UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

BIOQUÍMICA

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE MODELOS DE CULTURA DE

ASTRÓCITOS E MECANISMO DE INTERNALIZAÇÃO DA PROTEÍNA S100B

Fabiana Andrea Barrera Galland

Orientadora: Profa. Dra. Marina Concli Leite

Porto Alegre

2017
 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE MODELOS DE CULTURA DE

ASTRÓCITOS E MECANISMO DE INTERNALIZAÇÃO DA PROTEÍNA S100B

Fabiana Andrea Barrera Galland

Orientadora: Profa. Dra. Marina Concli Leite

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas:
Bioquímica da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, como requisito
parcial à obtenção de grau de Doutor
em Bioquímica.

Porto Alegre

2017

II
 CIP - Catalogação na Publicação

Barrera Galland, Fabiana Andrea

Caracterização Funcional de Modelos de Cultura de
Astrócitos e Mecanismo de Internalização da Proteína
S100B / Fabiana Andrea Barrera Galland. -- 2017.
163 f.

Orientadora: Marina Concli Leite.

Tese (Doutorado) -- Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Instituto de Ciências Básicas da
Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas: Bioquímica, Porto Alegre, BR-RS, 2017.

1. Astrócitos. 2. Endocitose. 3. S100B. 4.

Glutamina Sintetase. I. Concli Leite, Marina,
orient. II. Título.

Elaborada pelo Sistema de Geração Automática de Ficha Catalográfica da UFRGS com os

dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Dedico esta tese aos meus pais, que são minha maior referência

III
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez”.

(George Bernard Shaw)

IV
Agradecimentos

Aos meus pais Andres e Griselda pelo amor incondicional, pela torcida e
incentivo constante, por serem meus exemplos de vida!
Às minhas irmãs Lê e Eli por serem meus orgulhos, minhas inspirações e as
melhores amigas que a vida poderia ter me dado! E por me dar o presente de ser tia de
dois pitoquinhos que estão a caminho para alegrar ainda mais essa família!
Ao meu amor Maicon por todo apoio e incentivo. Por me ensinar a lutar por
aquilo que quero fazendo-me mais forte e tornando a minha jornada mais leve e
divertida! Te amo!
À Mara por ser minha segunda mãe, por torcer muito por mim sempre!
À minha amiga da vida, Maíra, por estar sempre do meu lado e ter me dado de
presente a minha afilhada linda, Melissa!
Aos meus sogros Nice e Seu Machado pelo carinho e torcida!
Ao pessoal da Eslovênia que contribuiu para fazer do meu Doutorado Sanduíche
inesquecível!
Às minhas amigas/colegas do laboratório (Caroll, Fezinha, Jéssica, Jé, Marina e
Gabriel) por fazer meus dias mais divertidos e ser um ótimo grupo de trabalho! Em
especial às que se dedicaram a esta tese com muito empenho e dedicação, Marina Seady
e a Jéssica Taday! Sem vocês a realização deste trabalho teria sido muito mais difícil!
À todo o pessoal do laboratório 33, bolsistas e pós graduandos por nos incluir, e
compartilhar formando um super grupo de trabalho alegre e divertido! Em especial a Fê
Hansen, pela grande amizade, troca de conhecimentos e confiança!
Ao CA por ser um super co-orientador, com toda sua experiência, sabedoria
encarando os problemas sempre de forma tão leve! Obrigada por toda ajuda!
Por fim, à quem não poderia faltar, a Marina, minha querida orientadora!
Obrigada por todos os teus ensinamentos, desde os tempos de IC, pela tua paciência,
dedicação, pelas horas de conversa sérias, mas também por aquelas de diversão!
Obrigada principalmente pela tua confiança. Certamente, tu és uma inspiração a seguir
na minha vida acadêmica!

V
Índice

Lista de Abreviaturas .................................................................................................................... 3

1. Introdução ............................................................................................................................. 4
1.1. Astrócitos ...................................................................................................................... 4
1.1.1. Origem................................................................................................................... 4
1.1.2. Morfologia............................................................................................................. 5
1.1.3. Proteínas marcadoras............................................................................................. 6
1.1.4. Funções ................................................................................................................. 7
1.1.4.1. Papel no desenvolvimento cerebral ................................................................... 8
1.1.4.2. Regulação do fluxo sanguíneo, barreira hematoencefálica (BHE) e
angiogênese .......................................................................................................................... 8
1.1.4.3. Manutenção do ambiente extracelular: fluído, íons e pH .................................. 9
1.1.4.4. Papel dos astrócitos na função sináptica ......................................................... 11
1.1.4.5. Metabolismo energético nos astrócitos ........................................................... 13
1.1.4.6. Astrogliose e doenças neurodegenerativas ...................................................... 14
1.2. S100B .......................................................................................................................... 15
1.2.1. Efeitos intracelulares da S100B .......................................................................... 16
1.2.2. Efeitos extracelulares da S100B .......................................................................... 17
1.2.3. Mecanismos de internalização............................................................................. 20
1.3. Glutamina Sintetase..................................................................................................... 22
1.4. Modelos de astrócitos .................................................................................................. 26
2. Justificativa ......................................................................................................................... 30
2.1. Objetivo Geral ............................................................................................................. 31
2.2. Objetivos Específicos .................................................................................................. 31
3. Resultados ........................................................................................................................... 32
3.1. Capítulo I..................................................................................................................... 32
Molecular and functional characterization of primary culture of astrocytes, immortalized
astrocytes and C6 glioma cells................................................................................................ 32
3.2. Capítulo II ................................................................................................................... 65
Time-dependent uptake and trafficking of vesicles capturing extracellular S100B in cultured
rat astrocytes ........................................................................................................................... 65
3.3. Capítulo III .................................................................................................................. 81
Standardization of a routine protocol for glutamine synthetase activity in astrocytes and
cerebral tissue, using glutamyl-transferase activity................................................................ 81
4. Discussão........................................................................................................................... 105

VI
 4.1. Caracterização molecular e funcional de cultura primária de astrócitos, astrócitos
imortalizados e glioma C6..................................................................................................... 105
4.1.1. Avaliação da morfologia basal e plasticidade após estímulo ................................ 105
4.1.2. Perfil molecular dos diferentes modelos de astrócitos .......................................... 106
4.1.3. Caracterização funcional do metabolismo do glutamato em modelo de astrócitos108
4.1.4. Comparação do metabolismo energético e comunicação por junção gap em
modelos de astrócitos ............................................................................................................ 110
4.1.5. Avaliação de resposta nos modelos de cultura de astrócitos ................................. 111
4.1.6. Escolha do modelo de cultura de astrócitos .......................................................... 113
4.2. Internalização tempo-dependente da S100B extracelular e análise da movimentação
de vesículas em cultura de astrócitos .................................................................................... 115
4.2.1. Mecanismo de internalização da S100B em cultura de astrócitos......................... 115
4.2.3. A mobilidade das vesículas S100B-Alexa488 é alterada pelo estímulo com ATP . 119
4.2.4. Regulação da S100B por endocitose ..................................................................... 121
4.3. Padronização de ensaio colorimétrico para dosagem de atividade da GS ................. 124
5. Conclusões ........................................................................................................................ 127
6. Perspectivas ....................................................................................................................... 130
7. Referências Bibliográficas ................................................................................................ 131

VII
Resumo

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas
funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo
neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas
células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um
importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica
de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo
para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema
isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem
C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais
homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de
resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos
comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo
adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as
funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou
secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos,
exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar
disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista
disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no
que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas
astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína
S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a
padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da
glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em
diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua
disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao
quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas.
O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no
SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas
linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de
astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No
entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com
a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo
reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual
apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6
representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas,
porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em
nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da
proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um
mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu
pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e
Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao
longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados
mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de
astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de
concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na
compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína.
Abstract

Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous
system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic
concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several
neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic
strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in
an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this
type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized
astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present
more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite
these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different
characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an
astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would
allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability.
This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic
and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high
extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular
space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a
comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein
profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of
S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular
dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to
measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed,
considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures.
This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise
the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases.
The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the
CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for
characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC.
Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by
gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a
reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented
a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC
showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study
of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured
astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-
dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine
dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that
vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles
capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the
understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as
the role of astrocytes in this regulation.

2
Lista de Abreviaturas

ANP – peptídeo natriurético atrial

AMPc - monofosfato cíclico de adenosina

AQP4 – aquaporina-4

ALDH1L1- membro da família L1 da aldeido desidrogenase 1 (aldehyde

dehydrogenase 1 family member L1)

BDNF - fator neurotrófico derivado do cérebro

BHE – barreira hematoencefálica

Cx43 – conexina-43

EAAT – transportador de aminoácidos excitatórios

ERO – espécies reativas de oxigênio

GABA – ácido gamaaminobutírico

GFAP – proteína ácida fibrilar

GLAST- transportador glutamato-aspartato

GLUT1 – transportador de glicose

GS – glutamina sintetase

IL – interleucina

iNOS – óxido nítrico sintase induzível

LCR - líquor

MSO – monoamina oxidase

NGF – fator de crescimento nervoso

RAGE – receptor para produtos finais de glicação avançada

SNC – sistema nervoso central

TNF-α – fator de necrose tumoral α

3
1. Introdução

1.1. Astrócitos

O sistema nervoso central (SNC) é formado pelas células neuronais e gliais. Por sua

vez, as células gliais são divididas em micróglia e macroglia. Ainda, a macroglia é

composta por outros três tipos células: os oligodendrócitos, células de Schwann e

astrócitos.

Entre as células gliais, os astrócitos são as mais abundantes. A razão

astrócitos/neurônio aumenta com a evolução das espécies, assim como a estrutura,

morfologia e diversidade entre espécies, indicando a importância destas células no

desenvolvimento de sistemas neurais mais sofisticados (Leuba & Garey 1989, Vasile et

al. 2017). O nome deriva da palavra grega para estrela (astron) junto com (cyte) de

célula, devido ao fato de semelhar-se a uma estrela quando descoberta no início do

século 20. Primeiramente foi descrita como uma célula passiva, servindo como suporte

estrutural de neurônios. Atualmente, é considerada como participante ativa nos circuitos

cerebrais e no processamento, apresentando um grande espectro de funções a nível

celular, tais como a formação, maturação e eliminação de sinapses, homeostase iônica,

depuração de neurotransmissores, regulação do volume no espaço extracelular e

modulação da atividade sináptica e plasticidade neuronal (Kimelberg & Nedergaard

2010, Vasile et al. 2017).

1.1.1. Origem

A gliogênese inicia-se tarde no desenvolvimento embrionário após o início da

formação neuronal. Os astrócitos originam-se de três fontes distintas: de células glia-

radial da zona ventricular durante a vida perinatal, progenitores da zona subventricular

durante a vida embrionária, e progenitores glia-restritos durante a vida pós-natal e na

4
vida adulta. Durante a vida perinatal as células tronco neurais sofrem uma mudança no

desenvolvimento passando a fazer parte da gliogênese e não mais da neurogênese. Nesta

mudança passam a expressar alguns marcadores astrocíticos como o GLAST (glutamate

aspartate transport), transportador de glutamato. Estas células parecem migrar ao longo

da glia radial até certo estágio do desenvolvimento, onde acredita-se que outra leva de

precursores astrocíticos passem a regular o processo. No entanto, os processos

moleculares e celulares que ocorrem nesta fase ainda são desconhecidos. (Molofsky &

Deneen 2015). O processo de diferenciação em astrócitos é de difícil estudo, devido a

variedade de marcadores moleculares característicos deste tipo celular, os quais são

expressos em um subtipo de astrócito, porém não em outros. Sabe-se que após a

migração e antes da maturação funcional e morfológica os astrócitos passam a expressar

algumas proteínas marcadoras como GFAP, S100B, ALDH1-L1. Esta diversidade de

linhagens astrocíticas, sugere que os astrócitos não são formados da mesma maneira, o

que explicaria a diversidade destas células em relação à localização, morfologia e

expressão gênica (Wang & Bordey 2008).

1.1.2. Morfologia

Assim como sua origem, os astrócitos maduros apresentam morfologia

heterogênea, com três principais variantes: a forma esférica espessa em processos,

chamado de protoplasmáticos, presentes na substância cinzenta, representando a forma

mais abundante; a forma menos carregada em processos, chamados de fibrosos da

substância branca e; a forma alongada com poucos processos, representados pelas

células de Bergmann no cerebelo e as células de Müller na retina. Os processos finos e

longos dos astrócitos fibrosos envelopam os nódulos de Ranvier, enquanto que os

processos presentes nos astrócitos protoplasmáticos estão em contato com os vasos

5
sanguíneos (pés-terminais), assim como com os neurônios. Os processos astrocíticos se

infiltram, na forma de lamelas e fibras, entre a intrincada rede de processos neurais

incluindo terminais sinápticos, dendritos e espinhos dendríticos. Observou-se que o

tamanho e a quantidade de processos em astrócitos podem variar com o aumento da

complexidade das funções cerebrais ao longo da escala evolutiva (Wang & Bordey

2008, Kimelberg & Nedergaard 2010).

1.1.3. Proteínas marcadoras

Por serem células altamente heterogêneas, torna-se difícil a identificação dos

astrócitos com apenas uma proteína característica. A identidade proteica pode variar

dependendo da origem, local ou mesmo as condições do microambiente onde a célula se

encontra. O filamento intermediário GFAP (glial fibrilar acid protein) foi a primeira

proteína marcadora e ainda é a mais usada como característica de astrócitos maduros,

apesar de que outras células também a expressem, porém em quantidades menores,

como as células ependimais (Eng 1985). Apesar da maioria dos astrócitos expressarem

GFAP, astrócitos negativos para esta proteína são detectados no SNC saudável. De fato,

a sua expressão é variável, dependente da região do astrócito, sendo regulada por muitas

moléculas presentes nos ambientes intra e intercelulares. No entanto, sua expressão é

essencial para o processo de reatividade astroglial e formação de cicatriz glial

(Sofroniew & Vinters 2010).

A proteína S100B, pertencente à família de proteínas S100 “EFhand” ligantes de

cálcio, também é amplamente usada como proteína marcadora de astrócitos. Apesar

disso, não é uma proteína exclusiva deste tipo celular, assim como nem todos os

astrócitos maduros a expressam (Vives et al. 2003). Além disso, outras proteínas são

abundantemente expressas em astrócitos, como os transportadores de aminoácidos

6
excitatórios EAAT1/GLAST e EAAT2/GLT-1. EAAT1 é mais presente em astrócitos

em desenvolvimento, enquanto que EAAT2 é mais expresso nas células diferenciadas

(Regan et al. 2007). A enzima glutamina sintetase (GS) também é altamente expressa

em astrócitos, com a importante função no ciclo glutamina-glutamato (Bernstein et al.

2014), que será abordado mais adiante. Ainda, canais de potássio internalizadores, como

Kir4.1, são altamente expressos nos pés terminais e nas regiões de contato sináptico de

astrócitos (Seifert et al. 2016). Já, a proteína transportadora de água, aquaporina-4

(AQP4), está abundantemente expressa na membrana perivascular de astrócitos

protoplasmáticos (Papadopoulos & Verkman 2013). No entanto, enquanto algumas

destas proteínas são expressas por todos os astrócitos (ex. EAAT2), outras são expressas

apenas por alguns subtipos desta célula (ex. Kir4.1). Devido a essa heterogeneidade

entre as células astrocíticas é recomendado o uso de pelo menos dois marcadores

proteicos para a identificação deste tipo celular. Recentemente, a enzima ALDH1L1

(aldehyde dehydrogenase 1 family member L1) vem sendo usada como um novo

marcador astroglial específico, também conhecida como 10-formil tetrahidrofolato

desidrogenase, a qual participa do metabolismo de folato (Yang et al. 2011, Cahoy et al.

2008).

1.1.4. Funções

Como vimos anteriormente, os astrócitos são células altamente heterogêneas,

não só pela diversidade morfológica, expressando diferentes identidades moleculares,

mas também pelas funções especializadas que esta célula é capaz de assumir de acordo

com o microambiente onde se encontra. Apesar disso, algumas funções clássicas dos

astrócitos são usadas para a sua identificação, as quais serão relatadas nesta sessão.

7
 1.1.4.1. Papel no desenvolvimento cerebral

Apesar dos astrócitos se desenvolverem após a formação inicial dos neurônios, eles

tem um importante papel no desenvolvimento dos neurônios da substância branca e

cinza no SNC. Estas células gliais são a principal fonte de matriz extracelular,

promovendo o crescimento de neuritos pela liberação de moléculas, tais como caderina

e moléculas de adesão (Tomaselli et al. 1988); ou então inibindo o crescimento de

neuritos pela liberação de proteoglicanos (Gonzalez et al. 1993). Além disso, astrócitos

secretam vários fatores de crescimento, como BDNF (brain derived neurotrophic

factor) e NGF (nerve growth factor), os quais controlam a maturação, diferenciação ou

sobrevivência neuronal (Vaca & Wendt 1992). A proteína S100B, por exemplo, auxilia

o crescimento de neuritos e protege os neurônios contra a excitotoxicidade

glutamatérgica (Donato 2003).

Além disso, estudos mais recentes mostram o papel dos astrócitos na sinaptogênese,

liberando moléculas que auxiliam na formação das sinapses ou ainda, induzem a

eliminação delas pela micróglia (Christopherson et al. 2005). Na substância branca, a

perda da função astrocítica ou da comunicação por junção gap induz processo de

desmielinização (Lutz et al. 2009).

1.1.4.2. Regulação do fluxo sanguíneo, barreira hematoencefálica

(BHE) e angiogênese

O posicionamento estratégico dos astrócitos em contato tanto com os vasos

sanguíneos (pés terminais) assim como com as sinapses, permite que estas células

regulem o fluxo sanguíneo de acordo com a atividade sináptica. Moléculas liberadas

pelos astrócitos tais como prostaglandinas e oxido nítrico, podem variar o diâmetro dos

vasos, aumentando ou diminuindo o fluxo sanguíneo (Gordon et al. 2007).

8
 Ainda, o contato físico entre células endoteliais e os pés terminais de astrócitos,

permite que estas células regulem indiretamente algumas propriedades da BHE, como

por exemplo, a indução de super-expressão de proteínas das junções oclusivas ou

transportadores de glicose (GLUT1) nas células endoteliais (Wang & Bordey 2008).

Viu-se que a interação entre estes tipos celulares deve-se a sinalização por cálcio

ativado por ATP. Como resultado, as variações de cálcio nas células endoteliais

interferem na permeabilidade da BHE (Paemeleire & Leybaert 2000).

Além disso, astrócitos tem a capacidade de regular a formação de vasos sanguíneos -

a angiogênese. Através da liberação de moléculas, tais como laminina ou fator de

crescimento vascular endotelial, promovem a crescimento dos vasos (Laterra &

Goldstein 1991).

1.1.4.3. Manutenção do ambiente extracelular: fluído, íons e pH

Os astrócitos tem a importante função de controlar o balanço eletrolítico do espaço

extracelular, principalmente nas regiões em contato com as sinapses. Uma das

principais atuações é no tamponamento de K+, o qual é liberado pelos neurônios durante

a neurotransmissão. O K+ em excesso causa hiperexcitabilidade e, portanto, deve ser

rapidamente removido pelos astrócitos, através de canais de potássio - como Kir, ou por

transportadores Na2+/K+ ATPase que atuam em menor extensão (Fig 1). Uma vez

captado os astrócitos redistribuem o íon, através de uma rede de células formada pelas

junções gap, e o liberam em regiões com concentrações mais baixas de potássio, ou

mesmo na circulação sanguínea pelos pés terminais (Olsen & Sontheimer 2008) (Leis et

al. 2005, Wang & Bordey 2008). Destaca-se a importância das junções gap não só na

participação da distribuição de K+, mas também de outros íons, como cálcio, ou até de

moléculas maiores como produtos do metabolismo energético, como veremos mais

9
adiante. Estas junções são formadas em astrócitos principalmente pela associação de

moléculas de conexina 43 (Cx43) (Fig 1) (Rouach et al. 2002).

Além dos transportadores de K+, os processos astrocíticos em contato com as

sinapses são ricos em AQP4, tendo importante função na homeostase de fluídos tanto

nesta região, quanto nos pés terminais em contato com vasos sanguíneos (King et al.

2004). Ainda, a membrana de astrócitos é rica em lançadeiras de prótons, incluindo o

trocador Na+/H+ e transportadores de bicarbonato, controlando o pH extracelular

(Deitmer & Rose 2010).

Fig 1. Representação das principais funções dos astrócitos. 1) Astrócitos atuando na sinapse
tripartite; 2) Regulação do fluxo sanguíneo com a presença de aquaporina-4 e canais de potássio nos pés
terminais; 3) Regulação da homeostase extracelular de íons e pH, apresentando canais de K +, Cl-, trocador
Na+/H+ e co-transportadores de Na+/HCO3; 4) Comunicação por junção gap entre astrócitos, onde pode
ocorrer a passagem de íons como o cálcio ou metabólitos energéticos, como o lactato. Figura modificada
de (Seifert et al. 2006)

10
 1.1.4.4. Papel dos astrócitos na função sináptica

É importante destacar que um único astrócito é capaz de cobrir centenas de milhares

de sinapses em roedores e, este número pode ser de uma ordem de grandeza maior em

humanos (Halassa et al. 2007, Oberheim et al. 2009). Esta ligação tão próxima entre

astrócitos e neurônios permite que estas células gliais participem da homeostase de

neurotransmissores, apresentando membranas ricas em transportadores de glutamato,

ácido gama-aminobutírico (GABA) e glicina. A rápida captação de GABA, por

exemplo, evita que o sinal inibitório se espalhe para outras regiões (Kinney & Spain

2002). Da mesma forma, os transportadores de glutamato EAAT1 e EAAT2, captam o

neurotransmissor e através da atividade da GS o glutamato é convertido à glutamina

(Fig 1). Uma vez produzida nos astrócito, a glutamina retorna para os neurônios para

novas sinapses. Portanto, a remoção do glutamato pelos astrócitos da fenda sináptica

garante o funcionamento das transmissões sinápticas, colocando os astrócitos como

protagonistas, ao invés de meros coadjuvantes das sinapses. Dá-se o nome de “sinapse

tripartite”, onde, além do neurônio pré e pós-sináptico, o astrócito torna-se o terceiro

elemento participante da sinapse (Kettenmann & Verkhratsky 2008).

Além da captação de neurotransmissores, os astrócitos participam da regulação

sináptica pela liberação de moléculas ativadoras como glutamato, purinas (ATP,

adenosina e guanina), GABA e D-serina, modulando assim as respostas neuronais

(Bezzi & Volterra 2001). A liberação dos gliotransmissores (assim chamadas as

moléculas liberadas pelos astrócitos que regulam a atividade sináptica) é ativada em

resposta a mudanças da atividade neuronal. Através dos receptores presentes na

membrana de astrócitos, como por exemplo, para o glutamato, acetilcolina, ATP,

GABA e norepinefrina, estas células respondem com elevação transitória nas

concentrações intracelulares de cálcio (De Pittà et al. 2016). Mais especificamente, em

11
resposta a estímulo sináptico os receptores ligados a proteína G na membrana dos

astrócitos, ativam a fosfolipase C e a produção de IP3, o que induz a liberação de Ca2+

pelo retículo endoplasmático. A variação de cálcio intracelular pode ser transmitida

entre astrócitos através da passagem de IP3 pelas junções gap e consequente aumento de

cálcio na célula adjacente, produzindo as conhecidas ondas de cálcio, que garante a

comunicação por longas distâncias, e é considerada uma forma de excitabilidade destas

células (Perea & Araque 2005, Scemes & Giaume 2006). É importante ressaltar que

esse processo de ativação dos astrócitos por ondas de cálcio é muito mais lento do que a

transmissão sináptica em neurônios. Considerando isso, o quão eficiente é a liberação

dos gliotransmissores em relação às respostas neurais, como ocorre a liberação e a

regulação da liberação destas moléculas, e ainda, como é regulado o tempo de resposta,

são temas ainda em estudo (De Pittà et al. 2016).

Além das respostas químicas, os astrócitos podem influenciar as sinapses através de

mudanças morfológicas. Recentemente, relacionou-se as mudanças estruturais e

funcionais na interação entre astrócitos e neurônios com a formação de memória (Zorec

et al. 2015). Observou-se na amígdala lateral de ratos que, após o condicionamento de

medo, os processos astrocíticos se retraem, ampliando a região sináptica e favorecendo

a comunicação neuronal e consolidação da memória (Ostroff et al. 2014). Ao contrário

disso, os processos astrocíticos podem servir como barreiras, limitando o sinal e a

comunicação entre sinapses vizinhas e ao mesmo tempo favorecendo a especificidade

da transmissão (Beenhakker & Huguenard 2010). Ainda, inibições farmacológicas ou

modelos transgênicos de animais, com funções astrocíticas alteradas, como por exemplo

o bloqueio da liberação de gliotransmissores, ou ainda o bloqueio do receptor de

adenosina A1 nos astrócitos comprometeu a plasticidade sináptica e prejudicou a

memória de longa duração. Portanto, cada vez mais estudos relacionam o papel dos

12
astrócitos também como participantes ativos das funções cognitivas (Oliveira et al.

2015).

1.1.4.5. Metabolismo energético nos astrócitos

Devido ao posicionamento estratégico dos astrócitos, em contacto com vasos

sanguíneos e axônios, estas células captam glicose da circulação, através do

transportador de glicose GLUT-1, e fornecem metabólitos energéticos a diferentes

elementos neurais. Aproximadamente 75% de toda a glicose que entra no parênquima

cerebral é fosforilada nos astrócitos (Hyder et al. 2006). Além disso, estas células são as

principais armazenadoras de glicogênio no SNC, suprindo a demanda energética em

condições de hipoglicemia. Não coincidentemente, o maior acúmulo dos grânulos de

glicogênio ocorre nas áreas de alta atividade sináptica. De acordo com isso, o conteúdo

de glicogênio pode ser modulado por neurotransmissores, como o glutamato. Além

disso, os metabólitos da glicose podem ser transferidos pelas junções gap, e este

processo também é regulado pela atividade neural (Brown & Ransom 2015, Pellerin &

Magistretti 1994). A maior parte da glicose captada pelos astrócitos não será utilizada

pela própria célula, mas será armazenada na forma de glicogênio ou convertida a

lactato, o qual é exportado para os neurônios como substrato energético preferencial. A

este processo é dado o nome de “lançadeira de lactato astrócito-neurônio” (Pellerin

2008). Isto ocorre devido às características bioquímicas da célula, apresentando altos

níveis de enzimas relacionadas à glicólise e ao metabolismo do glicogênio. Ao contrário

de neurônios, astrócitos apresentam altos níveis de frutose-2,6-bifosfato, molécula

chave na regulação da glicólise e, baixa atividade da piruvato desidrogenase, enzima

chave para a entrada no ciclo do ácido tricarboxílico. Além disso, os astrócitos

13
apresentam baixos níveis de proteínas relacionadas à lançadeira malato-aspartato

(Bouzier-Sore & Pellerin 2013).

1.1.4.6. Astrogliose e doenças neurodegenerativas

Os astrócitos têm sido relacionados como participantes de diversas doenças

neurodegerativas (Khandelwal et al. 2011). Nestas condições, os astrócitos podem

assumir características reativas, classificadas como astrogliose. Esta definição é

normalmente usada como um marcador de patologias no SNC. Conceitualmente ocorre

quando os astrócitos apresentam alterações moleculares, celulares e funcionais em

resposta a algum dano ou doença do SNC. As alterações sofridas pelos astrócitos

reativos variam com a gravidade do insulto, sendo progressivas em relação à expressão

molecular (Ex. GFAP e S100B), e hipertrofia celular. Nos casos graves, ocorre

proliferação e formação de cicatrizes gliais. Estas alterações são reguladas por

moléculas sinalizadoras específicas ao contexto, como citocinas inflamatórias,

lipopolissacarídeo (LPS), peptídeo beta amiloide ou até neurotransmissores (Sofroniew

2009). As alterações sofridas durante a astrogliose reativa tem a capacidade de alterar as

atividades da célula por ganho ou perda de função, podendo ter um impacto tanto

benéfico como prejudicial nas células neurais e não neurais circundantes (Sofroniew

2015).

As disfunções astrocíticas têm sido associadas a doenças psiquiátricas, doença de

Alzheimer, encefalopatia hepática, epilepsia, entre outras (Sofroniew & Vinters 2010).

As alterações astrocíticas podem ocorrer simplesmente pelo aumento da idade, ou então

induzidas por estímulos tóxicos. Logo, suas respostas podem modular os efeitos

celulares nas patologias neurodegenerativas, contribuindo para a perda de função

cerebral. Por exemplo, na encefalopatia hepática, o inchaço dos astrócitos é tido como a

14
principal causa do edema cerebral observado nesta doença. Além disso, estas células

assumem um papel importante na detoxificação da amônia, uma vez que apresentam a

enzima GS, a qual converte glutamato em glutamina captando o íon amônio. O

resultado de alterações nesse processo pode gerar um desequilíbrio na homeostase do

neurotransmissor glutamato, explicando alguns sintomas comportamentais desta doença

(Butterworth 2014). Alterações astrocíticas também são observadas na doença de

Alzheimer. Os astrócitos reativos estão intimamente associados com as placas amiloides

e, são capazes de captar e degradar os depósitos extracelulares de Aβ42 (Wyss-Coray et

al. 2003). Ainda, a intensidade da gliose reativa, determinada pelos níveis de GFAP,

está aumentada com a progressão da doença, ao mesmo tempo, os transportadores de

glutamato estão diminuídos, deixando os neurônios mais vulneráveis a excitotoxicidade

glutamatérgica (Simpson et al. 2010). A proteína S100B, também está aumentada nos

astrócitos reativos na doença de Alzheimer e é usada como uma proteína marcadora

para esta doença. Recentemente foi relatado que a sua inibição com pentamidina, a qual

inibe a sua interação com p53, é capaz de diminuir os efeitos inflamatórios no

hipocampo de ratos com modelo de Alzheimer (Cirillo et al. 2015).

1.2. S100B

Como relatado anteriormente, a S100B é uma das principais proteínas usadas

como marcadora de astrócitos. Apesar disso, a sua expressão não é exclusiva deste tipo

celular, sendo encontrada também em oligodendrócitos maduros, células progenitoras

neurais, ependimócitos, adipócitos, células musculares, entre outras (Donato 2001,

Vives et al. 2003). Contudo, sua expressão pode ser modificada dependendo da função

e do contexto celular, como por exemplo, sendo super-expressa em condições

patológicas, como na doença do Alzheimer (Sorci et al. 2013). Esta proteína está

15
distribuída no citoplasma e núcleo de astrócitos de cérebro adulto, assim como nos

processos astrocíticos das zonas perivasculares (Mbele et al. 2002). A S100B é uma

proteína altamente conservada entre espécies de vertebrados e entre diferentes tecidos

da mesma espécie. Ela se apresenta, na sua maioria, na forma de homodímeros de 21

kDa, e a ligação destas duas subunidades parece ser crucial para sua atividade

extracelular (Berger et al. 2002). A S100B faz parte da família de proteínas S100,

ligantes de cálcio do tipo “EF hand” (Marenholz et al. 2004). Esta proteína funciona

como sinalizadora de Ca2+ e a maioria de suas funções dependem desta interação, uma

vez que quando o Ca2+ se liga na sua estrutura muda a sua conformação expondo seu

sítio de interação (Rustandi et al. 2000). Outros íons, como zinco e cobre, também

apresentam afinidade pela S100B, podendo regular sua função (Marenholz et al. 2004).

1.2.1. Efeitos intracelulares da S100B

A S100B age tanto nos espaço intracelular quanto extracelular. No citoplasma

interage com o citoesqueleto modulando a polimerização de microtúbulos e de

filamentos intermediários, favorecendo a migração celular (Sorci et al. 1998). Além

disso, a S100B está altamente expressa em células tumorais, estando, portanto,

relacionada com proliferação e sobrevivência celular. Entre outras ações, esta proteína

inibe a fosforilação do supressor de tumor p53, inibindo sua ativação (Wilder et al.

2006). Ainda, a S100B parece inibir a diferenciação celular, porém apenas nos estágios

iniciais do desenvolvimento celular. Foi relatado que existe uma redução transitória da

expressão de S100B durante a diferenciação de astrócitos em cultura primária, que é

restaurada nos estágios de desenvolvimento posteriores (Donato et al. 2009). Cultura de

astrócitos nocautes para S100B (células geneticamente modificadas que não expressam

a proteína) demonstraram um aumento de cálcio transiente após estímulo com cafeína,

16
mostrando a participação desta proteína também na homeostase do cálcio (Xiong et al.

2000).

1.2.2. Efeitos extracelulares da S100B

Ao contrário da maioria das proteínas da família S100, a S100B pode ser encontrada

no espaço extracelular, onde exerce efeitos autócrinos e parácrinos na glia, em

neurônios e na microglia. O mecanismo pelo qual a S100B exerce seus efeitos

extracelulares ainda está sob estudo; entretanto, grande parte desses efeitos parece ser

mediado pela ligação com o RAGE (receptor for advanced glycation end products),

apesar de alguns efeitos serem independentes deste receptor (Leclerc et al. 2009).

Estudos sobre a estrutura de ligação revelaram que a S100B se liga ao domínio externo

V do receptor e que a forma tetramérica da proteína apresenta maior afinidade do que a

dimérica (Ostendorp et al. 2007).

Estudos em neurônios mostram que a S100B atua como uma proteína neurotrófica

em concentrações baixas (pico a nanomolares), induzindo crescimento de neuritos e

aumentando a sobrevivência neuronal in vitro e vivo (Donato et al. 2009). A extensão de

neuritos induzido por S100B parece ser mediado pela ligação com RAGE, ativando

Cdc42-Rac1(Huttunen et al. 2000). Além disso, a ligação S100B/RAGE protege

neurônios contra estímulos tóxicos ativando o fator anti-apoptótico Bcl-2 e a via

Ras/MEK/ERK1/2/NFκB. Em contraposição, concentrações micromolares da S100B

induzem apoptose neuronal, efeito mediado também via RAGE. Esta ligação aumenta

fatores da via ERK1/2, assim como a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)

e caspase-3 (Fig 2) (Huttunen et al. 2000, Businaro et al. 2006, Donato 2007, Van Eldik

& Wainwright 2003).

17
 Em astrócitos, a S100B estimula a proliferação e migração celular em baixas

concnetrações, além de prevenir as alterações morfológicas provocadas pela

neurotoxina trimetilestanho (Reali et al. 2005, Selinfreund et al. 1991). Por outro lado,

em altas doses, a S100B parece induzir a troca de resposta dos astrócitos de trófico para

tóxico, promovendo a produção de fatores inflamatórios. Concentrações na ordem de

micromolar de S100B induzem a ativação de oxido nítrico sintase induzível (iNOS) via

NFκB, a super-expressão de interleucina-1β (IL-1b), TLR2, FGF2 e TGFβ2 e a

liberação de interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-α (TNFα). Todos estes

efeitos parecem ser mediados via RAGE (Fig 2) (Ponath et al. 2007, Hu et al. 1996,

Lam et al. 2001, Reali et al. 2012, Villarreal et al. 2014).

Em micróglia, baixas concentrações de S100B atenuam a ativação microglial pela

ativação da via STAT3 (Zhang et al. 2011). Já em concentrações altas, a S100B induz

ativação microglial, via NFκB, estimula a secreção e liberação de citocinas AP-1

dependentes, assim como a expressão de ciclooxigenase-2, e a migração celular. Estes

efeitos também parecem ser mediados por RAGE (Petrova et al. 2000, Reali et al.

2005). No entanto, ativação de iNOS e produção de NO em micróglia ativada por

S100B mostrou-se independente de RAGE, indicando que outros receptores devem

estar envolvidos na ativação desta via (Fig 2) (Adami et al. 2004).

18
Fig 2. Representação esquemática dos efeitos da S100B extracelular sobre neurônios, micróglia e
astrócito. Figura modificada de (Donato & Heizmann 2010).

Regulação da concentração de S100B no espaço extracelular

A liberação da S100B para o espaço extracelular pode ocorrer de forma regulada por

um mecanismo ainda desconhecido. A sua secreção é realizada principalmente pelos

astrócitos no SNC, e pelos adipócitos na periferia (Gonçalves et al. 2008). De fato,

vários moduladores da secreção da S100B têm sido descritos, como variações na

concentração intracelular de cálcio (Davey et al. 2001), estímulo com glutamato

(Tramontina et al. 2006), IL-1β (de Souza et al. 2009), TNF-α (Edwards & Robinson

2006), amônia (Leite et al. 2006), fluoxetina (Tramontina et al. 2008), entre outros.

Por outro lado, a S100B pode ser liberada por lise celular, como no caso de um

trauma cerebral. Nesta condição a ação da S100B normalmente está relacionada a

efeitos tóxicos, se acumulando no espaço extracelular (Steiner et al. 2011). O uso da

proteína S100B como marcadora de dano cerebral tem sido amplamente proposto, uma

vez que esta proteína se encontra aumentada no soro ou líquor (LCR) após várias

condições patológicas, como dano traumático cerebral, isquemia, doença de Alzheimer,

19
esclerose lateral amiotrófica, entre outras (Steiner et al. 2011, Rothermundt et al. 2003).

No entanto, o aumento de S100B no LCR nem sempre corresponde a um aumento no

soro. Da mesma forma, disfunções da BHE nem sempre correspondem a um aumento

de passagem da S100B do LCR para o soro (Kleindienst et al. 2010, Guerra et al.

2011). Demonstrou-se recentemente que, após uma lesão cerebral traumática, a S100B é

transportada do cérebro para o sangue através de um sistema chamado glinfático, na

região perivascular entre a pia-máter e os vasos, onde ocorre a troca de substâncias entre

o fluído intersticial e LCR. No entanto, uma inibição desta via bloqueia a passagem de

S100B para o sangue, forçando as células cerebrais a metabolizar altas concentrações

desta proteína liberadas em uma situação de dano (Plog et al., 2015).

Apesar de se saber que a maioria dos efeitos extracelulares de S100B (tróficos e

tóxicos) são mediados pela sua ligação ao RAGE, pouco se sabe sobre como esta

proteína é eliminada do espaço extracelular pelas células cerebrais. Em condição

inflamatória, ou mesmo fisiológica algumas proteínas podem ser absorvidas do espaço

extracelular, por um processo de internalização celular, na tentativa de restaurar a

homeostase do ambiente extracelular, ou mesmo para fins de sinalização no caso da

endocitose mediada por receptor (Megias et al. 2000, Gould & Lippincott-Schwartz

2009). Entretanto, se isso ocorre com a proteína S100B ainda precisa ser estudado.

1.2.3. Mecanismos de internalização

Várias vias de internalização foram descritas em células eucarióticas, entre elas o

processo de fagocitose, o qual medeia à captação de partículas maiores, enquanto que a

pinocitose capta partículas no fluído. Estes dois processos dependem de actina, a qual

induz grandes mudanças de remodelamento na membrana plasmática, resultando em

grandes vesículas intracelulares (Mayor & Pagano 2007). Partículas menores podem ser

20
internalizadas via endocitose mediada por clatrina e endocitose mediada por caveolina,

as quais podem ser constitutivas ou desencadeadas pelo processo mediado por receptor

(Gruenberg & van der Goot 2006). As duas vias dependem de uma diversidade de

proteínas adaptadoras que atuam no recrutamento e seleção da carga a ser endocitada e

também na formação da curvatura de membrana. A dinamina é uma proteína GTPase

que atua nas duas vias tendo papel fundamental na cisão da vesícula com a membrana

plasmática. Além disso, outra via de endocitose independente de clatrina e caveolina são

conhecidas, como a ativada por ARF (fator de ribosilação ADP), porém são vias menos

caracterizadas (Conner & Schmid 2003, El-Sayed & Harashima 2013, Mayor & Pagano

2007). Todos estes tipos de endocitose diferem na cinética de formação, maquinaria

molecular associada e destino de carga.

Após a internalização, a maior parte da carga é encaminhada para a via endocítica,

formando os endossomos recentes (ER), que representam o ponto chave de destino para

várias proteínas (Fig 3). As moléculas captadas neste processo podem ser reconduzidas

de volta a membrana, nos chamados endossomos de reciclagem; encaminhadas para a

via Retículo Endoplasmático-Golgi; ou ainda conduzidas para a via de degradação em

lisossomos. A mudança do endossomo recente para o endossomo tardio (ET) se dá

através de mudanças de proteínas e lipídeos da membrana e a composição do lúmen da

vesícula. As proteínas EEA1 (early endosomal antigen-1) e LAMP1 (lysosomal

associated membrane protein-1) são classicamente usadas como marcadores de ER e

ET, respectivamente. A enzima V-ATPase é responsável por manter o interior do ER e

ET ácidos (pH 6,2 e 5,0 - 5,5 respectivamente). Curiosamente, essa acidificação parece

controlar a função dos endossomos, como a ligação de proteínas receptoras, atividade de

enzimas lisossomais e transportadoras. Ainda, nas regiões de formação dos ER, as

vesículas podem fusionar-se, formando os corpos multivesiculares, os quais apresentam

21
estrutura mais homogênea e, ocasionalmente, podem fusionar-se com os ET, ou ainda

serem reciclados de volta para a membrana plasmática, liberando os chamados

exossomos os quais tem importante papel na comunicação intercelular (Basso &

Bonetto 2016). Os ET também representam o ponto chave para o destino de proteínas,

as quais podem ser degradadas nos lisossomos; fusionar-se com a membrana

plasmática, liberando seu conteúdo interno; ou ainda interagirem com a via de

autofagia, degradando componentes citosólicos e organelas (Scott et al. 2014, Gould &

Lippincott-Schwartz 2009). Interessantemente, mostrou-se que a S100B citoplasmática

está presente em vesículas endocíticas em resposta a internalização de RAGE em

células de Schwann (Perrone et al., 2008). No entanto, a origem e as características das

vesículas positivas a S100B ainda não foram estudadas com precisão.

Fig 3. Representação esquemática da via endolisossomal e marcadores específicos. Modificado de

(Rajendran et al. 2010).
1.3. Glutamina Sintetase

22
 Além da S100B, GS é amplamente usada como marcadora de astrócitos, uma vez

que está altamente expressa neste tipo celular. Apesar disso, ela não é exclusiva de

astrócitos no SNC, sendo encontrada em outros tipos celulares, como neurônios e

oligodendrócitos, porém em baixas quantidades (Cammer, 1990, Bernstein et al., 2014).

Além de ser altamente expressa no cérebro, a GS está presente na maioria dos tecidos

periféricos em mamíferos, porém em maiores quantidades no fígado, rim e músculo

(Meister, 1985, Wang et al., 1996). Esta enzima possui importante função no

metabolismo do nitrogênio não só em animais, mas também em plantas e bactérias,

sendo evolutivamente bem conservada (Pesole et al. 1991, Kumada et al. 1993). A

atividade desta enzima é a única via conhecida para a produção de glutamina a partir de

glutamato e amônia. A glutamina é o aminoácido mais abundante em mamíferos e é

indispensável para diversas funções do organismo, sendo precursora para a síntese de

proteínas, glicose, purinas e pirimidinas. Este aminoácido também serve como doador e

coletor de nitrogênio, como transportador de nitrogênio entre os órgãos, assim como na

regulação da gliconeogênese hepática e renal (Chan et al. 2016).

No cérebro, a GS desempenha um papel essencial no ciclo glutamina-glutamato. O

glutamato liberado após a neurotransmissão é rapidamente removido da fenda sináptica

pelos transportadores de alta afinidade nos astrócitos (EAAT1 e EAAT2). Dentro dos

astrócitos, o glutamato é convertido à glutamina pela atividade da GS, logo, a glutamina

produzida será reenviada aos neurônios para uma nova sinapse. Esta reação, além de

evitar a excitotoxicidade glutamatérgica, auxilia na homeostase dos níveis tóxicos de

amônia, uma vez que esta reação liga o íon livre de amônia à estrutura do glutamato

(Cooper 2012, McKenna 2007). Ainda, a glutamina produzida a partir da GS também é

precursora da síntese de glutamato e GABA (Holten & Gundersen 2008).

23
 A avaliação da atividade da GS é muito importante para compreender as condições

fisiológicas e patológicas no tecido cerebral. Sabe-se que a redução da sua atividade em

astrócitos pode limitar a depuração de glutamato pelos EAATs ou mesmo prejudicar a

depuração de amônia levando ao comprometimento neurológico (Trabelsi et al. 2017).

Por este motivo a GS tem sido proposta como um marcador de dano cerebral. De fato, a

sua expressão ou atividade está comprometida em várias doenças neurodegenerativas,

tais como a encefalopatia hepática, doença de Alzheimer, epilepsia e lesão cerebral

traumática (Rose et al. 2013, Jayakumar & Norenberg 2016). Além disso, foi visto no

cérebro de ratos que a atividade da GS é sensível a alterações metabólicas periféricas

induzidas por restrição calórica (Ribeiro et al. 2009) ou exercício em esteira (Bernardi

et al. 2013).

Fisiologicamente a GS possui a seguinte reação:

(1) glutamato + NH4++ Mg2+ + ATP → glutamina + ADP + Pi

São conhecidos três tipos de genes para GS: GSI e III detectados principalmente

em bactérias, e GSII presente em células eucarióticas e algumas bactérias. Foi descrito

uma reação catalítica semelhante para os genes GSI e GSII, em que ligação do ATP à

enzima favorece a ligação com o glutamato (Wang et al. 1996). O fosfato produzido

pela clivagem do ATP permanece ligado à enzima, alterando a conformação da mesma

e, portanto, formando o sítio de ligação da amônia, a qual se liga ao complexo γ-

glutamil fosfato para produzir glutamina (Meister 1968, Liaw et al. 1995). A metionina

sulfoxamina (MSO) é um inibidor irreversível da enzima, sendo fosforilado na presença

de ATP e interagindo com o sítio ativo da enzima (Meister 1985).

Dois tipos de metodologias principais são utilizadas para determinar a atividade

da GS: ensaios radiométricos e colorimétricos. O primeiro tipo de ensaio tem a

vantagem de ser bastante sensível, porém, é de difícil manipulação, uma vez que utiliza

24
compostos radioativos, além de ser um ensaio mais custoso em comparação com

ensaios colorimétricos (Minet et al. 1997). Já nos ensaios colorimétricos, são medidas

duas atividades diferentes da GS: uma atividade sintetase e uma transferase, que pode

ocorrer em diferentes locais ativos da enzima (Meister 1985). Ambas as reações

produzem como produto final o γ-glutamil-hidroxamato, o qual quando em contato com

cloreto férrico produz uma cor amarelada característica. Em ambas as reações é

utilizada a hidroxilamina, ao invés do íon amônia, uma vez que é mais estável para a

reação in vitro. A atividade sintetase utiliza glutamato como substrato, como se segue:

(2) glutamato + NH2OH + Mg2+ + ATP → γ-glutamil-hidroxamato

Diferentemente, a atividade transferase utiliza glutamina como um substrato:

(3) glutamina + NH2OH + Mg2+ + ADP → γ-glutamil-hidroxamato

A atividade transferase e principalmente a sintetase foram bem caracterizadas por

Meister e colaboradores (Meister 1985). É importante ressaltar que as duas atividades

da enzima (Eq. 2 e 3) são encontradas no mesmo isolado de proteínas de tecido cerebral

altamente purificado e, respondem de forma idêntica ao mesmo tratamento. Logo,

considera-se que ambas as reações refletem a atividade da mesma enzima (Meister

1985, Juurlink 1982), apesar de que alguns trabalhos contestem isso (Boksha et al.

2000, Herzfeld 1973). Contudo, foi relatado que a reação transferase tem menos

interferentes para avaliação in vitro do que a reação sintetase. Isso se deve ao fato que a

reação de sintetase (Eq. 2) usa ATP como substrato, sendo facilmente hidrolisado pela

ATPase presente no homogeneizado de tecidos (Stadtman et al. 1968, Dennis et al.

1980). Além disso, o ADP produzido na Eq. 2 pode inibir a atividade da enzima,

fazendo com que a reação da transferase seja mais eficiente do que a sintetase

(Yamamoto et al. 1987). De fato, a reação transferase forma o produto mais

rapidamente, sendo cerca de 10 vezes mais rápida, avaliado em cérebro de ovelha

25
(Ehrenfeld et al. 1963, Ronzio et al. 1969). Apesar de ser comumente aplicado, o ensaio

para medir a reação transferase da GS foi menos padronizado do que a reação sintetase.

Ensaios para atividade da glutamil-transferase mostraram-se precisos e confiáveis no

tecido muscular (Minet et al. 1997) e nas bactérias (Ehrenfeld et al. 1963), porém, foi

pouco padronizado para o tecido cerebral. Foi sugerido que a regulação da atividade da

GS varia em músculo ou fígado, bem como em diferentes regiões cerebrais (Iqbal &

Ottaway 1970, Böttcher et al. 2003). De acordo com a nossa pesquisa, há apenas um

trabalho na literatura que mostra a padronização da atividade transferase da GS em

estrutura cerebral, porém apresenta diferenças na concentração de substratos e usa

método cromatográfico para a detecção do produto (Seiler et al. 1990). Desta forma,

torna-se necessário a caracterização da atividade da glutamil-transferase da GS em

diferentes tecidos cerebrais, assim como em cultura de astrócitos (Seiler et al. 1990,

Yamamoto et al. 1987). Esta análise permitiria o melhor uso da atividade da enzima

para avaliação em condições fisiológicas e patológicas do SNC.

1.4. Modelos de astrócitos

Ao longo dos anos de estudo foi possível provar que os astrócitos eram, ao contrário

do que se pensava, células altamente ativas, envolvidas em uma diversidade de funções,

participando desde a manutenção do ambiente extracelular, até na formação e regulação

de sinapses. A utilização da cultura primária de astrócitos como instrumento para estudo

deste tipo celular facilitou o progresso alcançado no conhecimento de propriedades e

funções que esta célula adota (Lange et al. 2012). Graças a este modelo foi possível

estudar, de forma sofisticada, características mecânicas e bioquímicas que seriam de

difícil acesso in vivo. O estudo em um sistema isolado permitiu verificar, por exemplo,

as características da sinalização por cálcio, aspectos eletrofisiológicos da célula, a

26
liberação e absorção de glio-moléculas, alterações morfológicas, entre outros fatores.

Além disso, este sistema também contribuiu para a compreensão do papel dos astrócitos

em doenças neurodegerativas como as doenças de Alzheimer e Parkinson,

caracterizando assim o envolvimento dos astrócitos com a causa e/ou progressão dessas

patologias, bem como a possibilidade de serem alvos de novos medicamentos

(Khandelwal et al. 2011, Liu et al. 2012).

A técnica de cultura primária de astrócitos é amplamente utilizada como modelo

para o estudo dos mecanismos celulares e, inclusive verificou-se recentemente que a

expressão de genes em cultura são similares ao in vivo (Hertz et al. 2016). Esse tipo de

cultura vem sendo utilizado como modelo de neuroinflamação (Guerra et al. 2011), de

intoxicação por amônia (Leite et al. 2006), bem como para o estudo da secreção de

diferentes compostos, como a proteína S100B (Nardin et al. 2007) , o ATP (Coco et al.

2003) e o glutamato (Bezzi & Volterra 2001). Apesar de amplamente aceito na

literatura, o modelo de cultura primária de astrócitos apresenta algumas desvantagens,

tais como o alto custo financeiro para a realização da técnica, a necessidade de mão de

obra altamente qualificada, por ser um processo demorado e, acima de tudo, a

heterogeneidade dessas células em cultura, o que aumenta a variabilidade dos resultados

obtidos entre diferentes grupos de pesquisa.

Na busca de alternativas que minimizassem essas desvantagens, as linhagens

celulares foram desenvolvidas. A linhagem de glioma C6 (ATCC CCL-10) foi

desenvolvida a partir do isolamento de células de um glioma de rato e estão entre as

linhagens mais utilizadas para o estudo de células astrogliais (Baber & Haghighat 2010,

Benda et al. 1968). Estas células são utilizadas como linhagem celular semelhante à

astrócitos em passagens elevadas (mais de cem) devido ao aumento da expressão de

alguns marcadores astróciticos como GFAP, S100B, GS e transportadores de glutamato

27
(Parker et al. 1980, Raju et al. 1980, Tabuchi et al. 1982, Haghighat 2005, Baber &

Haghighat 2010). Outro modelo de estudo para este tipo celular é o desenvolvimento de

astrócitos imortalizados, uma técnica já estabelecida, mas pouco utilizada na literatura

(Frisa & Jacobberger 2002, Geller & Dubois-Dalcq 1988). Esse tipo celular é

desenvolvido a partir de uma cultura primária de astrócitos os quais, são transfectados

com o plasmídeo pSV3-neo contendo o gene para o grande antígeno T do SV40, o qual

afeta a atividade de supressores de tumor como, por exemplo, o retinoblastoma e a p53

(Ahuja et al. 2005). Esta alteração resulta, portanto, em células mais proliferativas.

Após a seleção de uma única colônia essas células são isoladas e podem ser congeladas.

O uso de linhagens celulares apresenta um custo menor, quando comparado à

cultura primária de células; uma maior praticidade, visto que essas células podem ser

armazenadas congeladas e seu emprego não requer o uso de animais, tornando-se uma

alternativa ao uso destes. Além disso, tanto a linhagem C6 quanto os astrócitos

imortalizados possuem a vantagem de serem células mais homogêneas, visto que elas

descendem do mesmo clone, com a diferença principal que as C6 originam-se de células

tumorais e os astrócitos imortais de uma célula normal de astrócitos. Essa

homogeneidade entre as células facilita a comparação de resultados entre diferentes

laboratórios. Por outro lado, recentemente a literatura tem questionado o uso de

linhagens celulares. Uma vez que essas células são células altamente proliferativas e

apresentam algumas características diferentes das células primárias, o que pode resultar

em comportamentos diferentes em resposta a estímulos (Leite et al. 2009, Haghighat &

McCandless 1997b, Haghighat & McCandless 1997a).

Sabe-se, por exemplo, que as células da linhagem C6 possuem morfologia diferente

de astrócitos primários (Zhou et al. 2008) e que sua taxa de proliferação é muito mais

alta, o que pode ser explicado parcialmente devido à baixa expressão de conexinas,

28
sendo usadas como controle negativo nos ensaios de comunicação por junção gap (Leite

et al. 2009). Estudos anteriores mostram que as junções gap são importantes na

regulação da proliferação celular e estão envolvidas com muitas de suas funções

(Tabernero et al. 2006). Dentre as respostas mediadas por junções comunicantes

podemos citar a formação de ondas de cálcio (Bennett et al. 2003, Scemes & Giaume

2006); a resposta à atividade sináptica, fornecendo suporte energético aos neurônios

(Rouach et al. 2002, Tabernero et al. 2006) e a regulação dos mecanismos de morte

celular (Nodin et al. 2005). Todas essas funções podem estar alteradas nesse tipo celular

e, consequentemente, ele não se torna um modelo adequado para esse tipo de estudo.

Da mesma forma, diversas pesquisas mostram que astrócitos imortalizados

apresentam níveis detectáveis de proteínas características de astrócitos, como GFAP e

S100B, mas na sua maioria em níveis consideravelmente menores do que astrócitos de

cultura primária (Frisa & Jacobberger 2002, Furihata et al. 2016, Morikawa et al. 2001).

Pouco é discutido sobre a funcionalidade das moléculas detectadas. Mostrou-se que a

captação de leucina e arginina ocorre em menor escala do que em comparação com

células de cultura primária (Lin et al. 1997) e, em alguns trabalhos mostrou-se que as

células imortalizadas não foram capazes de responder a estímulos como os astrócitos de

cultura primárias (Geller & Dubois-Dalcq 1988, Morikawa et al. 2001).

Portanto, apesar destas linhagens serem mais homogêneas e apresentarem

algumas características similares aos astrócitos primários, existe uma carência de

estudos comparativos integrando os diferentes modelos de astrócitos (cultura primária,

células imortalizadas e linhagem C6), principalmente no que diz respeito as

características funcionais destas células. Tendo em vista que o estudo de células

astrogliais em cultura é de extrema importância para o avanço das pesquisas em

sinalização celular, doenças neurodegenerativas, bem como no desenvolvimento de

29
novas estratégias terapêuticas, se torna fundamental a realização de um estudo

comparativo entre os diferentes modelos de estudo no que se refere à caracterização

morfológica e funcional dessas células. Isso possibilitará a escolha de modelos mais

adequados para o objetivo de trabalhos futuros, otimizando as pesquisas nessa área do

conhecimento.

2. Justificativa

Tendo em vista o crescente interesse na diversidade funcional dos astrócitos, a

importância do estudo destas células em um sistema isolado para a compreensão de suas

funções e ainda, a divergência de resultados encontrados na literatura nos três principais

modelos experimentais de astrócitos, torna-se importante a realização de um estudo

comparativo no que diz respeito a aspectos moleculares e funcionais da CP, AI e C6.

Além disso, considerando o papel central dos astrócitos na regulação e manutenção do

ambiente extracelular e os efeitos de sinalização e toxicidade da proteína S100B no

espaço extracelular, coloca-se em questão a capacidade dos astrócitos de internalizar a

proteína S100B e quais seriam os destinos intracelulares desta proteína. Por fim, a

importância da avaliação da atividade da GS em condições fisiológicas e patológicas, e

a carência de estudos na padronização da atividade glutamil transferase da enzima em

cultura de astrócitos, assim como em outras regiões cerebrais, torna-se importante

caracterizar um ensaio para GS que seja confiável, específico e de alta aplicabilidade.

30
Objetivos

2.1. Objetivo Geral

Comparar e caracterizar o perfil molecular e funcional da CP, AI e C6, de forma a

aprofundar o estudo do papel dos astrócitos na regulação dos níveis extracelulares de

S100B e os possíveis mecanismos de internalização desta proteína.

2.2. Objetivos Específicos

2.2.1. Avaliação comparativa entre CP, AI e C6 em relação às diferenças

morfológicas; proteínas marcadoras; metabolismo glutamatérgico e

energético e comunicação por junção gap, em condições basais e frente a

estímulos específicos;

2.2.2. Avaliar a captação de S100B exógena em alta concentração por

astrócitos;

2.2.3. Estudar o envolvimento da via endolisossomal no mecanismo de

internalização da proteína S100B em astrócitos, caracterizando as vesículas

de internalização e sua dinâmica intracelular;

2.2.4. Padronizar um ensaio para a medida da atividade da GS, utilizando sua

atividade transferase em cultura de astrócitos e linhagem C6, bem como em

diferentes regiões cerebrais de ratos, que seja preciso, específico e de alta

aplicabilidade.

31
3. Resultados

3.1. Capítulo I

Molecular and functional characterization of primary culture of astrocytes,

immortalized astrocytes and C6 glioma cells.

Artigo em preparação

32
Molecular and functional characterization of primary culture of astrocytes,
immortalized astrocytes and C6 glioma cells.

Fabiana Gallanda, Marina Seadya, Jessica Tadaya, Soraya Smailib, Carlos Alberto
Gonçalvesa, Marina Concli Leitea

a
Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.
b
Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil

e-mail adress:
Fabiana Galland – [email protected]
Marina Seady – [email protected]
Jéssica Taday – [email protected]
Carlos-Alberto Gonçalves – [email protected]
Marina Concli Leite - [email protected]

Corresponding author: Marina Concli Leite

Depto Bioquímica, ICBS, UFRGS
Ramiro Barcelos, 2600-anexo
Porto Alegre, RS, Brazil
90035-003
Fax: 55-51-3308 5565
E-mail: [email protected]

33
Abstract

Understanding the role of astrocyte functions in central nervous system is in continuous

progress. Astrocyte culture is a potent instrument to study these cells in isolated system,
allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell, in
physiologic and pathologic state. However, the isolation of primary astrocytes culture
(PC) is a laborious process, is time consuming, and costly. An alternative to this model
is the use of cell lines, such as immortalized astrocyte cell line (IA) or C6 glioma cells
(C6) in high passages, which present some proteins characteristic of astrocytes. These
lineages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster
and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly
proliferative features and some different characteristics in compare to PC, which put
into question the validity of them as an astrocyte model. The objective of this work was
to show an integrative characterization and comparative analysis of PC, IA and C6
regarding molecular markers and glutamate and glucose metabolism and cell
communication. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) presented
differentiated astrocytic markers (eg. GFAP, S100B, AQP4 and ALDH1L1), although
expressing less quantities then PC. Similarly, the functionality of glutamatergic and
energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be
reduced in lineages cells. Our IA cell line did not reveal a reproducible model of classic
astrocytic functions, since it did not respond to most stimuli tested, in opposite to C6
cells that presented a similar response to PC under the same stimulus. The high
proliferative rate of lineage cells may explain the reduction of astrocytic differentiated
characteristics discussed in this work. Here we provide an integrative and functional
characterization of three astrocytic models, allowing the selection of a suitable model to
the study of astrocytes, optimizing the research in the area of knowledge.

34
Introduction

Astrocytes represent a highly heterogeneous neuroglia cell responsible for a variety of

complex and important functions in Central Nervous System (CNS). These cells have a
strategic position, covering most of capillary with their endfeet, and also in contact with
axon and synapses of neuronal cells (Kacem et al., 1998; Sofroniew and Vinters, 2010).
Rather than supportive and passive cells, astrocyte can be activated in response to
synaptic activity acting on potassium buffering or regulating fluid homeostasis through
kir4.1 channel and aquaporin-4, respectively (Olsen and Sontheimer, 2008;
Papadopoulos and Verkman, 2013). Furthermore, astrocytes are enriched with receptor
and transporters that regulated synaptic activity. One classic and important function is
the capacity of these cells to clearance neurotransmitters, such as glutamate forming the
glutamine-glutamate cycle. Once taken up, glutamate is converted into glutamine
through glutamine synthetase activity (GS), enzyme highly expressed in astrocytes.
Then, glutamine returns to neurons, where it will be restored back to glutamate for the
formation of new synapses (McKenna, 2007). The concept called “synapse tripartite”
represent an integrative system between neurons and glia, giving to astrocytes a
protagonist role, rather than merely supporting of synapses (Kettenmann and
Verkhratsky, 2008). Furthermore, astrocytes position ensures these cells to be the main
energy supplier in brain, up taking glucose from blood vessels and furnishing neurons
with energy metabolism (Bouzier-Sore and Pellerin, 2013). Gap junctions have an
important function in the transport of energy substrates and also in cell communication
through calcium signaling (Perea and Araque, 2005; Tabernero et al., 2006).

Many important advances in the knowledge of astrocytes were facilitated thanks to the
isolation of this cells in culture (Lange et al., 2012). Primary astrocytes cultures allowed
the study of these cells in basal and neurotoxic condition. Although this model may
represent some limitation for being an isolated system, recently, it was demonstrated
that they share similar characteristic of genes when compared with freshly astrocytes
brain (Hertz et al., 2017). Astrocyte culture is a potent instrument to study in a
sophisticated form mechanistic features that it would be difficult to achieve in vivo, as
electrophysiology, calcium signaling, gliosignaling release and uptake, morphologic and
biochemical changes which take place specific in these cells under different insult. This
model may also help in the development of new target drugs in neurodegenerative
disease.

35
Even though these advantages, the isolation of primary astrocytes culture is a laborious
process, is time consuming, present a high maintenance cost, and generate variable
results as are highly heterogeneous cells, making difficult to compare results among
different research groups. An alternative to this model is the use of cell lines, such as C6
(ATCC CCL-10). This glioma cell line is the most commonly used model, isolated
from rat brain tumor (Benda et al., 1968). These cells are used as astrocyte-like cell line
in high passages (over a hundred) due to increased expression of some astrocytes
marker, as GFAP, S100B, GS and glutamate transporters (Baber and Haghighat, 2010;
Haghighat, 2005; Parker et al., 1980; Raju et al., 1980; Tabuchi et al., 1982). Another
model to study astrocytes in culture is immortalized astrocytes, which are genetically
transformed cells with higher proliferative rate (Frisa and Jacobberger, 2002; Furihata et
al., 2016; Morikawa et al., 2001). This linage has the advantage to be originated from a
primary astrocyte culture and not from a tumor. This both type of cell lines provide
more homogeneous features than primary astrocytes cell culture, as are originated from
clones. Furthermore, are easily to manipulate once it can be stocked and thawed. The
high proliferative rate of this cell lines allows faster manipulation and also are cheaper
to maintain.

Despite this facilities, the use of cell lines have been questioned in the literature due to
the glioma features and some different characteristics in compare to primary cells,
which put into question the validity of this cell line models (Haghighat and
McCandless, 1997a, b; Leite et al., 2009; Nardin et al., 2007; Tabernero et al., 2006).
There is no data in literature that show a complete and integrative characterization of
primary astrocytes culture (CP) in compare to linage models, such as immortalized
astrocytes (IA) and C6 glioma cell line (C6). Here we show a comparative analysis of
these three models regarding morphological and functional features. We show
differences in cell morphology and protein expression characteristics of astrocytes, as
GFAP, S100B, aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1 (ALDH1L1), aquaporin-
4 (AQP4) and potassium channel-4 (Kir4.1). Furthermore, glutamate metabolism was
characterized, evaluating glutamate uptake and its transporters (EAAT1 and EAAT2),
glutamine synthetase activity, and GSH content. Glucose metabolism was also assessed
using H3-glucose uptake and it transport content (GLUT1). We also evaluated the
communication of these cells by gap junction checking Cx43 expression and Lucifer
yellow communication. In addition, we show the responsiveness of these models under

36
toxic stimulus evaluating astrocytic activation through GFAP content and S100B
secretion, glutamate and glucose metabolism and inflammatory cytokines. This work
contributes to the evaluation of astrocytes culture as an experimental model system
allowing the selection of a suitable model to the study of astrocytes, optimizing the
research in the area of knowledge.

Materials and Methods

Materials

Poly-L-lysine, methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT), neutral red,

glutathione standard, phthaldialdehyde and lipopolysaccharides from Escherichia coli
(LPS) 055:B5, L-glutamate, o-phenylenediamine (OPD), γ-glutamylhydroxamate acid,
N-methyl-d-glucamine and aminoguanidine hemisulfate salt (AG) were purchased from
Sigma [St. Louis, USA]. Fetal calf serum (FCS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium
(DMEM) and other materials for cell culture were purchased from Gibco [Carlsbad,
USA]. l-[2,3-3H] glutamate was purchased from Amersham International (United
Kingdom) and deoxy-d-glucose, 2-[3H(G)] (10 Ci/mmol) was purchased from
American Radiolabeled Chemicals, Inc. (Saint Louis, MO, USA). Lucifer Yellow was
purchase from Invitrogen, Life Technology Corporation, USA. Antibodies obtained
from Sigma [St. Louis, USA] were: anti-S100B (SH-B1) and anti-GFAP. Antibodies
obtained from Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz,USA): Polyclonal anti-RAGE
(N16), Anti-Glutamine Synthetase, polyclonal anti-Kir4.1, anti-BDNF, anti-GLUT1 and
anti-goat IgG-R. Antibodies obtained from Chemicon (Temecula,USA): Polyclonal
anti-AQP-4 antibody, and anti-Conexin-43. Monoclonal anti-Aldehyde dehydrogenase
family 1 member L1 was from Neuromab. Polyclonal anti-S100B and anti-rabbit
peroxidase were purchased from DAKO [São Paulo, Brazil] and GE [Little Chalfont,
United Kingdom], respectively. Antibody anti-EAAT1 and EAAT2 was purchased form
Abcam, and anti-actin from Merck Millipore Corporation.

Astrocytes primary cell culture (PC)

Primary astrocyte cultures from Wistar rats were prepared as previously described by
(Gottfried et al., 2002). Procedures were carried out in accordance with the NIH Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals and were approved by the local authorities.

37
Briefly, cerebral cortices of newborn Wistar rats (1-2 days old) were removed and
mechanically dissociated in Ca2+- and Mg2+-free balanced salt solution, pH 7.4,
containing (in mM): 137 NaCl; 5.36 KCl; 0.27 Na2HPO4; 1.1 KH2PO4 and 6.1 glucose.
The cortices were cleaned of meninges and mechanically dissociated by sequential
passage through a Pasteur pipette. After centrifugation at 1400 RPM for 5 min the pellet
was resuspended in DMEM (pH 7.6) supplemented with 8.39 mM HEPES, 23.8 mM
NaHCO3, 0.1% amphotericin B, 0.032% gentamicin and 10% fetal calf serum (FCS).
Cells were pated into 12 or 24-well- plates pre-treated with poly-L-lysine. Cultures were
maintained in DMEM containing 10% FCS in 5% CO2/95% air at 37°C. Medium was
changed every 3-4 days. Cells were allowed to grow to confluence, and used at 21 days
in vitro (DIV).

C6 Glioma cell culture (C6)

The C6 glioma cell line was obtained from the American Type Culture Collection
(Rockville, MD). Late passage cells (i.e., after at least 100 passages) were seeded in 25
cm2 flasks and cultured in DMEM 10% FCS (same medium described for astrocytes
primary culture). Exponentially growing cells were detached from the culture flasks
using 0.05% trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and seeded in 12 or 24-
well plates. Cells were allowed to grow to confluence, and used in 3 DIV.

Culture of immortalized astrocytes (IA)

Briefly, astrocyte primary culture with 11 DIV was transfected with a mixture of 3 µg
of pSV3-neo plasmid and 10 µg of lipofectAMINE (GIBCO) during 5 h. As a control,
cells were also transfected with GFP plasmid (pcDNA3 vector). Four days after
transfection, the antibody G418 was added for the selection of neomycin-resistant
colonies. The medium was changed every 3-4 days and the concentration of G418 was
gradually increased from 200 to 800 µg/mL. After 3 weeks, isolated colonies were
selected and seeded in 24-well plates and gradually expended until 75cm2 flasks. The
transfected cells were maintained in DMEM with 10% FCS, 1%
peniciline/streptomicine and 200 µg/mL of G418. Immortalized astrocytes of 10 to 30
passages were used for the experiments.

Immunocytochemistry

38
Immunocytochemistry was performed as described previously by (Lasič et al., 2016)
with some modification. Briefly, cell cultures were fixed with 4% paraformaldehyde/4%
sucrose for 10 min and permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS for 20 min at
room temperature. After blocking 1 h with 2% albumin bovine, the cells were incubated
overnight with anti-GFAP, anti-S100B, anti-actin. For primary astrocytes culture
antibodies were incubated at concentration of 1:1000 and for immortalized astrocytes
(IA) and C6 glioma cells antibodies were incubated at 1:250. After 3 washing steps with
PBS, specific secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (green staining) or
568 (red staining) was incubated for 1 h at room temperature. For all the
immunostaining-negative controls, the reactions were performed by omitting the
primary antibody. No reactivity was observed when the primary antibody was excluded.
Cell nuclei were stained with 0.2 mg/ml of 4’,6’-diamidino-2 phenylindole (DAPI). The
cells were visualized with a Nikon inverted microscope and the images were transferred
to a computer with a digital camera (Sound Vision Inc.).

S100B measurement

S100B was measured by ELISA, as previously described by (Leite et al., 2008). Briefly,
50 μl of sample (previously homogenized and diluted) plus 50 μl of Tris buffer 50 mM
were incubated for 2 h on a microtiter plate previously coated overnight with
monoclonal anti-S100B and blocked for 1 h with 2% albumin from chicken egg.
Polyclonal anti-S100 was incubated for 30 min and then peroxidase-conjugated anti-
rabbit antibody was added for a further 30 min. The microtiter plate was rinsed tree
times between each step with a wash solution. O-phenylenediamine was added for 30
min and the colorimetric reaction was determined at 492 nm. The standard S100B curve
ranged from 0.002 to 1 ng/ml.

GFAP measurement

The ELISA for GFAP was carried out, as previously described by (Tramontina et al.,
2007). Homogenates of cell culture (100 µl) previously diluted in TBS or standard
human GFAP (from Calbiochem) ranging from 0.1 to 5 ng were incubated in microtiter
plates for 24 h at 4°C. After blocking with 5% M-TBS for 2 h at room temperature, it
was incubated a rabbit polyclonal anti-GFAP (dilution in 0.5% M-TBS) for 1 h. Then,
secondary antibody conjugated with peroxidase it was incubated for 1 h at room
temperature. The microtiter plate was rinsed tree times between each step with a wash

39
solution. O-phenylenediamine was added for 30min and the colorimetric reaction was
determined at 492 nm.

Glutamine Synthetase activity

The enzymatic activity of glutamine synthetase was determined using the procedures
described previously by (Minet et al., 1997), with modifications. Briefly, homogenized
sample diluted in 50 mM imidazole were incubated with (mM): (50 imidazole, 50
hydroxylamine, 100 L-glutamine, 25 sodium arsenate dibasic heptahydrate, 0.2 ADP, 2
manganese chloride, pH 6.2) and incubated for 15 min at 37°C. The reaction was
stopped by the addition of 0.2 ml of 0.37 M FeCl3, 200 mM trichloroacetic acid, and
0.67 M HCl. After centrifugation, the absorbance of the supernatant was measured at
540 nm and compared to the absorbance generated by standard quantities of γ-
glutamylhydroxamate acid (Sigma) diluted in the same solution than the samples.
Glutamine synthetase activity was expressed as µmol/h/mg prot.

GSH

Glutathione content was determined as previously described (Browne and Armstrong,

1998). This assay detects only the reduced glutathione content. Briefly, sample were
homogenized in sodium phosphate buffer (0.1 M, pH 8.0) containing 5 mM EDTA and
protein was precipitated with 1.7% meta-phosphoric acid. Supernatant was assayed with
o-phthaldialdehyde (1 mg/mL methanol) at room temperature for 15 min. Fluorescence
was measured using excitation and emission wavelengths of 350 and 420 nm,
respectively. A calibration curve was employed using standard GSH solutions (0-500
μM).

Glutamate uptake assay

Glutamate uptake was measured, as previously described by (Gottfried et al., 2002) with
some modifications (Thomazi et al., 2004). Cell culture were incubated at 37 °C in
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing (in mM): 137 NaCl, 5.36 KCl, 1.26
CaCl2, 0.41 MgSO4, 0.49 MgCl2, 0.63 Na2HPO4·7 H2O, 0.44 KH2PO4, 4.17 NaHCO3
and 5.6 glucose, pH 7.4. The assay was started by the addition of 0.1 mM l-glutamate
and 0.66 μCi/mL L-[2,3-3H] glutamate. Incubation was stopped after 7 min for PC and
10 min for IA and C6 cells, by removing the medium and rinsing the cells three times
with ice cold HBSS. The slices were then lysed in a 0.5 M NaOH solution. Sodium-

40
independent uptake was determined using N-methyl-D-glucamine instead of NaCl.
Sodium dependent glutamate uptake was obtained by subtracting the non-specific
uptake from the total uptake to obtain the specific uptake. Radioactivity was measured
in a scintillation counter. Results were expressed as nmol/mg protein/min.

Glucose uptake assay

Glucose uptake was measured as previously described (Pellerin and Magistretti, 1994),
with modifications. Cell cultures were rinsed in with HBSS. Subsequently, cells were
incubated at 35 °C in HBSS (described above). The assay was initiated by the addition
of 0.1 μCi/ well deoxy-d-glucose, 2-[3H(G)]. The incubation was stopped after 15 min
by removing the medium and rinsing the slices three times with ice-cold HBSS. The
slices were then lysed in a solution containing 0.5 M NaOH. Glucose uptake was
calculated by subtracting the non-specific uptake, obtained by the glucose transporter
inhibitor, cytochalasin B (10 μM), from the total uptake in order to obtain the specific
uptake. Radioactivity was measured using a scintillation counter. Results were
expressed as nmol/mg protein/min.

Western blot analyses

Cell culture were homogenized in sample buffer (0.0625 M Tris–HCl, pH 6.8, 2% (w/v)
SDS, 5% (w/v) b-mercaptoethanol, 10% (v/v) glycerol, 0.002% (w/v) bromphenol
blue), subsequently boiled and centrifugated. Equal amounts (25 µg) of proteins were
electrophoresed in a 12% (w/v) SDS–polyacrylamide gel. The separated proteins were
blotted onto a nitrocellulose membrane. Membranes were incubated in TBS-T (20
mmol/L Tris–HCl, pH 7.5, 137 mmol/L NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20) containing 2%
(w/v) bovine albumine for 1 h at 4°C. Subsequently, the membranes were incubated
overnight, at 4°C, with the appropriate primary antibodies at concentration (1:5000):
anti-GFAP, anti-vimentin, Anti-GS, anti Kir4.1, anti-AQ-4, anti ALDH1L1, anti-Cx43,
BDNF, EAAT1, EAAT2, anti-Glut-1. Membranes were then rinsed with TBS-T, and
exposed to horseradish peroxidase-linked anti-IgG antibodies for 1 h at 4°C. Equivalent
loading of each sample was confirmed with anti-actin. The chemiluminescence signal
was detected using an ECL kit from Amersham and evaluated in the luminescence
image analyzer (Image Quant LAS4000 from GE). The luminescence signal was
analyzed using ImageJ software.

41
Lucifer Yellow

Scrape loading/dye transfer was carried out as previously described (Leite et al., 2009).
After treatment, the conditioned incubation buffer was removed and saved. The cultures
were quickly and carefully rinsed in Ca+2 -free HBSS to prevent uncoupling of the cells
as a result of high Ca2+ levels. Two parallel scrapes were performed with a scalpel blade
in the Ca+2 free HBSS with 0.1% (w/v) Lucifer yellow at room temperature. Disruption
of the cell membrane allows the dye to permeate the cell and to diffuse to surrounding
cells through GJ channels. The dye was rinsed away with HBSS after 1 min. The
conditioned incubation buffer was reintroduced and cultures were left for 7 min. After
that, cells were viewed with a Nikon inverted microscope and images transferred to a
computer with a digital camera. All images are representative fields from at least three
experiments carried out in triplicate.

Protein determination

Protein content was measured by Lowry’s method, modified by Peterson, using bovine
serum albumin as standard (Peterson, 1977).

Statistical analysis

Parametric data are reported as means ± standard errors and were analyzed by one-way
analysis of variance (ANOVA) followed by Duncan’s test, using SPSS-16.0. Tests are
specified in the legends, with the level of significance set at p < 0.05.

Results

Differences in morphology and molecular markers of astrocytes

Astrocytes basal morphology was evaluated in PC, IA and C6 (Fig 1). To this
comparison it was evaluated actin, GFAP and S100B by immunocytochemistry. As
show in images, PC and IA presented similar polygonal shape with some cell process
and actin label more delimited and with organized filaments. In contrast, C6 glioma
cells presented elongated body and with diffuse actin fibers. Cell morphology was also
evaluated after stimulated condition with forskolin, which is a classic stimulus that
induces morphology changes due to variation on intracellular levels of cyclic AMP
(Frizzo et al., 2004). PC and C6 showed stellated characteristic shape after forskolin

42
treatment noted in all labeled proteins. Nevertheless, PC was able to issue longer and
thin process than C6 cells. Unexpectedly, IA did not respond to forskolin stimulus.

In order to evaluate the maturation of these cells the GFAP/Vimentin ratio was
assessed. All three cell types showed greater levels of GFAP in compare to vimentin,
indicating differentiated cells (Fig 2A). Characteristic proteins markers for astrocytes as
GFAP and S100B ware evaluated, as well as proteins that are abundantly expressed in
this glial cells as ALDH1L1, AQP4 and Kir4.1. As noted in Fig 2 (B-E) GFAP, S100B,
ALDHL1 and AQP4 have reduced intracellular content in the two linage cells,
compared with PC. Interestingly, Kir4.1 showed similar levels in three cells models (Fig
2 F).

Glutamate metabolism in different models of astrocytes

Astrocytes play an essential role in glutamate-glutamine metabolism. Therefore, we

evaluated not only glutamate transporters content but also the functionality of these
transporters by measuring glutamate uptake basal rate. As noted in Fig 3A, glutamate
uptake in PC is much pronounced than IA and C6, and this reduced uptake rate may be
due to low amount of EAAT1 and EAAT2 transporters (Fig 3 B and C). Once uptaked
by astrocytes, glutamate is converted into glutamine, by the activity of glutamine
synthetase. As expected, glutamine synthetase activity and content is reduced in IA and
C6 compared to PC (Fig 3D and E). Interestingly, GSH content, which is the main
antioxidant in astrocytes and its biosynthesis also depends on glutamate content, is
produced in equivalent amount in the three models of astrocytes culture (Fig 3F).

Glucose metabolism in astrocyte linage and astrocytes primary culture

Astrocytes are the main energy supplier in brain, and have the important function to
uptake glucose, stock or distribute to neurons. In the comparison between the three
types of cells, C6 glioma cells uptake glucose in a significantly higher rate than PC and
IA (Fig 4A). Despite this data, PC presented high glucose transporter (GLUT-1) content
in compare to IA and C6 (Fig 4B).

Gap Junction communication

Astrocytes are interconnected by gap junction forming a syncytium between them. This
is an important characteristic which may be essential for many astrocytes function
(Rouach et al., 2002). This communication was evaluated by the analysis of Conexin43

43
content, the most abundantly expressed connexin in astrocytes culture, and by the
transfer of Lucifer Yellow. Connexin 43 is lower expressed and gap junction
communication is reduced in linage cells when compared to PC (Fig 5).

Astrocytes response under the same stimulus

Considering that the three models of astrocyte presented variation in basal protein
profile, we wondered if they would respond different to the same stimulus. We used
stimuli which are already described in the literature to interfere in astrocyte function. As
shown in table 1, LPS treatment induced a decrease in S100B secretion in PC and C6.
The same cells were affected under an oxidative damage induced by hydrogen peroxide,
regarding GS activity and GSH content. In addition, S100B treatment affected glucose
uptake in all cell models. In summary, PC and C6 present similar response under the
same stimulus, in opposite to IA which showed no effect in most stimulus tested.

Discussion

With the advent of primary culture of astrocytes it was possible to explore individual
characteristics of this type of cell in physiologic and toxic states which help to
understand brain functionality. The purpose of this study was to compare primary
astrocyte culture, genetically modify immortalized astrocytes or C6 linage cells
regarding morphological and functional features in basal and stimulated conditions.
Although commonly used, lineage characterizations are sparse, showing isolated
features analysis, and often not compared to a normal astrocyte. A complete and
integrative analysis of each cell in a single study allowed straight comparison, keeping
the same culture conditions such as culture protocol and medium composition.

Morphology and plasticity evaluation

The plasticity capacity of astrocytes may be critical for studying cellular functions,
since it is known that astrocyte emitting process regulate extracellular
microenvironment and interfere in the synaptic activity of neurons (De Pittà et al., 2016;
Ostroff et al., 2014). The capacity of the cell in culture to emit process and respond with
morphological changes to some treatment is a very efficient and used tool for the
evaluation of astrocytes function. In this work, morphology evaluation in basal
condition showed that PC and IA have similar polygonal shape and regular filaments

44
then C6 cells, which presented triangular cell body and irregular network. Accordingly,
a previous work observed differences in actin cytoskeleton structure between C6 and
PC, associated with C6 invasiveness(Zhou et al., 2008). Although, the morphologic
similarity with PC, IA did not respond to forskolin stimuli, which is a classical stimulus
that mobilize intracellular levels of cAMP, indicating restriction of this cells to the
study of cell plasticity. Similarly, in another work, immortalized cell lines did not
change the levels of GFAP expression in response to dibutyryl cAMP, as C6 and PC did
(Geller and Dubois-Dalcq, 1988). In opposite, PC and C6 cell showed high capacity to
change morphology after stimuli, contracting neatly their cell body and emitting long
process. Nevertheless, it was clear in our analysis that PC showed prominent thin and
long process than C6 cell. Interestingly, in another work, primary cell culture loses
process after subcultured, indicating that this procedure may interfere in the morphology
responsiveness of the cell (Passaquin et al., 1994). A similar process may occur in C6
and IA which have many passages. Furthermore, a reduction in astrocyte cell process in
C6 cells may also be explained by less quantities of GFAP, which is known to be
essential to astrocyte hypertrophy (Wilhelmsson et al., 2004).

Expression profile of astrocyte markers

Astrocytes are highly heterogeneous cells and present variation of characteristic and
function depending on cerebral region or specific pathologic context. Nevertheless,
astrocytes share some function similarities and some molecular markers that are used to
distinguish these cells from other glial cells. It is known that during development
GFAP/vimentin ratio increase, which is associated with astrocytic differentiation
(Menet et al., 2001). Here we show that all three models of analyzed cells presented
higher levels of GFAP than vimentin.

Furthermore, in this work we evaluated conventional protein markers and abundantly

expressed on astrocytes, such as GFAP and S100B (Brozzi et al., 2009; Eng, 1985; Van
Eldik and Wainwright, 2003). Both proteins were detected in all three models of
astrocytes cell culture, although in significantly less quantities in IA and C6 cells.
Detected levels of these proteins were previously observed in other works that studied
linage cells, although it was little discussed the comparative levels with PC (Furihata et
al., 2016; Groves et al., 1993; Morikawa et al., 2001; Raju et al., 1980; Tabuchi et al.,
1982). Besides these markers, we also evaluated ALDH1L1 protein which has been
used as a new astroglial marker (Souza et al., 2013; Yang et al., 2011). Although this
45
protein participates in folate metabolism, interfering in cell division and growth
(Krupenko, 2009), in our study we show reduced levels of ALDH1L1 in linage cells in
compare to PC. The same result was seen with AQP4 levels, which is widely expressed
in astrocytes membranes (Papadopoulos and Verkman, 2013). The reduced levels of
important astrocytic protein markers observed in IA and C6 may be explained because
of the high proliferative rate of these cells, which invest less in differentiation profile,
while may express more protein related with proliferation. In opposite, Kir4.1 channel,
which is also glial specific expressed (Seifert et al., 2016), was detected in equally
amount in PC, IA and C6 cells. It was shown that potassium conductance is very low in
gliomas in compare to differentiated cells. However, a reduction in potassium
conductance it was not related with a reduction in expression but to a distinct
localization of potassium channels, which were prominently expressed in nucleus
instead of plasma membrane (Olsen and Sontheimer, 2008). Therefore, the equal
expression observed in IA and C6 in compare PC may not represent the functionality of
potassium channels.

Functional characterization of glutamate metabolism

Astrocytes play an essential role in glutamate metabolism. Any dysfunction in

glutamate transporters or even GS activity may compromise brain functions. In fact, this
alterations are related to the development of neurodegenerative diseases (Benarroch,
2010). Recently it was shown that astrocyte glutamate uptake depends on GS activity,
which ensures an efficient clearance of glutamate by EAATs (Trabelsi et al., 2017). Our
results showed reduced levels of EAAT1, EAAT2 and GS content in IA and C6 than
PC, and this was related with lower glutamate metabolism as it was shown in reduced
glutamate uptake and GS activity. The presence of glutamate transporters in astrocyte
cell lines is unclear. Despite the detection of glutamate transporter in C6 and
immortalized astrocytes were seen in earlier studies, their functionality have not been
evaluated (Baber and Haghighat, 2010; Furihata et al., 2016). In opposite, other studies
have not detected these transporters (Palos et al., 1996; Vanhoutte and Hermans, 2008).
These differences could be explained by the number of subculturing at least in C6 cells.
EAAT2-C6 negative cells were observed in low passages, in opposite to ours cells that
were subcultured at least 100 times. The mechanistic reason to the switching of C6 from
glioma features to astrocyte differentiated characteristics are unknown, although may be
fundamental. Interestingly, EAAT2 over-expression was shown to reduce proliferative

46
rate of C6 cells under glutamate stimulus (Vanhoutte and Hermans, 2008), showing a
negative correlation between glutamate transporters and cell proliferation.

Another important characteristic of astrocytes in CNS is the resistance to oxidative

stress. This ability is thanks to high antioxidant GSH production, which uses glutamate
as a precursor (Matés et al., 2002). As seen in our results, although IA and C6 uptake
less glutamate, they presented similar GSH content in compare to PC. This result makes
us assume that a big part of glutamate taken up by lineage cells is destined to GSH
production, instead of glutamine synthesis (McKenna et al., 1996). Therefore, this
pathway may be different controlled in PC and linage cells. Furthermore, the Xc-
cysteine/glutamate antiporter system has been shown to be overexpressed in glioma
cells compared with normal astrocytes contributing to the growth, survival and
expansion. The import of L-cystein through Sxc- provides the substrate do GSH
synthesis (Bridges et al., 2012). Moreover, high GSH production in glioma cells may
also be necessary as an antioxidant defense against the high oxidative metabolism
observed in proliferative cells (Marie and Shinjo, 2011). Interestingly, GSH have been
related to cell proliferation interfering in telomerase activity (Pallardó et al., 2009).
Considering that linage cells presented higher proliferative rate than PC, is consistent to
think that they may have GSH activated pathway.

Energetic metabolism and gap junction in astrocytes

Astrocytes represent a key element in the capture of energetic compound supplying it to

active neurons. Most glucose utilized by astrocytes will be glycogen stored or/and
converted to lactate for extracellular export (Bouzier-Sore and Pellerin, 2013). GLUT-1
is the main glucose transporter in astrocytes (Pellerin, 2008). In our analysis, GLUT-1 is
down expressed in IA and C6 than PC. Surprisingly, the functionality of these
transporters, measured by glucose uptake, is much pronounced in C6 cells than IA and
PC (Fig 5). Accordingly, previews study showed that C6 glioma cells utilize more
glucose and produce less lactate than normal astrocytes (Haghighat and McCandless,
1997a). The authors suggest that glucose may be used in another pathway such as the
pentose phosphate shunt. These pathway produce NADPH, which could be also used by
glutathione reductase for the production of GSH (Dringen et al., 2015). Furthermore,
high levels of energy metabolism are common in proliferative cells (Marie and Shinjo,
2011). Taking into account that C6 originates from glioma cell lines it can be easily
assumed that these cells still maintain some characteristics of tumor cells. It is
47
interestingly to note, that although IA have a higher proliferative rate, it did not present
higher glucose metabolism as C6 cells. Immortalized astrocytes originate from a normal
astrocyte and not from a malignant cell. This may imply in different features and other
activated metabolic pathways.

In addition, glucose metabolism is related to gap junction communication, since

metabolic substrates can cross astrocytic gap junction (Tabernero et al., 2006).
Moreover, gap junction communication is related to proliferative rate. In fact, tumor
cells lines are usually devoid of gap junction, and are inhibited by tumor-promoting
molecules (Budunova and Williams, 1994). Astrocytes are interconnected by gap
junction composed primarily of Cx43 in cell culture (Rouach et al., 2002). C6 are
known to have low levels of cell communication, which is in accordance with the low
levels of Cx43 seen in our results in compare to PC. Interestingly, an increase in gap
junction communication decrease glucose uptake and proliferative rate in C6 cells
(Tabernero et al., 2006). Thus, high levels of glucose uptake, as seen in C6 cells, may
be explained by the low levels of functional communication.

Stimulus effect on astrocyte culture models

Some contradictory results are found in the literature when different models of astrocyte
culture are submitted to the same treatment (Haghighat and McCandless, 1997a; Leite et
al., 2009; Morikawa et al., 2001; Nardin et al., 2007). These results variation make
difficult the analysis and question the validity of the model. Therefore, we tested how
the three different models of astrocyte culture would respond to the same treatment. For
that, we used stimuli that were already known in the literature to cause functional
changes in primary culture. It is important to mention that variation in culture response
may also be influenced by differences in culture procedure, such as medium
composition, culture plate coating, subculture and days in vitro (Lange et al., 2012).
These differences may interfere in gene expression and morphology variation
(Passaquin et al., 1994). In fact, recently it was seen that extracellular matrix
composition determines astrocyte responses to mechanical and inflammatory stimuli
(Johnson et al., 2015). In this work, we maintained equal procedure to all three cultured
models, ensuring that the effects observed of treatment were due to biological cell
variation.

48
Overall, our results showed that PC and C6 cells respond similarly to the same stimulus,
regarding S100B secretion, GSH oxidative metabolism, glutamine synthetase activity
and glucose uptake (Table 1). Therefore, although they often presented differences in
the basal amount of protein, the activated pathways appear to be similar in tested
stimulus. In contrast, IA showed little reactivity in the assays tested, presenting similar
response to PC only in glucose uptake analysis, indicating that it is not a good model for
the study of astrocytes features, at least this clone transfected. Recently it was shown
that p53 isoform expressed in different passages, regulates astrocyte-mediated
neuroprotection and neurodegeneration (Turnquist et al., 2016). Therefore, IA that has
p53 inhibited (due to the transfection process) may have compromised functionality.

Proliferative rate and protein expression balance

The proliferative rat it is one of the main differences between PC and linage cells. It is
known, that IA and C6 growth in much higher degree than PC, which may explain some
basal differences related in protein profile. These linage cells may present an incomplete
differentiation phenotype while invest more in proteins related to cell proliferation. In
fact, the levels of any specific protein inside cell are dynamic. Gene expression may
vary dependent on cell density or cell cycle transition time. For example, a decrease in
proliferative associated genes is expected in confluence cells or, an upregulation in
differentiated associated genes (Frisa and Jacobberger, 2002). The attenuation in
proliferative abilities may allow the cell to undergo more differentiated status.
Therefore, it is important in this analysis, and in any other study that uses these cell
models, to maintain a confluence pattern to reach gene expression stability.

In general, our results showed that the two models of cell lines (IA and C6) were
positive for astrocytic characteristics proteins, but in much lower amount. Although IA
presented a slower growth rate than C6 cells, and a similar basal morphology with PC,
they did not prove to be a good reproductive model of the classic astrocytic functions.
In contrast, C6 cells, which have a tumorigenic origin, were able to present
differentiated characteristics, resembling more to astrocytes. In addition, the response of
these cells to the same stimulus was equivalent to PC.

Conclusion

In summary, we show an integrative characterization and comparative analysis of PC,

IA and C6. We analyzed in basal condition not only the expression protein profile of

49
each cell model, but also the functionality of this proteins regarding glutamate and
glucose metabolism and cell communication. Furthermore, variation in cellular
morphology or biochemistry response under the same stimulus was also assessed.

Based on our data, although PC is more time-consuming and costly technique, the use
as a reproductive model for astrocyte studies is undoubtedly preferential. However, the
C6 cell line, although present some limitations seems to functionally reproduce an
astrocyte in a considerable way. These cells may represent a good astrocytic model for
initial studies to detect in a faster way some characteristics which astrocytes are
involved, although for a deep analysis PC may be rather selected. All these issues must
be considered for the choice of a suitable model for the study of astrocyte. These work
provided limitation and the advantages of each culture, optimizing the research in the
area of knowledge.

Acknowledgements: This work was supported by Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Rio Grande do Sul (FAPERGS) and Instituto Nacional de Ciência e tecnologia (INCT).

50
References

Baber, Z., Haghighat, N., 2010. Glutamine synthetase gene expression and glutamate
transporters in C6-glioma cells. Metab Brain Dis 25(4), 413-418.

Benarroch, E.E., 2010. Glutamate transporters: diversity, function, and involvement in

neurologic disease. Neurology 74(3), 259-264.

Benda, P., Lightbody, J., Sato, G., Levine, L., Sweet, W., 1968. Differentiated rat glial
cell strain in tissue culture. Science 161(3839), 370-371.

Bouzier-Sore, A.K., Pellerin, L., 2013. Unraveling the complex metabolic nature of
astrocytes. Front Cell Neurosci 7, 179.

Browne, R.W., Armstrong, D., 1998. Reduced glutathione and glutathione disulfide.
Methods Mol Biol 108, 347-352.

Brozzi, F., Arcuri, C., Giambanco, I., Donato, R., 2009. S100B Protein Regulates
Astrocyte Shape and Migration via Interaction with Src Kinase: IMPLICATIONS FOR
ASTROCYTE DEVELOPMENT, ACTIVATION, AND TUMOR GROWTH. J Biol
Chem 284(13), 8797-8811.

Budunova, I.V., Williams, G.M., 1994. Cell culture assays for chemicals with tumor-
promoting or tumor-inhibiting activity based on the modulation of intercellular
communication. Cell Biol Toxicol 10(2), 71-116.

De Pittà, M., Brunel, N., Volterra, A., 2016. Astrocytes: Orchestrating synaptic
plasticity? Neuroscience 323, 43-61.

Dringen, R., Brandmann, M., Hohnholt, M.C., Blumrich, E.M., 2015. Glutathione-
Dependent Detoxification Processes in Astrocytes. Neurochem Res 40(12), 2570-2582.

Dringen, R., Kussmaul, L., Gutterer, J.M., Hirrlinger, J., Hamprecht, B., 1999. The
glutathione system of peroxide detoxification is less efficient in neurons than in
astroglial cells. J Neurochem 72(6), 2523-2530.

Eng, L.F., 1985. Glial fibrillary acidic protein (GFAP): the major protein of glial
intermediate filaments in differentiated astrocytes. J Neuroimmunol 8(4-6), 203-214.

51
Fernandes, S.P., Dringen, R., Lawen, A., Robinson, S.R., 2011. Inactivation of
astrocytic glutamine synthetase by hydrogen peroxide requires iron. Neurosci Lett
490(1), 27-30.

Frisa, P.S., Jacobberger, J.W., 2002. Cell density related gene expression: SV40 large T
antigen levels in immortalized astrocyte lines. BMC Cell Biol 3, 10.

Frizzo, J.K., Tramontina, A.C., Tramontina, F., Gottfried, C., Leal, R.B., Donato, R.,
Gonçalves, C.A., 2004. Involvement of the S100B in cAMP-induced cytoskeleton
remodeling in astrocytes: a study using TRTK-12 in digitonin-permeabilized cells. Cell
Mol Neurobiol 24(6), 833-840.

Furihata, T., Ito, R., Kamiichi, A., Saito, K., Chiba, K., 2016. Establishment and
characterization of a new conditionally immortalized human astrocyte cell line. J
Neurochem 136(1), 92-105.

Geller, H.M., Dubois-Dalcq, M., 1988. Antigenic and functional characterization of a

rat central nervous system-derived cell line immortalized by a retroviral vector. J Cell
Biol 107(5), 1977-1986.

Gottfried, C., Tramontina, F., Gonçalves, D., Gonçalves, C.A., Moriguchi, E., Dias,
R.D., Wofchuk, S.T., Souza, D.O., 2002. Glutamate uptake in cultured astrocytes
depends on age: a study about the effect of guanosine and the sensitivity to oxidative
stress induced by H(2)O(2). Mech Ageing Dev 123(10), 1333-1340.

Groves, A.K., Entwistle, A., Jat, P.S., Noble, M., 1993. The characterization of
astrocyte cell lines that display properties of glial scar tissue. Dev Biol 159(1), 87-104.

Guerra, M.C., Tortorelli, L.S., Galland, F., Da Ré, C., Negri, E., Engelke, D.S.,
Rodrigues, L., Leite, M.C., Gonçalves, C.A., 2011. Lipopolysaccharide modulates
astrocytic S100B secretion: a study in cerebrospinal fluid and astrocyte cultures from
rats. J Neuroinflammation 8, 128.

Haghighat, N., 2005. Estrogen (17beta-estradiol) enhances glutamine synthetase activity

in C6-glioma cells. Neurochem Res 30(5), 661-667.

Haghighat, N., McCandless, D.W., 1997a. Effect of 6-aminonicotinamide on

metabolism of astrocytes and C6-glioma cells. Metab Brain Dis 12(1), 29-45.

52
Haghighat, N., McCandless, D.W., 1997b. Effect of ammonium chloride on energy
metabolism of astrocytes and C6-glioma cells in vitro. Metab Brain Dis 12(4), 287-298.

Hertz, L., Chen, Y., Song, D., 2017. Astrocyte Cultures Mimicking Brain Astrocytes in
Gene Expression, Signaling, Metabolism and K(+) Uptake and Showing Astrocytic
Gene Expression Overlooked by Immunohistochemistry and In Situ Hybridization.
Neurochem Res 42(1), 254-271.

Johnson, K.M., Milner, R., Crocker, S.J., 2015. Extracellular matrix composition
determines astrocyte responses to mechanical and inflammatory stimuli. Neurosci Lett
600, 104-109.

Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G., 1998. Structural organization of the
perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose
transporter: a confocal microscopy study. Glia 23(1), 1-10.

Kettenmann, H., Verkhratsky, A., 2008. Neuroglia: the 150 years after. Trends Neurosci
31(12), 653-659.

Krupenko, S.A., 2009. FDH: an aldehyde dehydrogenase fusion enzyme in folate

metabolism. Chem Biol Interact 178(1-3), 84-93.

Lange, S.C., Bak, L.K., Waagepetersen, H.S., Schousboe, A., Norenberg, M.D., 2012.
Primary cultures of astrocytes: their value in understanding astrocytes in health and
disease. Neurochem Res 37(11), 2569-2588.

Lasič, E., Galland, F., Vardjan, N., Šribar, J., Križaj, I., Leite, M.C., Zorec, R.,
Stenovec, M., 2016. Time-dependent uptake and trafficking of vesicles capturing
extracellular S100B in cultured rat astrocytes. J Neurochem 139(2), 309-323.

Leite, M.C., Galland, F., Brolese, G., Guerra, M.C., Bortolotto, J.W., Freitas, R.,
Almeida, L.M., Gottfried, C., Gonçalves, C.A., 2008. A simple, sensitive and widely
applicable ELISA for S100B: Methodological features of the measurement of this glial
protein. J Neurosci Methods 169(1), 93-99.

Leite, M.C., Galland, F., de Souza, D.F., Guerra, M.C., Bobermin, L., Biasibetti, R.,
Gottfried, C., Gonçalves, C.A., 2009. Gap junction inhibitors modulate S100B secretion
in astrocyte cultures and acute hippocampal slices. J Neurosci Res 87(11), 2439-2446.

53
Marie, S.K., Shinjo, S.M., 2011. Metabolism and brain cancer. Clinics (Sao Paulo) 66
Suppl 1, 33-43.

Matés, J.M., Pérez-Gómez, C., Núñez de Castro, I., Asenjo, M., Márquez, J., 2002.
Glutamine and its relationship with intracellular redox status, oxidative stress and cell
proliferation/death. Int J Biochem Cell Biol 34(5), 439-458.

McKenna, M.C., 2007. The glutamate-glutamine cycle is not stoichiometric: fates of

glutamate in brain. J Neurosci Res 85(15), 3347-3358.

McKenna, M.C., Sonnewald, U., Huang, X., Stevenson, J., Zielke, H.R., 1996.
Exogenous glutamate concentration regulates the metabolic fate of glutamate in
astrocytes. J Neurochem 66(1), 386-393.

Menet, V., Giménez y Ribotta, M., Chauvet, N., Drian, M.J., Lannoy, J., Colucci-
Guyon, E., Privat, A., 2001. Inactivation of the glial fibrillary acidic protein gene, but
not that of vimentin, improves neuronal survival and neurite growth by modifying
adhesion molecule expression. J Neurosci 21(16), 6147-6158.

Minet, R., Villie, F., Marcollet, M., Meynial-Denis, D., Cynober, L., 1997.
Measurement of glutamine synthetase activity in rat muscle by a colorimetric assay.
Clin Chim Acta 268(1-2), 121-132.

Morikawa, M., Asai, K., Kokubo, M., Fujita, K., Yoneda, K., Yamamoto, N., Inoue, Y.,
Iida, J., Kishimoto, T., Kato, T., 2001. Isolation and characterization of a new immortal
rat astrocyte with a high expression of NGF mRNA. Neurosci Res 39(2), 205-212.

Nardin, P., Tramontina, F., Leite, M.C., Tramontina, A.C., Quincozes-Santos, A., de
Almeida, L.M., Battastini, A.M., Gottfried, C., Gonçalves, C.A., 2007. S100B content
and secretion decrease in astrocytes cultured in high-glucose medium. Neurochem Int
50(5), 774-782.

Olsen, M.L., Sontheimer, H., 2008. Functional implications for Kir4.1 channels in glial
biology: from K+ buffering to cell differentiation. J Neurochem 107(3), 589-601.

Ostroff, L.E., Manzur, M.K., Cain, C.K., Ledoux, J.E., 2014. Synapses lacking
astrocyte appear in the amygdala during consolidation of Pavlovian threat conditioning.
J Comp Neurol 522(9), 2152-2163.

54
Pallardó, F.V., Markovic, J., García, J.L., Viña, J., 2009. Role of nuclear glutathione as
a key regulator of cell proliferation. Mol Aspects Med 30(1-2), 77-85.

Palos, T.P., Ramachandran, B., Boado, R., Howard, B.D., 1996. Rat C6 and human
astrocytic tumor cells express a neuronal type of glutamate transporter. Brain Res Mol
Brain Res 37(1-2), 297-303.

Papadopoulos, M.C., Verkman, A.S., 2013. Aquaporin water channels in the nervous
system. Nat Rev Neurosci 14(4), 265-277.

Parker, K.K., Norenberg, M.D., Vernadakis, A., 1980. "Transdifferentiation" of C6 glial

cells in culture. Science 208(4440), 179-181.

Passaquin, A.C., Schreier, W.A., de Vellis, J., 1994. Gene expression in astrocytes is
affected by subculture. Int J Dev Neurosci 12(4), 363-372.

Pellerin, L., 2008. Brain energetics (thought needs food). Curr Opin Clin Nutr Metab
Care 11(6), 701-705.

Pellerin, L., Magistretti, P.J., 1994. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic
glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proc Natl
Acad Sci U S A 91(22), 10625-10629.

Perea, G., Araque, A., 2005. Glial calcium signaling and neuron-glia communication.
Cell Calcium 38(3-4), 375-382.

Peterson, G.L., 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al.
which is more generally applicable. Anal Biochem 83(2), 346-356.

Raju, T.R., Bignami, A., Dahl, D., 1980. Glial fibrillary acidic protein in monolayer
cultures of C-6 glioma cells: effect of aging and dibutyryl cyclic AMP. Brain Res
200(1), 225-230.

Rouach, N., Avignone, E., Même, W., Koulakoff, A., Venance, L., Blomstrand, F.,
Giaume, C., 2002. Gap junctions and connexin expression in the normal and
pathological central nervous system. Biol Cell 94(7-8), 457-475.

Seifert, G., Henneberger, C., Steinhäuser, C., 2016. Diversity of astrocyte potassium
channels: An update. Brain Res Bull.

55
Sofroniew, M.V., Vinters, H.V., 2010. Astrocytes: biology and pathology. Acta
Neuropathol 119(1), 7-35.

Souza, D.G., Bellaver, B., Souza, D.O., Quincozes-Santos, A., 2013. Characterization
of adult rat astrocyte cultures. PLoS One 8(3), e60282.

Tabernero, A., Medina, J.M., Giaume, C., 2006. Glucose metabolism and proliferation
in glia: role of astrocytic gap junctions. J Neurochem 99(4), 1049-1061.

Tabuchi, K., Imada, M., Nishimoto, A., 1982. Effects of cyclic AMP on S-100 protein
level in C-6 glioma cells. J Neurol Sci 56(1), 57-63.

Thomazi, A.P., Godinho, G.F., Rodrigues, J.M., Schwalm, F.D., Frizzo, M.E.,
Moriguchi, E., Souza, D.O., Wofchuk, S.T., 2004. Ontogenetic profile of glutamate
uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mech Ageing Dev
125(7), 475-481.

Trabelsi, Y., Amri, M., Becq, H., Molinari, F., Aniksztejn, L., 2017. The conversion of
glutamate by glutamine synthase in neocortical astrocytes from juvenile rat is important
to limit glutamate spillover and peri/extrasynaptic activation of NMDA receptors. Glia
65(2), 401-415.

Tramontina, F., Leite, M.C., Cereser, K., de Souza, D.F., Tramontina, A.C., Nardin, P.,
Andreazza, A.C., Gottfried, C., Kapczinski, F., Gonçalves, C.A., 2007. Immunoassay
for glial fibrillary acidic protein: antigen recognition is affected by its phosphorylation
state. J Neurosci Methods 162(1-2), 282-286.

Turnquist, C., Horikawa, I., Foran, E., Major, E.O., Vojtesek, B., Lane, D.P., Lu, X.,
Harris, B.T., Harris, C.C., 2016. p53 isoforms regulate astrocyte-mediated
neuroprotection and neurodegeneration. Cell Death Differ 23(9), 1515-1528.

Van Eldik, L.J., Wainwright, M.S., 2003. The Janus face of glial-derived S100B:
beneficial and detrimental functions in the brain. Restor Neurol Neurosci 21(3-4), 97-
108.

Vanhoutte, N., Hermans, E., 2008. Glutamate-induced glioma cell proliferation is

prevented by functional expression of the glutamate transporter GLT-1. FEBS Lett
582(13), 1847-1852.

56
Wartchow, K.M., Tramontina, A.C., de Souza, D.F., Biasibetti, R., Bobermin, L.D.,
Gonçalves, C.A., 2016. Insulin Stimulates S100B Secretion and These Proteins
Antagonistically Modulate Brain Glucose Metabolism. Neurochem Res 41(6), 1420-
1429.

Wilhelmsson, U., Li, L., Pekna, M., Berthold, C.H., Blom, S., Eliasson, C., Renner, O.,
Bushong, E., Ellisman, M., Morgan, T.E., Pekny, M., 2004. Absence of glial fibrillary
acidic protein and vimentin prevents hypertrophy of astrocytic processes and improves
post-traumatic regeneration. J Neurosci 24(21), 5016-5021.

Yang, Y., Vidensky, S., Jin, L., Jie, C., Lorenzini, I., Frankl, M., Rothstein, J.D., 2011.
Molecular comparison of GLT1+ and ALDH1L1+ astrocytes in vivo in astroglial
reporter mice. Glia 59(2), 200-207.

Zhou, D., Jiang, X., Xu, R., Cai, Y., Hu, J., Xu, G., Zou, Y., Zeng, Y., 2008. Assessing
the cytoskeletal system and its elements in C6 glioma cells and astrocytes by atomic
force microscopy. Cell Mol Neurobiol 28(6), 895-905.

57
 Table 1 Astrocytes culture response under stimulus

Assay Stimulus PC IA C6
LPS 1 µg/mL ↑ -- --
GFAP
24h (1) 178.1* ± 20 % 81 ± 10.2 % 122 ± 27 %
LPS 1 µg/mL ↓ -- ↓
S100B
24h (2) 77.6* ± 6.2 % 121.5 ± 30 % 37.5* ± 4.8 %
H2O2 50 µM ↓ -- ↓
GS activity
3h (3) 84.6* ± 3.4 % 125 ± 11 % 75.6* ± 8.9 %
S100B 0.1ng/mL ↓ ↓ ↓
Glucose uptake
30 min (4) 67.6* ± 4.8 % 78.6* ± 7.8 % 66.8* ± 11.7 %
H2O2 50 µM ↓ -- ↓
GSH content
3h (5) 70.2* ± 8.0 % 91.4* ± 6.3 % 66.9* ± 9.2 %

Table 1. Astrocytes were treated with the indicated stimulus and times and assays were
preceded. Stimuli were chosen in accordance with previews works which showed
alteration in PC parameters: 1 and 2 (Guerra et al., 2011); 3 (Fernandes et al., 2011), 4
(Dringen et al., 1999) 5 (Wartchow et al., 2016). Numbers indicate the percentage in
relation to controls. Arrows up indicate an increase, arrows down indicate a reduction in
compare to controls and trace indicates no effect. Statistical analysis was performed T-
test, with a significance level of p < 0.05.

Legends of Figures

Fig 1. Morphology and plasticity evaluation in PC, C6 and IA.

Immunocytochemistry for actin, GFAP and S100B was done in basal and forskolin
stimulated condition (15 min) in primary culture, immortalized astrocytes and C6 cells.

Fig 2. Astrocytes markers protein profile in PC, IA and C6. The content of
characteristic proteins of astrocytes were analysed in basal condition in PC, IA and C6.
Imunoblot for GFAP and vimentin ratio (A); GFAP (B) and S100B (C) content was
measured by ELISA; ALDH1L1 (D); AQP4 (E) and Kir4.1 (F) content was measured
by immunoblot. Representative immunoblot are shown in inserts. Each value is the
mean (± standard error) from at least 5 experiments. Statistical analysis was performed
one way ANOVA followed by Tukey’s test, with a significance level of p < 0.05.

58
Fig 3. Characterization of glutamate metabolism in PC, IA and C6 cells. Glutamate
uptake was examined in cells in basal condition by radiometric assay (A). The
immunocontent of EAAT1 (B) and EAAT2 (C) was measured by immunoblot.
Glutamine synthetase activity was measured by a colorimetric assay (D) and GS
immunocontent by immunoblot analysis (E). GSH content was measured by
fluorimetric assay (F). Representative immunoblot are shown in inserts. Each value is
the mean (± standard error) from at least 5 experiments. Statistical analysis was
performed one way ANOVA followed by Tukey’s test, with a significance level of p <
0.05.

Fig 4. Characterization of glucose metabolism in PC, IA and C6 cells. Glucose

uptake was examined in cells in basal condition by radiometric assay (A). The
immunocontent of GLUT-1 was measured by immunoblot (B). Representative
immunoblot is shown in insert. Each value is the mean (± standard error) from at least 5
experiments. Statistical analysis was performed one way ANOVA followed by Tukey’s
test, with a significance level of p < 0.05.

Fig 5. Gap junction comunication in PC, IA and C6. Conexin-43 immunocontent it

was evaluated in basal condition (A). Astrocytes were submitted to scrape loading with
Lucifer yellow for 10 min, as detailed in Materials and Methods. Cells in basal state are
shown in green fluorescent staining (B). Values of gross density luminescence unit
(mean ± SE) from three independent experiments performed in triplicate are indicated.

59
Figure 1

60
Figure 2

61
Figure 3

62
Figure 4

63
Figure 5

64
 3.2. Capítulo II

Time-dependent uptake and trafficking of vesicles capturing extracellular S100B in

cultured rat astrocytes

Artigo publicado no periódico Journal of Neurochemistry

65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
 3.3. Capítulo III

Standardization of a routine protocol for glutamine synthetase activity in astrocytes and

cerebral tissue, using glutamyl-transferase activity

Artigo submetido ao periódico Analytical Biochemistry

81
Standardization of a routine protocol for glutamine synthetase activity in
astrocytes and cerebral tissue, using glutamyl-transferase activity

Fabiana Galland, Marina Seady, Jessica Taday, Carlos Alberto Gonçalves, Marina
Concli Leite

Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil.

e-mail adress:
Fabiana Galland – [email protected]
Marina Seady – [email protected]
Jéssica Taday – [email protected]
Carlos-Alberto Gonçalves – [email protected]
Marina Concli Leite - [email protected]

Corresponding author: Marina Concli Leite

Depto Bioquímica, ICBS, UFRGS
Ramiro Barcelos, 2600-anexo
Porto Alegre, RS, Brazil
90035-003
Fax: 55-51-3308 5565
E-mail: [email protected]

82
Abstract

Classically glutamine synthetase (GS) converts glutamate and NH4+ into glutamine,
playing an important role in glutamine-glutamate cycle in brain tissue and alterations of
this enzyme have been described in neurodegenerative diseases, including Alzheimer´s
disease. Beyond synthetase activity, GS has also the transferase activity, which converts
glutamine and hydroxylamine into γ-glutamyl-hydroxamate. This reaction also reflects
GS activity but the assay was little standardized for brain tissue and would be very
useful for clinical and experimental studies. The aim of this study was to evaluate an
assay for the measurement of glutamyl-transferase activity of GS in a colorimetric
method for the applicability in different brain tissues, in astrocytes culture and C6
lineage cells. The assay was accurate, sensible and linear. It had a good reproducibility
having good intra and inter assays coefficients. It was applicable in many brain
structures and in glial cultures. The assay is specific for GS activity, as a selective
inhibitor of GS (MSO) reduces its activity, but not the quantity of enzyme. This assay
has the advantage of being less subjective to interference than synthetase reaction, fast
and samples were stable after thawing. Increase in GS activity may reflect on glia
maturation, furthermore, this assay is useful for the investigation of this enzyme in
physiological and pathological situations.

Keywords: Glutamine synthetase activity assay, astrocyte culture, brain.

83
 1. Introduction

Glutamine synthetase (GS) is a well evolutionarily conserved enzyme which has

important function in nitrogen metabolism in different organisms like bacteria, plants
and animals [1, 2]. GS is present in most mammalian tissues, however abundantly
expressed in liver, kidney, muscle and brain [3, 4]. The activity of this enzyme is the
only known route for the synthesis of glutamine from glutamate and ammonia.
Glutamine production is important as a nitrogen donor and collector, being essential for
the transport of nitrogen between organs, hepatic and renal gluconeogenesis and protein
turnover in the muscle [5].

In brain, GS activity plays an important role in glutamine-glutamate cycle, converting

glutamate into glutamine inside astrocytes, which prevents excitotoxicity of glutamate
in the synaptic cleft [6]. GS is also responsible for the main detoxification of ammonia
in the central nervous system (CNS) once add free ion ammonium in to skeleton of
glutamate, protecting against neurotoxicity [7]. Glutamine produced from GS is also
precursor for glutamate and GABA production [8]. This enzyme is abundantly present
in astrocytes in CNS, although some cells, as neurons and oligodendrocytes, were
reported to express low quantities of GS in human and rats’ brain [9, 10].

The measurement of GS activity is very important to understand physiologic and

pathological conditions in brain tissue. A reduction in GS activity in astrocytes may
limit glutamate clearance by the EAATs and ammonia detoxification, leading to
neurologic impairment [11]. Therefore, GS has been proposed as a marker of brain
damage [6, 12]. In fact, variations in the activity or expression of GS have been reported
in several neurodegenerative diseases, such as in hepatic encephalopathy (HE),
Alzheimer’s disease (AD), epilepsy and traumatic brain injury [13, 14]. Furthermore,
brain GS activity is sensitive to peripheral metabolic changes induced by caloric
restriction [15] or treadmill exercise [16].

GS in physiologic state has the following reaction:

(1) glutamate +NH4++ Mg2+ + ATP → glutamine + ADP + Pi

Three types of GS genes are known: GSI and III mainly detected in bacteria, and GSII
present in eukaryotic cells [3]. Similar catalytic reaction has been reported for GSI and
GSII genes in which ATP bond to the enzyme favored glutamate binding. The

84
phosphate produced by the cleavage of ATP to ADP remain attached to the enzyme,
changing the complex enzyme conformation forming the binding site for ammonia,
which attacks the intermediate γ-glutamyl phosphate to yield glutamine [17, 18].
Methionine sulfoxamine (MSO) is an irreversible inhibitor of the enzyme, which is
phosphorylated in the presence of ATP and interacts with the active site of the enzyme.

Two main methods are used to determine GS activity: radioactive and colorimetric
assays. The first method has the advantage of being highly sensible; however, it is
costly and of difficult employment since the use of radioactive compounds request extra
care of manipulation from the researcher [19]. In colorimetric assays two different
activities of GS are measured: a synthetase and a transferase reaction, which may occur
in different active sites of the enzyme [4]. Both reactions produce as final product γ-
glutamyl-hydroxamate, which react with ferric chloride producing a characteristic
yellowish color. Hydroxylamine, which is more stable for in vitro reaction, is used
instead of ammonia. The synthetase reaction use glutamate as a substrate, as follow:

(2) glutamate + NH2OH + Mg2+ + ATP → γ-glutamyl-hydroxamate

Differentially to the synthetase reaction, the transferase reaction uses glutamine as a

substrate:

(3) glutamine + NH2OH + Mn2+ + ADP → γ-glutamyl-hydroxamate

The transferase and specially the synthetase activity were very well characterized by
Meister and co-workers [4, 18, 20]. Both activities (Eq. 2 and 3) are present in the same
highly purified pellet and respond identical to the same treatment. Thus, both reactions
may reflect the levels of the same protein [4, 21]. The transferase reaction has the
advantage to have less interference for in vitro measurements than the synthetase
reaction, since synthetase reaction (Eq. 2) uses ATP as a substrate and it could be easily
hydrolyzed by the ATPase present in homogenate tissues [22, 23]. Furthermore, ADP
produced in equation 2 was shown to inhibit the enzyme [24]. Still, transferase reaction
was shown to be 10 times faster than synthetase in sheep brain [25, 26]. Despite being
commonly applied, GS transferase assay was less standardized than synthetase method.
Glutamyl-transferase activity assay was shown to be accurate and reliable in muscle
tissue [19] and in bacteria [26], however, was little standardized for brain tissue. In fact,
in the best of our knowledge, there is only one paper that standardized this method in
cerebral tissue, although with some differences in substrate composition, the use of

85
chromatographic method to identify γ-glutamyl-hydroxamate product and without
discriminate different cerebral regions [27]. It was suggested that GS enzyme from
muscle and kidney, or even in different regions from the brain are differently regulated,
therefore it is important standardize a method that is suitable for cerebral tissue [28, 29].
For this purpose, in this work we characterized an assay for glutamyl-transferase
activity of GS for the applicability in different brain tissues and in astrocytes culture.
We evaluated the sensibility and the linearity of the assay in time and quantity of
protein. We tested precision of the method evaluating intra and inter assays coefficients.
Stability of the enzyme after freezing and inhibition of activity comparing with its
expression was also assessed.

2. Materials and Methods

2.1. Rat sample

Thirty-day old female Wistar rats were obtained from the Central Animal House of the
Department of Biochemistry, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, RS – Brazil. The animals were maintained on a 12:12 h light/dark cycle (lights
on 07.00–19.00 h) in an air conditioned constant temperature (22°C ± 1°C) colony
room, with free access to water and a 20% (w/w) protein commercial chow (SUPRA,
Porto Alegre, RS, Brazil). The experimental protocol was approved by the Ethics
Committee for animal research of the Federal University of Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, Brazil and followed the “Principles of Laboratory Animal Care (NIH
publication 85-23, revised 1996). All efforts were made to minimize the number of
animals used and their suffering.

Rats were killed by decapitation, without any previously treatment, and cerebral
structures (cerebral cortex, hippocampus, cerebellum, striatum and hypothalamus) were
quickly dissected out and sliced. The tissue samples were immediately homogenized to
glutamine synthetase activity measurement or frozen for sample stability test.

86
 2.2. Astrocytes Cell culture

Primary astrocyte cultures from Wistar rats were prepared as previous described [30].
Procedures were carried out in accordance with the NIH Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals and were approved by the local authorities. Briefly, cerebral
cortices of newborn Wistar rats (1-2 days old) were removed and mechanically
dissociated in Ca2+- and Mg2+-free balanced salt solution, pH 7.4, containing (in mM):
137 NaCl; 5.36 KCl; 0.27 Na2HPO4; 1.1 KH2PO4 and 6.1 glucose. The cortices were
cleaned of meninges and mechanically dissociated by sequential passage through a
Pasteur pipette. After centrifugation at 1400 RPM for 5 min the pellet was resuspended
in DMEM (pH 7.6) supplemented with 8.39 mM HEPES, 23.8 mM NaHCO3, 0.1%
amphotericin B, 0.032% gentamicin and 10% fetal calf serum (FCS). Cultures were
maintained in DMEM containing 10% FCS in 5% CO2/95% air at 37°C, allowed to
grow to confluence, and used at 21 days in vitro.

2.3. C6 Glioma cell culture

The C6 glioma cell line was obtained from the American Type Culture Collection
(Rockville, MD). Late passage cells (i.e., after at least 100 passages) were seeded in 25
cm3 flasks and cultured in DMEM 10% FCS (same medium described for astrocytes
primary culture). Exponentially growing cells were detached from the culture flasks
using 0.05% trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and seeded in 12 or 24-
well plates. Cells were allowed to grow to confluence, and used at 3 days in vitro.

2.4. Chemicals and enzymes

Fetal calf serum (FCS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) and other
materials for cell culture were purchased from Gibco [Carlsbad, USA]. Poly-L-lysine,
hydroxylamine, L-glutamine, adenosine 5′-diphosphate sodium salt, L-Glutamic acid γ-
monohydroxamate and L-methionine sulfoximine were purchased from Sigma [St.
Louis, USA].

2.5. Preparation of solutions

All solutions were prepared with distilled water. Imidazole and hydroxylamine were
adjusted to pH 6.8 with hydrochloric acid. Solutions were stored at 4°C except for
glutamine, ADP, hydroxylamine and L-Glutamic acid γ-monohydroxamate which were
stored at -20°C.

87
 2.6. Protein determination

Protein content was measured by Lowry’s method modified by Peterson using bovine
serum albumin as standard [31].

2.7. GS activity assay

The enzymatic activity of glutamine synthetase was determined using the procedures
described previously [19] with modifications. Confluent astrocytes culture or rat tissue
sample were homogenized in 50 mM imidazole and lysed on ice with syringe.
Homogenates (100 µL) were incubated with 100 µL of the solution (mM): (50
imidazole, 50 hydroxylamine, 100 L-glutamine, 25 sodium arsenate dibasic
heptahydrate, 0.2 ADP, 2 manganese chloride, pH 6.8) 15 min at 37°C. To avoid the
non-enzymatic formation of γ-glutamylhydroxamate, this solution was prepared
immediately before its use. The reaction was stopped by the addition of 200 µL of 0.37
M FeCl3, 200 mM trichloroacetic acid, and 0.67 M HCl. Insoluble material was
removed by centrifugation at 1000 g for 15 min. The absorbance of 200 μL supernatant
was measured at 540 nm on a microtiter plate (SpectraMax I3, Molecular Devices).
Blank (the same volume of water instead of sample) or standard quantities of γ-
glutamylhydroxamate acid (Sigma) ranged from 0,156 mM to 10 mM, containing the
total incubation mixture, were compared with the absorbance of the samples. Glutamine
synthetase activity was expressed as µmol/h/mg prot.

2.8. Substrate curve

Confluent astrocytes culture from 24 well plates or a slice of 300 µm of brain tissue
sample were homogenized in 50 µL of imidazole (50 mM) and lysed on ice with
syringe. Several dilutions were made from the first homogenized and GS activity was
measured as previously described.

2.9. Time curve

Confluent astrocytes culture from 24 well plates or a slice of 300 µm of tissue sample
were homogenized in 200 µL of imidazole (50 mM) and lysed on ice with syringe. GS
activity was measured and the reaction was stopped at 5, 10, 15, 20, 25 or 30 minutes.

88
 2.10. GS activity inhibition

MSO 5 mM or H2O2 5 mM were added in cell culture homogenates during 1 h at 37°C.

After, GS activity was measured as previously described. In another set of experiments,
the extracellular medium of confluent astrocyte culture was replaced by DMEM without
serum and MSO 1 mM or H2O2 50 µM was added. Enzymatic activity was measured
after 3 h of treatment.

2.11. Sample stability test

In order to determine the stability of the enzyme after freezing, the enzymatic reaction
was measured fresh, 1 or 7 days after frozen in -20 or -80°C. Cell culture samples were
homogenized in (mM): 50 imidazole, 100 EGTA and 100 EDTA and frozen in solution.
Cerebral tissue samples were frozen dry.

2.12. GS immunocontent determination

Cerebral tissues of rats or cell culture were homogenized in sample buffer (0.0625 M
Tris–HCl, pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 5% (w/v) b-mercaptoethanol, 10% (v/v) glycerol,
0.002% (w/v) bromphenol blue), boiled and centrifuged 5 min at 10000g. Equal
amounts (30 µg) of proteins from each sample were electrophoresed in a 12% (w/v)
SDS–polyacrylamide gel. The separated proteins were blotted onto a nitrocellulose
membrane. Anti-Glutamine Synthetase was used at a dilution of 1:10000. After
incubating with the primary antibody for 24 h at 4°C, filters were washed and incubated
for 1h at 4°C with peroxidase-conjugated anti-goat immunoglobulin (IgG) at a dilution
of 1:5000. Equivalent loading of each sample was confirmed with anti-actin, except
from the culture sample, as different cells contains different amounts of actin. The
chemiluminescence signal was detected using an ECL kit from Amersham and
evaluated in the luminescence image analyzer (Image Quant LAS4000 from GE). The
luminescence signal differences were analyzed using ImageJ software.

2.13. Statistical analysis

Parametric data are reported as means ± standard error and were analyzed by T-test or
one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Duncan’s test, in the SPSS-16.0.
Tests are specified in the legends, with the level of significance set at p < 0.05.

89
 3. Results

3.1. Sensibility, linearity and reproducibility of the assay

The dilution of standard quantities of γ-glutamylhydroxamate acid was sensible from

0.156 mM and linear until 20 mM. The standard curve shows high linearity presenting
equation y=0.0736x + 0.0399 and R= 0.99 (Fig 1).

In order to verify the reproducibility of the method intra-assay and inter-assay

coefficients of variance (CV) were obtained from culture samples. For intra-assay
analysis the enzymatic activity of five aliquots from the same sample were measured in
the same experiment. This was repeated eight times with different samples. For inter-
assays analysis GS activity of the same sample was measured in different experiments.
The mean of eleven experiments were obtained. The coefficient of variation was
obtained by the ratio of standard deviation to the mean. This analysis showed good
intra-assay (5.58% N=8) and inter-assay (8.33% N=11) CV.

3.2. Time of incubation and amount of protein linearity

In order to verify the reliability of the technique the linearity of the assay was tested
with time of incubation and with quantity of protein in different samples (Fig 2).
Astrocytes culture and hippocampal slices show high linearity between 5 and 30
minutes of incubation with R=0.9879 and R=0.9804, respectively (Fig, 2A and B). The
quantity of product formed was also correspondent with the amount of protein either in
culture cells (Fig 2C) or hippocampal slices (Fig 2D), showing linearity of R=0.9898
and R=0.9871, respectively. All subsequent experiments were performed using an
incubation time of 15 min.

3.3. Frozen stability test

Freezing samples for subsequent determination of enzyme activity is a common

procedure. To verify the stability of the enzyme after thawed we tested the same sample
fresh and after thawed. Homogenates of astrocytes culture in solution with addition of
protease inhibitors and dry slice of hippocampal tissue were immediately frozen in -
20°C or -80°C. After 24 h or 1 week samples were thawed and enzymatic activity was
compared to fresh sample. Table 1 shows that hippocampal slices and homogenized cell
cultures samples are stable for GS activity measurement for a week in both tested

90
conditions (-20 or -80°C). It is important to mention that the stability of the enzyme was
not preserved after a moth frozen (data not shown).

3.4. Assay applicability

GS activity was detectable in astrocyte culture, C6 glioma cell line and different areas
of the brain (Fig 3). C6 glioma cell line showed significantly less enzyme activity than
astrocytes cell culture (Fig 3A). Immunocontent of enzyme was also measured (Fig 3A,
insert). In tissue sample, cerebellum showed an increased enzyme activity compared to
other cerebral regions (Fig 3B). GS content was also measured by immunoblotting
showing higher expression of the enzyme in cerebellum (Fig 3B, insert).

3.5. Assay Specificity

In order to evaluate the functionality and specificity of the assay we tested two GS
modulators: MSO, a specific inhibitor of the enzyme, and peroxide, a general oxidant.
First, we tested the inhibitors MSO and peroxide (both 5 mM) in homogenates of
astrocyte culture for 1h, followed by GS activity assay (Fig 4). In another set of
experiments we tested both inhibitors MSO (1mM) and peroxide (50 µM) in astrocytes
culture treated during 3 h, followed by GS activity assay (Fig 5). In both situations we
observed a statistical reduction in GS activity. It is important to mention that neither
MSO nor hydrogen peroxide caused a reduction of GS expression as seen in
immunoblotting analysis (Fig 5, insert).

4. Discussion

The measurement of GS activity is essential to observe any dysfunction in glutamine-

glutamate cycle and other important pathways in which this enzyme participates in the
brain. In this research we standardized an assay that measures the glutamyl-transferase
activity of glutamine synthetase in astrocytes cell culture, C6 lineage and different brain
tissue. Here, we show a sensible assay, detecting little quantities of product (0.156 mM)
and high linearity with R2 = 0.99 (Fig 1). Furthermore, the technique was very precise
showing an intra-assay and inter-assay CV lower than 10%, which is adequate for
enzymatic assays [32, 33]. GS transferase activity remained linear in range of protein
quantity (from 18.4 to 55.2 µg of protein in cell culture and from 7.6 to 121.1 µg of
protein in hippocampal slices) and time of incubation (5 to 30 min for both samples)
(Fig 2). The characterization of GS assay favors its wide use in the brain research area,

91
providing a good method to study the enzyme in physiologic condition state and
neurodegenerative diseases.

In addition, it was shown the applicability of the assay in different cerebral structures, in
astrocytes culture and in C6 glioma cell line (Fig 3). This assay showed to be highly
sensible, detecting GS activity even in cells with little amount of enzyme, such as C6
glioma cell line. It was shown that ammonia is differentially metabolized, depending on
brain region [34, 35], probably due to differences in astrocytes GS content or activity
from different regions of the CNS [36]. In fact, in our investigation, cerebellum showed
greater basal activity of GS when compared with other regions analyzed, and this
correspond with greater GS immunocontent as showed in western blot analysis.
Interestingly, Cao Danh and coauthor (1985) also obtained high GS activity in
cerebellum of rats compared with similar brain areas analyzed [37].

In our results, GS activity was reduced with MSO or peroxide treatment with no
alteration in the enzyme content. These data, not only demonstrate the specificity of the
assay, but show the importance to measure the activity of the enzyme rather than only
its expression. A commitment in enzyme activity may provide more information about
some physiologic alteration, such as oxidative damage, which results in the enzymatic
impairment.

It is known that enzymatic activity is highly dependent on its structure; and any
conformation change may interfere in its activity. In fact, freezing and thawing may
alter protein structure, which can be misinterpreted in activity assays. Here we show
that GS activity in dry freezing samples and in homogenates of cell culture was not
affected by freezing and thawing. The enzyme was stable up to 1 week, frozen either in
- 20°C or -80°C. It is important to say that the addition of protease inhibitor (PMSF,
EGTA and EDTA) was essential for the maintenance of activity in culture sample
homogenates. Without the addition of these inhibitors, cell culture samples were not
stable even for 24 h frozen (data not shown). Ensuring the stability of the enzyme after
thawing is extremely important to the reliability of the results, and provides better
flexibility to the researcher to do the analysis after experiment.

92
 5. Conclusion

Despite being commonly used, the GS transferase activity assay it was little
standardized in cerebral tissue [27]. Considering that may be differences in GS activity
from different organs it is important to characterize an assay specific for cerebral tissue
[28, 29]. Here, we characterized a colorimetric assay that measures transferase activity
of GS showing accuracy, sensibility and linearity. We demonstrate that it is applicable
in many structures of the CNS and in cell culture. GS transferase activity assay was
shown to be highly sensible to MSO treatment without changing the expression of the
enzyme, showing specificity. Furthermore, the evaluation of enzymatic activity after
freezing showed that GS is stable up to one week in dry tissue or cell culture
homogenates. This assay has the advantage to be less susceptible to interference than
synthetase reaction, faster and methodologically safer when compared to radioactive
assay. The literature demonstrates that GS is involved to the pathogenesis of several
neurological disorders, such as HE and AD, and changes in the activity of this enzyme
are a useful marker for astroglial functionality in acute brain injury and
neurodegeneration disorders. Herein, we standardized in brain tissue and astrocyte
culture a reliable, simple and cheaper GS activity assay, potentially very useful for the
investigation of this enzyme in physiological and pathological situations.

Acknowledgements: This work was supported by Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Rio Grande do Sul (FAPERGS) and Instituto Nacional de Ciência e tecnologia (INCT).

93
 6. References

[1] G. Pesole, M.P. Bozzetti, C. Lanave, G. Preparata, C. Saccone, Glutamine

synthetase gene evolution: a good molecular clock, Proc Natl Acad Sci U S A, 88
(1991) 522-526.

[2] Y. Kumada, D.R. Benson, D. Hillemann, T.J. Hosted, D.A. Rochefort, C.J.
Thompson, W. Wohlleben, Y. Tateno, Evolution of the glutamine synthetase gene, one
of the oldest existing and functioning genes, Proc Natl Acad Sci U S A, 90 (1993) 3009-
3013.

[3] Y. Wang, J. Kudoh, R. Kubota, S. Asakawa, S. Minoshima, N. Shimizu,

Chromosomal mapping of a family of human glutamine synthetase genes: functional
gene (GLUL) on 1q25, pseudogene (GLULP) on 9p13, and three related genes
(GLULL1, GLULL2, GLULL3) on 5q33, 11p15, and 11q24, Genomics, 37 (1996) 195-
199.

[4] A. Meister, Glutamine synthetase from mammalian tissues, Methods Enzymol, 113
(1985) 185-199.

[5] K. Chan, S.M. Busque, M. Sailer, C. Stoeger, S. Bröer, H. Daniel, I. Rubio-Aliaga,

C.A. Wagner, Loss of function mutation of the Slc38a3 glutamine transporter reveals its
critical role for amino acid metabolism in the liver, brain, and kidney, Pflugers Arch,
468 (2016) 213-227.

[6] C.F. Rose, A. Verkhratsky, V. Parpura, Astrocyte glutamine synthetase: pivotal in

health and disease, Biochem Soc Trans, 41 (2013) 1518-1524.

[7] A.J. Cooper, The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in
cerebral ammonia homeostasis, Neurochem Res, 37 (2012) 2439-2455.

[8] A.T. Holten, V. Gundersen, Glutamine as a precursor for transmitter glutamate,

aspartate and GABA in the cerebellum: a role for phosphate-activated glutaminase, J
Neurochem, 104 (2008) 1032-1042.

[9] H.G. Bernstein, J. Bannier, G. Meyer-Lotz, J. Steiner, G. Keilhoff, H. Dobrowolny,

M. Walter, B. Bogerts, Distribution of immunoreactive glutamine synthetase in the
adult human and mouse brain. Qualitative and quantitative observations with special

94
emphasis on extra-astroglial protein localization, J Chem Neuroanat, 61-62 (2014) 33-
50.

[10] W. Cammer, Glutamine synthetase in the central nervous system is not confined to
astrocytes, J Neuroimmunol, 26 (1990) 173-178.

[11] Y. Trabelsi, M. Amri, H. Becq, F. Molinari, L. Aniksztejn, The conversion of

glutamate by glutamine synthase in neocortical astrocytes from juvenile rat is important
to limit glutamate spillover and peri/extrasynaptic activation of NMDA receptors, Glia,
65 (2017) 401-415.

[12] A.R. Jayakumar, M.D. Norenberg, Glutamine Synthetase: Role in Neurological

Disorders, Adv Neurobiol, 13 (2016) 327-350.

[13] C.K. Petito, M.C. Chung, L.M. Verkhovsky, A.J. Cooper, Brain glutamine
synthetase increases following cerebral ischemia in the rat, Brain Res, 569 (1992) 275-
280.

[14] M. Kulijewicz-Nawrot, E. Syková, A. Chvátal, A. Verkhratsky, J.J. Rodríguez,

Astrocytes and glutamate homoeostasis in Alzheimer's disease: a decrease in glutamine
synthetase, but not in glutamate transporter-1, in the prefrontal cortex, ASN Neuro, 5
(2013) 273-282.

[15] L.C. Ribeiro, A. Quincozes-Santos, M.C. Leite, R.T. Abib, J. Kleinkauf-Rocha, R.

Biasibetti, L.N. Rotta, S.T. Wofchuk, M.L. Perry, C.A. Gonçalves, C. Gottfried, Caloric
restriction increases hippocampal glutamate uptake and glutamine synthetase activity in
Wistar rats, Neurosci Res, 64 (2009) 330-334.

[16] C. Bernardi, A.C. Tramontina, P. Nardin, R. Biasibetti, A.P. Costa, A.F. Vizueti, C.
Batassini, L.S. Tortorelli, K.M. Wartchow, M.F. Dutra, L. Bobermin, P. Sesterheim, A.
Quincozes-Santos, J. de Souza, C.A. Gonçalves, Treadmill exercise induces
hippocampal astroglial alterations in rats, Neural Plast, 2013 (2013) 709732.

[17] S.H. Liaw, I. Kuo, D. Eisenberg, Discovery of the ammonium substrate site on
glutamine synthetase, a third cation binding site, Protein Sci, 4 (1995) 2358-2365.

[18] A. Meister, The specificity of glutamine synthetase and its relationship to substrate
conformation at the active site, Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 31 (1968) 183-218.

95
[19] R. Minet, F. Villie, M. Marcollet, D. Meynial-Denis, L. Cynober, Measurement of
glutamine synthetase activity in rat muscle by a colorimetric assay, Clin Chim Acta, 268
(1997) 121-132.

[20] W.B. Rowe, A. Meister, Studies on the inhibition of glutamine synthetase by

methionine sulfone, Biochemistry, 12 (1973) 1578-1582.

[21] B.H. Juurlink, Glutamine synthetase and glutamyltransferase activities in the

mouse astrocyte in vitro, Neurochem Res, 7 (1982) 905-910.

[22] S.C. Dennis, J.C. Lai, J.B. Clark, The distribution of glutamine synthetase in
subcellular fractions of rat brain, Brain Res, 197 (1980) 469-475.

[23] E.R. Stadtman, B.M. Shapiro, A. Ginsburg, H.S. Kingdon, M.D. Denton,
Regulation of glutamine synthetase activity in Escherichia coli, Brookhaven Symp Biol,
21 (1968) 378-396.

[24] H. Yamamoto, H. Konno, T. Yamamoto, K. Ito, M. Mizugaki, Y. Iwasaki,

Glutamine synthetase of the human brain: purification and characterization, J
Neurochem, 49 (1987) 603-609.

[25] R.A. Ronzio, S. Wilk, W.B. Rowe, A. Meister, Preparation and studies on the
characterization of sheep brain glutamine synthetase, Biochemistry, 8 (1969) 2670-
2674.

[26] E. Ehrenfeld, S.J. Marble, A. Meister, ENZYMATIC SYNTHESIS OF GAMMA-

GLUTAMYLHYDROXAMIC ACID FROM GLUTAMIC ACID AND
HYDROXYLAMINE, J Biol Chem, 238 (1963) 3711-3716.

[27] N. Seiler, J. Reid, B. Knödgen, A sensitive method for the assay of glutamine
synthetase, Neurochem Res, 15 (1990) 301-305.

[28] K. Iqbal, J.H. Ottaway, Glutamine synthetase in muscle and kidney, Biochem J,
119 (1970) 145-156.

[29] T. Böttcher, M. Goiny, J. Bering, S. Domhof, R. Nau, U. Ungerstedt, Regional

differences in glutamine synthetase inhibition by L-methionine sulfoximine: a
microdialysis study in the rabbit brain, Exp Brain Res, 150 (2003) 194-200.

96
[30] C. Gottfried, F. Tramontina, D. Gonçalves, C.A. Gonçalves, E. Moriguchi, R.D.
Dias, S.T. Wofchuk, D.O. Souza, Glutamate uptake in cultured astrocytes depends on
age: a study about the effect of guanosine and the sensitivity to oxidative stress induced
by H(2)O(2), Mech Ageing Dev, 123 (2002) 1333-1340.

[31] G.L. Peterson, A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which
is more generally applicable, Anal Biochem, 83 (1977) 346-356.

[32] V.V. Daitx, J. Mezzalira, V.a.C. Moraes, A.C. Breier, J. Cé, J.C. Coelho,
Comparing the alpha-galactosidase A biochemical properties from healthy individuals
and Fabry disease patients, Clin Chim Acta, 445 (2015) 60-64.

[33] Z. Lukacs, P. Nieves Cobos, A. Keil, R. Hartung, E. Mengel, M. Beck, M.

Deschauer, F. Hanisch, R. Santer, Dried blood spots in the diagnosis of lysosomal
storage disorders--possibilities for newborn screening and high-risk population
screening, Clin Biochem, 44 (2011) 476.

[34] E.A. Kosenko, E.E. Beloushko, I.G. Kaminskiĭ, [Differences between cerebellum
and hippocampus in antioxidant system], Biomed Khim, 60 (2014) 469-472.

[35] E.A. Kosenko, L.A. Tikhonova, V.P. Reddy, G. Aliev, Y.G. Kaminsky,
Differential up-regulation of ammonia detoxifying enzymes in cerebral cortex,
cerebellum, hippocampus, striatum and liver in hyperammonemia, CNS Neurol Disord
Drug Targets, 13 (2014) 1089-1095.

[36] A.J. Patel, M.D. Weir, A. Hunt, C.S. Tahourdin, D.G. Thomas, Distribution of
glutamine synthetase and glial fibrillary acidic protein and correlation of glutamine
synthetase with glutamate decarboxylase in different regions of the rat central nervous
system, Brain Res, 331 (1985) 1-9.

[37] H. Cao Danh, M. Strolin Benedetti, P. Dostert, Age-related changes in glutamine

synthetase activity of rat brain, liver and heart, Gerontology, 31 (1985) 95-100.

[38] V. Felipo, R.F. Butterworth, Neurobiology of ammonia, Prog Neurobiol, 67 (2002)

259-279.

97
Table 1 Frozen stability of the enzyme.

Astrocytes Hippocampal slices

-20°C -80°C -20°C -80°C
Fresh 2.5±0.2 2.5±0.2 2.2 ±0.2 1.92±0.27
1 day 2.4±0.3 2.5±0.3 1.7±0.3 1.80±0.17
1 week 2.0±0.1 2.2±0.1 2.3±0.5 1.77±0.25

Legends of figures

Fig 1. Sensibility and linearity of the assay. Representative curve of standard

quantities of γ-glutamylhydroxamate acid ranged from 0.156 mM to 20 mM containing
the total incubation mixture. The absorbance was measured at 540 nm. The curve’s
correlation coefficient is shown.

Fig 2. Time of incubation and protein quantity linearity in astrocytes and

hippocampal slices. The same samples of astrocytes culture (A) or hippocampal slices
(B) were incubated at different time intervals, ranged from 5 to 30 minutes. For
standard quantities of protein several dilution of the same sample were made in
astrocytes culture (C) and in hippocampal slices (D) and incubated for 15 min.
Glutamine synthetase activity was expressed as µmol/h/mg prot. The correlation
coefficient (R²) was calculated for each curve.

Fig 3. Applicability of the assay in CNS. GS transferase activity was measured in (A)
astrocyte culture and C6 cell line or (B) in cerebral cortex (CX), hippocampus (HC),
cerebellum (CE), striatum (ST) and hypothalamus (HT) of Wistar rats. Imunocontent of
GS is shown in inserts in A and B. Each value is the mean (± standard error) of at least
5 independent experiments performed in triplicate or five rats. * represent significantly
difference, in (A) t-test and in (B) one way ANOVA followed by Duncan’s test, with a
significance level of p < 0.05).

Fig 4. GS activity is inhibited in vitro. Astrocytes previously homogenized were

incubated with 5 mM of MSO or peroxide at 37°C and GS activity was measured after
1h. Each value is the mean (± standard error) of at least 5 independent experiments

98
performed in triplicate. * significantly different (one way ANOVA followed by
Duncan’s test, with a significance level of p < 0.05).

Fig 5. GS activity is inhibited in treated astrocytes culture. MSO 1 mM or 50 µM of

peroxide were incubated in astrocytes culture at 37°C and GS activity was measured
after 3h. Immunocontent of GS is shown in insert. Each value is the mean (± standard
error) of at least 5 independent experiments performed in triplicate. * significantly
different (one way ANOVA followed by Duncan’s test, with a significance level of p <
0.05).

99
Figure 1

100
Figure 2

101
Figure 3

102
Figure 4

103
Figure 5

104
4. Discussão

4.1. Caracterização molecular e funcional de cultura primária de astrócitos,

astrócitos imortalizados e glioma C6.

Este trabalho teve como principal objetivo comparar três diferentes modelos de

cultura de astrócitos - cultura primária (CP), astrócitos imortais (AI) e linhagem C6

(C6) no que diz respeito às propriedades moleculares e, principalmente, funcionais de

cada tipo celular. Uma análise completa e a integração das características de cada célula

em um único estudo permitiu a comparação direta, uma vez que as condições de cultivo

foram mantidas as mesmas. Desta forma, foi possível avaliar o modelo mais adequado

de estudo para astrócitos em cultura, avaliando-se as desvantagens e vantagens de cada

tipo celular.

4.1.1. Avaliação da morfologia basal e plasticidade após estímulo

Varias funções dos astrócitos dependem da sua capacidade de alteração

morfológica, uma vez que quando emitem processos conseguem regular o

microambiente extracelular, ou mesmo interferir na atividade sináptica dos neurônios

(Ostroff et al. 2014, De Pittà et al. 2016). A capacidade das células em cultivo de

responder a certos estímulos com alterações morfológicas e emissão de processos é uma

ferramenta muito eficiente e utilizada para a avaliação das funções astrocíticas. Neste

trabalho, observamos que em estado basal CP e AI apresentavam morfologia mais

similar, mostrando formato poligonal e citoesqueleto de actina mais regular (Fig 1,

capítulo I). Já a linhagem C6, mostrou aspecto mais alongado, triangular e com uma

rede de filamentos de actina mais irregular. Um estudo anterior, já havia registrado

diferenças na estrutura do citoesqueleto entre CP e C6, destacando um aspecto mais

105
desorganizado nos filamentos de actina em C6, justificado por ser uma célula de

propriedades invasivas (Zhou et al. 2008). No entanto, quando o estímulo de forskolina

foi testado nestas células, AI não foram capazes de alterar a sua morfologia, como foi

observado em CP e C6. A forskolina é um estímulo clássico que induz alterações

morfológicas por um aumento intracelular dos níveis de AMPc (Frizzo et al. 2004). De

uma forma semelhante, outro estudo mostrou a incapacidade de AI alterarem a

expressão de GFAP em resposta a dibutiril AMPc em comparação com CP e C6 (Geller

& Dubois-Dalcq 1988). Estes resultados indicam a restrição do uso de AI para estudo de

alterações morfológicas em cultura. Em contraposição, CP e C6 apresentaram alta

capacidade de mudança morfológica, contraindo o corpo celular e emitindo processos

longos após estímulo com forskolina. Embora C6 tenha respondido ao estímulo, é

importante ressaltar que os processos vistos em CP foram mais proeminentes. Foi visto

que o subcultivo de cultura de astrócitos primários induziu uma mudança morfológica,

reduzindo a quantidade de processos aparentes (Passaquin et al. 1994). Este resultado

indica que o processo de subcultivo pode afetar a capacidade de resposta morfológica da

célula, como no caso de AI e C6. Além disso, as linhagens apresentaram redução no

nível de GFAP e vimentina, o que é considerado essencial para a indução de hipertrofia

em astrócitos (Wilhelmsson et al. 2004).

4.1.2. Perfil molecular dos diferentes modelos de astrócitos

O perfil molecular dos astrócitos é bastante heterogêneo, dependendo da origem,

local ou mesmo contexto patológico onde se encontra. Apesar disso, algumas proteínas

características são usadas como marcadores moleculares deste tipo celular. Sabe-se que

durante o desenvolvimento astrócitos reduzem os níveis de vimentina e aumentam os de

106
GFAP (Menet et al. 2001). De acordo com os dados do nosso estudo os três modelos de

astrócitos mostram razão aumentada de GFAP / vimentina.

Neste trabalho avaliamos o conteúdo intracelular de GFAP e S100B, que são

proteínas altamente usadas como marcadores astrogliais (Eng 1985, Van Eldik &

Wainwright 2003, Brozzi et al. 2009). Ambas as proteínas foram detectadas nos três

modelos de cultura de astrócitos, embora em quantidades significativamente menores

nos AI e C6 (Fig 2, Capítulo I). Resultados similares já haviam sido relatados para os

modelos de astrócitos, porém muitas vezes negligenciando a diferença em relação à

quantidade de proteína (Raju et al. 1980, Tabuchi et al. 1982, Groves et al. 1993,

Morikawa et al. 2001, Furihata et al. 2016). Além destes marcadores clássicos, também

foi avaliado a presença da proteína ALDH1L1 que vem sendo usada como um novo

marcador astroglial específico (Yang et al. 2011, Souza et al. 2013). Embora esta

proteína participe do metabolismo do folato, estando relacionada com divisão e

crescimento celular (Krupenko 2009) observamos níveis reduzidos em AI e C6 em

comparação com CP. O mesmo resultado foi encontrado para AQP4, proteína altamente

expressa em astrócitos (Papadopoulos & Verkman 2013). Uma possível explicação para

a redução nos níveis de proteínas marcadores de astrócitos em AI e C6 seria as altas

taxas proliferativas destas células, as quais devem investir menos no perfil de

diferenciação, em comparação com CP cuja taxa crescimento é bem menor.

A quantidade de canais de potássio Kir4.1 foi similar entre os três tipos

celulares. Trabalhos anteriores mostraram que a condutância de potássio é muita baixa

em gliomas em comparação com células diferenciadas. No entanto, este

comprometimento não se deve a uma redução nos níveis de expressão dos canais, mas

sim em uma diferença de localidade. Em gliomas os canais de potássio estão

proeminentemente expressões no núcleo ao invés da membrana celular (Olsen &

107
Sontheimer 2008). Portanto, a expressão equivalente do canal Kir4.1 em AI e C6 em

comparação com CP pode não representar a funcionalidade dos transportadores de

potássio.

4.1.3. Caracterização funcional do metabolismo do glutamato em modelo

de astrócitos

Os astrócitos desempenham um papel essencial no metabolismo do glutamato,

sendo importante para a depuração deste aminoácido da fenda sináptica, evitando assim

a excitotoxicidade. Qualquer disfunção nos transportadores de glutamato ou mesmo na

atividade da GS pode comprometer as funções cerebrais e está relacionada com o

desenvolvimento de doenças neurodegenerativas (Benarroch 2010). De fato, a atividade

da GS está intimamente ligada com a funcionalidade dos transportadores. Foi visto que

uma inibição na atividade da GS compromete a depuração de glutamato pelos EAATs

(Trabelsi et al. 2017). Os nossos resultados mostram que tanto AI quanto C6 são

positivos para EAAT1, EAAT2 e GS, porém apresentam níveis reduzidos em

comparação com CP (Fig 3 , Capítulo I). Além disso, observamos que não apenas a

quantidade, mas também a funcionalidade destas proteínas está reduzida, avaliada pela

captação de glutamato e atividade da GS. A presença de transportadores de glutamato

em linhagens de astrócitos não é clara. Embora alguns estudos tenham detectado a

presença de transportadores de glutamato, a funcionalidade destes não foi avaliada

(Baber & Haghighat 2010, Furihata et al. 2016). Já outros estudos não detectaram a

presença destes transportadores (Palos et al. 1996, Vanhoutte & Hermans 2008). Estas

diferenças podem estar relacionadas ao número de passagens celulares, pelo menos no

que diz respeito às células C6. As células negativas para EAAT2 foram observadas em

um estudo com C6 de baixas passagens, em oposição às células do nosso estudo, as

quais foram subcultivadas pelo menos 100 vezes. Pouco se sabe sobre o processo de
108
transição da linhagem C6, a qual, ao longo das passagens reduz características tumorais

para expressar fatores mais similares a um astrócitos diferenciado. Apesar disso, este

processo parece ser fundamental para a sua diferenciação. Foi visto em trabalhos

anteriores que a super-expressão de EAAT2 em células C6, reduziu a taxa proliferativa

após estímulo com glutamato (Vanhoutte & Hermans 2008), indicando a relação inversa

entre a presença de transportador de glutamato com a proliferação celular.

Outra característica importante dos astrócitos é a regulação e manutenção de

defesas antioxidantes. Estas células são ricas em GSH, um tripeptídeo composto de

glutamato, cisteína e glicina, considerado o principal antioxidante cerebral. Além de se

auto-proteger, astrócitos são capazes de suprir neurônios com precursores para a síntese

de GSH para defesa contra oxidantes (Dringen & Hamprecht 1996, Dringen et al.

2015). Nossos resultados mostraram quantidade similar no conteúdo de GSH nos três

modelos de cultura celular. Sabe-se que o glutamato é um precursor da síntese de GSH

(Matés et al. 2002). Contudo, os nossos dados mostraram que as linhagens celulares

captam menos glutamato em comparação com CP. Portanto, pode-se sugerir que o

glutamato captado por AI e C6 destina-se mais para a síntese de GSH, comparando

proporcionalmente com a CP. Em outras palavras, pode-se supor que o glutamato

captado pelas linhagens seria destinado em grande parte à produção de GSH, ao invés

da síntese de glutamina (Dringen 2000, McKenna 2007). O destino do glutamato uma

vez dentro do astrócito, mostrou-se variado, dependente das concentrações de glutamato

extracelular e de outros metabólitos (McKenna 2007). Portanto, esta via pode ser

diferentemente regulada em CP e nas linhagens celulares avaliadas. Além disso, não se

pode descartar outras fontes internas de glutamato, como o ciclo do ácido tricarboxílico.

Ainda, a expressão do sistema antiporter Xc cisteína-glutamato mostrou-se aumentada

em gliomas em comparação com astrócitos normais, contribuindo para o crescimento e

109
expansão celular. Este sistema também pode contribuir para a síntese de GSH, uma vez

que promove a entrada de seu substrato cisteina na célula (Bridges et al. 2012). Altos

níveis de GSH são necessários em células tumorais como uma defesa antioxidante

devido ao alto metabolismo oxidativo destas células (Marie & Shinjo 2011). Além do

mais, a GSH tem sido relacionada com a proliferação celular, interferindo na atividade

da telomerase (Pallardó et al. 2009). Portanto, é pertinente pensar que células

proliferativas tenham a via de produção de GSH mais ativa.

4.1.4. Comparação do metabolismo energético e comunicação por junção

gap em modelos de astrócitos

Os astrócitos são considerados elementos chave no metabolismo da glicose,

captando-a pelos pés-terminais em contato com vasos sanguíneos e redistribuindo-a aos

neurônios. O GLUT-1 é o principal transportador de glicose em astrócitos (Pellerin

2008). A glicose captada pode ser armazenada na forma de glicogênio e/ou convertida a

lactato para exportação aos neurônios (Bouzier-Sore & Pellerin 2013). Em relação à

expressão do transportador de glicose, AI e C6 apresentaram baixa quantidade de

GLUT-1 quando comparada aos níveis da CP. Porém, a funcionalidade deste

transportador, avaliado pela captação de glicose, foi significativamente maior em

células C6 do que AI e CP (Fig 4, Capítulo I). De acordo com este resultado, outro

trabalho mostrou que células C6 utilizam mais glicose e produzem menos lactato em

condições basais quando comparadas com astrócitos normais (Haghighat & McCandless

1997a, Haghighat & McCandless 1997b). Os autores sugerem que a glicose captada

pela C6 pode ser destinada a outras vias, como a das pentoses-fosfato para a síntese de

nucleotídeos. Se considerarmos esta hipótese, a via das pentoses-fosfato serve também

para a produção de NADPH, o qual pode ser utilizado pela glutationa redutase para a

manutenção dos níveis de GSH (Dringen et al. 2015). Além disso, sabe-se que o

110
metabolismo energético é um dos principais processos afetados durante a transição de

células normais para as células tumorais, e é um determinante para a manutenção da

proliferação celular (Marie & Shinjo 2011). Tendo-se em conta que as células C6 são

originadas a partir de um glioma, pode ser facilmente assumido que estas células ainda

mantenham algumas características das células tumorais, como por exemplo, a alta taxa

de proliferação e o alto consumo de glicose. É interessante notar que, embora os AI

tenham uma alta taxa proliferativa, não apresentaram uma maior captação de glicose,

assim como as C6. Os astrócitos imortalizados originam-se de um astrócito normal e

não de uma célula maligna, o que pode implicar em outras vias metabólicas ativadas

distintas de um tumor.

Além disso, o metabolismo da glicose está relacionado à comunicação por

junção gap, uma vez que substratos energéticos podem ser transferidos de célula a

célula por meio destas estruturas (Rouach et al. 2002). Por outro lado, as junções gap

estão também relacionadas às taxas de proliferação celular. As linhagens tumorais são

normalmente desprovidas de junção gap, uma vez que moléculas promotoras de tumor

as inibem (Budunova & Williams 1994). De fato, células C6 apresentam baixos níveis

de comunicação por junção gap, e são normalmente usadas como controle negativo para

esse tipo de ensaio (Leite et al. 2009, Tabernero et al. 2006). De acordo com isto, tanto

células C6 quanto AI apresentaram baixos níveis de Cx43 em comparação com CP (Fig

5, Capítulo I). Foi visto que um aumento da expressão de conexinas em células C6,

através de transfecção, diminui a captação de glicose e a taxa proliferativa destas

células, ao mesmo tempo que inibidores de junção gap aumentam a captação de glicose

(Tabernero et al. 2006). Assim, os altos níveis de captação de glicose, observados nas

células C6, podem também ser explicados pelo baixo nível de junção gap.

4.1.5. Avaliação de resposta nos modelos de cultura de astrócitos

111
 Alguns resultados contraditórios são encontrados na literatura quando diferentes

modelos de cultura de astrócitos são submetidos ao mesmo estímulo. Por exemplo, o

tratamento com glicose diminui a secreção de S100B em CP, porém aumenta em C6

(Nardin et al. 2007). O tratamento com amônia induz diferente resposta energética em

CP e C6 (Haghighat & McCandless 1997b), assim como os baixos níveis de

comunicação por junção gap em C6 induzem um aumento na captação de glicose

(Tabernero et al. 2006). Ainda, astrócitos imortalizados não responderam ao

tratamento com dibutiril AMPc em relação aos níveis de GFAP (Morikawa et al. 2001),

assim como não responderam ao tratamento com dopamina em relação aos níveis de

NGF em comparação com astrócitos normais (Geller & Dubois-Dalcq 1988). Essas

variações dificultam a análise dos dados e questionam a validade dos modelos. É

importante salientar que, além da variação biológica de cada tipo celular, resultados

contraditórios podem ser devido as diferentes condições de cultivo, como o protocolo de

cultivo, composição do meio e o número de subcultivos no caso de linhagens (Lange et

al. 2012). Estas variações podem interferir na expressão de genes e variação

morfológica (Passaquin et al. 1994). Recentemente foi observado que a composição da

matriz extracelular determina a resposta de astrócitos a estímulos mecânicos e

inflamatórios (Johnson et al. 2015). Neste trabalho, considerando que mantivemos as

mesmas condições de cultivo para os três modelos, podemos garantir que os efeitos

observados foram decorrentes apenas da variação biológica de cada célula. Os estímulos

utilizados já eram conhecidos na literatura por causar alterações funcionais em

astrócitos de cultura primária. Em geral, os resultados mostraram que CP e C6

respondem de forma semelhante ao mesmo estímulo, quanto à secreção de S100B, ao

metabolismo oxidativo de GSH, à atividade da glutamina sintetase e à captação de

glicose (Tabela 1, Capítulo I). Portanto, apesar de apresentarem frequentemente

112
diferenças na quantidade basal de proteína, as vias ativadas pelo mesmo estímulo

parecem ser semelhantes. Em contraste, os AI com a transfecção utilizada nesse estudo

mostraram pouca reatividade nos ensaios testados, apenas respondendo para o estímulo

relacionado à captação de glicose, indicando não ser um bom modelo para o estudo de

características específicas de astrócitos. Recentemente foi demonstrado que astrócitos

expressam duas isoformas da p53, as quais tem efeitos opostos sobre a neuroprotecção

mediada por astrócitos e a neurodegeneração (Turnquist et al. 2016). Deste modo, uma

inibição da p53, como ocorre no processo de transfecção e imortalização dos astrócitos,

pode afetar a funcionalidade destes genes, mudando portanto, a capacidade de resposta

destas células.

4.1.6. Escolha do modelo de cultura de astrócitos

Nesta parte do trabalho, apresentamos uma análise integrativa e comparativa de

três modelos de cultura de astrócitos: cultura primária, astrócitos imortais e linhagem

C6. Analisamos, em condição basal, não apenas o perfil de expressão proteica de cada

modelo celular, mas também a funcionalidade destas proteínas quanto ao metabolismo

do glutamato e da glicose e a comunicação celular. Além disso, a variação morfológica

ou respostas bioquímicas após a indução do mesmo estímulo também foi avaliado.

A taxa de proliferação é uma das principais diferenças entre CP e as linhagens

celulares. Esta variação pode explicar algumas diferenças basais relacionadas ao perfil

de expressão proteica. A alta taxa de crescimento das linhagens celulares acarreta em

um maior investimento em proteínas proliferativas, ao invés de proteínas relacionadas à

diferenciação. Logo, estas células podem apresentar um fenótipo de diferenciação

incompleta, o que justificaria os baixos níveis de proteínas marcadoras de astrócitos. De

fato, os níveis de qualquer proteína específica dentro da célula são dinâmicos. A

expressão de genes pode variar dependendo da densidade celular ou do tempo de

113
transição do ciclo celular. Por exemplo, espera-se uma diminuição dos genes associados

à proliferação e um aumento de genes associados à diferenciação em células confluentes

(Frisa & Jacobberger 2002). A redução da taxa de proliferação induzida, por exemplo,

pela retirada do soro, pode fazer com que a célula adote um status mais diferenciado.

Portanto, é importante manter um padrão de confluência para os estudos em cultivo

celular de forma a alcançar a estabilidade da expressão gênica.

Em geral, nossos resultados mostraram que os dois modelos de linhagens

celulares (AI e C6) foram positivos para proteínas características de astrócitos, porém

com perfil de expressão em quantidade muito menor. Embora AI apresente uma taxa de

crescimento mais lenta do que as células C6 e uma morfologia basal mais similar com

CP, não se revelou um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, uma vez

que não respondeu a maioria dos estímulos testados. Em contraste, as células C6, apesar

de sua origem tumoral, foram capazes de apresentar características diferenciadas,

apresentando resposta similar aos astrócitos de cultura primária quando submetidas ao

mesmo estímulo.

Com base nos nossos dados, embora o CP seja uma técnica mais demorada e

custosa, o uso como modelo reprodutivo para o estudo de astrócitos é sem dúvida

preferencial. A linhagem C6, embora apresente algumas limitações, reproduziu os

astrócitos funcionalmente na maioria dos testes. Além disso, o cultivo destas células é

um processo metodologicamente mais rápido, de baixo custo e sem o uso de animais.

Todas estas questões devem ser consideradas para a escolha de um modelo adequado

para o estudo de astrócitos.

No que diz respeito aos dados relacionados à S100B, que é uma das principais

proteínas características deste tipo celular, CP e C6 apresentaram níveis basais

diferentes, porém quando submetidas ao mesmo estímulo apresentaram resposta

114
semelhante, reduzindo a secreção da proteína em 24h de estimulo com LPS. Contudo,

os níveis reduzidos de proteínas em condições basais apresentados em C6 pode

dificultar o estudo, uma vez que o os dados ficam muito próximos ao limite de detecção

da técnica, muitas vezes gerando resultados negativos. Por este motivo, para a

continuidade do nosso estudo, escolhemos a CP para investigar a capacidade de

internalização da proteína S100B e as vias intracelulares de destino.

4.2. Internalização tempo-dependente da S100B extracelular e análise da

movimentação de vesículas em cultura de astrócitos

De forma a compreender os mecanismos moleculares que os astrócitos adotam para

a manutenção da homeostase cerebral e ainda, para entender os efeitos causados pela

S100B extracelular, estudamos o processo de internalização da proteína S100B marcada

com fluorescência em CP. Os resultados deste estudo revelaram que os astrócitos

captam a S100B extracelular de maneira tempo dependente via endocitose mediada pela

ligação ao RAGE. Ao longo do tempo, as vesículas capturadas S100B-Alexa488

positivas exibem mobilidade direcional, indicando que as vesículas ficam

funcionalmente aderidas ao citoesqueleto (Potokar et al. 2007). Além disso, a

mobilidade das vesículas S100B-Alexa488 positivas parecem ser reguladas pela alteração

intracelular de cálcio induzido por ATP, tal como foi determinado previamente para

vesículas endolisossomais, peptidérgicas e vesículas secretórias glutamatérgicas em

astrócitos (Stenovec et al. 2007, Potokar et al. 2008, Potokar et al. 2010).

4.2.1. Mecanismo de internalização da S100B em cultura de astrócitos

A ligação da proteína S100B com o fluoróforo Alexa permitiu avaliar de forma

eficiente a captação extracelular desta proteína em cultura de astrócitos (Fig 1, Capítulo

115
II). Pela primeira vez, mostrou-se que estas células são capazes de internalizar a

proteína S100B de forma efetiva em apenas 15 min de incubação e, que o número de

partículas captadas aumenta com o tempo de incubação (Fig. 2, Capítulo II). Além

disso, de forma a se entender melhor o mecanismo de endocitose, foi comparado o

processo de internalização de S100B-Alexa488 com Dextran546, um polissacarídeo

comumente usado para determinar mecanismo de endocitose inespecífica (Lim &

Gleeson 2011). Esta comparação permitiu verificar que a internalização inicial das duas

moléculas ocorria de forma diferente em relação ao tempo e estrutura, porém, acabavam

no mesmo compartimento em tempos prolongados, evidenciado pelo alto grau de

colocalização observado em 24h de incubação. Inicialmente, a S100B-Alexa488 foi

captada em uma taxa relativamente mais baixa do que Dextran546, além de apresentar

baixo grau de colocalização entre as duas moléculas. Além disso, a estimativa do

diâmetro das vesículas em 15 min de incubação mostrou-se diferente. Adicionalmente,

o peso molecular destas duas moléculas são diferentes, sendo a S100B homodimérica e

funcional no tamanho de 21 kDa, enquanto que o Dextran apresenta a metade do peso

com 10 kDa. Todos estes dados nos sugeriram um mecanismo distinto de internalização

entre S100B-Alexa488 e Dextran546. A formação da via endocítica pode ser constitutiva

ou mesmo ser ativada pela ligação a um receptor (González et al. 2007). Trabalhos

prévios mostraram que a endocitose de dextran ocorre de forma inespecífica por um

processo mediado por pinocitose (Commisso et al. 2013, Thilo et al. 1995). Sabendo-se

que a maioria dos efeitos extracelulares da S100B são mediados via RAGE (Donato et

al. 2013), neste trabalho verificamos se a internalização da S100B ocorreria por um

processo mediado por receptor. De fato, a internalização da S100B-Alexa488 foi

reduzida quase pela metade com a inibição do receptor RAGE, enquanto que a

internalização do Dextran546 não foi comprometida (Fig. 3, Capítulo II). Portanto, foi

116
possível verificar que a internalização de S100B é mediada pela ligação ao RAGE, pelo

menos em parte. De acordo com isso, os efeitos extracelulares da S100B, tanto tróficos

quanto tóxicos, podem ser dependentes da interação com RAGE (Leclerc et al. 2009,

Donato et al. 2009, Huttunen et al. 2000). A concentração da proteína no espaço

extracelular parece ser um fator importante no desencadeamento desses efeitos (Donato

2007). A endocitose ativada por receptor pode ser mediada tanto por clatrina quanto por

caveolina (Mayor & Pagano 2007). Foi visto que o tratamento com S100B em células

de Schwann promove a fosforilação e ativação de caveolina-1 seguida da internalização

de RAGE (Perrone et al. 2008). Estes dados sugerem que a S100B também pode ser

internalizada por uma forma de endocitose dependente de caveolina-1, contudo, isso

implicaria em maiores investigações. No nosso trabalho, mostramos que tanto a

internalização de S100B-Alexa488 quanto de Dextran546 são dependentes de dinamina,

uma proteína que está envolvida no processo de endocitose mediado tanto por

caveolina, quanto por clatrina e sua atuação é essencial para a cisão da vesícula com a

membrana plasmática (Mayor & Pagano 2007).

4.2.2. Caracterização das vesículas S100B-Alexa488 positivas

Uma vez endocitada, a S100B pode ter vários destinos intracelulares. Neste

trabalho mostramos que a S100B-Alexa488 está presente em vesículas do compartimento

endocítico, as quais participam no transporte intracelular de moléculas e degradação

(Fig 4, Capítulo II). A presença da S100B endógena em compartimentos vesiculares já

tinha sido sugerida por trabalhos prévios (Davey et al. 2001, Perrone et al. 2008), porém

a caracterização destas vesículas tinha sido pouco estudada. Os nossos dados mostraram

que a S100B-Alexa488 internalizada colocaliza fortemente com Dextran546 após a

incubação prolongada (51% após 3 h). Por sua vez, em outros trabalhos foi observado

117
que Dextran546 colocaliza fortemente com marcadores de endossomos tardios - LAMP1

e proteínas Rab7 - representando vesículas terminais do compartimento endolisossomal

(Humphries et al. 2011, Vardjan et al. 2012). Da mesma forma que o Dextran, as

vesículas S100B-Alexa488 positivas colocalizaram fortemente com LysoTracker (56%),

marcador de compartimentos ácidos, o qual também verificou-se que colocaliza com

EEA1 e LAMP1, marcadores de endossomos recentes e tardio, respectivamente

(Potokar et al. 2010). Além disso, uma porção das vesículas marcadas para S100B,

colocalizaram com EAA1 (9%) e LAMP1 (10%). É importante salientar que a via

endolisossomal consiste em subpopulações distintas de vesículas, caracterizadas por

diferentes proteínas de membrana, podendo apresentar vesículas positivas apenas para

Rab7 ou apenas para LAMP1, ou ainda positivas para ambos LAMP1/Rab7. Por sua

vez, cada uma destas vesículas apresentam diferentes dinâmicas intracelulares

(Humphries et al. 2011, Szymanski et al. 2011). Da mesma forma, em células epiteliais

humanas foram encontradas duas sub-populações de vesículas endocíticas de

reciclagem: uma positiva para Rab11 e transferrina; e outra positiva para Rab11 e

Neisseria meningitidis adhesin A (proteína de bactéria). Estas duas subpopulações

tiveram comportamentos diferentes em relação ao mesmo tratamento (Bozza et al.

2014). No nosso trabalho mostramos que a maior parte das vesículas S100B-Alexa488

colocalizam com Dextran546 e Lisotracker, e menos com os marcadores EEA1 e

LAMP1. A baixa colocalização com LAMP1 é intrigante, uma vez que foi visto que

tanto Dextran quanto lysotracker colocalizam fortemente com LAMP1 (Potokar et al.

2010, Vardjan et al. 2012). No entanto, isto pode ser explicado pela forma usada para

estimar a colocalização. Ou seja, a forma que foi expressa, a colocalização mostra que

apenas uma pequena fração de vesículas LAMP1 internalizam S100B, porém não que a

maioria da S100B não se localiza em vesículas positivas para LAMP1. De fato, se a

118
S100B fosse usada como o sinal de referência, a colocalização entre S100B e LAMP1

aumentaria para 39,35 ± 1,54% (n=72) em 1h de incubação, e ainda mais, 78,65 ±

1,26% (n = 82) em 24 h de incubação (resultados não mostrados). Estas análises

indicaram, que na verdade, a maior parte das vesículas positivas para S100B continham

LAMP1. Além disso, é importante se levar em conta que a composição molecular das

vesículas endocíticas é dinâmica e deve variar cada vez que uma vesícula se fusiona

uma com outra (Gould & Lippincott-Schwartz 2009, Scott et al. 2014). Portanto, é

esperado que a colocalização das vesículas positivas para S100B com marcadores

endocíticos não permaneça constante ao longo do tempo, como evidenciado na Fig 2A e

C do Capítulo II dos nossos resultados.

4.2.3. A mobilidade das vesículas S100B-Alexa488 é alterada pelo estímulo

com ATP

A avaliação da mobilidade das vesículas S100B-Alexa488 mostrou um aumento

de direcionalidade ao longo do tempo de incubação (Fig. 5, Capítulo II). Esta análise é

realizada através da avaliação do deslocamento máximo da vesícula e o comprimento

total percorrido (Potokar et al. 2005). Com estas informações é possível avaliar a

direcionalidade da vesícula dividindo-se o deslocamento máximo pelo comprimento

total percorrido. Um aumento de direcionalidade da vesícula também foi observado em

vesículas positivas para vírus transmitido por carrapato em astrócitos (Potokar et al.

2014). Este aumento na mobilidade pode ser explicado pelo progressivo acoplamento

das vesículas ao citoesqueleto, o qual geralmente serve como suporte para o tráfego de

vesículas (Potokar et al. 2007, Potokar et al. 2010, Vardjan et al. 2012, Potokar et al.

2013). No entanto, a mobilidade da vesícula S100B-Alexa488 foi reduzida com o

tratamento de ATP, o qual aumenta as concentrações citosólicas de cálcio (Fig. 6,

119
Capítulo II). Esta resposta é característica de vesículas endossomais de astrócito, uma

vez que o mesmo efeito foi observado em vesículas marcadas com Lysotracker (Potokar

et al. 2010) e Dextran (Vardjan et al. 2012). De fato, um aumento transitório de cálcio

pode afetar a integridade do citoesqueleto, principalmente de microtúbulos e/ou actina,

onde encontram-se proteínas motoras que impulsionam as vesículas (Soldati & Schliwa

2006). Da mesma forma, um aumento prolongado das concentrações de cálcio foi capaz

de induzir o desacoplamento parcial de microtúbulos em astrócitos (Stenovec et al.

2014). Apesar disso, foi verificado que o desacoplamento de microtúbulos ocorre em

concentrações de cálcio bem maiores (1-4 µM) (Schliwa et al. 1981) do que o estimulo

induzido por ATP (100 µM) é capaz de causar (780 ±120nM) (Salter & Hicks 1994).

Portanto, é mais provável que outro mecanismo esteja envolvido na redução de

mobilização destas vesículas. Ainda, foi observado que os endossomos marcados com

Lisotracker apresentam uma redução mais acentuada na direcionalidade quando

comparadas com vesículas peptidérgicas estimuladas com ATP (Stenovec et al. 2016).

Portanto, é possível que alguns tipos de vesículas se desconectem mais facilmente do

citoesqueleto devido a uma diferença de composição de proteínas na membrana e

interação com o citoesqueleto.

Em relação ao significado da redução da mobilidade da vesícula após estímulo

são geradas algumas hipóteses. Nos astrócitos são encontrados vários tipos de vesículas

além das endossomais, incluindo vesículas de aminoácidos (Ex. glutamatérgicas),

vesículas peptidérgicas (Ex. ANP- peptídeo natriurético atrial), e vesículas nucleotídicas

(ex. ATP). Além das diferenças em conteúdo, estas vesículas apresentam tamanhos e

dinâmicas diferentes (Guček et al. 2012). Sabe-se, por exemplo, que vesículas

endossomais e peptidérgicas apresentam uma natureza mais lenta quando comparadas a

vesículas glutamatérgicas. As vesículas de glutamato aumentam sua mobilidade com

120
um estímulo de cálcio, aumentando a fusão com a membrana plasmática e a liberação

de glutamato. Já as vesículas endossomais, como é o caso das vesículas S100B

positivas, podem apresentar a característica chamada “kiss and run” (beijar e fugir),

onde um comprometimento da mobilidade em função da variação de cálcio, poderia

aumentar o tempo de fusão com a membrana plasmática, de forma a liberar mais carga

intravesicular (Parpura et al. 2010, Parpura & Zorec 2010). Interessantemente, o

estímulo com AMPc ou cálcio aumenta a secreção endógena de S100B em

glioblastomas e esta secreção tem sido sugerida ser na forma de vesículas (Davey et al.

2001, Mbele et al. 2002). Além disso, foi visto que a inibição da proteína cinase src,

envolvida no processo de endocitose, diminui a secreção de S100B em células de

Schwann, o que poderia indicar que uma inibição da internalização da S100B também

induziria uma inibição de sua secreção (Perrone et al. 2008). Contudo, mais estudos

seriam necessários para verificar este processo com vesículas de S100B internalizadas.

4.2.4. Regulação da S100B por endocitose

Nesta parte do trabalho mostramos que astrócitos em cultura são capazes de

internalizar a S100B extracelular por um mecanismos de endocitose dependente de

RAGE e dinamina. Uma vez internalizada a S100B segue pela via endocitica,

colocalizando com importantes marcadores desta via, como Dextran e Lysotracker.

Avaliamos também neste trabalho o tráfego intracelular destas vesículas, mostrando um

aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, o qual é afetado pelo

estímulo com ATP que aumenta as concentrações de cálcio intracelular. Estes dados

auxiliam na compreensão do mecanismo de sinalização extracelular da proteína S100B,

assim como o papel dos astrócitos nesta regulação.

Sabe-se que a S100B apresenta efeitos contrastantes no espaço extracelular,

dependente da sua concentração local. Foi visto que em concentrações nanomolares a

121
S100B induz crescimento de neuritos e sobrevivência neuronal em resposta a um

estímulo tóxico, através da ativação de NFκB (Van Eldik & Wainwright 2003,

Villarreal et al. 2011). No entanto, em concentrações micromolares, pode induzir efeitos

tóxicos como apoptose (Hu et al. 1997) e um aumento de EROs por uma via dependente

de MEK/ERK1/2 (Businaro et al. 2006). Particularmente em astrócitos, a S100B em

baixas concentrações induz proliferação e migração em áreas agredidas (Villarreal et al.

2014, Selinfreund et al. 1991), além de prevenir alterações morfológicas e aumento de

iNOS induzido por neurotoxina, via NFκB (Reali et al. 2005). Já em altas

concentrações, a S100B induz a liberação de óxido nítrico e citocinas inflamatórias,

através ativação da via NFκB em astrócitos (Lam et al. 2001, Hu & Van Eldik 1999,

Ponath et al. 2007). A maioria dos efeitos, tanto tróficos quanto tóxicos parecem ser

mediados pela ligação ao RAGE. Neste trabalho usamos 1 µM de S100B, o que é

considerado uma concentração alta, podendo gerar, portanto, efeitos tóxicos. Contudo,

mais estudos seriam necessários para a avaliação destes parâmetros.

In vivo, o aumento das concentrações extracelulares de S100B está associado a

efeitos tóxicos, como por exemplo, após um dano traumático cerebral ou em algumas

doenças neurodegenerativas como doença de Alzheimer e esquizofrenia (Rothermundt

et al. 2003, Steiner et al. 2011). Portanto, a capacidade dos astrócitos de capturar o

excesso de S100B extracelular pode ser interpretada como uma tentativa de recuperação

do ambiente extracelular reduzindo os efeitos tóxicos da proteína, melhorando as

funções do SNC. Além disso, o sistema glinfático deve auxiliar na passagem desta

proteína do LCR para o soro e, qualquer comprometimento desta via poderia aumentar o

papel dos astrócitos nesta função de regulação da sinalização extracelular de S100B

(Plog et al. 2015).

122
 Esta atividade regulatória dos astrócitos pode estar representada em alguns

trabalhos, os quais mostram que ocorre um pico nos níveis de S100B no LCR após

lesão cerebral traumática ou uma resposta inflamatória, seguido por uma redução

subsequente nos níveis desta proteína (Berger et al. 2002, Guerra et al. 2011, Kruse et

al. 1991). Ainda, trabalhos in vitro também mostram um efeito semelhante ao

observado em cultura de astrócitos: citocina inflamatória (de Souza et al. 2013) e

fluoxetina (Tramontina et al. 2008) induzem uma elevação aguda nos níveis

extracelulares de S100B que são reduzidos em períodos mais longos. Esta redução dos

níveis extracelulares de S100B pode ser devido a uma diminuição da secreção desta

proteína por astrócitos, ou mesmo um aumento da captação de S100B por estas células.

A internalização da proteína pode representar não só uma forma de recuperar a

composição molecular do ambiente extracelular, mas também uma forma de sinalização

e comunicação intercelular. Considerando que as concentrações extracelulares de

S100B são determinantes para seu efeito trófico ou tóxico, os astrócitos devem ter a

importante função da regulação fina das concentrações extracelulares desta proteína,

regulando a resposta inflamatória ou trófica (Sofroniew 2015). Neste trabalho

mostramos que a internalização é, em parte, dependente de RAGE, o qual medeia tanto

respostas tróficas quanto tóxicas (Villarreal et al. 2014). Não se pode descartar que

outras células, além dos astrócitos, podem estar envolvidas na remoção extracelular de

S100B, como, por exemplo, a micróglia, a qual também expressa RAGE (Yan et al.

1996) e é capaz de endocitar debris extracelulares via pinocitose (Neumann et al. 2009),

macropinocitose (Mandrekar et al. 2009), assim como endocitose mediada por receptor

(Lee et al. 2008).

Portanto, a internalização da S100B pelos astrócitos pode representar uma tentativa

de reduzir as concentrações extracelulares da proteína de forma a evitar alguns efeitos

123
tóxicos, minimizando o dano em células vizinhas. Assim como, a internalização pode

representar uma forma de sinalização, onde os astrócitos captam S100B via RAGE, de

forma a induzir sinais intracelulares e mediar tanto respostas tóxicas, quanto tróficas.

4.3. Padronização de ensaio colorimétrico para dosagem de atividade da GS

Além da proteína S100B, outra proteína importante para a caracterização de

astrócitos é a GS. Nesta parte de nosso estudo, padronizamos um ensaio colorimétrico

que mede a atividade glutamil-transferase da GS em cultura de células e em diferentes

tecidos cerebrais. O estabelecimento de uma técnica confiável para a dosagem da

atividade da GS é essencial para verificar disfunções que podem ocorrer no ciclo

glutamina-glutamato e outras vias importantes das quais esta enzima participa no

cérebro.

Neste trabalho, conseguimos mostrar um ensaio sensível, detectando baixas

concentrações de produto (0,156 mM) e alta linearidade com R = 0,99 (Fig. 1, Capítulo

III). Além disso, a técnica foi precisa, mostrando um coeficiente de variância intra-

ensaio e inter-ensaio inferior a 10%, o que é adequado para ensaios enzimáticos (Lukacs

et al. 2011, Daitx et al. 2015). A atividade transferase da GS foi linear com relação a

quantidade de proteína (entre 18,4 - 55,2 μg em cultura celular e 7,6 - 121,1 μg em

fatias de hipocampo), bem como ao tempo de incubação (5 a 30 min para ambas as

amostras).

Além disso, o ensaio se mostrou com alta aplicabilidade, medindo a atividade da

GS em diferentes estruturas cerebrais, assim como em cultura de astrócitos e na

linhagem celular de glioma C6 (Fig. 3, Capítulo III). O ensaio foi altamente sensível,

detectando a atividade da GS mesmo em células com pouca quantidade da enzima,

como na linhagem C6. A enzima GS tem grande participação na detoxificação da

amônia cerebral. Estudos prévios mostram que a amônia é metabolizada diferentemente

124
dependendo da região cerebral (Kosenko et al. 2014a, Kosenko et al. 2014b),

provavelmente devido a diferenças no conteúdo ou atividade de GS nestas regiões (Patel

et al. 1985). De fato, neste estudo, o cerebelo apresentou maior atividade basal de GS

quando comparado com outras regiões analisadas. Corroborando com isso, Cao Danh e

Coauthor (1985) também obtiveram elevada atividade de GS no cerebelo de ratos

comparados com áreas cerebrais semelhantes (Cao Danh et al. 1985).

A atividade da GS foi comprometida pela incubação com MSO ou peróxido,

devido à ligação específica do inibidor ou oxidação da enzima, respectivamente, e não

devido alteração no seu conteúdo como mostrado por imunobloting (Fig 5, Capítulo

III). Estes resultados não apenas demonstram a especificidade do ensaio, mas também

salientam a importância de se medir a atividade da enzima, e não somente o seu

conteúdo. Como no nosso exemplo, um dano oxidativo pode comprometer a atividade

da enzima sem afetar o seu conteúdo. Portanto, a dosagem apenas da expressão da

enzima pode refletir de forma errônea a atividade desta.

Sabe-se que a atividade enzimática é altamente dependente da estrutura da

enzima e, portanto, qualquer mudança de conformação pode interferir na sua atividade.

De fato, o processo de congelamento e descongelamento pode alterar a conformação da

enzima e reduzir a sua atividade. Os nossos dados demonstraram que a atividade de GS

foi estável após congelamento, tanto em homogeneizados de cultura celular quanto em

fatias cerebrais congeladas a seco. A enzima mostrou-se estável por uma semana,

congeladas tanto a -20 ° C ou -80 ° C. A adição de inibidor de protease (PMSF, EGTA e

EDTA) foi essencial para a preservação da atividade em homogeneizados de amostras

de cultura. Sem a adição destes inibidores, estas amostras não foram estáveis nem

durante 24 h congeladas (dados não apresentados). A análise da estabilidade da enzima

125
é extremante importante para que o pesquisador tenha maior confiabilidade nos seus

resultados. Além disso, flexibiliza o tempo de dosagem após experimento.

4.3.1. Vantagens do ensaio

A atividade transferase da GS, apesar de comumente usada, foi pouco padronizada

para estruturas cerebrais. De fato, apenas um trabalho na literatura relata a padronização

do ensaio de GS para medir a atividade transferase, porém, além de ser uma

padronização mais simples, apresentou diferenças na composição dos substratos e usou-

se cromotografia para a identificação do produto (Seiler et al. 1990). Neste trabalho

caracterizamos um ensaio colorimétrico que mede com precisão, sensibilidade e

linearidade a atividade transferase da GS em diferentes estruturas cerebrais, assim como

em cultura de astrócitos e linhagem C6, evidenciando a sua alta aplicabilidade. Além

disso, esta técnica mostrou ser específica para GS, uma vez que o MSO, seu inibidor

específico, reduziu a sua atividade, mas não a quantidade de enzima. A avaliação da

atividade enzimática após congelamento mostrou que é a GS é estável quando mantida a

seco ou em solução de lise na presença de inibidores de protease por até uma semana.

Ainda, este ensaio tem a vantagem de apresentar menos interferentes do que a reação

sintetase. A técnica apresenta baixo custo e é metodologicamente mais segura quando

comparado com o ensaio radioativo. A literatura demonstra que a GS está envolvida na

patogênese de vários distúrbios neurológicos, tais como HE e DA, e as alterações na

atividade desta enzima são um marcador útil para a funcionalidade astroglial em lesões

cerebrais agudas e distúrbios neurodegenerativos. A padronização do ensaio da GS em

estruturas cerebrais favorece sua ampla utilização na área de pesquisa, proporcionando

um bom método para estudo da enzima tanto em situações fisiológicas quanto em

situações patológicas.

126
5. Conclusões

De forma geral apresentamos uma análise integrativa e comparativa de três modelos

de cultura celular de astrócitos: cultura primária, astrócitos imortais e linhagem C6.

Estes modelos têm sido estudados de forma a se entender a fisiologia dos astrócitos e o

comportamento destas células frente a diversos estímulos. De acordo com os nossos

dados, e como era esperado, o modelo mais adequado para o estudo de astrócitos sem

dúvida foi representado pela cultura primária de astrócitos. Esta é a forma de estudo

mais clássica da literatura, com a vantagem principal de ser originada do próprio córtex

cerebral de um rato. Estas células são fisiologicamente mais similares a um astrócito

que seria encontrado in vivo, assim como foi evidenciado recentemente pela análise de

expressão de genes (Hertz et al. 2017). É evidente que o processo de cultivo por si só já

é um fator limitante e de estresse, fazendo com que a célula adote um status mais

reativo, aumentando a expressão de algumas proteínas tais como a GFAP. Além disso,

as células de cultura primária apresentam alto grau de variabilidade, uma vez que

descendem de um sistema in vivo altamente heterogêneo. É importante se ter em

consideração que os astrócitos tratados em cultivo representam as células mais

resistentes, as quais sobreviveram a todo o processo de cultivo. Portanto, são células de

certa forma selecionadas, não representando todo o grau de variabilidade de um sistema

in vivo. Apesar disso, a proximidade destas células com o sistema in vivo é evidente

quando se mostra que astrócitos cultivados de diferentes regiões cerebrais ou mesmo de

diferentes animais apresentam expressão de proteínas diferenciadas e complexidade

diferente, assim como encontrado no organismo vivo (Pinto et al. 2000, Zhang et al.

2016). De fato, no nosso estudo, a cultura primária foi o modelo que apresentou

características mais acentuadas de um astrócito, respondendo facilmente a estímulos

morfológicos e bioquímicos.

127
 Os outros dois modelos de astrócitos são apresentados na literatura como uma

alternativa para o estudo de astrócitos, apresentando a principal vantagem de serem

células mais homogêneas e com alto poder reprodutivo, o que torna o processo mais

fácil, rápido e dinâmico uma vez que as células podem ser facilmente congeladas e

descongeladas. Apesar de comumente usadas, os trabalhos na literatura que mostram as

propriedades destas células são esparsos, com análise de características isoladas, e

frequentemente não comparadas a um astrócitos comum. Nas análises comparativas

deste estudo foi possível perceber que tanto em astrócitos imortais quanto em C6 foram

detectadas proteínas características de astrócitos, porém nem sempre a funcionalidade

destas células respondeu de forma similar a um astrócitos. Na nossa análise, os

astrócitos imortalizados não se mostraram um bom modelo para reproduzir as funções

astrocíticas estudadas, porém a linhagem C6, subcultivada pelo menos 100 vezes,

mostrou padrão de resposta similar a um astrócitos de cultura primária, podendo

representar uma alternativa viável para o estudo destas células. A linhagem C6 pode

sempre ser usada como um modelo de estudo inicial, detectando-se, de uma forma mais

rápida, algumas características onde os astrócitos estariam envolvidos, de modo que

possa ser analisado de uma forma mais aprofundada em um estudo posterior em

astrócitos de cultura primária.

Considerando os astrócitos de cultura primária como um bom modelo para o estudo

das propriedades astrocíticas, neste trabalho também avaliamos o envolvimento destas

células na manutenção do ambiente extracelular, principalmente no que diz respeito às

concentrações extracelulares da proteína S100B. Pela primeira vez foi mostrado que

astrócitos são capazes de captar a S100B extracelular, podendo representar um

mecanismo de controle da sinalização extracelular desta proteína.

128
 Considerando-se que os níveis extracelulares são determinantes para a sua ação

trófica ou toxica, é importante que suas concentrações sejam finamente reguladas. A

S100B foi captada pelos astrócitos de modo RAGE dependente, podendo representar

também uma forma de sinalização, ativando vias intracelulares, como a da NFκB, as

quais podem estimular a liberação de citocinas como foi demonstrado para IL-1β, IL-6 e

TNFα (Donato et al. 2009). Além disso, as vesículas positivas para S100B foram

caracterizadas, estando presentes em vesículas do sistema endolisossomal o qual tem

um importante papel no tráfico de proteínas e posterior degradação. Variações de cálcio

intracelulares inibiram a mobilidade destas vesículas, o que poderia implicar em mais

tempo de fusão destas vesículas com a membrana plasmática para a liberação do

conteúdo interno. Porém, para a confirmação desta hipótese mais estudos seriam

necessários.

Finalmente, um ensaio colorimétrico para a dosagem da atividade da GS foi

padronizado. Esta enzima é altamente expressa em astrócitos e sua atividade é essencial

para diversas funções cerebrais, como a manutenção do ciclo glutamina-glutamato.

Portanto, a padronização de uma técnica sensível, precisa e específica para esta enzima

é essencial para avaliar sua atividade em diferentes condições experimentais. Além

disso, o ensaio mostrou-se versátil, na medida em que foi aplicável tanto em cultura

celular (cultura primária de astrócitos e C6) quanto em diferentes estruturas cerebrais. A

atividade glutamil-transferase mostrou ser específica para GS, uma vez que o inibidor

para esta enzima, MSO, reduziu drasticamente sua atividade. Testes de congelamento

mostraram preservação da atividade da enzima, sob determinadas condições de

armazenamento, garantindo uma maior flexibilidade para dosagem após experimento.

Por fim, nesta tese demonstramos a importância da escolha de um modelo in vitro

de cultura de células para o estudo de astrócitos. Destacamos as diferenças moleculares

129
e funcionais entre cada tipo celular e suas limitações. Com este estudo inicial foi

possível escolher o modelo mais adequado para o estudo dos efeitos extracelulares da

proteína S100B. Demostramos que astrócitos de cultura primária são capazes de captar

a S100B extracelular, podendo representar uma forma de prevenção dos efeitos tóxicos

desta proteína sobre células neuronais. Estes dados podem ser usados para o estudo de

estratégias terapêuticas no controle dos efeitos tóxicos induzidos pela S100B em

doenças neurodegenerativas. Além disso, destacamos o papel dos astrócitos no

metabolismo cerebral e controle da homeostase extracelular.

6. Perspectivas

- Realizar uma curva de concentração da S100B-Alexa488 exógena e avaliar o

mecanismo de internalização e dependência com RAGE;

- Avaliação da captação de S100B-Alexa488 por outros tipos celulares;

- Estudar as vias intracelulares ativadas no tratamento com S100B-Alexa488;

- Avaliar mecanismos de secreção da S100B-Alexa488 para o espaço extracelular

realizando estímulos com cálcio e com inibidores de endocitose e exocitose;

- Comparação entre secreção de S100B-Alexa488 internalizada com S100B

endógena;

130
7. Referências Bibliográficas

Adami, C., Bianchi, R., Pula, G. and Donato, R. (2004) S100B-stimulated NO

production by BV-2 microglia is independent of RAGE transducing activity but

dependent on RAGE extracellular domain. Biochim Biophys Acta, 1742, 169-

177.

Ahuja, D., Sáenz-Robles, M. T. and Pipas, J. M. (2005) SV40 large T antigen targets

multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene, 24, 7729-

7745.

Baber, Z. and Haghighat, N. (2010) Glutamine synthetase gene expression and

glutamate transporters in C6-glioma cells. Metab Brain Dis, 25, 413-418.

Basso, M. and Bonetto, V. (2016) Extracellular Vesicles and a Novel Form of

Communication in the Brain. Front Neurosci, 10, 127.

Beenhakker, M. P. and Huguenard, J. R. (2010) Astrocytes as gatekeepers of GABAB

receptor function. J Neurosci, 30, 15262-15276.

Benarroch, E. E. (2010) Glutamate transporters: diversity, function, and involvement in

neurologic disease. Neurology, 74, 259-264.

Benda, P., Lightbody, J., Sato, G., Levine, L. and Sweet, W. (1968) Differentiated rat

glial cell strain in tissue culture. Science, 161, 370-371.

Bennett, M. V., Contreras, J. E., Bukauskas, F. F. and Sáez, J. C. (2003) New roles for

astrocytes: gap junction hemichannels have something to communicate. Trends

Neurosci, 26, 610-617.

Berger, R. P., Pierce, M. C., Wisniewski, S. R., Adelson, P. D., Clark, R. S., Ruppel, R.

A. and Kochanek, P. M. (2002) Neuron-specific enolase and S100B in

131
 cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury in infants and children.

Pediatrics, 109, E31.

Bernardi, C., Tramontina, A. C., Nardin, P. et al. (2013) Treadmill exercise induces

hippocampal astroglial alterations in rats. Neural Plast, 2013, 709732.

Bernstein, H. G., Bannier, J., Meyer-Lotz, G., Steiner, J., Keilhoff, G., Dobrowolny, H.,

Walter, M. and Bogerts, B. (2014) Distribution of immunoreactive glutamine

synthetase in the adult human and mouse brain. Qualitative and quantitative

observations with special emphasis on extra-astroglial protein localization. J

Chem Neuroanat, 61-62, 33-50.

Bezzi, P. and Volterra, A. (2001) A neuron-glia signalling network in the active brain.

Curr Opin Neurobiol, 11, 387-394.

Boksha, I. S., Tereshkina, E. B. and Burbaeva, G. S. (2000) Glutamine synthetase and

glutamine synthetase-like protein from human brain: purification and

comparative characterization. J Neurochem, 75, 2574-2582.

Böttcher, T., Goiny, M., Bering, J., Domhof, S., Nau, R. and Ungerstedt, U. (2003)

Regional differences in glutamine synthetase inhibition by L-methionine

sulfoximine: a microdialysis study in the rabbit brain. Exp Brain Res, 150, 194-

200.

Bouzier-Sore, A. K. and Pellerin, L. (2013) Unraveling the complex metabolic nature of

astrocytes. Front Cell Neurosci, 7, 179.

Bozza, G., Capitani, M., Montanari, P. et al. (2014) Role of ARF6, Rab11 and external

Hsp90 in the trafficking and recycling of recombinant-soluble Neisseria

meningitidis adhesin A (rNadA) in human epithelial cells. PLoS One, 9,

e110047.

132
Bridges, R. J., Natale, N. R. and Patel, S. A. (2012) System xc⁻ cystine/glutamate

antiporter: an update on molecular pharmacology and roles within the CNS. Br J

Pharmacol, 165, 20-34.

Brown, A. M. and Ransom, B. R. (2015) Astrocyte glycogen as an emergency fuel

under conditions of glucose deprivation or intense neural activity. Metab Brain

Dis, 30, 233-239.

Brozzi, F., Arcuri, C., Giambanco, I. and Donato, R. (2009) S100B Protein Regulates

Astrocyte Shape and Migration via Interaction with Src Kinase:

IMPLICATIONS FOR ASTROCYTE DEVELOPMENT, ACTIVATION, AND

TUMOR GROWTH. J Biol Chem, 284, 8797-8811.

Budunova, I. V. and Williams, G. M. (1994) Cell culture assays for chemicals with

tumor-promoting or tumor-inhibiting activity based on the modulation of

intercellular communication. Cell Biol Toxicol, 10, 71-116.

Businaro, R., Leone, S., Fabrizi, C., Sorci, G., Donato, R., Lauro, G. M. and Fumagalli,

L. (2006) S100B protects LAN-5 neuroblastoma cells against Abeta amyloid-

induced neurotoxicity via RAGE engagement at low doses but increases Abeta

amyloid neurotoxicity at high doses. J Neurosci Res, 83, 897-906.

Butterworth, R. F. (2014) Pathophysiology of brain dysfunction in hyperammonemic

syndromes: The many faces of glutamine. Mol Genet Metab, 113, 113-117.

Cahoy, J. D., Emery, B., Kaushal, A. et al. (2008) A transcriptome database for

astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding

brain development and function. J Neurosci, 28, 264-278.

Cao Danh, H., Strolin Benedetti, M. and Dostert, P. (1985) Age-related changes in

glutamine synthetase activity of rat brain, liver and heart. Gerontology, 31, 95-

100.

133
Chan, K., Busque, S. M., Sailer, M., Stoeger, C., Bröer, S., Daniel, H., Rubio-Aliaga, I.

and Wagner, C. A. (2016) Loss of function mutation of the Slc38a3 glutamine

transporter reveals its critical role for amino acid metabolism in the liver, brain,

and kidney. Pflugers Arch, 468, 213-227.

Christopherson, K. S., Ullian, E. M., Stokes, C. C. et al. (2005) Thrombospondins are

astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell, 120, 421-

433.

Cirillo, C., Capoccia, E., Iuvone, T., Cuomo, R., Sarnelli, G., Steardo, L. and Esposito,

G. (2015) S100B Inhibitor Pentamidine Attenuates Reactive Gliosis and

Reduces Neuronal Loss in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Biomed Res

Int, 2015, 508342.

Coco, S., Calegari, F., Pravettoni, E., Pozzi, D., Taverna, E., Rosa, P., Matteoli, M. and

Verderio, C. (2003) Storage and release of ATP from astrocytes in culture. J

Biol Chem, 278, 1354-1362.

Commisso, C., Davidson, S. M., Soydaner-Azeloglu, R. G. et al. (2013)

Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed

cells. Nature, 497, 633-637.

Conner, S. D. and Schmid, S. L. (2003) Regulated portals of entry into the cell. Nature,

422, 37-44.

Cooper, A. J. (2012) The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in

cerebral ammonia homeostasis. Neurochem Res, 37, 2439-2455.

Daitx, V. V., Mezzalira, J., Moraes, V. a. C., Breier, A. C., Cé, J. and Coelho, J. C.

(2015) Comparing the alpha-galactosidase A biochemical properties from

healthy individuals and Fabry disease patients. Clin Chim Acta, 445, 60-64.

134
Davey, G. E., Murmann, P. and Heizmann, C. W. (2001) Intracellular Ca2+ and Zn2+

levels regulate the alternative cell density-dependent secretion of S100B in

human glioblastoma cells. J Biol Chem, 276, 30819-30826.

De Pittà, M., Brunel, N. and Volterra, A. (2016) Astrocytes: Orchestrating synaptic

plasticity? Neuroscience, 323, 43-61.

de Souza, D. F., Leite, M. C., Quincozes-Santos, A., Nardin, P., Tortorelli, L. S., Rigo,

M. M., Gottfried, C., Leal, R. B. and Gonçalves, C. A. (2009) S100B secretion

is stimulated by IL-1beta in glial cultures and hippocampal slices of rats: Likely

involvement of MAPK pathway. J Neuroimmunol, 206, 52-57.

de Souza, D. F., Wartchow, K., Hansen, F., Lunardi, P., Guerra, M. C., Nardin, P. and

Gonçalves, C. A. (2013) Interleukin-6-induced S100B secretion is inhibited by

haloperidol and risperidone. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 43,

14-22.

Deitmer, J. W. and Rose, C. R. (2010) Ion changes and signalling in perisynaptic glia.

Brain Res Rev, 63, 113-129.

Dennis, S. C., Lai, J. C. and Clark, J. B. (1980) The distribution of glutamine synthetase

in subcellular fractions of rat brain. Brain Res, 197, 469-475.

Donato, R. (2001) S100: a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-

hand type with intracellular and extracellular functional roles. Int J Biochem Cell

Biol, 33, 637-668.

Donato, R. (2003) Intracellular and extracellular roles of S100 proteins. Microsc Res

Tech, 60, 540-551.

Donato, R. (2007) RAGE: a single receptor for several ligands and different cellular

responses: the case of certain S100 proteins. Curr Mol Med, 7, 711-724.

135
Donato, R., Cannon, B. R., Sorci, G., Riuzzi, F., Hsu, K., Weber, D. J. and Geczy, C. L.

(2013) Functions of S100 proteins. Curr Mol Med, 13, 24-57.

Donato, R. and Heizmann, C. W. (2010) S100B Protein in the Nervous System and

Cardiovascular Apparatus in Normal and Pathological Conditions. Cardiovasc

Psychiatry Neurol, 2010, 929712.

Donato, R., Sorci, G., Riuzzi, F., Arcuri, C., Bianchi, R., Brozzi, F., Tubaro, C. and

Giambanco, I. (2009) S100B's double life: intracellular regulator and

extracellular signal. Biochim Biophys Acta, 1793, 1008-1022.

Dringen, R. (2000) Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol,

62, 649-671.

Dringen, R., Brandmann, M., Hohnholt, M. C. and Blumrich, E. M. (2015) Glutathione-

Dependent Detoxification Processes in Astrocytes. Neurochem Res, 40, 2570-

2582.

Dringen, R. and Hamprecht, B. (1996) Glutathione content as an indicator for the

presence of metabolic pathways of amino acids in astroglial cultures. J

Neurochem, 67, 1375-1382.

Edwards, M. M. and Robinson, S. R. (2006) TNF alpha affects the expression of GFAP

and S100B: implications for Alzheimer's disease. J Neural Transm, 113, 1709-

1715.

Ehrenfeld, E., Marble, S. J. and Meister, A. (1963) ENZYMATIC SYNTHESIS OF

GAMMA-GLUTAMYLHYDROXAMIC ACID FROM GLUTAMIC ACID

AND HYDROXYLAMINE. J Biol Chem, 238, 3711-3716.

El-Sayed, A. and Harashima, H. (2013) Endocytosis of gene delivery vectors: from

clathrin-dependent to lipid raft-mediated endocytosis. Mol Ther, 21, 1118-1130.

136
Eng, L. F. (1985) Glial fibrillary acidic protein (GFAP): the major protein of glial

intermediate filaments in differentiated astrocytes. J Neuroimmunol, 8, 203-214.

Frisa, P. S. and Jacobberger, J. W. (2002) Cell density related gene expression: SV40

large T antigen levels in immortalized astrocyte lines. BMC Cell Biol, 3, 10.

Frizzo, J. K., Tramontina, A. C., Tramontina, F., Gottfried, C., Leal, R. B., Donato, R.

and Gonçalves, C. A. (2004) Involvement of the S100B in cAMP-induced

cytoskeleton remodeling in astrocytes: a study using TRTK-12 in digitonin-

permeabilized cells. Cell Mol Neurobiol, 24, 833-840.

Furihata, T., Ito, R., Kamiichi, A., Saito, K. and Chiba, K. (2016) Establishment and

characterization of a new conditionally immortalized human astrocyte cell line. J

Neurochem, 136, 92-105.

Geller, H. M. and Dubois-Dalcq, M. (1988) Antigenic and functional characterization of

a rat central nervous system-derived cell line immortalized by a retroviral vector.

J Cell Biol, 107, 1977-1986.

Gonçalves, C. A., Leite, M. C. and Nardin, P. (2008) Biological and methodological

features of the measurement of S100B, a putative marker of brain injury. Clin

Biochem, 41, 755-763.

Gonzalez, M. e. L., Malemud, C. J. and Silver, J. (1993) Role of astroglial extracellular

matrix in the formation of rat olfactory bulb glomeruli. Exp Neurol, 123, 91-105.

González, M. I., Krizman-Genda, E. and Robinson, M. B. (2007) Caveolin-1 regulates

the delivery and endocytosis of the glutamate transporter, excitatory amino acid

carrier 1. J Biol Chem, 282, 29855-29865.

Gordon, G. R., Mulligan, S. J. and MacVicar, B. A. (2007) Astrocyte control of the

cerebrovasculature. Glia, 55, 1214-1221.

137
Gould, G. W. and Lippincott-Schwartz, J. (2009) New roles for endosomes: from

vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol, 10, 287-

292.

Groves, A. K., Entwistle, A., Jat, P. S. and Noble, M. (1993) The characterization of

astrocyte cell lines that display properties of glial scar tissue. Dev Biol, 159, 87-

104.

Gruenberg, J. and van der Goot, F. G. (2006) Mechanisms of pathogen entry through

the endosomal compartments. Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 495-504.

Guček, A., Vardjan, N. and Zorec, R. (2012) Exocytosis in astrocytes: transmitter

release and membrane signal regulation. Neurochem Res, 37, 2351-2363.

Guerra, M. C., Tortorelli, L. S., Galland, F., Da Ré, C., Negri, E., Engelke, D. S.,

Rodrigues, L., Leite, M. C. and Gonçalves, C. A. (2011) Lipopolysaccharide

modulates astrocytic S100B secretion: a study in cerebrospinal fluid and

astrocyte cultures from rats. J Neuroinflammation, 8, 128.

Haghighat, N. (2005) Estrogen (17beta-estradiol) enhances glutamine synthetase

activity in C6-glioma cells. Neurochem Res, 30, 661-667.

Haghighat, N. and McCandless, D. W. (1997a) Effect of 6-aminonicotinamide on

metabolism of astrocytes and C6-glioma cells. Metab Brain Dis, 12, 29-45.

Haghighat, N. and McCandless, D. W. (1997b) Effect of ammonium chloride on energy

metabolism of astrocytes and C6-glioma cells in vitro. Metab Brain Dis, 12,

287-298.

Halassa, M. M., Fellin, T., Takano, H., Dong, J. H. and Haydon, P. G. (2007) Synaptic

islands defined by the territory of a single astrocyte. J Neurosci, 27, 6473-6477.

Hertz, L., Chen, Y. and Song, D. (2016) Astrocyte Cultures Mimicking Brain

Astrocytes in Gene Expression, Signaling, Metabolism and K(+) Uptake and

138
 Showing Astrocytic Gene Expression Overlooked by Immunohistochemistry

and In Situ Hybridization. Neurochem Res.

Hertz, L., Chen, Y. and Song, D. (2017) Astrocyte Cultures Mimicking Brain

Astrocytes in Gene Expression, Signaling, Metabolism and K(+) Uptake and

Showing Astrocytic Gene Expression Overlooked by Immunohistochemistry

and In Situ Hybridization. Neurochem Res, 42, 254-271.

Herzfeld, A. (1973) The distribution between gamma-glutamylhydrozamate synthetase

and L-glutamine-hydroxylamine glutamyltransferase activities in rat tissues.

Studies in vitro. Biochem J, 133, 49-57.

Holten, A. T. and Gundersen, V. (2008) Glutamine as a precursor for transmitter

glutamate, aspartate and GABA in the cerebellum: a role for phosphate-activated

glutaminase. J Neurochem, 104, 1032-1042.

Hu, J., Castets, F., Guevara, J. L. and Van Eldik, L. J. (1996) S100 beta stimulates

inducible nitric oxide synthase activity and mRNA levels in rat cortical

astrocytes. J Biol Chem, 271, 2543-2547.

Hu, J., Ferreira, A. and Van Eldik, L. J. (1997) S100beta induces neuronal cell death

through nitric oxide release from astrocytes. J Neurochem, 69, 2294-2301.

Hu, J. and Van Eldik, L. J. (1999) Glial-derived proteins activate cultured astrocytes

and enhance beta amyloid-induced glial activation. Brain Res, 842, 46-54.

Humphries, W. H., Szymanski, C. J. and Payne, C. K. (2011) Endo-lysosomal vesicles

positive for Rab7 and LAMP1 are terminal vesicles for the transport of dextran.

PLoS One, 6, e26626.

Huttunen, H. J., Kuja-Panula, J., Sorci, G., Agneletti, A. L., Donato, R. and Rauvala, H.

(2000) Coregulation of neurite outgrowth and cell survival by amphoterin and

139
 S100 proteins through receptor for advanced glycation end products (RAGE)

activation. J Biol Chem, 275, 40096-40105.

Hyder, F., Patel, A. B., Gjedde, A., Rothman, D. L., Behar, K. L. and Shulman, R. G.

(2006) Neuronal-glial glucose oxidation and glutamatergic-GABAergic

function. J Cereb Blood Flow Metab, 26, 865-877.

Iqbal, K. and Ottaway, J. H. (1970) Glutamine synthetase in muscle and kidney.

Biochem J, 119, 145-156.

Jayakumar, A. R. and Norenberg, M. D. (2016) Glutamine Synthetase: Role in

Neurological Disorders. Adv Neurobiol, 13, 327-350.

Johnson, K. M., Milner, R. and Crocker, S. J. (2015) Extracellular matrix composition

determines astrocyte responses to mechanical and inflammatory stimuli.

Neurosci Lett, 600, 104-109.

Juurlink, B. H. (1982) Glutamine synthetase and glutamyltransferase activities in the

mouse astrocyte in vitro. Neurochem Res, 7, 905-910.

Kettenmann, H. and Verkhratsky, A. (2008) Neuroglia: the 150 years after. Trends

Neurosci, 31, 653-659.

Khandelwal, P. J., Herman, A. M. and Moussa, C. E. (2011) Inflammation in the early

stages of neurodegenerative pathology. J Neuroimmunol, 238, 1-11.

Kimelberg, H. K. and Nedergaard, M. (2010) Functions of astrocytes and their potential

as therapeutic targets. Neurotherapeutics, 7, 338-353.

King, L. S., Kozono, D. and Agre, P. (2004) From structure to disease: the evolving tale

of aquaporin biology. Nat Rev Mol Cell Biol, 5, 687-698.

Kinney, G. A. and Spain, W. J. (2002) Synaptically evoked GABA transporter currents

in neocortical glia. J Neurophysiol, 88, 2899-2908.

140
Kleindienst, A., Schmidt, C., Parsch, H., Emtmann, I., Xu, Y. and Buchfelder, M.

(2010) The Passage of S100B from Brain to Blood Is Not Specifically Related to

the Blood-Brain Barrier Integrity. Cardiovasc Psychiatry Neurol, 2010, 801295.

Kosenko, E. A., Beloushko, E. E. and Kaminskiĭ, I. G. (2014a) [Differences between

cerebellum and hippocampus in antioxidant system]. Biomed Khim, 60, 469-472.

Kosenko, E. A., Tikhonova, L. A., Reddy, V. P., Aliev, G. and Kaminsky, Y. G.

(2014b) Differential up-regulation of ammonia detoxifying enzymes in cerebral

cortex, cerebellum, hippocampus, striatum and liver in hyperammonemia. CNS

Neurol Disord Drug Targets, 13, 1089-1095.

Krupenko, S. A. (2009) FDH: an aldehyde dehydrogenase fusion enzyme in folate

metabolism. Chem Biol Interact, 178, 84-93.

Kruse, A., Cesarini, K. G., Bach, F. W. and Persson, L. (1991) Increases of neuron-

specific enolase, S-100 protein, creatine kinase and creatine kinase BB

isoenzyme in CSF following intraventricular catheter implantation. Acta

Neurochir (Wien), 110, 106-109.

Kumada, Y., Benson, D. R., Hillemann, D., Hosted, T. J., Rochefort, D. A., Thompson,

C. J., Wohlleben, W. and Tateno, Y. (1993) Evolution of the glutamine

synthetase gene, one of the oldest existing and functioning genes. Proc Natl

Acad Sci U S A, 90, 3009-3013.

Lam, A. G., Koppal, T., Akama, K. T., Guo, L., Craft, J. M., Samy, B., Schavocky, J.

P., Watterson, D. M. and Van Eldik, L. J. (2001) Mechanism of glial activation

by S100B: involvement of the transcription factor NFkappaB. Neurobiol Aging,

22, 765-772.

141
Lange, S. C., Bak, L. K., Waagepetersen, H. S., Schousboe, A. and Norenberg, M. D.

(2012) Primary cultures of astrocytes: their value in understanding astrocytes in

health and disease. Neurochem Res, 37, 2569-2588.

Laterra, J. and Goldstein, G. W. (1991) Astroglial-induced in vitro angiogenesis:

requirements for RNA and protein synthesis. J Neurochem, 57, 1231-1239.

Leclerc, E., Fritz, G., Vetter, S. W. and Heizmann, C. W. (2009) Binding of S100

proteins to RAGE: an update. Biochim Biophys Acta, 1793, 993-1007.

Lee, H. J., Suk, J. E., Bae, E. J. and Lee, S. J. (2008) Clearance and deposition of

extracellular alpha-synuclein aggregates in microglia. Biochem Biophys Res

Commun, 372, 423-428.

Leis, J. A., Bekar, L. K. and Walz, W. (2005) Potassium homeostasis in the ischemic

brain. Glia, 50, 407-416.

Leite, M. C., Brolese, G., de Almeida, L. M., Piñero, C. C., Gottfried, C. and

Gonçalves, C. A. (2006) Ammonia-induced alteration in S100B secretion in

astrocytes is not reverted by creatine addition. Brain Res Bull, 70, 179-185.

Leite, M. C., Galland, F., de Souza, D. F., Guerra, M. C., Bobermin, L., Biasibetti, R.,

Gottfried, C. and Gonçalves, C. A. (2009) Gap junction inhibitors modulate

S100B secretion in astrocyte cultures and acute hippocampal slices. J Neurosci

Res, 87, 2439-2446.

Leuba, G. and Garey, L. J. (1989) Comparison of neuronal and glial numerical density

in primary and secondary visual cortex of man. Exp Brain Res, 77, 31-38.

Liaw, S. H., Kuo, I. and Eisenberg, D. (1995) Discovery of the ammonium substrate site

on glutamine synthetase, a third cation binding site. Protein Sci, 4, 2358-2365.

Lim, J. P. and Gleeson, P. A. (2011) Macropinocytosis: an endocytic pathway for

internalising large gulps. Immunol Cell Biol, 89, 836-843.

142
Lin, Y. C., Chow, C. W., Yuen, P. H. and Wong, P. K. (1997) Establishment and

characterization of conditionally immortalized astrocytes to study their

interaction with ts1, a neuropathogenic mutant of Moloney murine leukemia

virus. J Neurovirol, 3, 28-37.

Liu, X. P., Zheng, H. Y., Qu, M., Zhang, Y., Cao, F. Y., Wang, Q., Ke, D., Liu, G. P.

and Wang, J. Z. (2012) Upregulation of astrocytes protein phosphatase-2A

stimulates astrocytes migration via inhibiting p38 MAPK in tg2576 mice. Glia,

60, 1279-1288.

Lukacs, Z., Nieves Cobos, P., Keil, A., Hartung, R., Mengel, E., Beck, M., Deschauer,

M., Hanisch, F. and Santer, R. (2011) Dried blood spots in the diagnosis of

lysosomal storage disorders--possibilities for newborn screening and high-risk

population screening. Clin Biochem, 44, 476.

Lutz, S. E., Zhao, Y., Gulinello, M., Lee, S. C., Raine, C. S. and Brosnan, C. F. (2009)

Deletion of astrocyte connexins 43 and 30 leads to a dysmyelinating phenotype

and hippocampal CA1 vacuolation. J Neurosci, 29, 7743-7752.

Mandrekar, S., Jiang, Q., Lee, C. Y., Koenigsknecht-Talboo, J., Holtzman, D. M. and

Landreth, G. E. (2009) Microglia mediate the clearance of soluble Abeta through

fluid phase macropinocytosis. J Neurosci, 29, 4252-4262.

Marenholz, I., Heizmann, C. W. and Fritz, G. (2004) S100 proteins in mouse and man:

from evolution to function and pathology (including an update of the

nomenclature). Biochem Biophys Res Commun, 322, 1111-1122.

Marie, S. K. and Shinjo, S. M. (2011) Metabolism and brain cancer. Clinics (Sao

Paulo), 66 Suppl 1, 33-43.

143
Matés, J. M., Pérez-Gómez, C., Núñez de Castro, I., Asenjo, M. and Márquez, J. (2002)

Glutamine and its relationship with intracellular redox status, oxidative stress

and cell proliferation/death. Int J Biochem Cell Biol, 34, 439-458.

Mayor, S. and Pagano, R. E. (2007) Pathways of clathrin-independent endocytosis. Nat

Rev Mol Cell Biol, 8, 603-612.

Mbele, G. O., Deloulme, J. C., Gentil, B. J., Delphin, C., Ferro, M., Garin, J.,

Takahashi, M. and Baudier, J. (2002) The zinc- and calcium-binding S100B

interacts and co-localizes with IQGAP1 during dynamic rearrangement of cell

membranes. J Biol Chem, 277, 49998-50007.

McKenna, M. C. (2007) The glutamate-glutamine cycle is not stoichiometric: fates of

glutamate in brain. J Neurosci Res, 85, 3347-3358.

Megias, L., Guerri, C., Fornas, E. et al. (2000) Endocytosis and transcytosis in growing

astrocytes in primary culture. Possible implications in neural development. Int J

Dev Biol, 44, 209-221.

Meister, A. (1968) The specificity of glutamine synthetase and its relationship to

substrate conformation at the active site. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 31,

183-218.

Meister, A. (1985) Glutamine synthetase from mammalian tissues. Methods Enzymol,

113, 185-199.

Menet, V., Giménez y Ribotta, M., Chauvet, N., Drian, M. J., Lannoy, J., Colucci-

Guyon, E. and Privat, A. (2001) Inactivation of the glial fibrillary acidic protein

gene, but not that of vimentin, improves neuronal survival and neurite growth by

modifying adhesion molecule expression. J Neurosci, 21, 6147-6158.

144
Minet, R., Villie, F., Marcollet, M., Meynial-Denis, D. and Cynober, L. (1997)

Measurement of glutamine synthetase activity in rat muscle by a colorimetric

assay. Clin Chim Acta, 268, 121-132.

Molofsky, A. V. and Deneen, B. (2015) Astrocyte development: A Guide for the

Perplexed. Glia, 63, 1320-1329.

Morikawa, M., Asai, K., Kokubo, M. et al. (2001) Isolation and characterization of a

new immortal rat astrocyte with a high expression of NGF mRNA. Neurosci

Res, 39, 205-212.

Nardin, P., Tramontina, F., Leite, M. C., Tramontina, A. C., Quincozes-Santos, A., de

Almeida, L. M., Battastini, A. M., Gottfried, C. and Gonçalves, C. A. (2007)

S100B content and secretion decrease in astrocytes cultured in high-glucose

medium. Neurochem Int, 50, 774-782.

Neumann, H., Kotter, M. R. and Franklin, R. J. (2009) Debris clearance by microglia:

an essential link between degeneration and regeneration. Brain, 132, 288-295.

Nodin, C., Nilsson, M. and Blomstrand, F. (2005) Gap junction blockage limits

intercellular spreading of astrocytic apoptosis induced by metabolic depression.

J Neurochem, 94, 1111-1123.

Oberheim, N. A., Takano, T., Han, X. et al. (2009) Uniquely hominid features of adult

human astrocytes. J Neurosci, 29, 3276-3287.

Oliveira, J. F., Sardinha, V. M., Guerra-Gomes, S., Araque, A. and Sousa, N. (2015) Do

stars govern our actions? Astrocyte involvement in rodent behavior. Trends

Neurosci, 38, 535-549.

Olsen, M. L. and Sontheimer, H. (2008) Functional implications for Kir4.1 channels in

glial biology: from K+ buffering to cell differentiation. J Neurochem, 107, 589-

601.

145
Ostendorp, T., Leclerc, E., Galichet, A., Koch, M., Demling, N., Weigle, B., Heizmann,

C. W., Kroneck, P. M. and Fritz, G. (2007) Structural and functional insights

into RAGE activation by multimeric S100B. EMBO J, 26, 3868-3878.

Ostroff, L. E., Manzur, M. K., Cain, C. K. and Ledoux, J. E. (2014) Synapses lacking

astrocyte appear in the amygdala during consolidation of Pavlovian threat

conditioning. J Comp Neurol, 522, 2152-2163.

Paemeleire, K. and Leybaert, L. (2000) ATP-dependent astrocyte-endothelial calcium

signaling following mechanical damage to a single astrocyte in astrocyte-

endothelial co-cultures. J Neurotrauma, 17, 345-358.

Pallardó, F. V., Markovic, J., García, J. L. and Viña, J. (2009) Role of nuclear

glutathione as a key regulator of cell proliferation. Mol Aspects Med, 30, 77-85.

Palos, T. P., Ramachandran, B., Boado, R. and Howard, B. D. (1996) Rat C6 and

human astrocytic tumor cells express a neuronal type of glutamate transporter.

Brain Res Mol Brain Res, 37, 297-303.

Papadopoulos, M. C. and Verkman, A. S. (2013) Aquaporin water channels in the

nervous system. Nat Rev Neurosci, 14, 265-277.

Parker, K. K., Norenberg, M. D. and Vernadakis, A. (1980) "Transdifferentiation" of C6

glial cells in culture. Science, 208, 179-181.

Parpura, V., Baker, B. J., Jeras, M. and Zorec, R. (2010) Regulated exocytosis in

astrocytic signal integration. Neurochem Int, 57, 451-459.

Parpura, V. and Zorec, R. (2010) Gliotransmission: Exocytotic release from astrocytes.

Brain Res Rev, 63, 83-92.

Passaquin, A. C., Schreier, W. A. and de Vellis, J. (1994) Gene expression in astrocytes

is affected by subculture. Int J Dev Neurosci, 12, 363-372.

146
Patel, A. J., Weir, M. D., Hunt, A., Tahourdin, C. S. and Thomas, D. G. (1985)

Distribution of glutamine synthetase and glial fibrillary acidic protein and

correlation of glutamine synthetase with glutamate decarboxylase in different

regions of the rat central nervous system. Brain Res, 331, 1-9.

Pellerin, L. (2008) Brain energetics (thought needs food). Curr Opin Clin Nutr Metab

Care, 11, 701-705.

Pellerin, L. and Magistretti, P. J. (1994) Glutamate uptake into astrocytes stimulates

aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose

utilization. Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 10625-10629.

Perea, G. and Araque, A. (2005) Glial calcium signaling and neuron-glia

communication. Cell Calcium, 38, 375-382.

Perrone, L., Peluso, G. and Melone, M. A. (2008) RAGE recycles at the plasma

membrane in S100B secretory vesicles and promotes Schwann cells

morphological changes. J Cell Physiol, 217, 60-71.

Pesole, G., Bozzetti, M. P., Lanave, C., Preparata, G. and Saccone, C. (1991) Glutamine

synthetase gene evolution: a good molecular clock. Proc Natl Acad Sci U S A,

88, 522-526.

Petrova, T. V., Hu, J. and Van Eldik, L. J. (2000) Modulation of glial activation by

astrocyte-derived protein S100B: differential responses of astrocyte and

microglial cultures. Brain Res, 853, 74-80.

Pinto, S. S., Gottfried, C., Mendez, A., Gonçalves, D., Karl, J., Gonçalves, C. A.,

Wofchuk, S. and Rodnight, R. (2000) Immunocontent and secretion of S100B in

astrocyte cultures from different brain regions in relation to morphology. FEBS

Lett, 486, 203-207.

147
Plog, B. A., Dashnaw, M. L., Hitomi, E., Peng, W., Liao, Y., Lou, N., Deane, R. and

Nedergaard, M. (2015) Biomarkers of traumatic injury are transported from

brain to blood via the glymphatic system. J Neurosci, 35, 518-526.

Ponath, G., Schettler, C., Kaestner, F., Voigt, B., Wentker, D., Arolt, V. and

Rothermundt, M. (2007) Autocrine S100B effects on astrocytes are mediated via

RAGE. J Neuroimmunol, 184, 214-222.

Potokar, M., Korva, M., Jorgačevski, J., Avšič-Županc, T. and Zorec, R. (2014) Tick-

borne encephalitis virus infects rat astrocytes but does not affect their viability.

PLoS One, 9, e86219.

Potokar, M., Kreft, M., Li, L., Daniel Andersson, J., Pangrsic, T., Chowdhury, H. H.,

Pekny, M. and Zorec, R. (2007) Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.

Traffic, 8, 12-20.

Potokar, M., Kreft, M., Pangrsic, T. and Zorec, R. (2005) Vesicle mobility studied in

cultured astrocytes. Biochem Biophys Res Commun, 329, 678-683.

Potokar, M., Stenovec, M., Gabrijel, M., Li, L., Kreft, M., Grilc, S., Pekny, M. and

Zorec, R. (2010) Intermediate filaments attenuate stimulation-dependent

mobility of endosomes/lysosomes in astrocytes. Glia, 58, 1208-1219.

Potokar, M., Stenovec, M., Kreft, M., Kreft, M. E. and Zorec, R. (2008) Stimulation

inhibits the mobility of recycling peptidergic vesicles in astrocytes. Glia, 56,

135-144.

Potokar, M., Vardjan, N., Stenovec, M., Gabrijel, M., Trkov, S., Jorgačevski, J., Kreft,

M. and Zorec, R. (2013) Astrocytic vesicle mobility in health and disease. Int J

Mol Sci, 14, 11238-11258.

Rajendran, L., Knölker, H. J. and Simons, K. (2010) Subcellular targeting strategies for

drug design and delivery. Nat Rev Drug Discov, 9, 29-42.

148
Raju, T. R., Bignami, A. and Dahl, D. (1980) Glial fibrillary acidic protein in

monolayer cultures of C-6 glioma cells: effect of aging and dibutyryl cyclic

AMP. Brain Res, 200, 225-230.

Reali, C., Pillai, R., Saba, F., Cabras, S., Michetti, F. and Sogos, V. (2012) S100B

modulates growth factors and costimulatory molecules expression in cultured

human astrocytes. J Neuroimmunol, 243, 95-99.

Reali, C., Scintu, F., Pillai, R., Donato, R., Michetti, F. and Sogos, V. (2005) S100b

counteracts effects of the neurotoxicant trimethyltin on astrocytes and microglia.

J Neurosci Res, 81, 677-686.

Regan, M. R., Huang, Y. H., Kim, Y. S., Dykes-Hoberg, M. I., Jin, L., Watkins, A. M.,

Bergles, D. E. and Rothstein, J. D. (2007) Variations in promoter activity reveal

a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the

developing and mature CNS. J Neurosci, 27, 6607-6619.

Ribeiro, L. C., Quincozes-Santos, A., Leite, M. C. et al. (2009) Caloric restriction

increases hippocampal glutamate uptake and glutamine synthetase activity in

Wistar rats. Neurosci Res, 64, 330-334.

Ronzio, R. A., Wilk, S., Rowe, W. B. and Meister, A. (1969) Preparation and studies on

the characterization of sheep brain glutamine synthetase. Biochemistry, 8, 2670-

2674.

Rose, C. F., Verkhratsky, A. and Parpura, V. (2013) Astrocyte glutamine synthetase:

pivotal in health and disease. Biochem Soc Trans, 41, 1518-1524.

Rothermundt, M., Peters, M., Prehn, J. H. and Arolt, V. (2003) S100B in brain damage

and neurodegeneration. Microsc Res Tech, 60, 614-632.

149
Rouach, N., Avignone, E., Même, W., Koulakoff, A., Venance, L., Blomstrand, F. and

Giaume, C. (2002) Gap junctions and connexin expression in the normal and

pathological central nervous system. Biol Cell, 94, 457-475.

Rustandi, R. R., Baldisseri, D. M. and Weber, D. J. (2000) Structure of the negative

regulatory domain of p53 bound to S100B(betabeta). Nat Struct Biol, 7, 570-

574.

Salter, M. W. and Hicks, J. L. (1994) ATP-evoked increases in intracellular calcium in

neurons and glia from the dorsal spinal cord. J Neurosci, 14, 1563-1575.

Scemes, E. and Giaume, C. (2006) Astrocyte calcium waves: what they are and what

they do. Glia, 54, 716-725.

Schliwa, M., Euteneuer, U., Bulinski, J. C. and Izant, J. G. (1981) Calcium lability of

cytoplasmic microtubules and its modulation by microtubule-associated

proteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 78, 1037-1041.

Scott, C. C., Vacca, F. and Gruenberg, J. (2014) Endosome maturation, transport and

functions. Semin Cell Dev Biol, 31, 2-10.

Seifert, G., Henneberger, C. and Steinhäuser, C. (2016) Diversity of astrocyte potassium

channels: An update. Brain Res Bull.

Seifert, G., Schilling, K. and Steinhäuser, C. (2006) Astrocyte dysfunction in

neurological disorders: a molecular perspective. Nat Rev Neurosci, 7, 194-206.

Seiler, N., Reid, J. and Knödgen, B. (1990) A sensitive method for the assay of

glutamine synthetase. Neurochem Res, 15, 301-305.

Selinfreund, R. H., Barger, S. W., Pledger, W. J. and Van Eldik, L. J. (1991)

Neurotrophic protein S100 beta stimulates glial cell proliferation. Proc Natl

Acad Sci U S A, 88, 3554-3558.

150
Simpson, J. E., Ince, P. G., Lace, G. et al. (2010) Astrocyte phenotype in relation to

Alzheimer-type pathology in the ageing brain. Neurobiol Aging, 31, 578-590.

Sofroniew, M. V. (2009) Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar

formation. Trends Neurosci, 32, 638-647.

Sofroniew, M. V. (2015) Astrocyte barriers to neurotoxic inflammation. Nat Rev

Neurosci, 16, 249-263.

Sofroniew, M. V. and Vinters, H. V. (2010) Astrocytes: biology and pathology. Acta

Neuropathol, 119, 7-35.

Soldati, T. and Schliwa, M. (2006) Powering membrane traffic in endocytosis and

recycling. Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 897-908.

Sorci, G., Agneletti, A. L., Bianchi, R. and Donato, R. (1998) Association of S100B

with intermediate filaments and microtubules in glial cells. Biochim Biophys

Acta, 1448, 277-289.

Sorci, G., Riuzzi, F., Arcuri, C., Tubaro, C., Bianchi, R., Giambanco, I. and Donato, R.

(2013) S100B protein in tissue development, repair and regeneration. World J

Biol Chem, 4, 1-12.

Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O. and Quincozes-Santos, A. (2013)

Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One, 8, e60282.

Stadtman, E. R., Shapiro, B. M., Ginsburg, A., Kingdon, H. S. and Denton, M. D.

(1968) Regulation of glutamine synthetase activity in Escherichia coli.

Brookhaven Symp Biol, 21, 378-396.

Steiner, J., Bogerts, B., Schroeter, M. L. and Bernstein, H. G. (2011) S100B protein in

neurodegenerative disorders. Clin Chem Lab Med, 49, 409-424.

151
Stenovec, M., Kreft, M., Grilc, S., Potokar, M., Kreft, M. E., Pangrsic, T. and Zorec, R.

(2007) Ca2+-dependent mobility of vesicles capturing anti-VGLUT1 antibodies.

Exp Cell Res, 313, 3809-3818.

Stenovec, M., Trkov, S., Kreft, M. and Zorec, R. (2014) Alterations of calcium

homoeostasis in cultured rat astrocytes evoked by bioactive sphingolipids. Acta

Physiol (Oxf), 212, 49-61.

Stenovec, M., Trkov, S., Lasič, E., Terzieva, S., Kreft, M., Rodríguez Arellano, J. J.,

Parpura, V., Verkhratsky, A. and Zorec, R. (2016) Expression of familial

Alzheimer disease presenilin 1 gene attenuates vesicle traffic and reduces

peptide secretion in cultured astrocytes devoid of pathologic tissue environment.

Glia, 64, 317-329.

Szymanski, C. J., Humphries, W. H. and Payne, C. K. (2011) Single particle tracking as

a method to resolve differences in highly colocalized proteins. Analyst, 136,

3527-3533.

Tabernero, A., Medina, J. M. and Giaume, C. (2006) Glucose metabolism and

proliferation in glia: role of astrocytic gap junctions. J Neurochem, 99, 1049-

1061.

Tabuchi, K., Imada, M. and Nishimoto, A. (1982) Effects of cyclic AMP on S-100

protein level in C-6 glioma cells. J Neurol Sci, 56, 57-63.

Thilo, L., Stroud, E. and Haylett, T. (1995) Maturation of early endosomes and

vesicular traffic to lysosomes in relation to membrane recycling. J Cell Sci, 108

( Pt 4), 1791-1803.

Tomaselli, K. J., Neugebauer, K. M., Bixby, J. L., Lilien, J. and Reichardt, L. F. (1988)

N-cadherin and integrins: two receptor systems that mediate neuronal process

outgrowth on astrocyte surfaces. Neuron, 1, 33-43.

152
Trabelsi, Y., Amri, M., Becq, H., Molinari, F. and Aniksztejn, L. (2017) The conversion

of glutamate by glutamine synthase in neocortical astrocytes from juvenile rat is

important to limit glutamate spillover and peri/extrasynaptic activation of

NMDA receptors. Glia, 65, 401-415.

Tramontina, A. C., Tramontina, F., Bobermin, L. D., Zanotto, C., Souza, D. F., Leite,

M. C., Nardin, P., Gottfried, C. and Gonçalves, C. A. (2008) Secretion of

S100B, an astrocyte-derived neurotrophic protein, is stimulated by fluoxetine via

a mechanism independent of serotonin. Prog Neuropsychopharmacol Biol

Psychiatry, 32, 1580-1583.

Tramontina, F., Leite, M. C., Gonçalves, D. et al. (2006) High glutamate decreases

S100B secretion by a mechanism dependent on the glutamate transporter.

Neurochem Res, 31, 815-820.

Turnquist, C., Horikawa, I., Foran, E., Major, E. O., Vojtesek, B., Lane, D. P., Lu, X.,

Harris, B. T. and Harris, C. C. (2016) p53 isoforms regulate astrocyte-mediated

neuroprotection and neurodegeneration. Cell Death Differ, 23, 1515-1528.

Vaca, K. and Wendt, E. (1992) Divergent effects of astroglial and microglial secretions

on neuron growth and survival. Exp Neurol, 118, 62-72.

Van Eldik, L. J. and Wainwright, M. S. (2003) The Janus face of glial-derived S100B:

beneficial and detrimental functions in the brain. Restor Neurol Neurosci, 21,

97-108.

Vanhoutte, N. and Hermans, E. (2008) Glutamate-induced glioma cell proliferation is

prevented by functional expression of the glutamate transporter GLT-1. FEBS

Lett, 582, 1847-1852.

153
Vardjan, N., Gabrijel, M., Potokar, M. et al. (2012) IFN-γ-induced increase in the

mobility of MHC class II compartments in astrocytes depends on intermediate

filaments. J Neuroinflammation, 9, 144.

Vasile, F., Dossi, E. and Rouach, N. (2017) Human astrocytes: structure and functions

in the healthy brain. Brain Struct Funct.

Villarreal, A., Aviles Reyes, R. X., Angelo, M. F., Reines, A. G. and Ramos, A. J.

(2011) S100B alters neuronal survival and dendrite extension via RAGE-

mediated NF-κB signaling. J Neurochem, 117, 321-332.

Villarreal, A., Seoane, R., González Torres, A., Rosciszewski, G., Angelo, M. F., Rossi,

A., Barker, P. A. and Ramos, A. J. (2014) S100B protein activates a RAGE-

dependent autocrine loop in astrocytes: implications for its role in the

propagation of reactive gliosis. J Neurochem.

Vives, V., Alonso, G., Solal, A. C., Joubert, D. and Legraverend, C. (2003)

Visualization of S100B-positive neurons and glia in the central nervous system

of EGFP transgenic mice. J Comp Neurol, 457, 404-419.

Wang, D. D. and Bordey, A. (2008) The astrocyte odyssey. Prog Neurobiol, 86, 342-

367.

Wang, Y., Kudoh, J., Kubota, R., Asakawa, S., Minoshima, S. and Shimizu, N. (1996)

Chromosomal mapping of a family of human glutamine synthetase genes:

functional gene (GLUL) on 1q25, pseudogene (GLULP) on 9p13, and three

related genes (GLULL1, GLULL2, GLULL3) on 5q33, 11p15, and 11q24.

Genomics, 37, 195-199.

Wilder, P. T., Lin, J., Bair, C. L. et al. (2006) Recognition of the tumor suppressor

protein p53 and other protein targets by the calcium-binding protein S100B.

Biochim Biophys Acta, 1763, 1284-1297.

154
Wilhelmsson, U., Li, L., Pekna, M. et al. (2004) Absence of glial fibrillary acidic

protein and vimentin prevents hypertrophy of astrocytic processes and improves

post-traumatic regeneration. J Neurosci, 24, 5016-5021.

Wyss-Coray, T., Loike, J. D., Brionne, T. C., Lu, E., Anankov, R., Yan, F., Silverstein,

S. C. and Husemann, J. (2003) Adult mouse astrocytes degrade amyloid-beta in

vitro and in situ. Nat Med, 9, 453-457.

Xiong, Z., O'Hanlon, D., Becker, L. E., Roder, J., MacDonald, J. F. and Marks, A.

(2000) Enhanced calcium transients in glial cells in neonatal cerebellar cultures

derived from S100B null mice. Exp Cell Res, 257, 281-289.

Yamamoto, H., Konno, H., Yamamoto, T., Ito, K., Mizugaki, M. and Iwasaki, Y. (1987)

Glutamine synthetase of the human brain: purification and characterization. J

Neurochem, 49, 603-609.

Yan, S. D., Chen, X., Fu, J. et al. (1996) RAGE and amyloid-beta peptide neurotoxicity

in Alzheimer's disease. Nature, 382, 685-691.

Yang, Y., Vidensky, S., Jin, L., Jie, C., Lorenzini, I., Frankl, M. and Rothstein, J. D.

(2011) Molecular comparison of GLT1+ and ALDH1L1+ astrocytes in vivo in

astroglial reporter mice. Glia, 59, 200-207.

Zhang, L., Liu, W., Alizadeh, D., Zhao, D., Farrukh, O., Lin, J., Badie, S. A. and Badie,

B. (2011) S100B attenuates microglia activation in gliomas: possible role of

STAT3 pathway. Glia, 59, 486-498.

Zhang, Y., Sloan, S. A., Clarke, L. E. et al. (2016) Purification and Characterization of

Progenitor and Mature Human Astrocytes Reveals Transcriptional and

Functional Differences with Mouse. Neuron, 89, 37-53.

155
Zhou, D., Jiang, X., Xu, R., Cai, Y., Hu, J., Xu, G., Zou, Y. and Zeng, Y. (2008)

Assessing the cytoskeletal system and its elements in C6 glioma cells and

astrocytes by atomic force microscopy. Cell Mol Neurobiol, 28, 895-905.

Zorec, R., Horvat, A., Vardjan, N. and Verkhratsky, A. (2015) Memory Formation

Shaped by Astroglia. Front Integr Neurosci, 9, 56.

156