tadarida brasiliensis AY059687 558 Murphy et al., 2001b
Chiroptera Rousettus lanosus AY011484 558 Murphy et al, 2001a
Chiroptera Rhogeessa tumida AY834522 555 Teeling et al., 2005
34
Table S5. Continued.

Chiroptera Furipterus horrens AY834528 539 Teeling et al., 2005
Chiroptera Myzopoda aurita AY834524 542 Teeling et al., 2005
Chiroptera Rhinolophus creaghi AY834510 558 Teeling et al., 2005
Rodentia Agouti taczanowskii AY011471 585 Murphy et al, 2001a
Rodentia Dinomys branickii AY011470 558 Murphy et al, 2001a
Rodentia Hydrochaeris hydrochaeris AY011469 561 Murphy et al, 2001a
Rodentia Erethizon dorsatum AY011465 564 Murphy et al, 2001a
Rodentia Tamias striatus AY011457 558 Murphy et al, 2001a
Rodentia Muscardinus avellanarius AY011459 561 Murphy et al, 2001a
Rodentia Hystrix brachyurus AY011464 573 Murphy et al, 2001a
Rodentia Castor canadensis AY011458 558 Murphy et al, 2001a
Rodentia Dipodomys heermanni AY011466 558 Murphy et al, 2001a
Rodentia Cricetulus griseus AY011463 561 Murphy et al, 2001a
Lagomorpha Ochotona hyperborea AY011473 558 Murphy et al, 2001a
Lagomorpha Sylvilagus floridanus AY011472 558 Murphy et al, 2001a
Primates Ateles fusciceps AY011477 561 Murphy et al, 2001a
Primates Callimico goeldii AY011480 561 Murphy et al, 2001a
Primates Hylobates concolor AY011479 558 Murphy et al, 2001a
Primates Otolemur garnettii AF535049 558 Unpublished
Primates Lemur catta AY011476 558 Murphy et al, 2001a
Primates Macaca mulatta AY011478 558 Murphy et al, 2001a
Dermoptera Cynocephalus volans AF535048 558 Unpublished
Scandentia Tupaia minor AY011475 552 Murphy et al, 2001a
Scandentia Ptilocercus lowii EU142162 555 Janecka et al., 2007
Scandentia Urogale everetti AF535047 558 Unpublished
Xenarthra Euphractus sexcinctus AY011443 558 Murphy et al, 2001a
Xenarthra Chaetophractus villosus AY011444 558 Murphy et al, 2001a
Xenarthra Choloepus didactylus AY011442 558 Murphy et al, 2001a
Xenarthra Choloepus hoffmanni AY011441 558 Murphy et al, 2001a
Xenarthra Myrmecophaga tridactyla AY011446 558 Murphy et al, 2001a
Xenarthra Tamandua tetradactyla AY011445 558 Murphy et al, 2001a
Macroscelidea Elephantulus rufescens AY011455 558 Murphy et al, 2001a
35

Macroscelidea Macroscelides proboscideus AY011454 558 Murphy et al, 2001a
Afrosoricida Amblysomus hottentotus AY059685 558 Murphy et al., 2001b
Sirenia Trichechus manatus AY011451 555 Murphy et al, 2001a
Proboscídea Loxodonta africana AY011453 558 Murphy et al, 2001a
Hyracoidea Procavia capensis AY011452 561 Murphy et al, 2001a
Tubulidentata Orycteropus afer AY011456 558 Murphy et al, 2001a
Diprotodontia Macropus eugenii AY011440 555 Murphy et al, 2001a
Didelphimorphia Didelphis virginiana AY011439 555 Murphy et al, 2001a
36
Table S6. Sequences of the order Carnivora analyzed in this study.
Species Coverage GenBank accession no. Length (bp) Reference

Ailuropoda melanoleuca complete cds U56638 744 Unpublished
Ailurus fulgens complete cds U56639 744 Unpublished
Aonyx capensis partial cds EF987606 548 Koepfli et al., 2008
Aonyx cinérea partial cds EF987607 548 Koepfli et al., 2008
Arctonyx collaris partial cds EF987639 548 Koepfli et al., 2008
Bassaricyon alleni partial cds DQ660195 548 Koepfli et al., 2007
Bassaricyon gabbii partial cds DQ660196 548 Koepfli et al., 2007
Bassariscus astutus partial cds DQ660197 548 Koepfli et al., 2007
Bassariscus sumichrasti partial cds DQ660198 546 Koepfli et al., 2007
Canis adustus partial cds DQ240358 489 Pollinger et al., 2005
Canis aureus partial cds DQ240359 489 Pollinger et al., 2005
Canis familiaris complete cds XM_850457 1144 Annotation
Canis latrans partial cds DQ240360 489 Pollinger et al., 2005
Canis lúpus partial cds DQ240361 489 Pollinger et al., 2005
Canis simensis partial cds DQ240363 489 Pollinger et al., 2005
Cuon alpinus partial cds DQ240366 489 Pollinger et al., 2005
Dusicyon thous partial cds DQ240364 488 Pollinger et al., 2005
Eira Barbara partial cds DQ660206 548 Koepfli et al., 2007
Enhydra lutris partial cds DQ660204 548 Koepfli et al., 2007
Felis catus Complete cds NM_001009828 744 Murphy et al, 2001a
Galictis cuja partial cds EF987638 548 Koepfli et al., 2008
Galictis vittata partial cds EF987637 548 Koepfli et al., 2008
Gulo gulo partial cds EF987635 548 Koepfli et al., 2008
Helarctos malayanus complete cds AF002240 744 Direct submission
Hydrictis maculicollis partial cds EF987612 548 Koepfli et al., 2008
Ictonyx striatus partial cds EF987636 548 Koepfli et al., 2008
Leopardus pardalis partial cds AY011497 558 Murphy et al, 2001a
Lontra canadensis partial cds EF987608 548 Koepfli et al., 2008
Lontra felina partial cds EF987609 548 Koepfli et al., 2008
Lontra longicaudis partial cds EF987610 548 Koepfli et al., 2008
Lutra lutra partial cds EF987611 548 Koepfli et al., 2008
Lutra sumatrana partial cds EF987614 548 Koepfli et al., 2008
Lutrogale perspicillata partial cds EF987615 548 Koepfli et al., 2008
Lycaon pictus partial cds DQ240367 489 Pollinger et al., 2005
37

Martes americana partial cds DQ660207 548 Koepfli et al., 2007
Martes flavigula partial cds EF987629 548 Koepfli et al., 2008
Martes foina partial cds EF987630 548 Koepfli et al., 2008
Martes martes partial cds EF987631 548 Koepfli et al., 2008
Martes melampus partial cds EF987632 548 Koepfli et al., 2008
Martes pennanti partial cds EF987633 548 Koepfli et al., 2008
Martes zibellin partial cds EF987634 548 Koepfli et al., 2008
Meles meles partial cds EF987641 548 Koepfli et al., 2008
Mellivora capensis partial cds EF987641 548 Koepfli et al., 2008
Melogale moschata partial cds EF987642 548 Koepfli et al., 2008
Melogale personata partial cds EF987643 548 Koepfli et al., 2008
Mustela erminea partial cds EF987619 548 Koepfli et al., 2008
Mustela eversmannii partial cds EF987620 548 Koepfli et al., 2008
Mustela frenata partial cds EF987621 548 Koepfli et al., 2008
Mustela nigripes partial cds EF987623 548 Koepfli et al., 2008
Mustela nivalis partial cds EF987624 548 Koepfli et al., 2008
Mustela nudipes partial cds EF987625 548 Koepfli et al., 2008
Mustela putorius partial cds EF987626 548 Koepfli et al., 2008
Mustela sibirica partial cds EF987627 548 Koepfli et al., 2008
Mustela strigidorsa partial cds EF987628 548 Koepfli et al., 2008
Mustela vison partial cds DQ660205 548 Koepfli et al., 2007
Nasua narica partial cds DQ660199 548 Koepfli et al., 2007
Nasua nasua partial cds DQ660200 548 Koepfli et al., 2007
Nyctereutes procyonoides partial cds DQ240368 489 Pollinger et al., 2005
Otocyon megalotis partial cds DQ240369 489 Pollinger et al., 2005
Panthera onça partial cds AY011498 558 Murphy et al, 2001a
Poecilogale albinucha partial cds EF987616 548 Koepfli et al., 2008
Potos flavus partial cds DQ660201 548 Koepfli et al., 2007
Procyon cancrivorus partial cds DQ660202 548 Koepfli et al., 2007
Procyon lotor complete cds AF003188 744 Direct submission
Pseudalopex culpaeus partial cds DQ240370 489 Pollinger et al., 2005
Pseudalopex fulvipes partial cds DQ240371 479 Pollinger et al., 2005
Pseudalopex griseus partial cds DQ240372 479 Pollinger et al., 2005
38

Pseudalopex sechurae partial cds DQ240374 489 Pollinger et al., 2005
Pseudalopex vetulus partial cds DQ240375 489 Pollinger et al., 2005
Pteronura brasiliensis partial cds EF987613 548 Koepfli et al., 2008
Selenarctos thibetanus complete cds DQ093584 744 Unpublished
Speothos venaticus partial cds DQ240376 489 Pollinger et al., 2005
Taxidea taxus partial cds DQ660208 548 Koepfli et al., 2007
Urocyon cinereoargenteus partial cds DQ240377 489 Pollinger et al., 2005
Urocyon littoralis partial cds DQ240378 486 Koepfli et al., 2007
Ursus americanus partial cds DQ240386 489 Koepfli et al., 2007
Ursus arctos complete cds AF002239 744 Direct submission
Vulpes cana partial cds DQ240379 476 Pollinger et al., 2005
Vulpes chama partial cds DQ240380 477 Pollinger et al., 2005
Vulpes corsac partial cds DQ240381 488 Pollinger et al., 2005
Vulpes macrotis partial cds DQ240382 489 Pollinger et al., 2005
Vulpes rueppellii partial cds DQ240383 476 Pollinger et al., 2005
Vulpes vulpes cds parciais DQ240384 489 Pollinger et al., 2005
Vulpes zerda partial cds DQ240385 479 Pollinger et al., 2005
39
Table S7. Sequences of the order Cetartiodactyla analyzed in this study.

Balaena mysticetus partial cds EU444888 569 Demere et al., 2008
Balaenoptera acutorostrata partial cds EU444885 569 Demere et al., 2008
Balaenoptera bonaerensis partial cds EU444884 569 Demere et al., 2008
Balaenoptera borealis partial cds EU444882 569 Demere et al., 2008
Balaenoptera edeni partial cds EU444883 569 Demere et al., 2008
Balaenoptera musculus partial cds EU444881 569 Demere et al., 2008
Balaenoptera physalus partial cds EU444880 569 Demere et al., 2008
Bos taurus complete cds NM_001046607 1207 Arab et al., 1997
Caperea marginata partial cds EU444887 569 Demere et al., 2008
Delphinus tropicalis partial cds AY954641 515 Unpublished
Eschrichtius robustus partial cds EU444886 569 Demere et al., 2008
Eubalaena japonica partial cds EU444889 569 Demere et al., 2008
Hippopotamus amphibius partial cds AY011488 561 Murphy et al, 2001a
Lama glama partial cds AY011489 558 Murphy et al, 2001a
Lipotes vexillifer complete cds AY700119 747 Direct submission
Megaptera novaeangliae partial cds AY011486 561 Murphy et al, 2001a
Mesoplodon densirostris partial cds AY954636 515 Unpublished
Neophocaena phocaenoides partial cds AY954644 515 Unpublished
Okapia johnstoni partial cds AY011492 567 Murphy et al, 2001a
Physeter catodon partial cds EU444877 569 Demere et al., 2008
Pontoporia blainvillei partial cds AY954645 515 Unpublished
Sousa chinensis partial cds AY954638 515 Unpublished
Stenella coeruleoalba partial cds AY954639 515 Unpublished
Sus scrofa Complete cds NM_214259 1184 Leibrok et al., 1989
Tragelaphus eurycerus partial cds AY011490 567 Murphy et al, 2001a
Tursiops aduncus partial cds AY954637 515 Unpublished
Tursiops truncatus partial cds AY011487 561 Murphy et al, 2001a
Ziphius cavirostris partial cds EU444878 569 Demere et al., 2008
40
Table S8. Sequences of the order Chiroptera analyzed in this study.

Anoura geoffroyi partial cds AY834519 544 Teeling et al., 2005
Artibeus jamaicensis partial cds AY011482 558 Murphy et al, 2001a
Craseonycteris thonglongyai partial cds AY834531 561 Teeling et al., 2005
Cynopterus brachyotis partial cds AY834508 558 Teeling et al., 2005
Emballonura atrata partial cds AY834514 558 Teeling et al., 2005
Eptesicus fuscus partial cds EF397712 558 Miller-Butterworth et al., 2007
Eumops auripendulus partial cds AY834530 527 Teeling et al., 2005
Furipterus horrens partial cds AY834528 539 Teeling et al., 2005
Hipposideros commersoni partial cds AY834511 561 Teeling et al., 2005
Macroderma gigas partial cds AY834512 542 Teeling et al., 2005
Megaderma lyra partial cds AY059688 561 Murphy et al., 2001b
Miniopterus fraterculus partial cds EF397711 558 Miller-Butterworth et al., 2007
Miniopterus natalensis partial cds EF397710 530 Miller-Butterworth et al., 2007
Myotis daubentoni partial cds AY834523 558 Teeling et al., 2005
Mystacina tuberculata partial cds AY834527 544 Teeling et al., 2005
Myzopoda aurita partial cds AY834524 542 Teeling et al., 2005
Natalus stramineus partial cds AY834529 558 Teeling et al., 2005
Noctilio albiventris partial cds AY834520 533 Teeling et al., 2005
Pteronotus parnellii partial cds AY834525 557 Teeling et al., 2005
Pteropus giganteus partial cds AY011483 558 Murphy et al, 2001a
Rhinolophus creaghi partial cds AY834510 558 Teeling et al., 2005
Rhinopoma hardwicke partial cds AY834513 543 Teeling et al., 2005
Rhogeessa tumida partial cds AY834522 555 Teeling et al., 2005
Rhynchonycteris naso partial cds AY834516 536 Teeling et al., 2005
Rousettus lanosus partial cds AY011484 558 Murphy et al, 2001a
Tadarida brasiliensis partial cds AY059687 558 Murphy et al., 2001a
Taphozous nudiventris partial cds AY834515 538 Teeling et al., 2005
Thyroptera tricolor partial cds AY834526 545 Teeling et al., 2005
41
Table S9. Sequences of the order Rodentia analyzed in this study.

Agouti taczanowskii partial cds AY011471 585 Murphy et al, 2001a
Castor canadensis partial cds AY011458 558 Murphy et al, 2001a
Cavia porcellus complete cds AB012097 768 Direct submission
Cavia tschudii partial cds AY011468 581 Murphy et al, 2001a
Cricetulus griseus partial cds AY011463 561 Murphy et al, 2001a
Dinomys branickii partial cds AY011470 558 Murphy et al, 2001a
Dipodomys heermanni partial cds AY011466 558 Murphy et al, 2001a
Erethizon dorsatum partial cds AY011465 564 Murphy et al, 2001a
Hydrochaeris hydrochaeris partial cds AY011469 561 Murphy et al, 2001a
Hystrix brachyurus partial cds AY011464 573 Murphy et al, 2001a
Mus musculus complete cds NM_001048142 4009 Maisonpierre et al., 1990
Muscardinus avellanarius partial cds AY011459 561 Murphy et al, 2001a
Rattus norvegicus complete cds BC087634 1625 Strausberg et al., 2002
Spermophilus citellus complete cds AY646114 925 Unpublished
Tamias striatus partial cds AY011457 558 Murphy et al, 2001a
42
Supplementary references for tables S4-S9.
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43
Table S10. Proportion of conserved sites in different BDNF data sets.
Data set 1 Data set 2 Carnivora Chiroptera Cetartiodactyla Rodentia
Total nucleotide 720 570 510 546 543 570

sites
Conserved sites 0.66 0.55 0.77 0.72 0.81 0.71
Total protein 240 ª 190 a 170 a 182 ª 181 ª 183 a

sites 121 b 121 b 110 b 121 b 112 b 121 b
119 c 69 c 60 c 61 c 69 c 62 c
Conserved sites 0.81 a 0.63 a 0.83 a 0.80 a 0.89 a 0.81 a
0.68 b 0.50 b 0.76 b 0.71 b 0.83 b 0.73 b
0.94 c 0.83 c 0.97 c 0.97 c 1c 0.98 c
a
Considering amino acid sites in the entire proBDNF.
b
Considering amino acid sites in the Pro domain only.
c
Considering amino acid sites in the mature domain only.
44
Table S11. Parameter Estimates, Log-likelihood Values, and Likelihood Ratio Test for the models M1, M2, M7 and M8. More
information about the hypotheses tested can be found on Supplementary Methods. P: number of site classes contained in each
model, including the ω distribution; lnL: log likelihood values; LRT: Likelihood Ratio Test (with α =0.05 and df=1).
Data set 1.
Model P Estimates of Parameters lnL Nested Models LRT χ2 Conclusion

M1 2 p1=0.96162; p2=0.03838 -3107.245
w1=0.02472 w2=1
M2 3 p1=0.96162; p2=0.03838; p3=0 -3107.245 M1-M2 0 3.84 Does not reject H0.
w1=0.02472; w2=1; w3=9.41299
M7 10 p1-p10= 0.10000 -3100.867 M7-M8 3.752 3.84 Does not reject H0.
w1-w3=0; w4=0.00007; w5=0.0056; w6=0.00284
w7=0.0114;w8=0.03653; w9=0.10849; w10=0.33638
M8 11 p1-p10=0.09839; p11=0.01605 -3098.991
w1 e w2=0; w3=0.00006; w4=0.00041; w5=0.00173
w6=0.00545; w7=0.01445; w8=0.03446;w9=0.07947;
w10=0.20777; w11=1
Data set 2.

M1 2 p1=0.94008; p2=0.05992
-6780.185
w1=0.03814; w2=1
M2 3 p1=0.94008; p2=0.05992; p3=0
w1=0.03814; w2=1; w3=2.50723
-6780.185 M1-M2 0 3.84 Does not reject H0.
M7 10 p1-p10=0.10000
w1 e w2=0; w3=0.00007; w4=0.00066; w5=0.00360
-6725.628 M7-M8 22.642 3.84 Accepts H1
w6=0.01402; w7=0.04362; w8=0.11619;
w9=0.27822; w10=0.63176
M8 11 p1-p10=0.09708; p11=0.02924
w1=0; w2=0.00005; w3=0.00048;w4=0.00203;
-6714.307
w5=0.00601; w6=0.01449; w7=0.03082; w8=0.06119;
w9=0.12011; w10=0.26712; w11=1
45
Cetartiodactyla data set.

M1 2 p1=0.96184; p2=0.03816 -1278.477
w1=0.01746; w2=1
M2 3 p1=0.97142; p2=0.01570; p3=0.01288 -1278.057 M1-M2 0.84 3.84 Does not reject H0.
w1=0.02134; w2=1; w3=2.08966
M7 10 p1-p10=0.10000 -1279.879 M7-M8 4.32 3.84 Accepts H1
w1-w6=0; w7=0.00001; w8=0.00075
w9=0.03431; w10=0.64583
M8 11 p1-p10=0.09841; p11=0.01586 -1277.719
w1 e w2=0; w3=0.00001; w4=0.00007;
w5=0.00048; w6=0.00214; w7=0.0755;
w8=0.02279; w9=0.06397;
w10=0.19908; w11=2.19016
Chiroptera data set.

M1 2 p1=0.93457; p2=0.06543 -2355.118
w1=0.02059; w2=1
w1=0.02059; w2=1; w3=35.35224
M7 10 p1-p10=0.10000 -2353.245 M7-M8 0.366 3.84 Does not reject H0.
w1-w4=0; w5=0.00006; w6=0.00068;
w7=0.00512; w8=0.02880; w9=0.131096;
w11=0.51289
M8 11 p1-p10=0.09731; p11=0.02689 -2353.062
w1- w3=0; w4=0.00004; w5=0.00035;
w6=0.00196; w7=0.00816; w8=0.02821;
w9=0.08795; w10=0.28925; w11=1
46
Carnivora data set.

M1 2 p1= 0.96447; p2=0.03553 -1523.436636
w1=0.03928; w2=1
M2 3 p1= 0.96447; p2= 0.02060; p3= 0.01493 -1523.436636 M1-M2 0 3.84 Does not reject H0.
w1= 0.03928; w2=1; w3=1
w1=0;w2= 0.00001; w3= 0.00013 w4= 0.00087;
w5= 0.00355; w6= 0.01101; w7= 0.02866;
w8= 0.06699; w9= 0.14964;
w10= 0.36281
M8 11 p1-p10=10000; p11= 0.00001 -1521.929860
w1=0; w2= 0.00001; w3= 0.00013; w4= 0.00087;
w5= 0.00355; w6= 0.01101; w7= 0.02867;
w8= 0.06699; w9= 0.14963; w10= 0.36277;
w11= 1
Rodentia data set.

M1 2 p1=0.94095; p2=0.05905 -2182.025
w1=0.03053; w2=1
w1=0.03053; w2=1; w3=70.11957
w1-w3=0; w4=0.00007; w5=0.00058;
w6=0.00335; w7=0.01435; w8=0.05047;
w9=0.15613; w10=0.46989
M8 11 p1-p10=0.09888; p11=0.01118 -2174.323
w1 e w2=0; w3=0.00002; w4=0.00024;
w5=0.00134; w6=0.00536; w7=0.01721;
w8=0.04785; w9=0.12381;
w10=0.34213; w11=1.62736
47
Table S12. Analysis of natural selection in the BDNF coding sequence (sites 1-18
correspond to the signal peptide and were excluded), based on data sets 1 and 2
(see Supplementary Methods). For each residue, we indicate the posterior
probability of belonging to the site class exhibiting evidence of positive selection,
as well as the mean + standard error (SE) of the nonsynonymous to synonymous
substitution ratio (ω ). Sites indicating very low probability of positive selection (i.e.
close to zero) indicate high probability of negative selection (i.e. functional
constraint). Residues are numbered according to the human sequence. Sites
inferred to be under positive selection (see Table 1) are marked with an asterisk.
Sites experimentally demonstrated to be involved in specific aspects of BDNF
function are highlighted in bold, and detailed in the footnotes.
Residue Data set 1 Data set 2

Probab. ω + SE Probab. ω + SE
19A 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.051 + 0.009
20P 0.00002 0.058 + 0.040 0.00000 0.051 + 0.013
21M 0.00000 0.053 + 0.020 0.00000 0.051 + 0.011
22K 0.00000 0.056 + 0.034 0.00000 0.051 + 0.013
23E 0.00001 0.056 + 0.035 0.00000 0.054 + 0.022
24A 0.00489 0.173 + 0.189 0.00000 0.185 + 0.125
25N 0.00022 0.121 + 0.124 0.00000 0.286 + 0.103
26I 0.00884 0.279 + 0.220 0.36505 1.021 + 0.377
27R 0.03965 0.199 + 0.319 0.05587 0.463 + 0.326
28G 0.00112 0.090 + 0.111 0.00000 0.058 + 0.036
29Q 0.05218 0.320 + 0.349 0.00006 0.182 + 0.146
30G 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.008
31G 0.00008 0.107 + 0.108 0.00000 0.276 + 0.108
32L 0.00009 0.060 + 0.051 0.00004 0.191 + 0.147
33A 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.058 + 0.032
34Y 0.00000 0.056 + 0.034 0.00000 0.054 + 0.022
35P 0.00475 0.113 + 0.159 0.00000 0.053 + 0.023
36G 0.42198 0.952 + 0.530 0.00012 0.266 + 0.156
37V 0.00953 0.288 + 0.224 0.00000 0.108 + 0.082
38R 0.00002 0.058 + 0.040 0.00000 0.052 + 0.014
39T 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.051 + 0.010
40H 0.00001 0.057 + 0.037 0.00000 0.056 + 0.028
41G 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.056 + 0.026
42T 0.00165 0.097 + 0.123 0.00061 0.303 + 0.169
43L 0.00004 0.059 + 0.045 0.00000 0.052 + 0.015
44E 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.051 + 0.010
45S 0.00000 0.065 + 0.053 0.00000 0.051 + 0.008
46V 0.07099 0.503 + 0.335 0.00159 0.563 + 0.145
47N 0.02072 0.332 + 0.261 0.00006 0.371 + 0.138
48G 0.00000 0.054 + 0.026 0.00000 0.051 + 0.007
49P 0.00001 0.057 + 0.038 0.00000 0.055 + 0.026
50K 0.00009 0.104 + 0.106 0.00000 0.281 + 0.102
51A 0.12969 0.535 + 0.429 0.00027 0.336 + 0.154
52G 0.00002 0.057 + 0.039 0.00000 0.074 + 0.063
53S * 0.00765 0.124 + 0.182 0.77941 1.329 + 0.331
1
54R 0.00003 0.057 + 0.039 0.00000 0.058 + 0.035
1
55G 0.00007 0.074 + 0.073 0.00000 0.073 + 0.054
1
56L 0.00004 0.059 + 0.044 0.00000 0.072 + 0.059
1
57T 0.00001 0.057 + 0.038 0.00000 0.104 + 0.089
48

1,2
58S 0.00147 0.096 + 0.122 0.00047 0.222 + 0.169
1
59L 0.00008 0.060 + 0.049 0.00000 0.059 + 0.038
60A 0.00005 0.059 + 0.046 0.00000 0.059 + 0.039
61D 0.00000 0.062 + 0.046 0.00000 0.051 + 0.009
62T 0.00006 0.059 + 0.047 0.00000 0.053 + 0.021
63F 0.00258 0.104 + 0.138 0.00000 0.059 + 0.038
64E 0.00000 0.056 + 0.032 0.00000 0.051 + 0.011
65H 0.00000 0.055 + 0.031 0.00000 0.051 + 0.009
3
66V 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.008
67I 0.00000 0.055 + 0.032 0.00000 0.051 + 0.011
68E 0.00000 0.055 + 0.032 0.00000 0.051 + 0.010
69E 0.00000 0.062 + 0.046 0.00000 0.051 + 0.010
70L 0.00004 0.059 + 0.045 0.00000 0.052 + 0.016
71L 0.00007 0.060 + 0.047 0.00000 0.052 + 0.018
72D 0.00003 0.071 + 0.067 0.00000 0.195 + 0.110
73E 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.051 + 0.010
74D 0.00004 0.096 + 0.096 0.00000 0.053 + 0.019
75Q 0.00000 0.056 + 0.034 0.00000 0.085 + 0.070
76K 0.00133 0.143 + 0.151 0.00000 0.065 + 0.047
77V 0.01513 0.221 + 0.245 0.01350 0.550 + 0.193
78R 0.00070 0.085 + 0.100 0.00001 0.274 + 0.135
79P 0.00001 0.057 + 0.038 0.00000 0.068 + 0.052
80N * 0.52648 1.092 + 0.489 0.59787 1.205 + 0.369
81E 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.058 + 0.032
82E 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.053 + 0.020
83N 0.00000 0.063 + 0.048 0.00000 0.283 + 0.102
84N * 0.72621 1.320 + 0.501 0.98596 1.496 + 0.101
85K 0.00000 0.053 + 0.023 0.00000 0.050 + 0.006
86D 0.00000 0.054 + 0.023 0.00000 0.050 + 0.006
87A 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.070 + 0.051
88D 0.00000 0.053 + 0.021 0.00000 0.050 + 0.005
89L 0.00100 0.093 + 0.113 0.00010 0.266 + 0.155
90Y 0.00001 0.057 + 0.037 0.00000 0.054 + 0.023
91T 0.00001 0.057 + 0.036 0.00000 0.142 + 0.121
92S 0.00003 0.059 + 0.044 0.00000 0.052 + 0.015
93R 0.00001 0.056 + 0.035 0.00000 0.051 + 0.009
94V 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.052 + 0.015
95M 0.00000 0.053 + 0.020 0.00000 0.051 + 0.011
96L 0.00002 0.058 + 0.040 0.00000 0.051 + 0.014
97S 0.00000 0.054 + 0.026 0.00000 0.051 + 0.013
98S 0.00001 0.056 + 0.035 0.00000 0.056 + 0.031
99Q 0.00012 0.061 + 0.053 0.00000 0.053 + 0.020
100V 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.008
101P 0.00039 0.064 + 0.065 0.00000 0.055 + 0.027
102L 0.00007 0.060 + 0.049 0.00000 0.053 + 0.019
103E 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.050 + 0.006
104P 0.00011 0.060 + 0.051 0.00000 0.053 + 0.019
105P 0.00012 0.061 + 0.052 0.00000 0.053 + 0.022
106L
0.00011 0.061 + 0.052 0.00000 0.062 + 0.047
49

107L 0.00001 0.057 + 0.038 0.00000 0.055 + 0.026
108F 0.00009 0.060 + 0.051 0.00000 0.053 + 0.021
109L 0.00003 0.059 + 0.044 0.00000 0.052 + 0.015
110L 0.00020 0.062 + 0.057 0.00000 0.053 + 0.019
111E 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.050 + 0.005
112E 0.00000 0.056 + 0.032 0.00000 0.051 + 0.011
113Y 0.00000 0.056 + 0.034 0.00000 0.051 + 0.012
114K 0.00001 0.056 + 0.035 0.00000 0.051 + 0.013
115N 0.00000 0.056 + 0.033 0.00000 0.051 + 0.012
116Y 0.00000 0.056 + 0.034 0.00000 0.051 + 0.012
117L 0.00005 0.059 + 0.045 0.00000 0.052 + 0.015
118D 0.00000 0.055 + 0.032 0.00000 0.051 + 0.009
119A 0.00002 0.057 + 0.038 0.00000 0.052 + 0.015
120A 0.00004 0.059 + 0.044 0.00000 0.052 + 0.017
121N 0.00000 0.053 + 0.021 0.00000 0.050 + 0.006
122M 0.00000 0.053 + 0.020 0.00000 0.050 + 0.006
123S 0.00005 0.059 + 0.046 0.00000 0.053 + 0.020
124M 0.00000 0.061 + 0.043 0.00000 0.050 + 0.006
4
125R 0.00000 0.054 + 0.026 0.00000 0.051 + 0.009
4
126V 0.00000 0.055 + 0.030 0.00000 0.051 + 0.009
4
127R 0.00003 0.059 + 0.043 0.00000 0.052 + 0.015
4
128R 0.00001 0.057 + 0.036 0.00000 0.051 + 0.013
129H 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.051 + 0.009
130S 0.00016 0.062 + 0.055 0.00000 0.053 + 0.022
131D 0.00000 0.053 + 0.021 0.00000 0.050 + 0.005
132P 0.00004 0.059 + 0.044 0.00000 0.052 + 0.018
133A 0.00004 0.071 + 0.068 0.00000 0.051 + 0.009
134R 0.00001 0.057 + 0.037 0.00000 0.052 + 0.014
135R 0.00003 0.058 + 0.042 0.00000 0.052 + 0.018
136G 0.00000 0.054 + 0.026 0.00000 0.051 + 0.008
137E 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.050 + 0.005
138L 0.00004 0.059 + 0.044 0.00000 0.052 + 0.015
139S 0.00000 0.054 + 0.023 0.00000 0.051 + 0.009
140V 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.008
141C 0.00005 0.059 + 0.046 0.00000 0.053 + 0.019
142D 0.00000 0.053 + 0.021 0.00000 0.050 + 0.005
143S 0.00002 0.069 + 0.062 0.00000 0.051 + 0.011
5
144I 0.00024 0.080 + 0.088 0.00000 0.108 + 0.093
145S 0.00000 0.054 + 0.023 0.00000 0.051 + 0.009
5
146E 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.051 + 0.010
147W 0.00002 0.058 + 0.042 0.00000 0.058 + 0.036
148V 0.00000 0.055 + 0.030 0.00000 0.051 + 0.011
149T 0.00003 0.058 + 0.042 0.00000 0.052 + 0.015
150A 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.051 + 0.010
151A 0.00000 0.056 + 0.032 0.00000 0.051 + 0.013
152D 0.00000 0.055 + 0.031 0.00000 0.051 + 0.010
153K 0.00000 0.056 + 0.033 0.00000 0.051 + 0.013
50
Residues Data set 1 Data set 2
6
154K 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.050 + 0.006
6
155T 0.00004 0.058 + 0.043 0.00000 0.053 + 0.020
6
156A 0.00006 0.059 + 0.046 0.00000 0.052 + 0.017
6
157V 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.008
6
158D 0.00000 0.053 + 0.021 0.00000 0.050 + 0.005
6
159M 0.00000 0.053 + 0.020 0.00000 0.050 + 0.006
6
160S 0.00003 0.059 + 0.043 0.00000 0.052 + 0.018
6
161G 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.051 + 0.009
6
162G 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.007
6
163T 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.051 + 0.010
164V 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.051 + 0.009
165T 0.00001 0.056 + 0.034 0.00000 0.051 + 0.013
166V 0.00000 0.055 + 0.030 0.00000 0.051 + 0.009
167L 0.00009 0.060 + 0.049 0.00000 0.053 + 0.020
168E 0.00000 0.056 + 0.032 0.00000 0.051 + 0.010
169K 0.00000 0.055 + 0.031 0.00000 0.051 + 0.010
170V 0.00000 0.055 + 0.030 0.00000 0.051 + 0.009
171P 0.00006 0.059 + 0.047 0.00000 0.053 + 0.020
172V 0.00001 0.056 + 0.034 0.00000 0.051 + 0.013
6
173S 0.00116 0.094 + 0.116 0.00000 0.057 + 0.031
6
174K 0.00001 0.056 + 0.035 0.00000 0.051 + 0.013
6
175G 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.008
6
176K 0.00009 0.060 + 0.050 0.00000 0.052 + 0.016
6
177L 0.00004 0.059 + 0.044 0.00000 0.052 + 0.015
178K 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.050 + 0.006
179Q 0.00003 0.058 + 0.043 0.00000 0.052 + 0.014
180Y 0.00001 0.057 + 0.036 0.00000 0.051 + 0.012
181F 0.00000 0.056 + 0.035 0.00000 0.054 + 0.024
182Y 0.00001 0.056 + 0.035 0.00000 0.054 + 0.022
183E 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.050 + 0.005
184T 0.00000 0.055 + 0.030 0.00000 0.051 + 0.010
185k 0.00000 0.053 + 0.022 0.00000 0.051 + 0.011
186C 0.00001 0.057 + 0.037 0.00000 0.052 + 0.015
187N 0.00000 0.055 + 0.031 0.00000 0.051 + 0.012
188P 0.00001 0.058 + 0.040 0.00000 0.051 + 0.014
189M 0.00000 0.053 + 0.020 0.00000 0.053 + 0.019
190G 0.00002 0.058 + 0.041 0.00000 0.056 + 0.029
191Y 0.00001 0.057 + 0.038 0.00000 0.054 + 0.023
192T 0.00003 0.058 + 0.042 0.00000 0.052 + 0.015
193K 0.00000 0.054 + 0.025 0.00000 0.051 + 0.008
194E 0.00000 0.054 + 0.024 0.00000 0.050 + 0.007
195G 0.00000 0.055 + 0.030 0.00000 0.051 + 0.009
196C 0.00001 0.057 + 0.036 0.00000 0.052 + 0.016
197R 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.051 + 0.011
198G 0.00000 0.054 + 0.027 -
199I 0.00000 0.056 + 0.033 -
200D 0.00000 0.053 + 0.021 -
201K 0.00000 0.055 + 0.029 -
-
202R 0.00000 0.054 + 0.024
51
Residues Data set 1 Data set 2

203H 0.00001 0.057 + 0.038 -
204W 0.00002 0.058 + 0.042 -
205N 0.00000 0.063 + 0.048 -
206S 0.00001 0.058 + 0.040 -
6 -
207K 0.00001 0.056 + 0.035
208C
6
0.00001 0.057 + 0.036 -
209R
6
0.00157 0.070 + 0.091 -
6 -
210T 0.00009 0.060 + 0.050
6 -
211T 0.00000 0.055 + 0.029 -
6
212Q 0.00000 0.056 + 0.035 -
6
213S 0.00003 0.059 + 0.044 -
6
214Y 0.00001 0.057 + 0.037 -
6
215V 0.00000 0.055 + 0.029 -
6 -
216R 0.00002 0.058 + 0.041
217A 0.00000 0.055 + 0.029 -
218L 0.00004 0.059 + 0.044 -
-
219T 0.00000 0.055 + 0.030
-
220M 0.00000 0.053 + 0.020 -
221D 0.00000 0.056 + 0.033 -
222S 0.00001 0.066 + 0.057 -
7
223K 0.00001 0.056 + 0.035 -
7
224K 0.00000 0.053 + 0.023 -
7
225R 0.00018 0.060 + 0.053 -
226I 0.00059 0.087 + 0.101 -
227G 0.00000 0.055 + 0.028 -
-
228W 0.00002 0.058 + 0.042
-
229R 0.00007 0.059 + 0.045 -
230F 0.00000 0.056 + 0.035 -
231I 0.00000 0.056 + 0.033 -
232R 0.00000 0.054 + 0.027 -
5
233I 0.00000 0.056 + 0.033 -
5
234D 0.00000 0.053 + 0.021 -
235T 0.00009 0.060 + 0.050 -
236S 0.00002 0.058 + 0.040 -
-
237C 0.00018 0.062 + 0.057
-
238V 0.00008 0.060 + 0.049 -
239C 0.00018 0.062 + 0.057 -
240T 0.00009 0.060 + 0.050 -
241L 0.00008 0.060 + 0.048 -
242T 0.00000 0.055 + 0.030 -
243I 0.00002 0.058 + 0.041 -
244K 0.00000 0.055 + 0.029 -
245R 0.00000 0.054 + 0.024 -
246G -
0.00006 0.059 + 0.046
247R -
0.00002 0.058 + 0.041
1. Short proBDNF cleavage motif.

2. Insertion point for the serine/threonine expansions observed in cetartiodactyls
and caviomorph rodents (see Table S1 and Figures 1 and S4).
3 Functional variant Val66Met identified in humans.
4. Mature BDNF cleavage motif.
5. Motifs mediating interaction with the carboxipeptidase-E co-receptor.
6. Motifs mediating interaction with the TrkB receptor.
7. Motif mediating interaction with the p75 and TrkB receptors.
52
Table S13. Analysis of natural selection in the BDNF coding sequence (sites 1-18 correspond to the signal peptide and were excluded), based on
taxon-specific data sets (see Supplementary Methods). Statistics and annotations are as described in Table S12. Sites inferred to be under positive
selection in at least one of data sets (see Table 1) are marked with an asterisk.
Residues Carnivora Cetartiodactyla Chiroptera Rodentia
Probab. ω + SE Probab. ω + SE Probab. ω + SE Probab. ω + SE
19A - - 0.00001 0.057 + 0.037 0.00001 0.057 + 0.036
20P - - 0.00005 0.060 + 0.047 0.00003 0.059 + 0.045
21M - - 0.00000 0.055 + 0.028 0.00000 0.056 + 0.032
22K - - 0.00008 0.061 + 0.051 0.00031 0.064 + 0.065
23E - - 0.00003 0.059 + 0.046 0.00014 0.062 + 0.056
24A 0.00007 0.060 + 0.049 0.00128 0.096 + 0.120
- -
25N 0.00003 0.074 + 0.073 0.00151 0.161 + 0.166
- -
26I 0.00331 0.178 + 0.185 0.20854 0.709 + 0.468
27R
- - 0.00249 0.074 + 0.105 0.13811 0.392 + 0.557
28G - 0.16650 0.520 + 0.807 0.00053 0.065 + 0.071 0.00010 0.061 + 0.052
29Q - 0.01224 0.104 + 0.241 0.11094 0.432 + 0.439 0.03865 0.205 + 0.326
30G 0.00073 0.068 + 0.079 0.00072 0.068 + 0.082 0.00000 0.057 + 0.036 0.00000 0.057 + 0.036
31G 0.01630 0.161 + 0.241 0.00068 0.068 + 0.081 0.00000 0.057 + 0.036 0.02488 0.368 + 0.274
32L 0.00485 0.082 + 0.138 0.00684 0.089 + 0.178 0.00031 0.064 + 0.063 0.00033 0.064 + 0.065
33A 0.19521 0.590 + 0.537 0.00100 0.070 + 0.089 0.00001 0.057 + 0.037 0.00001 0.057 + 0.036
34Y 0.00177 0.073 + 0.099 0.00197 0.075 + 0.108 0.00003 0.059 + 0.044 0.00003 0.059 + 0.045
35P 0.20126 0.533 + 0.764 0.01593 0.113 + 0.281 0.00134 0.069 + 0.088 0.00067 0.066 + 0.075
36G 0.00375 0.079 + 0.126 0.00827 0.093 + 0.196 0.00042 0.065 + 0.067 0.02305 0.171 + 0.269
37V 0.00046 0.066 + 0.072 0.01660 0.165 + 0.260 0.00008 0.060 + 0.050 0.00001 0.057 + 0.036
38R 0.00209 0.074 + 0.104 0.00259 0.077 + 0.119 0.00013 0.061 + 0.055 0.00009 0.061 + 0.053
39T 0.00111 0.070 + 0.088 0.00116 0.071 + 0.092 0.00001 0.058 + 0.040 0.00001 0.057 + 0.039
40H 0.00354 0.079 + 0.123 0.00698 0.090 + 0.181 0.00458 0.117 + 0.162 0.00006 0.060 + 0.049
41G 0.00038 0.065 + 0.069 0.00056 0.067 + 0.077 0.00000 0.056 + 0.033 0.00019 0.082 + 0.089
42T 0.00481 0.082 + 0.137 0.01024 0.099 + 0.219 0.01550 0.150 + 0.230 0.02411 0.173 + 0.273
43L 0.00302 0.077 + 0.117 0.00451 0.083 + 0.148 0.00180 0.102 + 0.131 0.00012 0.062 + 0.055
44E 0.00019 0.063 + 0.061 0.00043 0.066 + 0.072 0.00001 0.068 + 0.061 0.00000 0.055 + 0.031
53
45S 0.00076 0.068 + 0.080 0.00068 0.068 + 0.081 0.00001 0.057 + 0.037 0.00001 0.057 + 0.037
46V 0.10198 0.438 + 0.434 0.03558 0.216 + 0.353 0.07736 0.530 + 0.339 0.00337 0.177 + 0.185
47N * 0.24152 0.662 + 0.578 0.00427 0.082 + 0.144 0.61496 1.169 + 0.464 0.02816 0.274 + 0.296
48G 0.00038 0.065 + 0.069 0.00056 0.067 + 0.077 0.00000 0.056 + 0.033 0.00000 0.057 + 0.036
49P 0.00250 0.075 + 0.110 0.00287 0.078 + 0.123 0.00005 0.060 + 0.047 0.00003 0.059 + 0.045
50K 0.00023 0.064 + 0.063 0.00044 0.066 + 0.073 0.00002 0.071 + 0.067 0.02699 0.368 + 0.280
51A * 0.00613 0.086 + 0.150 0.95891 2.423 + 1.195 0.07566 0.370 + 0.391 0.00476 0.117 + 0.164
52G 0.02089 0.172 + 0.262 0.00827 0.093 + 0.196 0.00033 0.064 + 0.064 0.00187 0.102 + 0.132
53S * 0.00289 0.077 + 0.115 0.01884 0.121 + 0.311 0.37821 0.871 + 0.535 0.84950 1.636 + 0.736
1
54R 0.00719 0.088 + 0.160 0.00773 0.092 + 0.189 0.00043 0.065 + 0.068 0.00043 0.065 + 0.068
1
55G 0.01670 0.162 + 0.243 0.00072 0.068 + 0.082 0.00000 0.057 + 0.036 0.00026 0.084 + 0.094
1
56L 0.00302 0.077 + 0.117 0.00451 0.083 + 0.148 0.00007 0.060 + 0.050 0.00281 0.109 + 0.146
1
57T 0.00410 0.080 + 0.130 0.00110 0.071 + 0.091 0.00004 0.059 + 0.045 0.01467 0.233 + 0.250
1,2
58S 0.00301 0.077 + 0.117 0.00381 0.081 + 0.138 0.02350 0.169 + 0.264 0.23282 0.637 + 0.589
1
59L 0.00485 0.082 + 0.138 0.00685 0.089 + 0.180 0.00028 0.063 + 0.061 0.00014 0.062 + 0.056
60A 0.00351 0.079 + 0.123 0.00567 0.086 + 0.165 0.00037 0.064 + 0.065 0.00070 0.067 + 0.076
61D 0.00027 0.064 + 0.065 0.00043 0.066 + 0.072 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.055 + 0.029
62T 0.00481 0.082 + 0.137 0.00871 0.095 + 0.201 0.00081 0.067 + 0.078 0.00063 0.066 + 0.074
63F 0.00597 0.085 + 0.149 0.18709 0.572 + 0.871 0.00054 0.065 + 0.071 0.00013 0.062 + 0.055
64E 0.00312 0.077 + 0.118 0.00374 0.080 + 0.137 0.00002 0.059 + 0.043 0.00003 0.059 + 0.045
65H 0.00104 0.070 + 0.086 0.00198 0.074 + 0.109 0.00001 0.057 + 0.038 0.00001 0.057 + 0.038
3
66V 0.00047 0.066 + 0.072 0.00081 0.069 + 0.084 0.00000 0.056 + 0.033 0.00001 0.057 + 0.036
67I 0.00245 0.075 + 0.109 0.00084 0.069 + 0.085 0.00003 0.059 + 0.044 0.00001 0.057 + 0.037
68E 0.00312 0.077 + 0.118 0.00248 0.076 + 0.118 0.00003 0.059 + 0.045 0.00002 0.058 + 0.041
69E 0.00019 0.063 + 0.061 0.00043 0.066 + 0.072 0.00001 0.068 + 0.060 0.00000 0.055 + 0.030
70L 0.00302 0.077 + 0.117 0.00393 0.081 + 0.139 0.00007 0.060 + 0.050 0.00015 0.062 + 0.056
54

71L 0.00483 0.082 + 0.137 0.00684 0.089 + 0.178 0.00020 0.062 + 0.058 0.00021 0.063 + 0.059
72D 0.00029 0.064 + 0.065 0.00043 0.066 + 0.072 0.04417 0.408 + 0.313 0.00124 0.098 + 0.123
73E 0.00456 0.122 + 0.168 0.00043 0.066 + 0.072 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.055 + 0.031
74D 0.00027 0.064 + 0.065 0.00043 0.066 + 0.072 0.00001 0.068 + 0.061 0.00003 0.071 + 0.067
75Q 0.00152 0.072 + 0.095 0.00274 0.077 + 0.121 0.41732 0.964 + 0.483 0.00002 0.059 + 0.044
76K 0.00304 0.077 + 0.117 0.09907 0.360 + 0.596 0.00208 0.104 + 0.135 0.00016 0.062 + 0.057
77V 0.20927 0.612 + 0.549 0.00953 0.097 + 0.211 0.01180 0.222 + 0.236 0.13242 0.557 + 0.438
78R 0.00258 0.076 + 0.111 0.00379 0.081 + 0.138 0.02526 0.267 + 0.285 0.00177 0.099 + 0.128
79P 0.00250 0.075 + 0.110 0.00284 0.078 + 0.123 0.00127 0.098 + 0.122 0.00003 0.059 + 0.045
80N * 0.46473 1.038 + 0.626 0.09573 0.353 + 0.595 0.14180 0.568 + 0.432 0.07289 0.466 + 0.362
81E 0.05020 0.235 + 0.360 0.00043 0.066 + 0.072 0.00002 0.058 + 0.041 0.00003 0.059 + 0.044
82E 0.00718 0.132 + 0.189 0.00465 0.083 + 0.150 0.00002 0.058 + 0.041 0.00001 0.057 + 0.038
83N 0.00035 0.065 + 0.068 0.01118 0.150 + 0.225 0.00002 0.072 + 0.068 0.00148 0.156 + 0.163
84N * 0.04190 0.219 + 0.336 0.81383 2.094 + 1.218 0.78233 1.346 + 0.399 0.88530 1.651 + 0.629
85K 0.00024 0.064 + 0.064 0.00058 0.067 + 0.077 0.00000 0.055 + 0.029 0.00000 0.056 + 0.033
86D 0.00027 0.064 + 0.065 0.00046 0.066 + 0.073 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.055 + 0.030
87A 0.01098 0.145 + 0.213 0.01938 0.172 + 0.277 0.00000 0.056 + 0.034 0.00021 0.082 + 0.089
88D 0.00027 0.064 + 0.065 0.00043 0.066 + 0.072 0.00000 0.054 + 0.027 0.00000 0.055 + 0.029
89L 0.00554 0.084 + 0.145 0.13986 0.535 + 0.568 0.00033 0.064 + 0.064 0.00032 0.064 + 0.065
90Y 0.00529 0.084 + 0.142 0.00224 0.076 + 0.113 0.00003 0.059 + 0.044 0.00003 0.059 + 0.045
91T 0.00414 0.080 + 0.130 0.00095 0.070 + 0.087 0.00729 0.127 + 0.183 0.01838 0.160 + 0.248
92S 0.00304 0.077 + 0.117 0.00334 0.079 + 0.131 0.00010 0.061 + 0.052 0.00005 0.060 + 0.048
93R 0.00071 0.067 + 0.078 0.00297 0.078 + 0.125 0.00000 0.057 + 0.036 0.00002 0.058 + 0.042
94V 0.00132 0.071 + 0.091 0.00119 0.071 + 0.093 0.00000 0.056 + 0.034 0.00001 0.057 + 0.037
95M 0.00021 0.064 + 0.062 0.00043 0.066 + 0.073 0.00000 0.055 + 0.028 0.00004 0.075 + 0.075
96L 0.00361 0.079 + 0.124 0.00284 0.078 + 0.123 0.00004 0.060 + 0.047 0.00006 0.060 + 0.049
55

97S 0.00278 0.076 + 0.114 0.00068 0.068 + 0.081 0.00021 0.063 + 0.059 0.00003 0.059 + 0.045
98S 0.00319 0.078 + 0.119 0.00648 0.089 + 0.173 0.00027 0.063 + 0.062 0.00006 0.060 + 0.049
99Q 0.00859 0.092 + 0.172 0.01224 0.104 + 0.241 0.00037 0.064 + 0.066 0.00097 0.068 + 0.083
100V 0.00046 0.066 + 0.072 0.00081 0.069 + 0.084 0.00000 0.056 + 0.033 0.00001 0.057 + 0.036
101P 0.00782 0.090 + 0.166 0.01538 0.112 + 0.275 0.00166 0.071 + 0.094 0.00213 0.073 + 0.103
102L 0.00485 0.082 + 0.138 0.00684 0.089 + 0.178 0.00031 0.064 + 0.063 0.00032 0.064 + 0.065
103E 0.00019 0.063 + 0.061 0.00056 0.067 + 0.076 0.00000 0.055 + 0.028 0.00000 0.055 + 0.030
104P 0.00730 0.089 + 0.161 0.00859 0.094 + 0.200 0.00002 0.059 + 0.044 0.00043 0.065 + 0.068
105P 0.00782 0.090 + 0.166 0.01538 0.112 + 0.275 0.00138 0.070 + 0.089 0.00033 0.064 + 0.065
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107L 0.00252 0.075 + 0.110 0.00281 0.078 + 0.123 0.00004 0.060 + 0.047 0.00003 0.059 + 0.045
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-
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192T 0.00807 0.093 + 0.194 - -
193K
- 0.00044 0.066 + 0.073
- - -
194E 0.00043 0.066 + 0.072 - -
195G - 0.00072 0.068 + 0.082
- - -
196C 0.00264 0.077 + 0.120
- - -
197R 0.00107 0.070 + 0.089
- - -
198G -
- - -
199I -
59
Supplementary Figures.
Fig. S1. Human BDNF isoform a, that codes for a protein containing 247 amino acids. The
first 18 residues comprise the signal peptide. The underlined motifs represent sites within
BDNF that have been implicated in functional aspects: cleavage to form a shorter
proBDNF (54RGLT↓SL59) (Seidah et al., 1999); mature form cleavage (125RVRR128)
(Lee et al., 2001; Gray & Ellis, 2008); carboxipeptidase-E co-receptor interaction (144I and
146E; 233ID234) (Luo et al, 2005); TrkB receptor interaction (154KTAVDMSGGT163;
173SKGQL177; 207QCRTTQSYVR216) (Ibáñez et al, 1991; Ibáñez et al, 1993);
interaction with receptors p75 and TrkB (223KKR225) (Rydén et al., 1995).
60
Figure S2. Alignment of the target-sequence (human locus BDNF - p23560) - excluding
the signal peptide - and the two templates, which have 3D structures available in the
protein data bank (pdb): 1b8m subunit A and 2ia8. 2ia8 subunit A, derived from
mitochondrial cytochrome c peroxidase, was identified as the best available match using
BLAST screening, with 30% identities. 1b8m subunit A was obtained directly from BDNF
crystallographic studies (for more information see Supplementary Methods). The figure
was generated using the multiple sequence alignment program T-Coffee. Symbols: “*”
indicates regions of amino acid identities; “:” indicates regions of amino acid similarities; “.”
indicates regions of unrelated amino acids.
61
Figure S3. ProBDNF homodimer, with two symetric units of the mature domain
(green and red colors), and two symmetric units of the pro domain (blue and yellow
colors). The figures were generated using the program Pymol (version 0.99rc6). A
and B represent distinct views.
62
Fig. S4. Location of positively selected amino acids (underlined) identified in each data
set, using one representative sequence (without the signal peptide) as an example. Grey
fonts indicate the pro domain, whereas black fonts depict the mature domain. A. Protein
sequence of Homo sapiens (data set 1); B. Protein sequence of Homo sapiens (data set
2); C. Protein sequence of cattle (Bos taurus, order Cetartiodactyla); the rectangle
indicates an insertion of three serines in this sequence; D. Protein sequence of a mountain
paca (Agouti taczanowskii, order Rodentia). The rectangle indicates an insertion of 11
serines observed in this sequence; E Protein sequence of sheath-tailed bat (Emballonura
atrata, order Chiroptera); F. Protein sequence of a domestic cat (Felis catus) (order
Carnivora).
63
Capítulo 3 – Considerações Finais.
Os estudos conjuntos de análises evolutivas de seqüências e análises
estruturais das mesmas proteínas (enfocando conformações em momentos
distintos) e suas implicações com características funcionais podem contribuir para
elucidar aspectos funcionais desconhecidos, entender em maiores detalhes o
processo de evolução da molécula em questão, e até mesmo redirecionar pesquisas
experimentais da área envolvida.
Esta investigação indicou regiões do BDNF conservadas entre espécies,
assim como o padrão de seleção natural atuante (seleção positiva, negativa ou
neutra) em cada um de seus codons. Estas informações indicaram que a restrição
seletiva negativa, atuando em uma proporção similar em toda seqüência, pôde
ocorrer no curso da evolução das linhagens de mamíferos. Esta análise foi
administrada em uma caracterização estrutural paralela abordando a construção de
um modelo viável condizente com a predição da estrutura secundária e a
conformação nos domínios do BDNF (pro e maduro), baseado na modelagem
molecular por homologia do peptídeo inteiro.
Apesar de o domínio maduro do BDNF formar cristais heterodiméricos
estáveis com outros membros da família (BDNT/NT3; BDNF/NT4), ainda não havia
um modelo de duas unidades simétricas da porção madura desta proteína
disponível, modelo este importante para inferências estruturais, em nível atômico.
Recentes estudos de Paoletti et al. (2006) e Paoletti et al. (2008) demonstraram que
o domínio pró não processado do NGF (membro mais conhecido desta família
protéica) forma também uma estrutura dimérica simétrica. Estes estudos apontaram
dois esboços estruturais para o peptídeo inteiro, baseados nas análises
experimentais com SAXS. Nossos modelos do proBDNF inteiro foram condizentes
64
com o formato crab-like, descrito por estes autores, na qual um monômero é
constituído por um domínio pró, ancorado pela “base” de um domínio maduro. Os
modelos gerados demonstraram-se satisfatórios na maioria dos parâmetros
inferidos. A estrutura peculiar de todo proBDNF remeteu-nos a uma maior cautela na
modelagem, assim como a exclusão de modelos em muitas tentativas anteriores.
Estudos experimentais que indicaram motivos consenso relacionados à
função do BDNF nos tecidos-alvos identificaram, até o momento, apenas motivos
situados no domínio maduro. Através das nossas análises, tanto o domínio pró
quanto o domínio maduro demonstraram uma proporção similar de restrição seletiva
negativa. Levando em consideração aqueles estudos anteriores e o nosso, infere-se
uma maior atenção funcional e estrutural para o domínio pro, do qual se conhece
pouco, como também sua relação com o domínio maduro. Neste contexto, a função
do BDNF foi identificada a partir de estudos comparativos, utilizando o NGF, e
posteriormente confirmado por métodos bioquímicos e de localização celular. A
partir daí, as pesquisas em neurociências têm apostado nesta pequena proteína,
dentre outros aspectos, por causa de suas particularidades importantes, que
claramente o diferenciam dos outros membros neurotróficos, incluindo plasticidade
neuronal (relevante para o aprendizado e a memória), e um polimorfismo funcional
bem relatado na literatura (V66M). Entretanto, questões ainda teóricas - se o pró-
domínio é ou não um intermediário na rota de sinalização, se é rapidamente clivado
para a proteína madura, e restrições práticas para o estudo in vitro utilizando o pró-
domínio, têm dificultado o direcionamento do foco das pesquisas para a região pro.
O polimorfismo humano V66M, amplamente citado na literatura, implica uma
substituição única do aminoácido valina por uma metionina no domínio pró. Além de
algumas patologias envolvidas, este SNP afeta o direcionamento do domínio maduro
processado para uma rota de sinalização regulada. Outro intrigante fato descrito diz
65
respeito à inserção dos aminoácidos serina e/ou treonina na seqüência pró de
algumas espécies (46 de 153 analisadas), primeiramente observada para poucas
espécies, e ampliada pelo nosso estudo. Nosso estudo indentificou um padrão de
variação de inserção de uma até onze serinas. Em roedores utilizados como modelo
para os estudos acerca do BDNF (Mus musculus, Rattus norvegicus) foi observado
à inserção de uma treonina seguida pela serina. Através do parâmetro de ômega (ω)
analisado, e a posição destas inserções na estrutura modelada, sugere-se que estes
indels estão próximos de sítios sujeitos a restrições seletivas importantes, o que
indica que a presença destes aminoácidos adicionais pode ter efeitos biológicos
relevantes. A contribuição de futuras pesquisas que adicionem estas inserções seria
relavante para relacionar com possíveis implicações funcionais. Em geral, esta
pesquisa encoraja futuras contribuições, que além de outros aspectos, almejem
elucidar e aprofundar os estudos iniciais de interações do BDNF com outras
moléculas, usando como base os sítios identificados neste estudo como
provavelmente exercendo funções biológicas importantes.
66
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PONTIFÍCIA UNIVERSIADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

EVOLUÇÃO E MODELAGEM MOLECULAR DO

FABÍOLA SALENE MATTEI

FABÍOLA SALENE MATTEI

Dissertação apresentada ao Programa

Orientador: Eduardo Eizirik

Bernadete Baseggio Mattei

João Maximino Mattei

Rodolfo Devino Baseggio Mattei

“Ao conhecimento brilhante e orientações nestes dois anos. Levo na minha

Figura 1. Alinhamento das seqüencias de aminoácidos das Neurotrofinas.....8

Figura 2. Anotação da seqüência protéica do BDNF em humanos...............12

Figura 3. Esquema da estrutura neurotrófica madura típica...........................14

Tabela 1. Modelos protéicos cristalográficos disponíveis...............................15

Figura 4. Interação do BDNF com outras proteínas.......................................17

antiBDNF: BDNF opposite strand (fita oposta do BDNF)

BDNF: Brain derived neurotrophic factor (Fator neurotrófico derivado do cérebro)

IDRs: Intrinsic disorder regions (Regiões intrínsecas desordenadas)

LTD: Long-term depression (Depressão de longa duração)

LTP: Long-term potentialization (Potencialização de longa duração)

mtDNA: Mitochondrial DNA (DNA mitocondrial)

MeCP2: Methyl CpG binding protein 2 (Proteína de ligação Metil CpG 2)

NATs: Natural antisense transcritpts (Transcritos antisensos naturais)

NGF: Nerve growth factor (Fator de crescimento do nervo)

NT-3: Neurotrophin 3 (Neurotrofina 3)

NT-4: Neurotrophin 4 (Neurotrofina 4)

p75NTR: p75 neurotrophic receptor (receptor neurotrófico p75)

matBDNF: C-terminal form of BDNF (Forma C-terminal do BDNF)

proBDNF: N-terminal domain of BDNF (Domínio N-terminal do BDNF)

proNGF: N-terminal domain of NGF (Domínio N-terminal do NGF)

rRNA: Ribosomal RNA (RNA ribossomal)

Trk: Tyrosine kinase receptor (receptor tirosina cinase)

TrkB: Tyrosine kinase receptor B (receptor tirosina cinase B)

O fator neurotrófico conhecido como BDNF tem atraído considerável atenção na

Palavras-Chave: ProBDNF, forma homodimérica, seleção natural, mamíferos.

Key-words: ProBDNF, homodimeric form, natural selection, mammals.

Lista de Figuras e Tabelas........................................................................................ii

Capítulo 1 – Introdução e Objetivos.........................................................................6

1. 1. BDNF como membro da família das neurotrofinas.........................................6

1.2. Estrutura e expressão do gene BDNF.............................................................8

1.3. Proteína BDNF................................................................................................9

1.4. Sinalização mediada pela proteína BDNF.....................................................15

1.5. Alinhamento de seqüências e caracterização molecular evolutiva................18

1.6. Modelagem molecular por homologia............................................................21

Capítulo 2 – Artigo Científico..................................................................................24

2.1. Informação suplementar.............................................................................32

Capítulo 3 – Considerações Finais.........................................................................58

1. 1. BDNF como membro da família das neurotrofinas.

O Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é um membro da família de

proteínas homólogas conhecidas como neurotrofinas, e tem um papel central no

desenvolvimento, fisiologia, e patologia do sistema nervoso; como também em processos

relacionados à plasticidade cerebral como a memória, e o aprendizado (Yamada et al.,

2002). Neurotrofinas, que em mamíferos, incluem o Fator de crescimento nervoso (NGF),

a Neurotrofina 3 (NT-3), a Neurotrofina 4 (NT-4), e o BDNF, têm sido caracterizadas em

último apresenta-se como molécula-modelo para os estudos neurotróficos. Os primeiros

estudos que abrangeram a filogenia molecular envolvendo as neurotrofinas relataram uma

seqüência de eventos para a formação dos genes neurotróficos: duas duplicações

diferenciação dos pares, caracterizada pela especialidade individual de cada gene