UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
NÍVEL: DOUTORADO

EFEITO DA ADIÇÃO DE GLUTATIONA EM VINHOS

ESPUMANTES

Vanessa Webber

Caxias do Sul, 2016.

 Vanessa Webber

EFEITO DA ADIÇÃO DE GLUTATIONA EM VINHOS

ESPUMANTES

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul,

visando à obtenção de grau de Doutora em

Biotecnologia.

Orientadora: Profa. Dra. Regina Vanderlinde

Coorientadoras: Dra. Sandra Valduga Dutra

Profª. Dra. Valéria Weiss Angeli

Caxias do Sul, 2016.

 VANESSA WEBBER

EFEITO DA ADIÇÃO DE GLUTATIONA EM VINHOS

ESPUMANTES

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul, visando
à obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.

Orientadora: Profa. Dra. Regina Vanderlinde

Co-orientadoras: Profa. Dra. Valéria Weiss Angeli

Dra. Sandra Valduga Dutra

TESE APROVADA EM 02 DE SETEMBRO DE 2016

____________________________________________
Orientadora: Profa. Dra. Regina Vanderlinde

____________________________________________
Co-orientadora: Profa. Dra. Valéria Weiss Angeli

____________________________________________
Co-orientadora: Dra. Sandra Valduga Dutra

____________________________________________
Profa. Dra. Neidi Garcia Penna

____________________________________________
Profa. Dra. Cláudia Alberici Stefenon

___________________________________________
Prof. Dr. Sérgio Echeverrigaray Laguna
Dedico esta tese aos meus primeiros mentores,
meu pai Valter e minha mãe Ivete,
que nunca mediram esforços para me ajudar
e sempre incentivaram meu aprendizado.
Ao meu marido, Maurício e minha filha Julia,
pela paciência e companheirismo.
AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela proteção e por me dar força, serenidade e equilíbrio para

realização desta tese.

Ao meu marido Maurício e minha filha Julia pelo amor e carinho que me dão força e

fazem meus dias mais felizes.

A minha família, especialmente minha mãe, Ivete, meu pai, Valter e meus irmãos

Aline e Vinícius pelo apoio. A minha avó Jurema pelas orações.

À Profa. Dra. Regina Vanderlinde pela orientação, pelos ensinamentos, pela confiança

depositada e pelas oportunidades de aprendizado desde a iniciação na pesquisa, como bolsista

de iniciação científica.

À Profa. Dra. Valéria Weiss Angeli pela co-orientação, pela exigência, pelo bom

exemplo, pela colaboração em relação aos trabalhos relacionados às micro e nanopartículas e,

por dedicar até mesmo seu tempo de licença para minha orientação.

Ao enólogo Alejandro Cardozo da vinícola Piagentini Ltda., por auxiliar na

idealização do projeto e deste trabalho, na obtenção do mosto e na elaboração dos

espumantes.

Aos professores e funcionários do curso de Pós-Graduação em Biotecnologia em

especial aos professores Dr. Sergio Echeverrigaray e Dra. Mirian Salvador e Dr. Aldo J. P.

Dillon pelo acompanhamento e sugestões que deixaram este trabalho melhor e a secretária

Lucimara Serafini Rech pelo apoio constante.

Aos meus colegas e amigos Ângela Rossi Marcon, Carlos Roani, Fernanda Spinelli,

Gilberto João Carnieli, Júlio Meneguzzo, Plínio Manosso, Susiane Leonardelli, Sandra

Valduga Dutra, pelo auxílio, incentivo e amizade, que foram essenciais para a realização deste

trabalho.
 Às bolsistas de iniciação científica Letícia Pederiva, Cristiane Leonardelli, Pâmela

Neto, Giovana Modelski e Bruna Lizot Trentin; e aos colegas de pós-graduação Daniel de

Siqueira Ferreira e Cátia Branco pela ajuda prática na realização dos experimentos e análises

dos espumantes deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Manique Barreto, meus sinceros agradecimentos por estar

sempre pronto a me ajudar, deixar sempre seu laboratório de portas abertas para me receber e

para realizar meus experimentos.

Aos colegas da UFSC, Sabrina Matos de Carvalho, Cleonice da Rosa e Matheus

Maciel por me receberem e me auxiliarem na utilização dos equipamentos com sua

experiência e com seus conhecimentos.

À Universidade de Caxias do Sul (UCS), ao Instituto Brasileiro do Vinho (IBRAVIN)

e ao Laboratório de Referência Enológica (LAREN) pela oportunidade da realização desta

pesquisa.

Ao CNPq, à Fapergs e a Capes, pelo apoio financeiro necessário para realização do

trabalho.

Agradeço a todas aquelas pessoas que de forma direta ou indireta contribuíram para

realização deste trabalho.

ÍNDICE

LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. I

LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................. II
LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................. III
RESUMO................................................................................................................................ IV
ABSTRACT ............................................................................................................................. V
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 6
2. OBJETIVO ........................................................................................................................ 9
3.1. OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 9
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................ 9
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA GERAL........................................................................ 11
3.1. VINHO ESPUMANTE ..................................................................................................... 11
3.1.1. Etapas na elaboração de vinhos espumantes através do método tradicional .... 13
3.1.2. Envelhecimento dos vinhos espumantes e a autólise das leveduras .................. 14
3.2. OXIDAÇÃO DOS VINHOS .............................................................................................. 17
3.2.1. Alteração oxidativa do perfil aromático ............................................................ 17
3.2.2. Alteração oxidativa dos compostos fenólicos ..................................................... 19
3.2.3. Escurecimento .................................................................................................... 20
3.3. GLUTATIONA .............................................................................................................. 22
3.3.1. Glutationa como antioxidante em mostos e vinhos: inibição do escurecimento e
impacto nos compostos aromáticos................................................................................... 26
3.4. ENCAPSULAÇÃO DA GLUTATIONA ............................................................................... 33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 38
4.1. CAPÍTULO 1 – EFEITO DA GLUTATIONA NA PREVENÇÃO DA OXIDAÇÃO DE VINHOS
BRANCOS................................................................................................................................ 39
4.2. CAPÍTULO 2 - EFEITO DA ADIÇÃO DE GLUTATIONA EM VINHOS ESPUMANTES .......... 49
4.3. CAPÍTULO 3 – EFEITO DA GLUTATIONA DURANTE O ARMAZENAMENTO DE VINHOS
ESPUMANTES .......................................................................................................................... 58
4.4. CAPÍTULO 4 – PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROPARTÍCULAS DE Β-
CICLODEXTRINA/GLUTATIONA E QUITOSANA/GLUTATIONA OBTIDAS POR SPRAY-DRYER ....... 65

5. DICUSSÃO GERAL ....................................................................................................... 89

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ............................................................................ 92
7. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR ........................................................................ 94
8. ANEXOS ........................................................................................................................ 105
8.2. ANEXO I - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................ 105
 i

LISTA DE TABELAS

Lista de Tabelas do Capítulo 2

TABLE 1 – EXPERIMENTAL DESIGN 32...................................................................................... 52

TABLE 2 – VOLATILE COMPOSITION OF SPARKLING WINE – EXPERIMENTS 1-9 …………….… 53
TABLE 3 – PHENOLIC COMPOUNDS, COLOR INDEX, FREE SO2 AND GSH CONTENT OF SPARKLING
WINE – EXPERIMENTS 1-9 ………………………………………………………………….… 54

Lista de Tabelas do Capítulo 3

TABELA 1 – SO2 LIVRE, ACETALDEÍDO, ÍNDICE DE COR, CONCENTRAÇÃO DE CATEQUINA,

EPICATEQUINA, ÁCIDO CAFEICO, ÁCIDO CUMARICO E COMPOSTOS FENÓLICOS TOTAIS DOS
ESPUMANTES COM 1, 6, 12 E 18 MESES DE ARMAZENAMENTO ................................................... 63

Lista de Tabelas do Capítulo 4

TABELA 1. RENDIMENTO, PERCENTUAL DE RECUPERAÇÃO E EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DAS

FORMULAÇÕES DE MICROPARTÍCULAS DE QUITOSANA/GSH E DE Β-CD/GSH ........................... 81
TABELA 2. PARÂMETROS OBTIDOS PARA A EQUAÇÃO MT/M∞ = KTN PARA A FORMULAÇÃO DE
MICROPARTÍCULA DE Β-CD E PARA A DE QUITOSANA, AMBAS CONTENDO GSH ........................ 85
 ii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – ESTRUTURA QUÍMICA DAS MOLÉCULAS DE GLUTATIONA REDUZIDA (A) COM A

PRESENÇA DO GRUPO SULFÍDRICO E GLUTATIONA OXIDADA (B) COM A PRESENÇA DA PONTE
DISSULFETO ............................................................................................................................... 22
FIGURA 2 – REAÇÃO DA GLUTATIONA COM COMPOSTOS DE ORTO-QUINONA (O LOCAL DA
ADIÇÃO DEPENDE DO TIPO DE COMPOSTO FENÓLICO ENVOLVIDO) (SONNI ET AL., 2011) ............ 27

Lista de Figuras do Capítulo 3

FIGURA 1 – CONCENTRAÇÃO DE GSH NOS VINHOS ESPUMANTES DURANTE O TEMPO DE 1, 6 E 12

MESES DE ARMAZENAMENTO. ..............................................ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.1
FIGURA 2 – CONCENTRAÇÃO DE GLUTATIONA TOTAL NOS VINHOS ESPUMANTES DURANTE O
TEMPO DE 1, 6 E 12 MESES DE ARMAZENAMENTO. ...............ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.1

Lista de Figuras do Capítulo 4

FIGURA 1. MICROGRAFIAS OBTIDAS POR MEV DAS MICROPARTÍCULAS DE (A)

QUITOSANA/GSH, (B) QUITOSANA, (C) Β-CD/GSH, (D) Β-CD, (E) GSH.................................... 74
FIGURA 2. ESPECTROS NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO PARA (A) GSH, (B) QUITOSANA, (C)
MICROPARTÍCULAS QUITOSANA/GSH, (D) MISTURA FÍSICA QUITOSANA E GSH ........................ 75
FIGURA 3. ESPECTROS NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO PARA (A) GSH, (B) Β-CD, (C)
MICROPARTÍCULAS Β-CD/GSH, (D) MISTURA FÍSICA Β-CD E GSH ........................................... 76
FIGURA 4. TERMOGRAMAS DE DSC: (A) GSH, (B) QUITOSANA, (C) Β-CD, (D) Β-CD/GSH, (E)
QUITOSANA/GSH, (F) MISTURA FÍSICA QUITOSANA E GSH, (G) MISTURA FÍSICA Β-CD E GSH .. 77
FIGURA 5. TERMOGRAMAS DAS AMOSTRAS DE (A) QUITOSANA, (B) GSH, (C) MICROPARTÍCULAS
DE QUITOSANA/GSH, (D) MICROPARTÍCULAS DE Β-CD/GSH, (E) Β-CD .................................... 78
FIGURA 6. DIFRATOGRAMAS DAS MICROPARTÍCULAS DE QUITOSANA (A), DAS
MICROPARTÍCULAS DE Β-CD (B), DA Β-CD (C), DA QUITOSANA (D) E DA GSH (E)..................... 80
FIGURA 7. PERFIL DE LIBERAÇÃO DA GSH EM VINHO MODELO (SOLUÇÃO HIDROALCOÓLICA
12 %, PH 3,5) À 25 ºC (N=3) ...................................................................................................... 83
FIGURA 8. LIBERAÇÃO DA GSH PELA RAZÃO MT/M∞ EM FUNÇÃO DO TEMPO PARA AS
MICROPARTÍCULAS Β-CD/GSH E QUITOSANA/GSH .................................................................. 84
 iii

LISTA DE ABREVIATURAS

GSH – glutationa

GSSG – glutationa oxidada ou glutationa dissulfeto

CD – ciclodextrina

PPO – polifenoloxidase

POD – peroxidase

ROS – espécies reativas de oxigênio

GRP – Grape Reaction Product ou 2-(S)-glutationilcaftárico

GEC – Glutathione Equivalent Capacity

DTT – ditiotreitiol

NDA – naftaleno-2,3-dicarboxaldeído

UV – ultravioleta

MEV ou SEM – microscopia eletrônica de varredura

TGA – análise termogravimétrica

DSC – calorimetria exploratória diferencial

FT-IR – espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier

DRX ou XRD – difratometria de raios X

EE – eficiência de encapsulação

DNTB – sulfidril 5,5-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico)

 iv

RESUMO

Vinhos espumantes, assim como os vinhos brancos, são muito susceptíveis a oxidação nas
etapas de elaboração e durante o armazenamento e envelhecimento. A glutationa (GSH),
antioxidante naturalmente presente nas uvas e derivados, contribui positivamente na
preservação de aromas, prevenção do escurecimento e outros defeitos decorrentes do
armazenamento prolongado em vinhos brancos. A molécula de GSH é muito reativa, devido a
seu grupo sulfidrila. Neste sentido, uma alternativa para preservá-la e manter suas
propriedades antioxidantes por um maior período durante o armazenamento dos espumantes
seria a microencapsulação em um sistema polimérico. A microencapsulação também poderia
evitar um aspecto negativo da utilização de GSH em vinhos, que é indução da formação de
H2S (off-flavour), visto que, se a GSH for liberada lentamente poderia evitar o efeito redutor
de oxigênio no vinho. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da
adição de GSH livre em espumantes e preparar microcápsulas contendo glutationa para adição
em vinhos e/ou espumantes. A GSH livre (10, 20 e 30 mg L-1) foi adicionada em diferentes
etapas da elaboração (mosto, vinho base e espumante) de espumantes pelo método tradicional.
Foram avaliados os efeitos da adição de GSH sobre compostos aromáticos, os compostos
fenólicos relacionados ao escurecimento de vinhos brancos e as concentrações de SO2 livre.
As análises dos compostos fenólicos e da glutationa total e reduzida foram realizadas por
cromatografia líquida de alta eficiência e espectrofotometria UV e, as análises dos compostos
aromáticos foram realizadas por cromatografia gasosa. As micropartículas contendo GSH
como composto ativo foram preparadas por spray-dryer com quitosana ou β-ciclodextrina (β-
CD), como polímeros e sua caracterização foi realizada por microscopia eletrônica de
varredura (MEV), análise termogravimétrica (TGA), calorimetria exploratória diferencial
(DSC), espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourrier (FT-IR),
difratometria de raios-X (DRX). Além disso, foram realizados testes para verificar a
recuperação da GSH, a eficiência de encapsulação e a cinética de liberação da GSH em vinho
modelo. A adição de GSH ao mosto influenciou mais na composição do espumante do que a
adição ao vinho base. Entretanto, a adição de GSH ao vinho base manteve níveis elevados de
SO2 na forma livre. A adição de 10 mg L-1 de GSH no mosto é suficiente para assegurar
menores concentrações de ácidos cafeico, cumárico e ferrúlico nos espumantes. A adição de
20 mg L-1 de GSH no espumante junto com o liquor de expedição resultou em menor índice
de cor, maiores quantidades de SO2 na forma livre, menores concentrações de acetaldeído e
mesma quantidade de compostos fenólicos até 12 meses de armazenamento em garrafas. A
quantidade de GSH adicionada no espumante pronto decaiu em um mês de armazenamento e
estabilizou nos primeiros seis meses, porém a quantidade de glutationa total permaneceu
maior no espumante com adição de 30 mg L-1, até 12 meses de armazenamento. Apesar de
somente a GSH ter propriedade antioxidante, a quantidade de glutationa total teve maior
correlação com os resultados obtidos e, por isso, o nível de glutationa total pode ser um
melhor indicador da condição antioxidante do vinho. Foi possível encapsular glutationa tanto
utilizando β-CD, quanto utilizando quitosana. A caracterização das microcápsulas
comprovaram um microrrevestimento do composto ativo e uma interação entre a GSH e os
polímeros utilizados. A β-CD foi mais eficiente para encapsular a GSH, permitindo a
liberação gradativa da molécula em solução de vinho modelo e maior proteção da molécula,
conferindo melhor estabilidade térmica para GSH.

Palavras-chave: glutationa, vinhos espumantes, microencapsulação, antioxidante.

 v

ABSTRACT

Sparkling wine, white wines as well, are very susceptible to oxidation in the processing stages
and during storage and aging. Glutathione (GSH), present naturally in grapes and derivatives,
is an antioxidant which positively contributes to the preservation of aromas, prevention of
browning and other defects resulting from prolonged storage of white wines. The GSH
molecule is very reactive due to its sulfhydryl group. In this sense, an alternative to preserve it
and maintain its antioxidant properties for a longer period during the storage of sparkling
wine would be the microencapsulation of GSH into a polymeric system. Microencapsulation
of GSH could also prevent a negative aspect of the use of GSH in wine, which is inducing the
formation of H2S (off-flavor), once the GSH is released slowly avoid oxygen reduced
conditions in wine. In this context, this study aimed to evaluate the effect of adding free GSH
in sparkling wine and prepare microcapsules containing glutathione to addition to the wine
and/or sparkling wine. The free GSH (10, 20 and 30 mg L-1) was added at different stages
(must, base wine and sparkling wine) of sparkling wine elaboration by the traditional method.
The effects of the addition of GSH on aromatics compounds, phenolic compounds related to
browning of white wines and on the free SO2 concentrations were evaluated. The analysis of
phenolic compounds and the total and reduced glutathione were performed by high-
performance liquid chromatography and UV spectrophotometry and; the analyzes of the
aromatic compounds were made by gas chromatography. The microparticles containing GSH
as active compound were prepared by spray-dryer with chitosan or β-cyclodextrin as
polymers and their characterization was performed by scanning electron microscopy (SEM),
thermal gravimetric analysis (TGA), differential scanning calorimetry (DSC), spectroscopy in
the infrared with Fourier transform (FT-IR), X-ray diffraction (XRD). Furthermore, tests were
performed to verify the recovery of GSH, the encapsulation efficiency and release kinetics of
GSH in a model wine. The addition of GSH to the must influenced more in the sparkling wine
composition than the addition to the base wine. However, the addition of GSH to the base
wine appears to maintain higher levels of SO2 in its free form. The addition of 10 mg L-1 of
GSH in the mus is sufficient for lower concentrations of caffeic acid, coumaric acid and
ferulic in sparkling wine. The addition of 20 mg L-1 of GSH in the sparkling wine toghether
with the expedition liqour resulted in lower color index, larger amounts of SO2 in free form,
lower acetaldehyde concentration and same amount of phenolic compounds up to 12 months
storage in bottle. The amount of GSH added to the ready sparkling wine declined in one
month storage and stabilized within the first six months, but the amount of total glutathione
remained higher in sparkling wine with addition of 30 mg L-1 until 12 months of storage.
Although only GSH have antioxidant property, the total amount of glutathione had a higher
correlation with the results obtained and therefore, the overall glutathione levels are a better
indicator of wine antioxidant condition than GSH itself. It was possible to encapsulate
glutathione using both, β-CD or chitosan. The characterization of microcapsules proved the
micro surfacing of the active compound and an interaction between GSH and the polymers as
well as improvement of the thermal stability of the molecule. The β-CD was more efficient for
encapsulating GSH, allowing a gradual release of the molecule into model wine solution and
added protection of the molecule, giving improved thermal stability for GSH.

Keywords: glutathione, sparkling wines, microencapsulation, antioxidant.

 6

1. INTRODUÇÃO

A vitivinicultura brasileira está concentrada principalmente no estado do Rio Grande

do Sul, particularmente na Serra Gaúcha, região que se destaca pela produção –

aproximadamente 95% do espumante brasileiro – e qualidade dos seus espumantes. A Serra

Gaúcha apresenta diversos fatores naturais que propiciam a elaboração de um vinho base com

aromas primários finos e delicados, boa acidez e baixo teor alcoólico, resultando em

espumantes de alta qualidade, sendo comparados aos melhores do mundo.

O vinho espumante pode ser elaborado através do método tradicional (Champenoise)

ou método Charmat. O vinho espumante elaborado através do método tradicional é o produto

final que após duas fermentações permanece por um período amadurecendo com as leveduras

dentro da garrafa. Este método resulta em espumantes com aroma complexo caracterizado por

notas de levedura e tostado, de qualidade diferenciada. Os vinhos espumantes brasileiros são

elaborados predominantemente com as uvas Chardonnay e Pinot Noir, embora a uva Riesling

Itálico também seja utilizada em alguns cortes.

Durante a elaboração e armazenamento dos vinhos espumantes podem ocorrer reações

de oxidação, o que leva a perda dos aromas característicos do vinho, formação de aromas

atípicos e escurecimento. A adição de antioxidantes é uma das alternativas para evitar o

processo oxidativo e manter a qualidade dos vinhos. O dióxido de enxofre (SO2) é o

antioxidante tradicionalmente utilizado, também por sua ação antimicrobiana. Os sulfitos

ainda são considerados as ferramentas mais eficazes para controlar reações de oxidação em

vinhos, entretanto são tóxicos e alergênicos. Atualmente, a indústria vinícola busca

alternativas para reduzir o uso de SO2, visto que a busca de uma alimentação saudável através

do consumo de produtos naturais é uma tendência mundial. Embora a eliminação total do SO2

ainda não seja viável, evidências científicas e tecnológicas confirmam a possibilidade de

reduzir significativamente seu uso nas etapas iniciais de vinificação. Entretanto, é mais difícil
 7

encontrar substitutos adequados para o SO2 nos vinhos finais engarrafados.

A glutationa é um antioxidante que está naturalmente presente em uvas. Ela pode estar

na forma reduzida (GSH) ou na forma oxidada (GSSG) dependendo do meio, sendo que sua

molécula é muito reativa. Apenas na forma reduzida ela apresenta propriedades antioxidantes,

que podem inibir reações de oxidação, prevenir o escurecimento e a formação de compostos

aromáticos atípicos e decorrentes da oxidação no vinho, além de preservar os aromas

varietais. A glutationa reduzida (GSH) pode sofrer reações de adição com compostos

fenólicos oxidados (o-quinonas), converter eles de volta a sua forma reduzida e menos reativa,

além disso, a GSH pode ligar compostos aldeídos relevantes para vinho, assim como o SO2,

evitando a oxidação do vinho.

Os níveis de GSH naturalmente encontrados nos vinhos podem variar conforme a

cultivar, o local de cultivo (solo, clima, altitude) e conforme as práticas enológicas utilizadas.

Durante a fermentação, a concentração de GSH é variável e o metabolismo da levedura é

influenciado pelo conteúdo de GSH extracelular. A adição de GSH vem sendo muito

discutida atualmente pelos órgãos regulamentadores de diversos países, por isso, estudos

sobre a adição de GSH em vinhos espumantes são necessários para elucidar qual a

concentração de GSH deveria ser adicionada e em que etapa da elaboração, para possibilitar a

avaliação da sua contribuição para qualidade dos vinhos espumantes.

A GSH é uma molécula muito reativa e logo que adicionada ao vinho se combina com

outros compostos ou se oxida, conforme as condições do meio. Para proteger a molécula de

GSH contra agentes químicos e/ou degradação enzimática e, para evitar que ela se esgote na

forma livre, combinando com outros compostos rapidamente, uma alternativa interessante

para a adição de GSH em vinhos seria a sua proteção em micro ou nanocápsulas. Dessa

maneira, a GSH seria liberada de forma controlada, reagindo continuamente com os

compostos do vinho por um maior tempo durante seu armazenamento em garrafas. A micro
 8

ou nanoencapsulação de GSH também poderia evitar a indução da formação de H2S (off-

flavour), evitando condições de oxigênio baixo disponível.

Neste contexto, este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da adição de

diferentes concentrações de GSH em diferentes etapas da elaboração de vinhos espumantes na

sua composição volátil e fenólica durante o tempo de amadurecimento em contato com as

borras e durante o tempo de armazenamento. Além disso, este trabalho tem também como

objetivo preparar e caracterizar microcápsulas contendo glutationa visando sua adição em

vinhos.
 9

2. OBJETIVO

3.1.Objetivo Geral

Avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de GSH durante o processo de

elaboração de vinhos espumantes, pelo método tradicional, sobre a manutenção dos compostos

aromáticos e fenólicos, e também sobre o escurecimento durante o amadurecimento e

armazenamento, bem como encapsular GSH e estudar sua liberação em vinho modelo.

3.2.Objetivos específicos

 Estudar o efeito da adição de GSH em vinhos espumantes em concentrações de 10, 20 e

30 mg L-1, em três etapas da elaboração pelo método tradicional (antes da primeira

fermentação, antes da segunda fermentação e após o degórgement);

 Avaliar a concentração de GSH e de glutationa total nos vinhos espumantes com adição

de GSH durante o armazenamento;

 Estudar o efeito da adição de GSH sobre a concentração de ésteres e álcoois superiores

nos vinhos espumantes durante o armazenamento;

 Estudar o efeito da adição de GSH sobre concentração dos ácidos cafeico, cumárico e

ferrúlico, catequina e epicatequina nos vinhos espumantes durante o armazenamento;

 Avaliar o efeito da adição de GSH sobre o índice de cor e o SO2 livre nos vinhos

espumantes durante o armazenamento;

 Elaborar micropartículas de quitosana e de β-ciclodextrina contendo GSH pelo método

de secagem por spray dryer;

 10

 Caracterizar as micropartículas contendo GSH e avaliar a liberação de GSH em vinho

modelo.
 11

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA GERAL

3.1. Vinho espumante

O vinho espumante requer métodos de elaboração diferenciados, tem alto valor

agregado e sua principal característica é o perlage. As propriedades sensoriais peculiares dos

espumantes, como a efervescência, dependem da segunda fermentação de um vinho base, e do

processo de autólise, que ocorre durante o processo de envelhecimento em garrafas na

presença de cepas de leveduras (Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

Dependendo do processo de elaboração, os vinhos espumantes podem ser classificados

em vinhos espumantes fermentados na garrafa e vinhos espumantes fermentados em grandes

tanques herméticos. Para os vinhos espumantes fermentados em grandes recipientes, a

fermentação é realizada nos tanques hermeticamente fechados, o vinho permanece um

mínimo de 20 dias na presença de leveduras e, após, o vinho espumante é transferido para a

garrafa. Para os vinhos espumantes fermentados em garrafas, a segunda fermentação e o

processo de amadurecimento são realizados na garrafa que será comercializado. Esta técnica

de elaboração é chamada método clássico ou tradicional (Martínez-Rodríguez & Pueyo,

2009).

Entre os vinhos espumantes elaborados pelo método tradicional incluem-se o

“Talento” italiano, o “Cava” elaborado na Espanha e o “Champagne” na França. As principais

diferenças entre estes tipos de vinhos são as variedades de uvas utilizadas na preparação do

vinho base, a zona de produção (área geográfica) e o tempo em contato com as leveduras,

cada um regulado por legislação própria de cada país (Ough, 1992; Hidalgo, 2003).

Os espumantes brasileiros são elaborados principalmente na região sul,

 12

especificamente na Serra Gaúcha. Nesta região as condições climáticas e geográficas são

favoráveis para a produção de uvas para elaboração de espumantes, pois durante os meses de

dezembro, janeiro e fevereiro, que são determinantes do ciclo vegetativo das videiras visando

a elaboração de espumantes, o número de dias de chuvas bastante elevado reduz a insolação,

enquanto as noites são frescas com temperaturas noturnas menores que de 20°C (Mével,

2006). Estes dois fatores fazem que as uvas não maturem completamente, o que lhes confere

elevado teor de acidez e teores moderados de açúcar, um perfil perfeito para uvas destinadas à

produção de espumantes. Aliado a isto, a lenta maturação favorece a formação de aromas

muito finos e delicados, fator também essencial para a qualidade do espumante (Azevedo &

Velloso, 2006). Estes fatores climáticos da região resultam em uvas com baixo potencial

alcoólico (9,5 a 10,5% v/v), acidez titulável relativamente elevada (75 a 85 meq/L) e pH

baixo (3,10 a 3,25), condições necessárias para garantir o frescor, fator importante para a

qualidade dos vinhos espumantes (Rizzon et al., 2000).

As uvas Chardonnay, entre as brancas, e Pinot Noir, entre as tintas, são as mais

utilizadas para elaboração de vinhos espumantes. Além dessas, são utilizadas também as

variedades brancas Riesling Itálico, Sémillon e Trebbiano, e em casos mais específicos, a

Cabernet Franc, vinificada em branco (Rizzon et al., 2000). As variedades Chardonnay e a

Pinot Noir são originárias da França. A primeira origina um vinho equilibrado e aporta aromas

de maçã verde, abacaxi e cítricos maduros, reforçando a complexidade aromática e a acidez, além

de preencher o meio de boca, aumentando a persistência final. A segunda é uma cultivar de

película tinta vinificada em branco para elaboração de vinho espumante que apresenta

excelente acidez e sútil aromas de frutas vermelhas, com toques de especiarias, além de conferir

mais corpo e estrutura ao espumante (Rizzon et al., 2000; Azevedo & Velloso, 2006).
 13

3.1.1. Etapas na elaboração de vinhos espumantes através do método tradicional

Para elaboração dos vinhos espumantes, o vinho base derivado da primeira

fermentação, produzido através das técnicas usuais utilizadas na obtenção de vinhos brancos,

é transvasado para garrafas e adicionado do liquor de tirage. O vinho base pode ser

monovarietal ou uma mistura de vinhos de diferentes variedades, e deve apresentar certas

características sensoriais (cor pálida e aroma frutado) e analíticas (concentração suficiente de

oxigênio para que as leveduras se multipliquem, conteúdo de álcool moderado e baixa acidez

volátil). Não deve conter leveduras residuais, ou bactérias, e usualmente é submetido à

estabilização tartárica. Depois de introduzido na garrafa, ela é fechada com uma tampa

temporária (Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

O liquor de tirage é uma solução formada por leveduras responsáveis pela segunda

fermentação, sacarose e mosto de uva, nas proporções corretas para produzir uma pressão

desejável de dióxido de carbono (CO2). As leveduras utilizadas na segunda fermentação

devem também apresentar características como atividade fermentativa a baixas temperaturas,

resistência ao etanol e a pressão do dióxido de carbono, potencial de decantação, etc. (Saracco

& Gozzelino, 1995; Martínez-Rodríguez et al., 2001).

As garrafas são mantidas em ambientes escuros com temperatura e umidade

controlada especialmente para o processo de amadurecimento. Neste estágio ocorre a segunda

fermentação, o CO2 é formado e estabilizado e, posteriormente, é ocorre o amadurecimento

em contato com as leveduras. Durante este amadurecimento ocorre a autólise de leveduras,

causando a liberação de muitos compostos importantes para a qualidade dos espumantes e que

porpocionam características únicas a cada garrafa (Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009;

Torresi et al., 2011). As garrafas são então submetidas a um processo de movimentação para

o que o sedimento se desloque para o gargalo da garrafa. Este processo foi originalmente

realizado com as garrafas inclinadas em pupitres de madeira, girando-as manualmente 1/8 de

 14

volta por dia durante aproximadamente quinze ou mais dias, dependendo do tipo de vinho, de

sua estrutura coloidal, do tipo de levedura e da capacidade desta formar grumos (Ribéreau-

Gayon et al., 2003; Torresi et al., 2011). Hoje, este sistema vem sendo substituído por

sistemas automatizados que podem mover todas as garrafas simultaneamente (Torresi et al.,

2011). Após, este depósito de leveduras no gargalo das garrafas é congelado através da

imersão em um banho criogênico. A tampa é removida e a pressão interna ocasiona a

expulsão do depósito congelado (Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

No processo de expulsão do depósito de leveduras, em francês denominado

degorgement, uma quantidade de vinho pode ser perdida, a qual pode ser compensada na

adição do licor de expedição. Este liquor deve ser composto do próprio vinho espumante ou

por sacarose, mosto de uva, mosto parcialmente fermentado, ou mosto corrigido ou não, o

vinho base, ou uma mistura desses produtos, com adição, quando relevante, de vinhos

destilados. Dessa maneira, pode ser dado ao vinho espumante o grau de doçura desejável.

Finalmente, a garrafa é fechada com a rolha final (Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

3.1.2. Amadurecimento dos vinhos espumantes e a autólise das leveduras

O processo de amadurecimento do vinho espumante é associado com a qualidade

sensorial do vinho final. É durante este processo que ocorre a autólise das leveduras, através

da qual são liberados compostos intracelulares para o vinho que podem alterar

significativamente sua composição final (Torresi et al., 2011). A autólise das leveduras

poderia ser definida como a hidrólise dos biopolímeros sob a ação de enzimas hidrolíticas que

liberam compostos do citoplasma (peptídeos, aminoácidos, ácidos graxos e nucleotídeos) e da

parede celular (glucanos e manoproteínas) para o vinho (Alexandre & Guilloux-Benatier,

2006). Geralmente, a autólise inicia no final da fase de crescimento estacionário e está

associado à morte celular. Quando os açúcares e outros nutrientes são consumidos, as células
 15

de levedura utilizam suas reservas de energia interna, compostas de glicogênio e outros

elementos. Uma vez que estas reservas se tornam insuficientes para a demanda de energia da

célula, inicia sua autofagia e subsequentemente autólise (Alexandre & Guilloux-Benatier,

2006; Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

As características gerais do mecanismo de autólise propostas são as seguintes: enzimas

hidrolíticas são liberadas no espaço intracelular devido à degradação das endoestruturas das

células. Inicialmente estas enzimas são inibidas por inibidores citoplasmáticos específicos,

que após são degradados provocando a ativação proteolítica dessas enzimas. Quando o espaço

intracelular é insuficiente devido à acumulação dos produtos da hidrólise formados pela

degradação enzimática de macromoléculas intracelulares, os produtos autolíticos são

liberados ao meio extracelular. Por fim, uma maior degradação de compostos mais

polimerizados em compostos de baixo peso molecular ocorre no ambiente extracelular

(Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

As pesquisas realizadas sobre autólise em enologia são realizadas com dois enfoques:

um sobre a quebra da parede celular através da análise das mudanças nos seus componentes

durante a hidrólise, realizando estudos estruturais e ultraestruturais das células de leveduras e,

outro, analisando os diferentes produtos liberados no meio durante a autólise, seguindo as

mudanças nos compostos nitrogenados, polissacarídeos, glicoproteínas, ácidos nucléicos,

lipídios e outras macromoléculas. As condições de autólise durante o envelhecimento dos

vinhos espumantes elaborados pelo método tradicional não são ótimas e por isso pode levar

meses ou anos até que termine (Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

Durante o amadurecimento dos vinhos espumantes, as leveduras podem liberar

aminoácidos para o meio extracelular antes que a autólise inicie. Esta liberação ocorre como

uma resposta celular a ausência de nutrientes do vinho. Durante o processo de autólise, a

concentração de aminoácidos aumenta apenas alguns miligramas por litro. Duas possíveis
 16

explicações são sugeridas para esta observação: primeiro, a protease A é uma endoprotease

que produz peptídeos ao invés de aminoácidos, e, segundo, que os aminoácidos liberados são

transformados através de reações de descarboxilação e desaminação, que causariam a redução

na concentração final dos aminoácidos. A concentração de peptídeos no vinho aumenta antes

que a concentração de aminoácidos livres, demonstrando que primeiro são liberados peptídeos

e posteriormente, estes são hidrolisados em aminoácidos (Moreno-Arribas et al., 1996). A

concentração final de peptídeos presentes nos vinhos espumantes pode ser influenciada por

diferentes variáveis, tais como a temperatura, tempo de amadurecimento, cepa de levedura

utilizada na segunda fermentação, entre outros (Martínez-Rodríguez et al., 2002).

Ainda durante a autólise das leveduras no processo de elaboração de vinhos

espumantes, a atividade enzimática (proteases e glucanases) causa a quebra dos glucanos e a

liberação das manoproteínas da parede celular (Alexandre & Guilloux-Benatier, 2006).

Outros compostos, liberados durante a autólise, estão presentes em quantidades menores, tais

como lipídios e ácidos nucléicos, podem ter um papel importante nas características sensoriais

do vinho final (Pueyo et al., 2000; Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009). Lipídios podem

afetar as características organolépticas do vinho, pois os ácidos graxos liberados podem

aumentar os componentes voláteis com baixo limiar de percepção, tanto diretamente como

através de derivados tais como ésteres, cetonas e aldeídos (Charpeniter & Feuillat, 1993).

Além disso, vários compostos voláteis são formados ou liberados durante a autólise (Hidalgo

et al., 2004), alguns com baixos níveis de percepção. Os ésteres são a maior família de

compostos voláteis liberados durante a autólise (Alexandre & Guilloux-Benatier, 2006;

Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009). Diferentes autores relacionam a qualidade dos vinhos

espumantes à concentração de ésteres, como caproato de isoamila, acetato de octila, acetato

de feniletila, caproato de feniletila, linoleato de etila, e succinato de dietila (Pozo-Bayón et al.,

2003; Pueyo et al., 1995). Embora seja aceito que a segunda fermentação e o amadurecimento
 17

em contato com as leveduras alteram o perfil aromático dos vinhos espumantes (Francioli et

al., 2003; Riu-Aumatell et al., 2006), o impacto destes compostos nas propriedades sensoriais

dos vinhos espumantes é pouco entendida (Martínez-Rodríguez & Pueyo, 2009).

Apesar dos baixos níveis de oxigênio disponíveis no meio devido à presença de CO2,

durante o amadurecimento e armazenamento dos vinhos espumantes em garrafas, podem

ocorrer reações de oxidação envolvendo compostos fenólicos e aromáticos, assim como

ocorre nos vinhos brancos tranquilos.

3.2. Oxidação dos vinhos

O processo oxidativo dos vinhos inclui alterações como a perda de aromas frutados e

florais, o desenvolvimento de aromas desagradáveis e o escurecimento precoce. A

susceptibilidade de um vinho a estas alterações está relacionada principalmente a três fatores:

(1) potencial redox do vinho; (2) concentração e tipo de antioxidantes – intrínsecos ou

adicionados –; (3) compostos fenólicos presentes; e, concentração de oxigênio dissolvido

(Silva Ferreira et al., 2003; Li et al., 2008; Hosry et al., 2009; Comuzzo & Zironi, 2013).

3.2.1. Alteração oxidativa do perfil aromático

O aroma dos vinhos constitui uma das mais importantes características organolépticas

da sua qualidade e tipicidade. Nos vinhos jovens, o aroma é essencialmente determinado pelos

constituintes voláteis provenientes das uvas e da vinificação. Entretanto, durante o

amadurecimento e o armazenamento, vários compostos voláteis do vinho são transformados.

Como exemplo, os ésteres de ácidos graxos formados na fermentação alcoólica que

constituem elementos importantes do aroma dos vinhos brancos e desaparecem durante a

conservação, devido à hidrólise destes ésteres (Ribéreau-Gayon et al., 2003). Neste sentido,
 18

vários compostos fermentativos (ésteres etílicos de ácidos graxos, acetatos, ácidos graxos e

terpenos) diminuem com o envelhecimento oxidativo, enquanto outros, como sotolon e

derivados de furfural, aumentam (Lavigne et al., 2008; Papadopoulou & Roussis, 2008;

Roussis & Sergianitis, 2008).

A degradação oxidativa do aroma do vinho é dependente de vários fatores, incluindo a

concentração de oxigênio dissolvido, pH, temperatura de armazenamento, concentração e tipo

de compostos fenólicos presentes, assim como a presença de antioxidantes exógenos, tais

como SO2 e ácido ascórbico (Silva Ferreira et al., 2002). Ela é caracterizada pela perda de

aromas característicos e formação de aromas atípicos (off flavour) associados a deterioração

do vinho, como naftalina, amadeirado, feno, ração, querosene (Vaimakis & Roussis, 1996;

Escudero et al., 2002; Silva Ferreira et al., 2002; Papadopoulou & Roussis, 2008; Roussis &

Sergianitis, 2008). A presença destes aromas atípicos têm sido atribuída a compostos como 3-

(metiltio)propionaldeído (metional), 4-propenil-2-metoxifenol (eugenol), 3-hidroxi-4,5-

dimetil-2(5H)-furanona (sotolon), 2,4,5-trimetil-1,3-dioxolano, fenilacetaldeído e 1,1,6-

trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN) (Escudero et al., 2000; Silva Ferreira et al.,2003; Lavigne

et al., 2008). Além destes, a aminoacetofenona, um composto derivado do ácido indol-

acético, também é associado a aromas característicos do envelhecimento atípico, como de

amaciante de roupa, verniz ou naftalina (Hoenicke et al., 2002; Shneider, 2007). O seu limiar

de percepção sensorial situa-se entre 0,7 e 1,0 μg.L-1. Os vinhos de uvas Vitis vinifera contêm

teores entre 0,02 e 0,3 μg.L-1, porém em vinhos alterados, esse teor pode chegar até 10 μg.L-1.

Já nos vinhos de uvas da espécie Vitis labrusca, a aminoacetofenona participa do seu aroma

característico, não sendo considerado um aroma atípico ou defeito aromático (Dubourdieu &

Lavigne-Cruege, 2004; Shneider, 2007).

Além dos compostos aromáticos citados, o acetaldeído, quando presente em

concentrações elevadas, também pode ser considerado característico de vinhos oxidados. Este
 19

aldeído pode estar presente no vinho depois da fermentação primária como um resíduo do

metabolismo primário da levedura, ou pode ser formado se o vinho se encontra em condições

de oxidação. Neste último caso, acetaldeído é formado através da oxidação microbiana do

etanol em condições aeróbias. Depois de formado, este composto pode combinar-se com os

compostos fenólicos flavanóides, incluindo taninos e antocianinas, originando pigmentos

escuros (Sonni et al., 2011b; Comuzzo & Zironi, 2013). Em baixas concentrações, o

acetaldeído dá um aroma frutado agradável ao vinho; mas em concentrações elevadas, se

transforma em um aroma vegetal irritante lembrando grama verde ou maçã (Liu & Pilone,

2000).

3.2.2. Alteração oxidativa dos compostos fenólicos

No vinho, os polifenóis e especialmente os flavonoides, como os flavan-3-ols e os

produtos da sua condensação, as procianidinas, representam uma classe de compostos

prontamente oxidáveis envolvendo o escurecimento e a instabilidade de importantes

componentes aromáticos varietais durante o envelhecimento (Fernandez-Zurbano et al., 1995;

Li et al., 2008; Nikolantonaki et al., 2014). Os compostos fenólicos presentes em maior

quantidade nos mostos e vinhos brancos são os ácidos benzóicos e cinâmicos, catequinas,

procianidinas e flavonóis. Entre os ácidos cinâmicos presentes nos vinhos brancos estão o

ácido p-cumárico e o ácido cafeico, e, em menor quantidade o ácido ferrúlico. Estes ácidos

cinâmicos existem em estado livre e na forma combinada com o ácido tartárico (ácidos

cutárico e caftárico) (Ribéreau-Gayon et al., 2003) e são os primeiros substratos a serem

oxidados no mosto (Comuzzo & Zironi, 2013). A hidroxilação dos monofenóis resulta na

formação de orto-difenóis que são os compostos mais susceptíveis a oxidação, os quais,

quando oxidados formam as orto-quinonas (du Toit et al., 2006; Li et al., 2008; Sonni et al.,

2011). As quinonas podem polimerizar e condensar com muitos outros compostos (incluindo
 20

espécies fenólicas e não-fenólicas), formando pigmentos escuros, sendo essas reações

aceleradas em pH alto (Rigaud et al.,1991; Fernández-Zurbano et al., 1995; Li et al., 2008).

3.2.3. Escurecimento oxidativo em vinhos brancos

O escurecimento é um processo oxidativo envolvendo açúcares, lipídios, aminoácidos,

ou fenóis em alimentos (Li et al., 2008). É um dos principais problemas encontrados durante

a vinificação, principalmente em vinhos brancos, pois resulta em efeitos negativos nas

propriedades sensoriais (perda de cor, aroma e aumento da adstringência) (Escudero et al.,

2002; Silva Ferreira, et al., 2002) e perda do valor nutricional do vinho (Sioumis et al., 2006).

Portanto, manter a qualidade do vinho branco através de todas as fases da vinificação,

envelhecimento em barris ou garrafas e armazenamento em prateleiras continua sendo um

grande desafio (Nikolantonaki et al., 2014).

O escurecimento do vinho pode ser classificado em enzimático e não-enzimático em

função do mecanismo inicial de oxidação. O enzimático ocorre na maioria das vezes em

mostos, podendo ser controlado, e o não-enzimático prevalece no vinho fermentado,

principalmente na presença de ferro e cobre (Li et al., 2008).

No escurecimento enzimático, as principais enzimas oxidoredutases responsáveis pelo

mecanismo de escurecimento são as polifenoloxidases (PPO) e as peroxidases (POD). O

escurecimento enzimático em mostos é correlacionado com o conteúdo de ácidos

hidroxicinâmicos, incluindo os ácidos caftárico, cutárico e feftárico, sendo suas conformações

naturais trans, ainda que as conformações cis estejam presentes em pequenas quantidades. Os

substratos preferidos das PPO, entre os compostos fenólicos do mosto, são o ácido caftárico e,

em menor intensidade, seu homólogo monohidroxilado, o ácido cutárico (Singleton et al.,

1985; Li et al., 2008). A oxidação enzimática do ácido caftárico e do cutárico conduz ao ácido

caftárico-o-quinona, que participa da degradação oxidativa dos mostos devido sua alta
 21

concentração e reatividade (Rigaud et al.,1991; Fernández-Zurbano et al., 1995; Li et al.,

2008).

A oxidação não-enzimática é decorrente da oxidação dos compostos fenólicos e

subsequente polimerização dos produtos oxidados. As reações de polimerização entre fenóis e

outros constituintes do vinho, incluíndo acetaldeído e ácido glioxílico também podem originar

pigmentos escuros. Os compostos mais susceptíveis são o ácido cafeico e seus ésteres,

catequina, epicatequina, antocianinas e seus derivados, e ácido gálico (Li et al., 2008). Os

níveis de flavan-3-ols são significativamente correlacionados com o grau de escurecimento da

maioria dos vinhos brancos (Fernández-Zurbano et al., 1995)

Durante o envelhecimento o mecanismo de oxidação ocorre devido às espécies

reativas de oxigênio (ROS), tais como o radical superóxido e sua forma protonada, o radical

hidroperoxil. Os grupos funcionais catecol podem reagir com esses radicais, formando

semiquinonas, quinonas e peróxido de hidrogênio; este último pode formar radicais hidroxil

através da reação de Fenton. Esses radicais hidroxil são muito reativos e instáveis; eles

reagem imediatamente, principalmente com os compostos mais representativos no vinho,

como etanol (oxidado à acetaldeído) (Comuzzo & Zironi, 2013).

Diferentes vinhos possuem capacidade oxidativa diversa, dependendo do potencial

redox do vinho, que é dependente do seu status antioxidante. Esse status está diretamente

relacionado aos níveis de antioxidantes tais como fenólicos, GSH, ácido ascórbico e SO2. A

relação entre estes componentes pode retardar a oxidação do vinho (Sioumis et al., 2006;

Hosry et al., 2009).

 22

3.3. Glutationa

A glutationa é um tripeptídeo de ácido glutâmico, cisteína e glicina. É sintetizada a

partir de aminoácidos, através da ação sequencial da γ-glutamilcisteína e da glutationa

sintetase (Noctor & Foyer, 1998). Sua forma monomérica é conhecida como glutationa

reduzida (GSH) e seu dímero, como glutationa oxidada (GSSG) (Figura 1). A GSSG é

formada em consequência da oxidação da GSH, mas pode ser reduzida novamente a GSH

através da enzima glutationa redutase e concomitante oxidação de NADPH (Kritzinger et al.,

2013).

Figura 1 – Estrutura química das moléculas de glutationa reduzida (A) com a presença do
grupo sulfídrico e glutationa oxidada (B) com a presença da ponte dissulfeto

A GSH desempenha vários papéis fisiológicos e bioquímicos em plantas, os mais

importantes são o controle redox e no metabolismo do enxofre (Noctor & Foyer, 1998). A

importância biológica da GSH está relacionada a seu grupo sulfidrila livre (SH) do resíduo de

cisteína, que confere a propriedade redox e nucleofílica. Assim, a GSH pode reduzir radicais
 23

livres devido à sua capacidade de transferir um átomo de hidrogênio do seu grupo sulfidrila e

manter em forma reduzida muitas outras moléculas na matriz do mosto/vinho (Friedman,

1994; Noctor & Foyer, 1998; du Toit et al., 2007).

A glutationa é um componente natural de muitas frutas capaz de inibir a oxidação

enzimática e não-enzimática em sucos de frutas, vinhos e outros alimentos (Friedman, 1994;

Roussis et al., 2007). A GSH foi quantificada primeiramente em uvas em 1989, por Cheynier

et al. (1989). Neste estudo, o conteúdo de GSH em uvas de 28 variedades Vitis vinifera e seus

respectivos mostos variou entre 56 e 372 μmol kg-1 (17-114 mg kg-1). Essa grande variação

foi atribuída não somente a variedade, mas também a safra, localização, condições e zonas de

cultivo e práticas enológicas (Cheynier et al., 1989). Neste sentido, diversos fatores estão

relacionados com o conteúdo de GSH nas uvas, por exemplo, o status de nitrogênio da videira

– estimado como conteúdo de nitrogênio assimilável pela levedura do mosto (Kritzinger et al.,

2013).

No início do amadurecimento da uva a quantidade de GSH aumenta nas bagas. Além

disso, foi observada uma forte correlação entre os níveis de GSH e de sólidos solúveis nas

bagas até 16º Brix, após, a GSH se manteve estável (Adams & Liyanage, 1993; Okuda &

Yokotsuka, 1999). Okuda e Yokotsuka (1999) estabeleceram que a glutationa presente nas

bagas durante a maturação está, em sua maioria (>90%), na forma reduzida. Segundo os

autores, o aumento nos níveis de GSH em bagas no início do amadurecimento pode ser

atribuído a uma maior contribuição dos componentes do floema de fontes como folhas

maduras para a baga. Entretanto, ainda é incerto se a GSH pode ser sintetizada na própria

baga ou qual seria o local exato de síntese (Kritzinger et al., 2013).

Em mostos, o conteúdo de GSH é muito variável. Níveis que variam de não

detectáveis até 100 mg L-1 foram relatados (Cheynier et al., 1989; Park et al., 2000). Muitos

fatores podem influenciar a concentração de GSH no mosto, por exemplo, exposição ao

 24

oxigênio, atividade da tirosinase, maceração com a casca durante o período pré-fermentativo e

pressão aplicada na sua extração (du Toit et al., 2007; Maggu et al., 2007; Comuzzo & Zironi,

2013). Segundo du Toit et al. (2007) que estudaram o efeito dos tratamentos oxidativos e

redutivos na elaboração de vinhos sobre a concentração de GSH em sucos de uvas brancas e

seus vinhos resultantes, o tratamento redutivo (<0,3 mg L-1 de O2 dissolvido, obtido durante a

prensagem) resulta em níveis maiores de GSH quando comparado ao experimento controle (1

– 1,5 mg L-1 de O2 dissolvido adicionado) e ao tratamento oxidativo (3,5 – 4 mg L-1 de

oxigênio dissolvido adicionado). Estes resultados estão de acordo com outro estudo realizado

por Maggu et al. (2007), no qual a utilização de pressões maiores na etapa de extração e um

maior tempo de maceração com as cascas (maior contato com oxigênio) levou a redução na

quantidade de GSH, além de elevar níveis de compostos fenólicos oxidáveis em relação ao

controle (Maggu et al., 2007). A utilização de práticas enológicas oxidativas, além de reduzir

a quantidade de GSH, resulta em níveis de GSSG elevados (Kritzinger et al., 2013).

Os resultados relativos à evolução da concentração de GSH durante fermentação

alcoólica são contraditórios (Kritzinger et al., 2013) e os níveis de GSSG, em geral,

permanecem baixos (< 2 mg L-1) (Kritzinger, 2012). A GSH está envolvida em muitos

mecanismos de resposta ao estresse de Saccharomyces cerevisiae, como a falta de enxofre e

de nitrogênio, o estresse oxidativo e a remoção de metais pesados e alguns compostos

químicos (Penninckx, 2002). Durante a fermentação alcoólica, a GSH pode ser absorvida ou

liberada pela levedura através de transportadores. Além disso, o metabolismo da levedura

provavelmente é influenciado pelo conteúdo de GSH extracelular (Kritzinger et al., 2013).

Lavigne et al. (2007) propuseram que a quantidade de GSH presente após a fermentação

alcoólica é dependente da cepa de levedura. No entanto, em estudo realizado por Fracassetti et

al. (2010), a influência da cepa de levedura foi considerada insignificante. Algumas leveduras

comerciais enriquecidas com glutationa foram desenvolvidas e prometem benefícios, como

 25

exercer efeito complementar de proteção contra oxidação e favorecer a formação de tióis

voláteis estáveis (Lallemand, 2011).

As razões das variações de concentração de GSH durante a fermentação continuam

inexplicadas. Entretanto, sabe-se que muitas uvas e metabólitos de levedura são tanto

assimilados como liberados pela levedura durante a fermentação dependendo das interações

não lineares entre a composição inicial do mosto, a base genética da cepa de levedura e os

muitos parâmetros ambientais que afetam o crescimento das leveduras, tais como,

temperatura, pH e a pressão osmótica (Kritzinger et al., 2013).

Os níveis de GSH em vinhos brancos varia de não detectáveis até 30 mg L-1

(Marchand & de Revel, 2010; Janes et al., 2010; Fracassetti et al., 2011; Roland & Schneider,

2015); em vinhos tintos, até aproximadamente 2 mg L-1 (Marchand & de Revel, 2010; Roland

& Schneider, 2015); e em sucos de uva até 40 mg L-1 (du Toit et al., 2007; Fracassetti et al.,

2011). Foram observados níveis tanto maiores quanto menores de GSH nos vinhos em

comparação aos seus mostos (Park et al., 2000; du Toit et al., 2007; Kritzinger, 2012; Lavigne

et al., 2007; Andújar-Ortiz et al., 2012) e, níveis maiores de GSH foram observados em

vinhos jovens, ainda em tanques, antes do engarrafamento (Fracassetti et al., 2011). Janes et

al. (2010) reportaram que a média dos níveis de GSH em 28 vinhos jovens Sauvignon Blanc

foi de 12,5 mg L-1. Em outro estudo realizado por Fracassetti et al. (2015) foi observado que

as maiores concentrações de GSH (12,4 ± 1,4 mg L-1) foram detectadas ao final da

fermentação alcoólica. Esta concentração reduziu após a trasfega e continuou reduzindo

durante o envelhecimento sob as borras. A concentração de GSH geralmente decai durante o

envelhecimento e armazenamento do vinho (Ugliano et al., 2011; Kritzinger, 2012; Lavigne

et al., 2007; Andújar-Ortiz et al., 2012; Fracassetti & Tirelli, 2015).

Durante o envelhecimento em garrafa, a exposição ao oxigênio também pode

influenciar a concentração de GSH em vinho. Vinhos Sauvignon Blanc expostos a níveis mais
 26

baixos de oxigênio durante envelhecimento em garrafa apresentaram maiores concentrações

de GSH em comparação àqueles expostos a níveis mais altos de oxigênio, o que foi atribuído

ao grau de oxidação inferior em vinhos com níveis mais baixos de oxigênio (Ugliano et al.,

2011).

Os resultados sobre o efeito de borras de leveduras nos níveis de GSH no vinho são

contraditórios (Kritzinger et al., 2013). Segundo Lavigne et al. (2007), as propriedades

redutoras das borras de levedura impediram a oxidação de GSH durante o envelhecimento em

barril de vinhos Sauvignon Blanc. Além disso, o esgotamento da GSH foi mais rápido em

vinhos que foram envelhecidos em barricas novas como resultado do maior efeito de oxidação

de madeira nova. Por outro lado, Kritzinger (2012) mostrou claramente uma significativa

redução no teor de GSH durante o envelhecimento, ainda que em condições redutoras, que

fariam limitar a oxidação de GSH. Segundo Dubourdieu & Lavigne-Cruège (2004), a GSH

não é liberada a partir das células de levedura autolisadas. Fracassetti & Tirelli (2015) não

observaram liberação de GSH pelas borras de leveduras. A perda da GSH observada durante o

envelhecimento sob as borras pode estar relacionada com a capacidade das borras ligarem-se

aos tióis, responsáveis pelos defeitos organolépticos (reduzido) (Fracassetti & Tirelli, 2015).

Devido à complexidade e variabilidade do seu comportamento, a evolução da GSH

durante vinificação pode alterar drasticamente e a concentração pode ser manipulada pelo

enólogo, limitando a oxidação ao longo do processo de vinificação e envelhecimento

(Kritzinger et al., 2013).

3.3.1. Glutationa como antioxidante em mostos e vinhos: inibição do escurecimento e

impacto nos compostos aromáticos

O mecanismo de ação da GSH como antioxidante em mostos e vinhos envolve a

formação do chamado Grape Reaction Product (GRP), ou produto da reação da uva, que se
 27

refere ao produto resultante da reação entre a glutationa e as quinonas de certos fenóis do

mosto (Figura 2), como o-difenóis, especialmente o ácido caftárico. A oxidação do ácido

caftárico por ação da enzima PPO forma a orto-quinona do ácido que, em um meio que

contenha glutationa, reage espontaneamente com esta para formar o composto ácido 2-(S)-

glutationilcaftárico (GRP). As orto-quinonas são compostos que possuem propriedades

eletrofílicas e, por isso, ligam-se facilmente com moléculas nucleofílicas, como a GSH

(Nikolantonaki et al., 2014). A formação do GRP, que é incolor, praticamente inerte e não é

substrato da PPO, supõe um processo de paralisação das reações de oxidação, o que evita a

formação de polímeros escuros e previne o escurecimento até certo ponto (Singleton et al.,

1985). Além disso, enquanto um mol de um fenol simples pode consumir 3,4 átomos de

oxigênio, o mesmo fenol combinado com a glutationa, sob a forma de GRP, pode consumir

até 8,5 moles de oxigênio (Cilliers & Singleton, 1990).

Figura 2 – Reação da glutationa com compostos de orto-quinona (o local da adição depende

do tipo de composto fenólico envolvido) (Sonni et al., 2011)

Entretanto, o GRP pode ser oxidado pela lacase ou pelas quinonas do ácido caftárico

em excesso após a glutationa se esgotar, resultando um escurecimento intenso. A adição de

ácido caftárico a soluções de PPO-GRP induz a degradação completa do GRP, devido a um

fenômeno de co-oxidação, implicando na oxidação enzimática do ácido caftárico a

correspondente o-quinona, seguida da oxidação do GRP por esta mesma quinona. A interação
 28

entre PPO e SO2 pode prevenir a produção de GRP o que manterá muito mais ácidos

caftáricos e p-cutáricos livres com alto potencial e escurecimento (Rigaud et al.,1991; Li et

al., 2008). Portanto, a razão entre ácidos hidroxicinâmicos e GSH de um mosto deve

apresentar uma boa indicação da sua susceptibilidade à oxidação, sendo que razões maiores

levam a obtenção de mostos mais escuros. Uma proporção de 0,9-2,2 caracteriza um mosto

levemente escuro e, mostos de cor média ou muito escuro são caracterizados por razões de

1,1-3,6 e 3,8-5,9, respectivamente (du Toit et al., 2006).

Wu (2014) testou o efeito da GSH na inibição do escurecimento enzimático e não-

enzimático em sucos de uva. Foi avaliada a ação de GSH em diferentes concentrações (de 100

a 600 mg L-1) na inibição da atividade enzimática de PPOs extraídas de sucos de uva. A partir

da concentração de 400 mg L-1, a GSH inibiu 99,4% da atividade das PPOs, por isso esta

concentração foi utilizada para ser adicionada em sucos de uva logo após sua obtenção e em

sucos enlatados, posteriormente esterilizados e armazenados à 80ºC. Os ensaios foram

avaliados quanto ao escurecimento em diferentes tempos e comparados a ensaios controle,

obtidos da mesma forma, porém sem adição de GSH. O escurecimento observado nos sucos

com adição de GSH foi significativamente menor que observados nos ensaios controle até o

período analisado (6h para o suco recém-obtido e 36h esterilizado).

Hosry et al. (2009) avaliaram a susceptibilidade ao escurecimento e o grau de

oxidação de vinhos brancos mantidos sob condições de oxidação, nos quais foi adicionada

GSH em diferentes concentrações. Concluíram que a estabilidade destes vinhos pode ser

realçada pela adição de GSH e sugerem a sua adição no momento do engarrafamento a fim de

prevenir o envelhecimento atípico do vinho. Segundo Dubourdieu & Lavigne-Cruege (2004),

uma concentração de 10 mg L-1 de GSH adicionada no engarrafamento de vinhos Sauvignon

Blanc reduziu significativamente a tonalidade amarela do vinho durante um período de três

anos de envelhecimento, em comparação ao vinho controle.

 29

O estudo realizado por Sonni et al. (2011a), em um vinho branco modelo, relaciona o

efeito antioxidante da glutationa e do ácido ascórbico evidenciado através da prevenção ao

escurecimento e da estabilidade de compostos fenólicos como (+)-catequina, ácido caféico e

outros compostos envolvidos na reação de escurecimento oxidativo. Entretanto, este estudo

mostra que, em altas concentrações de glutationa (860 mg L-1), a prevenção do escurecimento

ocorre inicialmente e, eventualmente, após, pode levar a formação de pigmentos escuros. Isto

porque, no período inicial, durante o qual a glutationa ofereceu um efeito protetor, a produção

dos precursores do pigmento xantilium e de orto-quinona derivada de compostos fenólicos foi

limitada. Após, quando a glutationa induziu a coloração, pigmentos poliméricos diferentes

daqueles encontrados no vinho modelo sem adição de glutationa foram formados. Na

presença de ácido ascórbico, altas concentrações de glutationa foram capazes de retardar a

redução do ácido ascórbico e inibir a reação dos produtos da degradação do ácido ascórbico

com o flavanol do vinho, (+)-catequina. Entretanto, com o esgotamento da glutationa,

novamente ocorre um aumento da produção de uma grande variedade de pigmentos

poliméricos diferentes.

Sonni et al. (2011b) mostraram que a inibição inicial que ocorreu no estudo citado

anteriormente foi devido à capacidade de GSH para formar produtos de adição com

compostos de carbonila, tais como o ácido glioxílico. Além disso, estes autores provaram que

o efeito inibidor da GSH sobre a formação de dímeros derivados de ácido glioxílico foi

independente de temperatura (20 vs 45°C) ou a presença de cobre e ferro. Os autores

relataram também a formação de outro produto no qual GSH reage com um composto

intermediário para a produção de dímeros, interrompendo as reações de polimerização. Esta

inibição das reações de polimerização de carbonil-derivados impede a formação de pigmentos

indesejados, tais como o amarelo cátion xantílio, o qual pode induzir mudanças de cores que

são negativamente relacionados à qualidade do vinho.

 30

Para entender melhor as reações que a glutationa e outros conservantes do vinho

participam e quais produtos podem ser resultantes destas reações, Nikolantonaki et al., (2014)

investigaram o poder nucleofílico relativo dos principis conservantes (dióxido de enxofre,

ácido ascórbico e glutationa), como também de um conservante natural (floroglucinol) em

relação ao composto tiol varietal (3-sulfanilhexanol) em uma quinona modelo (4-metil-1,2-

benzoquinona). Os três conservantes reagiram rapidamente com a quinona modelo, entretanto,

comparando os redimentos dos produtos de reação, o ácido ascórbico foi o que reagiu mais

rápido, seguido pelo dióxido de enxofre e pela glutationa, nesta ordem. O local do ataque

nucleofílico na orto-quinona modelo ocorreu nas três posições possíveis para os três

antioxidantes nucleofílicos estudados. Assim, as três posições possíveis têm eletrofilicidade

semelhantes e a reatividade em cada posição é afetada pelo caráter nucleofílico. Ainda neste

estudo, foi avaliada a existência de interações sinérgicas entre estes conservantes. A análise

quantitativa dos produtos da reação mostrou que o dióxido de enxofre teve uma reatividade

similar sozinho ou em misturas com ácido ascórbico e/ou glutationa. Este resultado

demonstrou a falta de efeito sinérgico entre estes três conservantes em condições ácidas como

a do vinho. As reações foram conduzidas em concentrações equimolares, mas no vinho as

proporções dos compostos variam. Porém, as taxas rápidas de reação dos conservantes do

vinho com as quinonas sugerem que essas substâncias poderiam proteger o vinho mesmo

quando presentes em concentrações muito baixas.

Panero et al. (2015) estudaram o efeito da adição de glutationa e elagitaninos em

relação à oxidação de vinhos brancos engarrafados com duas concentrações de SO2 (20 mg L-
1
e 60 mg L-1), durante 6 meses de armazenamento. A adição de GSH, assim como obervado

por, Nikolantonaki et al. (2014), não proporcionou nenhum efeito em relação ao SO2.

Entretanto, contrariando outros estudos (Hosry et al., 2009; Dubourdieu & Lavigne-Cruege,

2004, Sonni et al., 2011a) nenhum efeito protetor contra o escurecimento foi observado.
 31

Panero et al. (2015) também estudaram o efeito da adição GSH em níveis mais elevados de

SO2 e em dois níveis de oxigênio dissolvido. A adição de GSH provocou um aumento

significativo na taxa de oxigênio consumida durante o primeiro mês de envelhecimento em

garrafa, o que está de acordo com os resultados obtidos por Ugliano et al. (2011), no qual

vinhos Sauvignon Blanc expostos a níveis mais baixos de oxigênio durante envelhecimento

em garrafa apresentaram maiores concentrações de GSH em comparação àqueles expostos a

níveis mais altos de oxigênio. Entretanto, no estudo realizado por Panero et al. (2015), após

um ano, não foram observados efeitos sobre o processo de oxidação. Segundo Panero et al.

(2015), a GSH, ao contrário de outros aditivos antioxidantes, não aumentou a combinação do

SO2, porém a perda rápida e quase completa de GSH foi observada durante os primeiros

meses de envelhecimento em garrafa.

Quanto a ação da GSH na preservação dos compostos aromáticos, estima-se que

concentrações entre 10 e 20 mg L-1 de GSH adicionadas no momento do engarrafamento são

ótimas para controlar a degradação oxidativa de certos aromas voláteis (Roussis et al., 2007).

No caso das variedades aromáticas, a glutationa parece limitar a redução de ésteres voláteis

(acetato de isoamila, hexanoato de etila) e terpenos (linalol) durante o armazenamento

(Roussis et al., 2007; Papadopoulou & Roussis, 2008) e no caso específico de vinhos

Sauvignon Blanc no armazenamento em garrafa, proteger os tióis voláteis, 4-metil-4-

mercaptopentanona e 3-mercaptohexanol (Dubourdieu & Lavigne-Cruege, 2004). A GSH

pode levar a redução das associações orto-quinonas e outros tióis, pois compete pelas o-

quinonas, dessa forma leva a um aumento de aromas relacionados aos compostos tióis e seus

derivados no vinho (Fracassetti et al., 2011). Alguns metabólitos derivados diretamente da

glutationa poderiam estar envolvidos na revelação de aromas de mercaptanos, como

mercaptohexanol e mercaptopentanona, em vinhos Sauvignon Blanc (Roland et al., 2011).

Ugliano et al. (2011) demonstraram que os vinhos com adição de GSH (20 mg L-1)
 32

antes do engarrafamento acumularam níveis mais elevados de H2S durante o envelhecimento

em garrafas de vinho Sauvignon Blanc comparados com os vinhos em que não foi adicionado

GSH. Esse efeito foi ampliado em condições de baixo oxigênio e em elevadas concentrações

de cobre (II). Os autores atribuíram o acumulo de H2S a capacidade antioxidante da GSH, que

causa condição redutora no vinho que promove a produção de H2S, mas afirmam ser preciso

realizar mais estudos para elucidar o papel da GSH na produção de H2S.

Sabendo que a GSH é um composto interessante para evitar os efeitos do

envelhecimento atípico, Sarakbi & Kauffmann (2014) estabeleceram um critério para

caracterização de vinhos brancos e o chamaram de capacidade equivalente da glutationa

(GEC, glutathione equivalent capacity). A GEC é um critério quantitativo que pode ser

utilizado, juntamente com outros critérios, para avaliar a estabilidade do vinho branco,

especialmente em relação ao aroma do vinho. É calculada através da soma das áreas dos picos

dos aminotióis em relação à área do pico de uma solução padrão de glutationa (1μM) obtidos

através de cromatografia líquida com detecção amperométrica em um eletrodo de prata. A

GEC foi inversamente relacionada ao escurecimento dos vinhos brancos da variedade

Riesling e, além disso, foi obsvervada uma redução gradual de 55% da GEC durante um

período de 29 dias de envelhecimento. A GEC foi cerca de cinco vezes maior nos mostos do

que nos vinhos, entretanto observou-se uma perda de 66% da GEC em 30 min de exposição

ao ar em temperatura ambiente.

A GSH pode exercer um efeito protetor sobre a cor nas diversas etapas da eleboração

dos vinhos e sobre os aromas do vinho durante o envelhecimento. No entanto, a maior parte

dos estudos foram realizados em meios sintéticos e/ou sob condições extremas de oxidação,

portanto, outros estudos nas condições reais do vinho são necessários para obtermos

resultados conclusivos. A instabilidade da glutationa, tanto em contato com oxigênio como

com compostos fenólicos oxidados, explica porque poucos estudos são realizados para
 33

analisar glutationa em mostos e vinhos (Dubourdieu & Lavigne-Cruege, 2004).

3.4. Encapsulação da glutationa

Com os avanços da engenharia de materiais e da nanotecnologia, o estudo sobre

encapsulação de substâncias ativas em micro/nanopartículas poliméricas tem despertado

grande interesse científico e tecnológico, devido sua propriedade de transporte e liberação

dessas substâncias com aplicações eficazes nos campos da medicina e farmácia (Huertas et

al., 2010; Rao et al., 2011). Encapsulação é um processo de empacotamento de materiais

sólidos, líquidos ou gasosos em cápsulas, as quais podem liberar o conteúdo de forma

controlada e sob condições específicas. A utização do processo de encapsulação tem

solucionado limitações no emprego de ingredientes alimentícios, visto que pode suprimir ou

atenuar características organolépticas indesejáveis, reduzir a volatilidade e a reatividade, e

aumentar a estabilidade destes em condições ambientais adversas (Favaro-Trindade et al.,

2008).

A GSH livre presente no vinho pode sofrer hidrólise tanto química como enzimática

ou ainda, o grupo tiol da GSH pode ser oxidado a GSSG, assim as propriedades antioxidantes

da GSH seriam perdidas. A encapsulação de GSH em um sistema polimérico parece ser uma

alternativa promissora para proteger a molécula de GSH contra agentes químicos e/ou

enzimáticos (Lopedota et al., 2009; Trapani et al., 2010; Kafedjiiski et al., 2005) durante o

envelhecimento ou armazenamento de vinhos e espumantes. Além disso, a GSH encapsulada

poderia evitar a formação do H2S, que, segundo Ugliano et al. (2011) é formado com a

presença de GSH, provavelmente, devido a condição redutora que a GSH livre ocasiona no

meio.

Micro e nanopartículas são definidas como partículas sólidas que formam um sistema
 34

de transporte e liberação controlada de substâncias ativas, incluindo micro/ nanoesferas e

micro/nanocápsulas, as quais diferem entre si por suas composições e suas organizações

estruturais (Schaffazick et al., 2003; Huertas et al., 2010). Nas micro/nanocápsulas a

substância ativa pode estar presente no núcleo ou adsorvida na superfície da cápsula,

enquanto que as micro/nanoesferas possuem uma estrutura do tipo matriz onde a substância

ativa pode ser adsorvida na superfície da esfera ou retida na matriz polimérica (Huertas et al.,

2010; Rao et al., 2011). No caso das micro/nanocápsulas a cavidade pode conter a substância

ativa sob a forma líquida ou sólida como uma dispersão/emulsão molecular. Esta cavidade

serve como reservatório e tem caráter lipofílico ou hidrofílico, de acordo com o caráter de

solubilidade da substância ativa e com o método de preparação (Huertas et al., 2010). As

nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de substâncias ativas que apresentam

diâmetro inferior a 1000 nm (1 µm), enquanto as micropartículas apresentam diâmetro de 1 a

1000 µm (Kreuter, 1996; Schaffazick et al., 2003).

Os mecanismos de liberação dos materiais ativos microencapsulados variam de acordo

com a natureza do agente encapsulante, sendo que normalmente ocorrem devido a

mecanismos como: variação de temperatura e de pH, solubilidade do meio, biodegradação,

difusão, ruptura mecânica, permeabilidade seletiva e gradiente de concentração existente em

relação ao meio de liberação. A difusão do agente ativo na matriz polimérica é definida como

um processo de transferência de massa de moléculas individuais de uma substância por

intermédio de um movimento molecular aleatório e associado a um gradiente de concentração

(Favaro-Trindade et al., 2008).

A escolha do método de encapsulação depende das características da substância ativa,

do material encapsulante, do mecanismo de liberação e do tamanho das estruturas que se

deseja obter (Bansode et al., 2010). Em termos gerais, os métodos de encapsulação são

dividos em três tipos: químicos (ex: polimerização interfacial e in sito), físico-químicos (ex:
 35

coacervação e separação de fases, expansão de fluidos supercríticos) e físico-mecânicos (ex:

secagem ou congelamento por pulverização, tecnologia de leito fluidizado, evaporação do

solvente). A microencapsulação pelo método de secagem por pulverização (spray drying) é

um processo comercial de baixo custo que é principalmente utilizado para a encapsulação de

perfumes, óleos e sabores. Neste método as partículas do material ativo são dispersas numa

solução de polímero e pulverizadas dentro de uma câmara quente. O material de parede

solidifica sobre as partículas do material ativo enquanto o solvente evapora de tal forma que

as microcápsulas são obtidas em forma polinuclear ou de matriz (Jyothi et al., 2010).

Diferentes tipos de materiais podem ser encapsulados, como: proteínas, peptídeos,

óleos voláteis, ingredientes alimentícios, pigmentos, corantes, catalisadores, pesticidas, entres

outros (Jyothi et al., 2010). Diferentes tipos de revestimentos ou materiais de parede podem

ser utilizados, entretanto, para uso em alimentos estes materiais devem ser cuidadosamente

escolhidos para evitar riscos à saúde dos consumidores. O material de parede adequado para

aplicação na indústria vinícola deve ter pré-requisitos adicionais, tais como, grau de pureza

alimentício, ter baixo custo e ser abundante.

A quitosana é um polímero amplamente utilizado para liberação oral de muitas

proteínas e fármacos, pois não é toxica, é biodegradável, biocompatível e tem boas

propriedades mecânicas (Koo et al., 2011). A quitosana é obtida pela reação de desacetilação

da quitina em meio alcalino. A quitina é um polímero natural, extraído de exoesqueleto de

crustáceos e insetos, composto pelas unidades monoméricas de β-(1→4)- 2-amino-2-desoxi-

D-glicose e β-(1→4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glicose. Este polímero natural possui uma

estrutura cristalina altamente organizada, tem baixa reatividade química e é insolúvel em meio

aquoso e na maioria dos solventes orgânicos, porém pode se dissolver facilmente em soluções

de ácidos fracos diluídos, como o ácido acético (Laranjeira & Fávare, 2009). Micropartículas

de quitosana podem ser facilmente obtidas por gelificação iônica entre grupos catiônicos da
 36

quitosana e ânions multivalentes (Koo et al., 2011). Kafedjiiski et al. (2005) sintetizaram e

caracterizaram o conjugado quitosana-glutationa e concluíram que ele pode ser capaz de

carregar macromoléculas hidrofílicas, além de melhorar as propriedades mucoadesivas e a

permeabilidade de substâncias ativas in vitro.

Estudos anteriores reportaram a inclusão de ciclodextrinas (CDs) em sistemas de

nanopartículas de quitosana (Trapani et al., 2010; Jingou et al., 2011). A inclusão de CDs em

estruturas de micro ou nano partículas foi realizada visando melhorar a capacidade dessas

partículas de carrearem compostos hidrofóbicos (Del Valle, 2004), no entanto, os estudos

mostraram que micropartículas de CD podem também carrear moléculas hidrofílicas com alta

eficiência (Lopedota et al., 2009; Jingou et al., 2011). As CDs são obtidas a partir do amido, e

são adequadas para microencapsulação por inclusão molecular. São formadas por um número

variável de glucose unidas entre si por ligações α-1,4. As mais comuns são α-CD, β-CD e γ-

CD, com 6, 7 e 8 unidades de glucose, respectivamente. Têm a forma de um cone truncado,

com uma cavidade hidrofóbica no centro e uma camada externa hidrofílica, portanto, solúveis

em água (Del Valle, 2004). As CDs são capazes de interagir com a parte hidrofóbica das

cadeias laterais de compostos peptídeos ou proteínas e assim, impedir em certa medida sua

degradação (Irie & Uekama, 1999). Lopedota et al. (2009) sugerem uma fraca interação entre

GSH e CDs, sendo que a espinha dorsal do peptídeo pode ser parcialmente incluída na

cavidade da CD, enquanto grupos de ácido carboxílico e amina polares e o grupo tiol

permanecem fora da cavidade. Essa interação, mesmo sendo fraca, é capaz de evitar a

degradação da GSH por endopeptidases (Garcia-Fuentes et al., 2006).

As técnicas de encapsulação utilizadas na elaboração de vinhos e espumantes são

aplicadas principalmente como método para imobilização de células de levedura (Silva et al.,

2002; Martynenko &. Gracheva, 2003; Servetas et al., 2013), de bactérias ácido-lácticas

(Kosseva et al., 1998; Maicas, 2001; Kosseva & Kennedy, 2004 ) e de enzimas (Spagna et al.,
 37

2002). Entre as técnicas de imobilização celular disponíveis, a oclusão em géis de

polissacarídeos, tais como ágar-ágar, alginato, quitosana e carragenana, é a mais importante e

amplamente utilizada (Kourkoutas et al., 2004; Torresi et al., 2011). No entanto, a utilização

de alginatos e de hidrogéis de polissacarídeos, em geral, não é uma boa escolha industrial por

causa do alto custo e baixa estabilidade química e mecânica. Apenas a aplicação de géis de

alginato na fermentação secundária na garrafa de espumantes elaborados pelo método

tradicional tem sido comercialmente utilizada em processos de vinificações, com a finalidade

de facilitar e tornar mais rápido o processo de remuage e facilitar a remoção das células no

degorgement (Kourkoutas et al., 2004).

 38

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados serão apresentados em forma de capítulos.

CAPÍTULO 1

Efeito da glutationa na prevenção da oxidação de vinhos brancos

Artigo publicado na Revista Brasileira de Viticultura e Enologia

CAPÍTULO 2

Efeito da adição de glutationa em vinhos espumantes

Artigo publicado na revista Food Chemistry

CAPÍTULO 3

Efeito da glutationa durante o armazenamento de vinhos espumantes

Artigo aprovado na revista Food Chemistry

CAPÍTULO 4

Preparação e caracterização de micropartículas de β-ciclodextrina/glutationa e

quitosana/glutationa obtidas por spray-dryer

Artigo será submetido para Química Nova

 39

4.1. CAPÍTULO 1 – Efeito da glutationa na prevenção da oxidação de vinhos

brancos
40
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4.2. CAPÍTULO 2 - Efeito da adição de glutationa em vinhos espumantes

Artigo publicado na Food Chemistry

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4.3. CAPÍTULO 3 – Efeito da glutationa durante o armazenamento de vinhos

espumantes

Artigo publicado na revista Food Chemistry

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 65

4.4. CAPÍTULO 4 – Preparação e caracterização de micropartículas de β-

ciclodextrina/glutationa e quitosana/glutationa obtidas por spray-dryer

Artigo será submetido para Química Nova

 66

PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROPARTÍCULAS DE β-

CICLODEXTRINA/GLUTATIONA E QUITOSANA/GLUTATIONA OBTIDAS POR
SPRAY-DRYING

Vanessa Webbera*, Daniel de Siqueira Ferreiraa, Pedro Luis Manique Barretob, Sabrina
Matos de Carvalhob, Valéria Weiss Angelia, Regina Vanderlindea, c

a
Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul, 95070-560 Caxias do Sul – RS,
Brasil
b
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Santa
Catarina, 88034-001 Florianópolis – SC, Brasil
c
Laboratório de Referência Enológica, Instituto Brasileiro do Vinho, 95084-470 Caxias do
Sul – RS, Brasil
* e-mail: [email protected]

PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF MICROPARTICLES OF β-

CYCLODEXTRIN/GLUTATHIONE AND CHITOSAN/GLUTATHIONE OBTAINED BY
SPRAY-DRYING

The aim of this work was to prepare and characterize spray-dried microparticles using β-
cyclodextrin (β-CD) or chitosan as polymers for encapsulation of glutathione (GSH) for its
addition to wine to prevent oxidation. SEM showed spherical microparticles, with wrinkled
surfaces for β-CD/GSH and smooth surfaces for chitosan/GSH microparticles. A wide
distribution of particle size was observed and, β-CD/GSH showed an average diameter
smaller than the chitosan/GSH microparticles. FT-IR showed a possible interaction between
GSH and both polymers. DSC and DRX showed that encapsulation process produced a
marked decrease in GSH crystallinity. The encapsulation efficiency was 25.0 % for
chitosan/GSH and 62.4 % for β-CD/GSH microparticles. The GSH release profiles from
microparticles showed that β-CD can control the release behaviors of GSH better than
chitosan in a model wine. Cumulative release data were fitted to an empirical equation to
compute diffusional exponent (n), which indicated the non-Fickian trend for GSH release.

Keywords: microparticles, chitosan, cyclodextrin, glutathione.

 67

INTRODUÇÃO

A glutationa (γ-glutamil-cysteinil-glicina; GSH) é o tiol de baixo peso molecular mais

abundante nas células animais. É um tripeptídeo linear sintetizado a partir de aminoácidos,
através da ação sequencial da γ-glutamilcisteína e da glutationa sintetase.1 O par redox GSH/
glutationa dissulfeto (GSSG) é o principal determinante da capacidade antioxidante das
células.2 A GSH é capaz de reagir com um radical livre para formar a glutationa dissulfeto
(GSSG ou glutationa oxidada), que é desprovida de atividade antioxidante, mas que pode ser
reduzida pela glutationa redutase que utiliza NADPH como substrato, regenerando a GSH.1,3
Porém, a GSH pode ser perdida de modo irreversível em meios muito susceptíveis à oxidação
e, na falta da enzima e/ou substrato, a GSH permanece na forma oxidada, não sendo
novamente reduzida.4
A glutationa é um componente natural de muitas frutas que tem o papel importante de inibir a
oxidação de sucos de frutas, vinhos e outros alimentos.5 No vinhos brancos, a GSH
desempenha um papel importante na proteção contra o escurecimento e contra a perda de
aromas devido ao processo oxidativo.6-8 A GSH inibe formação de polímeros escuros, pois
evita a polimerização que ocorre a partir dos compostos o-quinonas presentes nos vinhos
devido à oxidação dos compostos fenólicos. A GSH com o seu grupo tiol servindo como um
centro nucleofílico rico em elétrons substitui o anel eletrofílico da quinona do ácido caftárico.
Essa substituição regenera a forma hidroquinona da metade do ácido cafeico. O produto
formado Grape Reaction Product (GRP, ex: ácido 2-S-glutationilcaftárico), que não é escuro e
não é facilmente oxidável.9-11 Devido à sua propriedade antioxidante, a adição de glutationa
como um ingrediente funcional em alimentos é sugerida.2 Entretanto, a aplicação de GSH em
alimentos é limitada por apresentar baixa biodisponibilidade devido à pouca absorção
celular12 e à sua instabilidade13. Quando adicionada em vinhos a GSH livre se perde
rapidamente.14,15 Em vista disso, a encapsulação de GSH em um sistema polimérico capaz de
proteger o peptídeo contra oxidação química e/ou enzimática parece ser uma alternativa
promissora.16-18
Sistemas de encapsulação vêm sendo utilizados para proteger ingredientes sensíveis contra as
condições ambientais (como luz, oxigênio, água e temperatura) que o alimento é submetido
durante seu processamento e seu armazenamento.19 Estes sistemas permitem que uma barreira
polimérica proteja a substância bioativa contra condições de oxidação, agindo como um
mecanismo de liberação controlada, resultando em uma melhor estabilidade da substância.13,19
 68

Além disso, a encapsulação tem sido aplicada para melhorar a funcionalidade e a

biodisponibilidade de substâncias bioativas.20-22
A quitosana é um polímero amplamente utilizado para liberação oral de muitas proteínas e
fármacos, pois não é toxica, é biodegradável, biocompatível e tem boas propriedades
mecânicas.13 A quitosana é obtida pela reação de desacetilação da quitina em meio alcalino. A
quitina é um polímero natural, extraído de exoesqueleto de crustáceos e insetos, composto
pelas unidades monoméricas de β-(1→4)- 2-amino-2-desoxi-D-glicose e β-(1→4)-2-
acetamida-2-desoxi-D-glicose. Este polímero natural possui uma estrutura cristalina altamente
organizada, tem baixa reatividade química e é insolúvel em meio aquoso e na maioria dos
solventes orgânicos, porém pode se dissolver facilmente em soluções de ácidos fracos
diluídos, como o ácido acético.23 Micropartículas de quitosana podem ser facilmente obtidas
por gelificação iônica entre grupos catiônicos da quitosana e ânions multivalentes.13
Kafedjiiski et al.18 sintetizaram e caracterizaram o conjugado quitosana-glutationa e
concluíram que ele pode ser capaz de carregar macromoléculas hidrofílicas, além de melhorar
as propriedades mucoadesivas e a permeabilidade de fármacos in vitro.
Estudos anteriores reportaram a inclusão de ciclodextrinas (CDs) em sistemas de
nanopartículas de quitosana.17, 24
A inclusão de CDs em estruturas de micro ou nano
partículas foi realizada visando melhorar a capacidade dessas partículas de carrearem
compostos pouco solúveis,25 no entanto, os estudos mostraram que micropartículas de CD
podem também carrear moléculas hidrofílicas com alta eficiência.16, 24 As CDs são obtidas a
partir do amido, e são adequadas para microencapsulação por inclusão molecular. São
formadas por um número variável de glucose unidas entre si por ligações α-1,4. As mais
comuns são α-CD, β-CD e γ-CD, com 6, 7 e 8 unidades de glucose, respectivamente. Têm a
forma de um cone truncado, com uma cavidade hidrofóbica no centro e uma camada externa
hidrofílica, portanto, solúveis em água.25 As CDs são capazes de interagir com a parte
hidrofóbica das cadeias laterais de compostos peptídeos ou proteínas e assim, impedir em
certa medida sua degradação.18 Lopedota et al.16 sugerem uma fraca interação entre GSH e
CDs, sendo que a espinha dorsal do peptídeo pode ser parcialmente incluída na cavidade da
CD, enquanto grupos de ácido carboxílico e amina polares e o grupo tiol permanecem fora da
cavidade. Essa interação, mesmo sendo fraca, é capaz de evitar a degradação da GSH por
endopeptidases.27
Portanto, este trabalho tem como objetivo preparar e caracterizar micropartículas de quitosana
e de β-CD contendo GSH através do método de aspersão por spray dryer.
 69

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais

Os componentes das micropartículas como: glutationa reduzida (≥ 98.0 %, G4251), quitosana

(baixo peso molecular, 448869) e β-ciclodextrina (≥ 97.0 %, C4767) foram comprados da
Sigma-Aldrich do Brasil. O ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzóico) utilizado na quantificação da
GSH também foi obtido da Sigma-Aldrich (≥98 %, BioReagent, adequado para determinação
de grupos sulfifril, D8130). Os demais reagentes utilizados foram adquiridos da Merck Brasil.

Preparação das micropartículas de β-ciclodextrina

Foram adicionados 13,02 mM de GSH (4 g) e de β-ciclodextrina (14,78 g) em 500 mL de

água destilada. Após a completa dissolução dos componentes sob agitação, a mistura foi seca
em spray dryer (Büchi) em temperatura de entrada de 200 ºC (controlada), temperatura de
saída de 72 ºC, aspiração de 100 % (35 m3 h-1 de volume de fluxo) e fluxo da bomba de 20 %
(fluxo de alimentação de 10mL min-1). O rendimento em micropartículas resultantes do
processo de secagem foi calculado através da seguinte equação: rendimento = [(peso das
micropartículas secas)/ (peso total de sólidos na solução antes da secagem)] * 100.

Preparação das micropartículas de quitosana

As micropartículas de quitosana foram preparadas conforme metodologia de Koo et al. 13 com

algumas modificações. Foram adicionados 5 gramas de quitosana em 250 mL de solução de
ácido acético 2 % (pH= 4,5) e a solução foi mantida sob agitação por 12 h até a completa
dissolução da quitosana. Esta solução foi diluída com adição de 250 mL de água destilada.
Em 250 mL desta solução contendo 2,5 g de quitosana foram adicionados 200 mL de solução
aquosa contendo 12,5 g de GSH. A mistura final obtida foi seca em spray dryer (Büchi) em
temperatura de entrada de 130 ºC (controlada), temperatura de saída de 47 ºC, aspiração de
100 % (35 m3 h-1 de volume de fluxo) e fluxo da bomba de 20 % (fluxo de alimentação de 10
mL min-1). O rendimento em micropartículas resultantes do processo de secagem foi
calculado através da seguinte equação: rendimento = [(peso das micropartículas secas)/ (peso
total de sólidos na solução antes da secagem)] * 100.
 70

Caracterização físico-química das micropartículas

Análise morfológica

A avaliação morfológica das micropartículas foi realizada através de microscopia eletrônica

de varredura. As micropartículas foram anexadas em uma fita adesiva de carbono condutiva
para microscopia sobre um porta-amostras. Após, foi realizada uma deposição de ouro à
plasma em atmosfera de argônio por cerca de 2 minutos. A morfologia da superfície das
partículas foi avaliada em um microscópio eletrônico de varredura modelo SSX-550
Shimadzu operando em alto vácuo. Todas as micrografias foram obtidas nos aumentos em
ampliação original de 1000 e 3000 vezes.

Espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier - FTIR

Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em um espectrômetro modelo Nicolet

IS 10 da Thermo Scientific. Esta análise foi realizada para as amostras de GSH, β-CD,
quitosana micropartículas de β-CD/GSH e quitosana/GSH, e da mistura dos componentes das
micropartículas nas mesmas proporções utilizadas nas suas preparações. Para esta análise as
amostras foram preparadas em forma de pastilhas contendo KBr (grau espectroscópico IR).
As amostras foram analisadas de 450 a 4000 cm-1 com resolução de 1 cm-1.

Calorimetria exploratória diferencial – DSC

As curvas de DSC foram obtidas com um DSC-60 – modelo DAC-60 da Shimadzu. Alíquotas
de 5 mg de cada amostra foram colocadas em panelas de alumínio. As medidas por DSC
foram realizadas por aquecimento das amostras até 250 ºC a uma taxa de 5 ºC min-1. Esta
análise foi realizada para as amostras de GSH, β-CD, quitosana, micropartículas de β-
CD/GSH e quitosana/GSH, e da mistura dos componentes das micropartículas nas mesmas
proporções utilizadas nas suas preparações.

Análise Termogravimétrica – TGA

As curvas termogravimétricas das amostras dos padrões GSH, β-CD, quitosana, destes
mesmos padrões dissolvidos e submetidos a secagem por srpay dryer, e micropartículas de β-
 71

CD/GSH e quitosana/GSH foram obtidas utilizando um equipamento Shimadzu TGA-50, na

faixa de temperatura de 23 °C a 800 °C, com uma taxa de aquecimento de 10 °C min -1 em
atmosfera de N2 com fluxo de 50 mL min-1. A massa utilizada foi de aproximadamente 10 mg
de amostra em pó.

Difratometria de Raios X – DRX

As análises por difratometria de raios-X foram realizadas utilizando um Difratômetro de

Raios-X (Shimadzu, XRD6000X). As amostras foram escaneadas de 5º a 40º.

Recuperação da GSH microencapsulada

Uma concentração teórica de 50 mg L-1 de GSH em forma de micropartículas de β-CD/GSH e

de quitosana/GSH foi dissolvida em vinho modelo. Para preparação do vinho modelo, 5g L-1
de ácido tartárico foram adicionados em solução hidroalcoólica 12 %. O pH foi ajustado a 3,5
com NaOH 1N. A concentração de ácido tartárico foi escolhida para que simulasse a ação de
todos os ácidos do vinho e produzisse uma acidez titulável final ~ 4 g L-1.28,29 Para garantir a
total dissolução do polímero e do fármaco, as soluções de micropartículas a 50 mg L-1 de
GSH permaneceram no ultrassom por 15 min à temperatura ambiente. Após foi medida a
concentração de GSH em espectrofotômetro, conforme metodologia descrita abaixo. A
porcentagem de GSH recuperada das micropartículas foi calculada através da seguinte
equação:

Recuperação de GSH % = [(GSH Medida)/ (GSH Total Teórica)] *100

A GSH total teórica é a quantidade de GSH na microcápsula supondo que toda a GSH
adicionada no seu preparo esteja presente na alíquota de micropartícula utilizada e a GSH
medida é a quantidade de GSH recuperada lida em espectrofotômetro, após a diluição total do
polímero e do fármaco.

Eficiência de Encapsulação

A eficiência de encapsulação (EE%) será obtida através da relação entre a concentração de

GSH na superfície das micropartículas e o conteúdo total de GSH nas partículas após a
 72

secagem em spray dryer, dividida pela GSH total teórico (GSH adicionada na preparação das
micropartículas) e é expressa em porcentagem de GSH encapsulada, calculada utilizando a
Equação 1 exposta a seguir.13,30

𝐺𝑆𝐻 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙−𝐺𝑆𝐻 𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

𝐸𝐸 = × 100 (Equação 1)
𝐺𝑆𝐻 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜

A concentração de GSH na superfície das micropartículas foi realizada conforme metodologia

adaptada de Quispe-Condori, Saldaña e Temelli30, considerando que a solubilidade da GSH
em água é alta e muito maior que a dos polímeros. Foi pesada 4,662 mg de micropartículas de
β-CD/GSH e 1,204 mg das micropartículas quitosana/GSH, para resultar em uma
concentração teórica total de 100 mg L-1 de GSH quando dissolvidas em 10 mL. As
micropartículas foram acondicionadas em um filtro de papel e percoladas com 2 mL de água
destilada até o total escoamento desta para um béquer. O procedimento de percolação foi
realizado cinco vezes. A quantificação da GSH superficial foi realizada através da
quantificação de GSH contida na água destilada que percolou o filtro contida no béquer (n=3).

Cinética de Liberação da GSH

Foi pesada 46,62 mg de micropartículas de B-CD/GSH e 12,04 mg das micropartículas

quitosana/GSH, para resultar em uma concentração teórica total de 100 mg L-1 de GSH
quando dissolvidas em 100 mL. As micropartículas foram dispersas em 100 mL de vinho
modelo e a concentração de GSH liberada foi analisada por espectrofotometria em 0,17; 0,50;
0,83; 1,00; 1,17; 2,83; 3,50; 4,00; 5,33; 6,00; 25,00 e 48,00 horas (n=3).

Quantificação de GSH

A quantificação da GSH foi realizada por espectrofotometria, segundo metodologia adaptada

de Rahman et al.31 Este método envolve oxidação de GSH através do reagente sulfidril 5,5-
diotio-bis(ácido 2-nitrobenzóico) (DNTB) para formar o derivado amarelo ácido 5-tio-2-
nitrobenzóico (TNB), medido a absorbância de 412 nm. Para esta análise, em cubetas de
quartzo de 10 mm de caminho ótico, foram pipetados 0,4 mL da amostra, 1,6 mL de solução
tampão fosfato (pH 7,5) e 2,0 mL de solução de DNTB. Após 1 min da reação, a amostra foi
analisada à 412 nm em espectrofotômetro PerkinElmer, modelo Lambda 40. A solução
 73

tampão fosfato foi preparada com Na2HPO4. 12H2O (10 mM) em água ultrapura; com pH
ajustado a 7,5 usando solução de ácido ortofosfórico. A solução de DNTB é composta de 2
mg de DNTB em 3 mL de tampão fosfato. As concentrações de GSH presente nas amostras
foram calculadas através de curva analítica em solução hidroalcoólica com pH 3,8 feita no
mesmo dia em que as amostras foram analisadas e nas seguintes concentrações de GSH 10,
20, 30, 40, 50, 75, 100 mg L-1.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização físico-química das micropartículas

Análise morfológica

A análise morfológica das micropartículas quitosana/GSH e β-CD/GSH mostrou a presença

de partículas esféricas e com ampla distribuição de tamanho para ambas as formulações
(Figura 1). Comparando as Figuras 1a e 1c foi possível observar que, em média, as
micropartículas de β-CD apresentaram diâmetros menores do que as de quitosana. As
micropartículas de β-CD apresentaram-se como uma esfera com depressões superficiais
aparentes enquanto as micropartículas de quitosana mostraram superfícies lisas e sem
depressões. As micropartículas β-CD/GSH apresentaram uma superfície externa arredondada,
sem trincas aparentes ou porosidade (Figura 1c), aspectos indicativos de boa proteção do
material do núcleo. Essa morfologia também foi observada em micropartículas obtidas com
goma arábica, secas por pulverização.32
As depressões superficiais das micropartículas de β-CD e as rugosidades observadas nas
micropartículas de quitosana são características do processo rápido de secagem por
pulverização em spray dryer. Estes resultados estão de acordo com as morfologias
apresentadas por Oliveira et al.33 de microesferas de quitosana e por Zhang et al.34 e de
Oliveira et al.35 em micropartículas de quitosana e β-CD, ambos utilizando secagem por
spray-drying.
 74

Figura 1. Micrografias obtidas por MEV das micropartículas de (a) quitosana/GSH, (b)
quitosana, (c) β-CD/GSH, (d) β-CD, (e) GSH

A Figura 1 (1b e 1d) mostra as micrografias dos materiais de parede (quitosana e β-CD,
respectivamente) secos em spray dryer sem adição do composto ativo. Comparando as
morfologias das micropartículas com as dos polímeros sem adição do composto ativo
podemos observar algumas diferenças. A micrografia da micropartícula de quitosana/GSH
apresentou morfologia diferente da morfologia do polímero de quitosana, que apresentou
depressões superficiais contínuas. Porém a morfologia da micropartícula de quitosana/GSH
foi similar a morfologia da GSH pura submetida diluição em água e posterior secagem em
spray dryer (Figura 1e), o que pode ser indicativo de uma baixa interação entre a quitosana e a
GSH. Por outro lado, a morfologia da micropartícula de β-CD/GSH mostrou diferenças tanto
em relação a morfologia da β-CD quanto a da GSH que foram submetidas ao mesmo processo
de secagem das micropartículas. A micrografia de β-CD mostrou grandes cavidades e uma
forma não esférica e a da GSH mostrou-se esférica e lisa, enquanto as micropartículas
mostraram forma esférica não regular com algumas depressões superficiais. Estes resultados
demonstram uma possível interação entre o polímero, β-CD, e o composto ativo, GSH.

Espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier - FTIR

Os espectros de FTIR da GSH, da quitosana e da β-CD puras, assim como das micropartículas
e da mistura física dos componentes das micropartículas foram registrados (Figura 2 e 3,
respectivamente). Os espectros obtidos para a quitosana, para a β-CD e para a glutationa
 75

separadamente são similares aos obtidos em estudos anteriores.16,24,34,36 O espectro de GSH

pura (Figura 2a e 3a) mostrou bandas de absorção fortes atribuídas a estiramentos carbonil e
amida (1713 cm-1 e 1600 cm-1, respectivamente), bem como a banda referente ao grupo – SH
em 2525 cm-1.16

(a)

(b)

(c)

(d)

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

-1
Número de ondas (cm )

Figura 2. Espectros na região do infravermelho para (a) GSH, (b) quitosana, (c)
micropartículas quitosana/GSH, (d) mistura física quitosana e GSH

As bandas características da quitosana são a 3426 cm-1 (estiramentos -OH e -NH2), 2922 cm-1
e 2872 cm-1 (estiramento -CH), 1601 cm-1 (estiramento -NH2), 1078 cm-1 (estiramento C-O-C)
e 601 cm-1 (vibração do estiramento do anel piranosídico) (Figura 2b).24 A estrutura química
da quitosana apresenta dois grupamentos polares capazes de formar ligações de hidrogênio, o
grupo hidroxila e o grupo amino. No espectro da micropartícula quitosana/GSH (Figura 2c) a
banda na região do estiramento OH e NH desloca-se para valores menores (3300 cm-1),
sugerindo interações via ligações de hidrogênio entre os componentes na micropartícula. O
espectro das micropartículas quitosana/GSH mostra uma banda sobreposta em 2525 cm-1
referente ao grupo - SH da GSH. O espectro obtido da mistura física de quitosana e GSH
(Figura 2d) foi similar ao espectro da GSH pura e diferente do espectro da micropartícula
quitosana/GSH, sugerindo uma possível interação entre o polímero e a GSH.
 76

(a)

(b)

(c)

(d)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

-1
Número de ondas (cm )

Figura 3. Espectros na região do infravermelho para (a) GSH, (b) β-CD, (c) micropartículas
β-CD/GSH, (d) mistura física β-CD e GSH

Os espectros na região do infravermelho da micropartícula de β-CD foram muito semelhantes

aos do polímero puro. Os picos característicos de β-CD incluem 3400 cm-1 (estiramento -OH),
2927 cm-1 (estiramento -CH), 1640 cm-1 (flexão H-O-H), 1400 cm-1 (flexão -OH), 1156 cm-1
(estiramento –CO), 1028 cm-1 (estiramento C-O-C) e 950 cm-1 (vibração do esqueleto
envolvendo a ligação α-1,4).24,36 O espectro da micropartícula de β-CD mostra uma banda
forte em 1646 cm-1 atribuída à flexão H-O-H do polímero, uma banda fraca em 1713 cm-1 dos
estiramentos carbonil da GSH e uma banda fraca sobreposta em 2525 cm-1 referente ao grupo
- SH da GSH (Figura 3c), sugerindo uma possível interação entre o polímero e a GSH.16
O espectro obtido da mistura física de quitosana e GSH (Figura 3d) mostra picos
característicos dos dois componentes, diferentemente do espectro das microcápsula β-
CD/GSH o qual foi mais similar ao espectro da β-CD pura, o que indica a possibilidade de
interação entre a β-CD e a GSH.

Calorimetria Exploratória Diferencial – DSC

Os perfis de DSC da quitosana, da β-CD, da GSH e das duas formulações das micropartículas
são mostrados na Figura 4. O perfil da GSH pura exibiu um único pico endotérmico a 196 ºC,
correspondente à fusão da GSH. Nos perfis de DSC das micropartículas contendo GSH o pico
 77

em 196 ºC não esteve presente e os termogramas são semelhantes aos dos polímeros,
principalmente com relação às micropartículas de quitosana. Estes resultados, tomados em
conjunto, estão de acordo com os resultados obtidos por Lopedota et al.16 no qual o processo
de encapsulação também produziu uma diminuição acentuada na cristalinidade de GSH e
conferiu a ela um estado quase amorfo. Provavelmente causado pela intercalação das cadeias
de GSH e as cadeias poliméricas. No caso do sistema β-CD/GSH, outra causa provável é a
pequena concentração de GSH na formulação da micropartícula, quando comparada a
concentração do polímero.

(g)

(f)
Fluxo de calor

(e)
(d)
(c)

(b)

(a)
endo

0 50 100 150 200 250

o
Temperatura ( C)

Figura 4. Termogramas de DSC: (a) GSH, (b) quitosana, (c) β-CD, (d) β-CD/GSH, (e)
quitosana/GSH, (f) mistura física quitosana e GSH, (g) mistura física β-CD e GSH

Análise Termogravimétrica – TGA

As análises termogravimétricas foram realizadas para avaliar a estabilidade térmica das

micropartículas e também dos seus componentes individualmente, como mostra a Figuras 5.
A curva termogravimétrica da GSH padrão não houve perda de massa até 205 ºC. Acima de
205 ºC foi observada perda de massa de 55 % entre 200 ºC e 400 ºC e, após 400 ºC uma perda
de massa menos acentuada com patamar final indefinido, conforme observado por Baek,
Choy e Choi.37
A quitosana na primeira etapa de decomposição apresentou uma perda de água inicial de 10 %
até 100 ºC. Entre 100 e 280 ºC a curva termogravimétrica da quitosana apresentou perda de
massa de 5 % e entre 280 e 380 ºC uma perda de 35 %, correspondente a desacetilação e
 78

despolimerização do composto. Entre 380-700 ºC apresentou uma perda de 20 % e, acima de

700 ºC, a perda continua com patamar indefinido. Estes resultados são similares aos obtidos
em estudos anteriores.38-41

100

90

80
Perda de Massa (%)

70

60

50

40
(a)
30 (b)
(c)
20
(d)
10
(e)
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

o
Temperatura ( C)

Figura 5. Termogramas das amostras de (a) quitosana, (b) GSH, (c) micropartículas de
quitosana/GSH, (d) micropartículas de β-CD/GSH, (e) β-CD

O termograma da β-CD apresentou três etapas de decomposição. A primeira etapa de 15 % de

perda de massa até 120 ºC é referente à evaporação de água, que pode ser observada também
no termograma de DSC como o pico endotérmico nesta faixa de temperatura (Figura 4 c). O
segundo evento térmico de decomposição (70 %) iniciou em 290 ºC. Este evento foi reportado
anteriormente por outros autores nesta mesma faixa de temperatura.42 O mecanismo envolvido
nesta fase de transição não está claro ainda, mas parece estar associado à hidratação do cristal
que ocorre com a síntese de β-CD, que pode estar presente em formas cristalinas diferentes
com uma possível transição entre elas.43 As formas pseudomórficas prevalentes para os
cristais de β-CD são as formas decahidratado ou dodecahidratado. As diferenças estruturais
destes hidratos dependem da quantidade de moléculas de água e de como elas são dispostas
no interior da ciclodextrina. Isto explica a fusão e a decomposição da β-CD em temperaturas
acima de 300 ºC, e está principalmente relacionado à ausência de um pico de fusão claro,
antes da decomposição,42 como pode ser observado na curva de DSC (Figura 5 c).
 79

Comparando as curvas termogravimétricas dos componentes das micropartículas de forma

isolada com as das micropartículas contendo GSH, podemos observar que a curva
termogravimétrica da micropartícula de quitosana/GSH inicialmente é similar a da quitosana
pura, apresentando uma perda de água até a temperatura de 100 ºC. A partir desta temperatura
a curva termogravimétrica da micropartícula de quitosana/GSH apresenta uma perda de massa
com perfil similar ao da GSH pura seca em spray dryer. Estes resultados sugerem que não
houve proteção da GSH contra a degradação. Entretanto, um comportamento diferente pôde
ser observado para a amostra β-CD/GSH. A curva termogravimétrica das micropartículas β-
CD/GSH mostra que há uma perda de água até 100 ºC e que, até 290 ºC não há perda de
massa, como ocorreu para a amostra de β-CD. Portanto, provavelmente houve uma proteção
da molécula de GSH, evitando sua degradação a partir dos 150 ºC até 290 ºC. Até a
temperatura de 320 ºC a degradação das micropartículas β-CD/GSH foi similar ao perfil da β-
CD pura. À 320 ºC uma perda de massa de 42 % ocorreu na micropartícula e posteriormente
a perda de massa continua menos acentuada. O termograma das micropartículas β-CD/GSH
foi, portanto diferente da GSH pura e da β-CD pura, sugerindo que ocorreu uma interação
entres os compostos, conferindo maior estabilidade térmica à GSH.
Comparando as curvas termogravimétricas das duas micropartículas (Figura 5c e 5d) podemos
observar que a micropartícula β-CD/GSH conferiu maior estabilidade em relação ao aumento
de temperatura quando comparada a micropartícula quitosana/GSH.

Difratometria de Raios X – DRX

Os difratogramas de quitosana, β-CD, GSH e das micropartículas de quitosana e β-CD

carregadas com GSH são mostrados na Figura 6. Assim como nos estudos anteriores, a
quitosana mostrou um estado amorfo para parcialmente cristalino,44 apresentando dois picos
característicos em 2θ de 11º, que corresponde a cristais hidratados e em 20º que corresponde a
cristais anidros (Figura 5 c).24,44 Por outro lado, os padrões de β-CD e de GSH apresentaram
fortes características cristalinas, com vários picos fortes nos difratogramas. O espectro de
difração de raios-X da GSH cristalina foi caracterizado por um pico intenso em 2θ de 22,3º e
dois picos de baixa intensidade a 2θ de 9-11º.16 Nos espectros de raios-X das micropartículas
esses picos estão ausentes, ou fortemente reduzidos, o que indica que a GSH pode existir
como dispersão molecular nas micropartículas poliméricas.45
 80

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)
0 10 20 30 40
2

Figura 6. Difratogramas das micropartículas de quitosana (a), das micropartículas de β-CD

(b), da β-CD (c), da quitosana (d) e da GSH (e)

No espectro de difração das micropartículas de quitosana o pico em 2θ de 20º da quitosana

torna-se ainda mais amplo. É conhecido que a largura do raio-X do pico de difração está
relacionado com o tamanho de cristalito, o pico alargado geralmente resulta de um cristal
imperfeito. Assim, o pico largo das micropartículas podem ser resultado da reação de
reticulação entre o polímero e a GSH, o que pode destruir a estrutura cristalina dos
compostos.46
Estes resultados estão de acordo com resultados anteriores obtidos com a análise dos
compostos estudados16,24,44,47 e sugerem que o processo de microencapsulação ocasiona uma
redução na cristalinidade da GSH e/ou confere a ela um estado quase amorfo.

Rendimento, Recuperação e Eficiência de Encapsulação

O rendimento do processo de preparação em micropartículas (Tabela 1) foi maior para a

formulação das micropartículas de β-CD/GSH quando comparado ao rendimento em
micropartículas da formulação de quitosana/GSH. Estes resultados estão de acordo com os
rendimentos obtidos em outros estudos sobre a obtenção de micropartículas por spray
 81

dryer,32,34,48, sendo previamente esperada uma perda significativa dos componentes que ficam
retidos no equipamento devido ao processo de secagem. O rendimento do processo de
secagem depende muito da configuração do equipamento, por isso estes dados não são
relatados na maioria dos estudos32 e também por isso são de difícil comparação com os
demais estudos.

Tabela 1. Rendimento, percentual de recuperação e eficiência de encapsulação das

formulações de micropartículas de quitosana/GSH e de β-CD/GSH
Formulação Rendimento % Recuperação % (n=3) EE% (n=3)
quitosana/GSH 49,2 100,5 ± 9,5 25,0 ± 14,4
β-CD/GSH 61,7 109,7 ± 1,0 62,4 ± 12,2

Através do doseamento da GSH após a dissolução das micropartículas (Tabela 1) foi possível
recuperar totalmente a GSH adicionada a ambas formulações, β-CD/GSH e quitosana/GSH.
Os resultados sugerem que o processo de preparação não ocasionou perda e/ou degradação do
composto ativo, considerando que as variações que ocorreram para mais ou para menos de
100% podem ser explicadas devido a heterogeneidade das alíquotas retiradas do pó de
micropartículas, tendo em vista que as eficiências de encapsulação foram menores que 100 %.
A capacidade da quitosana e da β-CD reter a GSH foi determinada através da eficiência de
encapsulação (Tabela 1). Podemos observar que a GSH apresentou menor afinidade com a
quitosana do que com a β-CD, provavelmente devido a baixa massa molar do peptídeo e a
presença de somente um grupo de carga negativa na sua estrutura.17. Ikeda et al.49 utilizaram
a β-CD para formar complexos de inclusão com captopril, e os resultados mostraram a
inclusão total da molécula na cavidade da β-CD com o ácido carboxílico localizado dentro da
cavidade e a parte terminal tiol para fora da cavidade. Com a GSH, provavelmente a parte
interna da cavidade de β-CD se liga a uma porção do L-glutamato da cadeia lateral da GSH
assim como ocorreu com a GSH e a α-CD em estudo anterior.27 Dados obtidos por RMN
mostram que a associação entre GSH e α-CD ocorre na ordem de 55-70 M-1 a 25 ºC e,27
apesar de alguns sinais sobrepostos impedirem uma medida precisa das constantes de
complexação entre GSH e uma ciclodextrina quimicamente modificada (sulphobutyl ether-β-
cyclodextrin), Trapani et al.17 sugerem uma afinidade semelhante. Em estudo recente
realizado por Cutrignelli et al.,50 a eficiência de encapsulação da GSH em lipossomas
contendo GSH ou complexos de inclusão contendo GSH/ciclodextrinas (β e quimicamente
modificadas) foi entre 13,6 e 23,7 %.
 82

Em relação a conjugação entre quitosana e GSH, uma das formas possíveis seria pelo método
de polimerização de radicais, através da formação da ligação amida entre os grupos
carboxílicos da glicina da GSH e os grupos amina da quitosana.13,18 Provavelmente, a
eficiência de encapsulação da micropartícula de quitosana/GSH não foi maior porque não
foram adicionados catalisadores para reação e, o tempo de reação foi curto quando comparado
a outros estudos.13,18 Além disso, o pH da solução não foi ajustado para valores próximos a
neutralidade; o que pode ter dificultado a conjugação através da polimerização de radicais.
Em pH 7 o resíduo de glicina de GSH é particularmente móvel, enquanto a parte glutamina da
GSH é a mais rígida.51 Portanto, em pH de 4,5, resultante da mistura da solução de quitosana
com a solução de GSH no preparo das micropartículas, a mobilidade da glicina deve ter sido
um pouco reduzida, dificultando ligação entre os dois compostos. Koo et al.13 encontraram
eficiências de encapsulação entre 20 e 65 % na obtenção de nanopartículas de quitosana/GSH
preparadas através do método de gelificação iônica com tripolifosfato de sódio, com ajuste de
pH à 6 e diversas proporções variáveis de GSH e tripolifosfato de sódio. A baixa eficiência
de encapsulação da micropartícula quitosana/GSH também pode-se dever ao fato de que a
quitosana utilizada neste estudo possui baixo peso molecular e, por isso, as moléculas de GSH
são imobilizadas em posições mais próximas e, portanto a GSH pode se auto-oxidar através
da formação de ligações dissulfeto intramoleculares, apresentando menos grupos tiois livres,52
tendo em vista que não foram adicionados agentes redutores durante o preparo das
micropartículas.

Cinética de liberação da GSH em vinho modelo

Geralmente o processo de liberação do composto ativo ocorre pelo intumescimento da rede

polimérica, que ocorre quando o meio aquoso penetra na rede levando a mesma a uma
expansão. Essa rede polimérica torna-se cada vez mais ampla permitindo a liberação do ativo
para a fase externa até o equilíbrio termodinâmico. Neste sentido, a cinética de liberação da
GSH dependerá dos seguintes fenômenos: difusão do polímero em meio aquoso, cinética de
relaxamento da macromolécula, difusão do composto ativo através da rede polimérica
intumescida.53,54 A liberação da GSH foi testada para as amostras: quitosana/GSH e β-
CD/GSH. A Figura 7 apresenta a liberação da GSH em intervalos entre 0,16 a 48 horas.
Nota-se na Figura 7 que a liberação da GSH contida na micropartícula de quitosana/GSH é
maior do que na micropartícula de β-CD/GSH. Nos primeiros minutos para a micropartícula
de quitosana/GSH ocorre uma fase inicial de liberação rápida seguida de uma fase mais lenta
 83

até o equilíbrio. Essa fase inicial de liberação mais rápida pode ser atribuída à GSH presente
na superfície da micropartícula. Esse efeito pode ser denominado efeito burst. Nesse caso a
liberação de cerca de 90% da GSH presente na amostra quitosana/GSH para o meio aconteceu
no primeiro dia, seguido de um pequeno aumento nessa porcentagem no segundo dia. Para as
micropartículas de β-CD/GSH essa liberação ocorreu mais lentamente e até uma hora, a
concentração de GSH liberada ao meio foi menor do que 10 mg L-1 (limite de quantificação
do método). Sendo a liberação inicial menos acentuada e o efeito burst menor para as
micropartículas de β-CD/GSH do que para as micropartículas de quitosana/GSH, indicando
baixo índice de GSH superficial na amostra, ou seja, a liberação se dá pela difusão da GSH do
interior da matriz de β-CD através do intumescimento da rede polimérica.

100

80
GSH (%)

60
Quitosana
40 β-CD

20

0
0 10 20 30 40 50
Tempo (h)
Figura 7. Perfil de liberação da GSH em vinho modelo (solução hidroalcoólica 12 %, pH
3,5) à 25 ºC (n=3)

Os estudos anteriores que tratam da encapsulação da GSH em sistemas poliméricos de

quitosana, β-CD ou quitosana/β-CD tratam da aplicação farmacêutica de GSH e, por isso,
avaliam sua liberação em meios sintéticos diversos, por exemplo, simulando meios gástricos e
intestinais,16,17,24,55 o que torna difícil uma comparação. Além do mais se considerarmos os
diferentes métodos de encapsulação e as diferentes formulações encontradas nos estudos
anteriores. O perfil de liberação rápida é típico observado para micropartículas de quitosana e
são atribuídos a um mecanismo combinado da complexação equilibrada entre quitosana e o
composto ativo e da difusão do composto ativo através da camada fina da quitosana.17
 84

Os dados de liberação in vitro de GSH em vinho modelo das micropartículas β-CD/GSH e

quitosana/GSH foram fundamentados apropriadamente no modelo de Korsmeyer–Peppas, que
é utilizado para determinar o mecanismo de liberação da porção inicial do composto ativo
(Mt/M∞≤ 60%) através da Equação 2:

𝑀𝑡
= 𝐾 𝑡𝑛 (Equação 2)
𝑀∞

Na equação acima, Mt/M∞ é a fração de GSH liberada a um tempo t, K é a taxa constante de

liberação e n é o expoente de liberação, indicativo do mecanismo de liberação da composto
ativo. O valor de n é usado para caracterizar o mecanismo de liberação da GSH. Os valores de
n, K e do coeficiente de determinação (R2) foram obtidos através dos gráficos mostrados na
Figura 8 e são mostrados na Tabela 2.

Figura 8. Liberação da GSH pela razão Mt/M∞ em função do tempo para as micropartículas
β-CD/GSH e quitosana/GSH

Para partículas esféricas, n=0,43 corresponde a um mecanismo de liberação Fickniano,

indicando que o composto ativo é liberado por difusão e, n=0,85 corresponde ao transporte
Caso II (relaxação), indicando a liberação por inchaço ou entumescimento. Valores de n entre
0,43 e 0,85 correpondem a um transporte não Fickiano ou anômalo, indicando uma
superposição dos dois fatores, difusão e intumescimento.56,57 O comportamento Fickiano foi
observado para a partícula quitosana/GSH, o que está de acordo com os resultados de
eficiência de encapsulação (Tabela 1). Além disso, os valores de K sugerem que a taxa de
liberação de GSH foi superior nas micropartículas quitosana/GSH. O valor de n para as
micropartículas β-CD/GSH foi maior do que 0,45 e menor que 0,85, o que indica que, para
 85

esta formulação, a liberação da GSH seguiu uma liberação não-Fickiana. Portanto, no caso da
micropartícula β-CD/GH, além da liberação da GSH por difusão, ocorreu a expansão da
cadeia do polímero ocasionando penetração de fluido para dentro da matriz.24 Contudo, as
micropartículas β-CD/GH apresentaram uma liberação da GSH mais lenta quando
comparadas as micropartículas quitosana/GSH.

Tabela 2. Parâmetros obtidos para a equação Mt/M∞ = Ktn para a formulação de

micropartícula de β-CD e para a de quitosana, ambas contendo GSH
Amostra K n R2
β-CD/GSH 0,1826 0,64 0,89
Quitosana/GSH 0,5810 0,10 0,85

CONCLUSÃO

Foi possível encapsular glutationa tanto utilizando β-CD quanto utilizando quitosana. Os
métodos utilizados neste estudo são de fácil preparação, não envolvem a presença de
tensoativos e, no caso das micropartículas de β-CD/GSH, nem solventes orgânicos. A
caracterização das microcápsulas comprovaram um microrrevestimento do composto ativo e
uma interação entre a GSH e os polímeros utilizados, além de melhorar a estabilidade térmica
da molécula. A β-CD foi mais eficiente para encapsular a GSH, permitindo a liberação lenta
da molécula em solução de vinho modelo e maior proteção da molécula, conferindo melhor
estabilidade térmica para GSH. Outros estudos devem ser realizados a fim de melhorar a
estabilidade da GSH e liberando-a mais lentamente em meios hidroalcoólicos com pHs
baixos, como vinhos e espumantes, além de avaliar a viabilidade de utilização de GSH
encapsulada nestes produtos.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), ao

Conselho Nacional para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio
financeiro.
 86

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 89

5. DICUSSÃO GERAL

Com os resultados desta tese podemos observar que a adição de GSH evita tanto a

oxidação enzimática, que ocorre principalmente no mosto, quanto à oxidação química, que

ocorre principalmente durante o armazenamento dos vinhos espumantes. Os efeitos da adição

de GSH foram maiores no mosto que no vinho base, uma vez que o mosto se encontra em

condições mais vulneráveis à oxidação. Porém, a adição de GSH no vinho base influenciou na

manutenção dos níveis de SO2 livre e dessa forma a GSH pode ser uma alternativa promissora

para prolongar o efeito antioxidante e conservante no vinho espumante.

A adição de GSH nas diferentes etapas de elaboração do vinho espumante apresentou

maior influência nos resultados do que as diversas concentrações (10, 20 ou 30 mg L-1) de

GSH adicionadas. O efeito da adição de GSH sobre compostos aromáticos e fenólicos foi

maior quando a GSH foi adicionada no mosto. Já no vinho base, a adição de GSH mostrou

maior influência na preservação dos níveis de SO2 livre, dos ésteres etílicos e acetato de

isoamila. E finalmente, a adição após o degorgement não apresentou influência sobre a

manutenção dos níveis de SO2 livre, dos compostos fenólicos ou aromáticos, porém, teve

influência na manutenção da qualidade dos vinhos espumantes, pois permitiu evitar a

oxidação durante o armazenamento desses vinhos em garrafas, evitando o escurecimento e a

formação de acetaldeído.

Provavelmente, quando a GSH é adicionada ao mosto a GSH reage com compostos o-

quinona evitando que a cadeia de reações de oxidação que levam à formação de compostos

poliméricos prossiga, proporcionando um meio de fermentação em condições reduzidas. Isto

evitou a oxidação do etanol e do 2-feniletanol em acetaldeído e fenilacetaldeído,

respectivamente. Possibilitando maiores quantidades de 2-feniletanol (aroma de rosas) no

vinho espumante. Apesar da adição de GSH no mosto ter proporcionado condições reduzidas
 90

ao vinho, provavelmente não evitou a oxidação dos compostos fenólicos à o-quinonas.

Quando a GSH é adicionada ao vinho base ela evita que o SO2 combine com outros

compostos do vinho, mantendo-o na forma livre, o que permite que o mesmo atue como

conservante e antioxidante por um tempo maior e, por consequência, ajuda a prevenir a perda

de compostos aromáticos, como ésteres etílicos e acetato de isoamila. Quando a GSH foi

adicionada após o degorgement, evitou a formação de acetaldeído ou ainda, possibilitou uma

reação de adição entre a GSH e o acetaldeído, embora este seja principalmente ligado ao SO2.

Portanto, a GSH evitou que o acetaldeído combinasse com outros compostos como a

catequina, para formar polímeros maiores, os quais podem causar o escurecimento do vinho.

Devido a isso, e ao fato de a GSH reagir com compostos o-quinona, sua adição após o

degorgement evitou o escurecimento dos vinhos espumantes por até 12 meses de

armazenamento em garrafas.

Os níveis de glutationa total nos vinhos espumantes foram maiores quando a GSH foi

adicionada no mosto, e apresentaram uma relação inversa com o escurecimento do vinho

espumante durante o armazenamento. Por isso, a concentração de glutationa total parece ser

um bom indicador do potencial antioxidante do vinho.

Os níveis de GSH esgotaram rapidamente nos vinhos espumantes após a adição da

mesma, independente da concentração adicionada. Os níveis de glutationa total também

reduziram rapidamente, mas de forma gradual conforme a concentração adicionada. Para

evitar que a GSH esgote rapidamente do meio, combinando com outros compostos presentes

no vinho, a mesma foi encapsulada em um sistema polimérico para ser liberada gradualmente,

evitando assim, a formação de H2S que ocorre em condições fortemente reduzidas, ou seja,

com baixo nível de oxigênio disponível.

A encapsulação de GSH foi realizada pelo método de secagem por pulverização em

spray-dryer com a utilização de quitosana ou beta-ciclodextrina. As micropartículas de β-

 91

ciclodextrina contendo GSH apresentaram maior eficiência de encapsulação, protegeram

melhor a molécula da GSH contra o aumento da temperatura e, liberaram a GSH de forma

mais lenta em vinho modelo por dissolução do polímero. Após 48 horas toda a GSH

encapsulada foi liberada ao vinho modelo. A adição da micropartícula contendo GSH antes da

fermentação pode ser uma alternativa promissora para obtermos maior quantidade de GSH

após a fermentação alcoólica, evitando que a mesma seja absorvida ou consumida pelas

leveduras. Porém, outros agentes encapsulantes devem ser testados para obtermos uma

liberação mais lenta da GSH no vinho, a fim de preservá-lo contra a oxidação durante o

armazenamento.
 92

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

A adição de GSH ao mosto influenciou mais na composição do espumante do que a

adição ao vinho base. Entretanto, a adição de GSH ao vinho base pareceu manter níveis mais

elevados de SO2 na forma livre.

A concentração de GSH adicionada ao mosto e/ou ao vinho base não influenciou

significativamente nos resultados. A adição de 10 mg L-1 de GSH no mosto é suficiente para

assegurar menores concentrações de ácidos cafeico, cumárico e ferrúlico nos espumantes.

A adição de 20 mg L-1 de GSH no espumante junto com o licor de expedição resultou

em menor índice de cor, maiores quantidades de SO2 na forma livre, menores concentrações

de acetaldeído e mesma quantidade de compostos fenólicos até 12 meses de armazenamento

em garrafas.

A quantidade de GSH adicionada no espumante pronto decaiu em um mês de

armazenamento e estabilizou nos primeiros seis meses, porém a quantidade de glutationa total

permaneceu maior no espumante com adição de 30 mg L-1, até 12 meses de armazenamento.

Apesar de somente a GSH ter propriedade antioxidante, a quantidade de glutationa

total teve maior correlação com os resultados obtidos e, por isso, os níveis de glutationa total

seja um melhor indicador da condição antioxidante do vinho do que propriamente a GSH.

Foi possível encapsular glutationa tanto utilizando β-CD, quanto utilizando quitosana.

A caracterização das microcápsulas comprovaram um microrrevestimento do composto ativo

e uma interação entre e a GSH os polímeros utilizados, além de melhorar a estabilidade

térmica da molécula. A β-CD foi mais eficiente para encapsular a GSH, permitindo a

liberação gradativa da molécula em solução de vinho modelo e maior proteção da molécula,

conferindo melhor estabilidade térmica para GSH.

 93

Com os resultados e conclusões obtidos, estabelecemos as seguintes perspectivas para

continuação do trabalho:

1. Estudar a utilização de doses de GSH > 30 mg L-1, combinando técnicas enológicas

destinadas a controlar as causas múltiplas de oxidação do vinho.

2. Elucidar o papel da GSH nos níveis de SO2 livre e se uso de GSH como antioxidante

em vinhos poderia reduzir o uso de SO2, utilizando níveis maiores de GSH.

3. Estudar a influência da adição de GSH nos espumantes na autólise das leveduras.

4. Estudar a influência da adição da GSH na fermentação maloláctica.

5. Estudar a influência da adição da GSH na espuma dos vinhos espumantes.

6. Encapsular a moléculas de GSH utlizando outras técnicas de obtenção de nano e/ou

micropartículas e outros agentes encapsulantes a fim de melhorar a estabilidade da

GSH, liberando-a mais lentamente em meios hidroalcoólicos com pHs baixos, como

vinhos e espumantes, reagindo continuamente com os compostos do vinho por um

maior tempo durante seu armazenamento em garrafas.

7. Avaliar a viabilidade de utilização de GSH encapsulada em vinhos e espumantes.

8. Estudar se a GSH liberada lentamente favorece que o vinho permaneça em condições

reduzidas de oxigênio e evite a formação de H2S.

 94

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 105

8. ANEXOS

8.2. ANEXO I - Delineamento experimental

Foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento foram adicionados 10 e

20 mg L-1 de GSH no mosto e no vinho base, conforme planejamento experimental fatorial 32

(Tabela 1).

Tabela 1 – Delineamento experimental 1: Experimento fatorial 32.

Variáveis
Experimento Variáveis Reais
Codificadas
GSH no mosto GSH no vinho base
X1 X2
(mg L-1) (mg L-1)
1 -1 -1 0 0
2 -1 0 0 10
3 -1 1 0 20
4 0 -1 10 0
5 0 0 10 10
6 0 1 10 20
7 1 -1 20 0
8 1 0 20 10
9 1 1 20 20

No segundo experimento foram adicionados 10, 20 e 30 mg.L-1 de GSH após o

degorgement (Tabela 2). Neste experimento foi avaliada a oxidação e a preservação dos

compostos aromáticos durante o armazenamento do espumante pronto para o consumo.

Tabela 2 – Delineamento experimental 2: adição de GSH no momento do

engarrafamento.

Experimento Variáveis Reais

GSH no vinho base GSH no espumante
(mg.L-1) (mg.L-1)
1 0 0
2 0 10
3 0 20
4 0 30
 106

As amostras foram analisadas após o engarrafamento nos períodos de 1, 6, 12, 18

meses. Foram realizadas análises de compostos aromáticos, compostos fenólicos e sensoriais.

Cada tratamento foi realizado em 3 garrafas, as análises foram realizadas em triplicata para

cada garrafa.