UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO

MONISE THAÍS HERPICH

Obtenção de linhagens duplo-haplóides de milho

MARINGÁ
PARANÁ - BRASIL
MAIO – 2012
 MONISE THAÍS HERPICH

Obtenção de linhagens duplo-haplóides de milho

Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Maringá, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Genética e Melhoramento, para obtenção
do título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Ronald José Barth Pinto.

MARINGÁ
PARANÁ - BRASIL
MAIO - 2012
FOLHA DE APROVAÇÃO

ii
Aos meus pais maravilhosos, Eliani Marilei Freitag e Guido Herpich, pelo exemplo de
seres humanos amorosos, éticos, humildes, serenos e honestos.
Aos meus avós, Mário Abílio Freitag e Augusto Herpich, pela influência, desde
criança, em admirar tudo que reflete no nome “Agronomia” e por hoje me dedicar e
amar a minha profissão.
A toda a minha família, pelo total apoio, por sempre acreditar na minha capacidade e
principalmente pelo amor e respeito.
Com amor dedico.

iii
 AGRADECIMENTOS

Sempre a Deus, da forma como eu o reconheço e acredito.

À Universidade Estadual de Maringá (UEM) e ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Melhoramento (PGM), pela oportunidade.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes)
pela concessão da bolsa de estudo.
À Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola (Coodetec), pelo apoio em
disponibilizar ferramentas e materiais necessários a esta pesquisa.
Ao professor doutor Ronald José Barth Pinto, pela orientação, grande
amizade e ajuda e por ser um exemplo de profissional para mim.
Ao Dr. Ivan Schuster, pela paciência, dedicação como meu Coorientador e
também por ser, para mim, um grande exemplo como profissional e ser humano.
À Dra. Elisa Serra Negra Vieira, por acreditar na minha capacidade, pela
amizade e carinho.
À Dra. Polyana Kelly Martins, por se tornar uma grande amiga, pelos
importantes ensinamentos teóricos e práticos, pela paciência e carinho.
À Dra. Leandra Regina Texeira e futura Dra. Fabiane Lazzari, pela ajuda
prestada e disponibilidade.
À minhas amadas famílias, Freitag e Herpich, principalmente pelo apoio e
orgulho em ter uma mestranda na família.
Aos meus amigos Simone, Bruna, Clériston, Cris, Karinie, Pricila, Fairuz,
Carol, Marlon, Renato, Fran, Patrícia, Polaka, Suzana entre outros, que fazem da
minha vida um verdadeiro mar de alegrias.
A todos meus amigos do Núcleo de Biotecnologia da Coodetec, em especial
à Crisleine, Fabiane, Joselaine, Laura, Mariana, Patrícia Vinholes e Vanessa e ao
Leonardo, Marcelo, Carlinhos e Henderson, pela amizade, alegrias, colaboração e
companheirismo durante essa jornada.
Aos amigos de Maringá, em especial à Carla, Cláudia, Greicy, Katlin e
Juliana e ao Leonardo, Marcelo, André, Henrique, Bernardo, Dino, Bombeiro e
Fernando Fernande, pela amizade e companhia.
Ao professor doutor Ednaldo Michellon, pela oportunidade em participar do
projeto “Programa Paranaense de Certificação de Produtos Orgânicos”
(Universidade sem Fronteiras), cujas atividades oportunizaram a obtenção de uma

iv
bolsa de estudos, no período anterior ao recebimento de bolsa da Capes, permitindo
que eu me mantivesse em Maringá e adquirisse conhecimentos valiosos para minha
vida profissional.
Finalmente, a todos os que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho e que estarão sempre em meu coração.

v
 BIOGRAFIA

MONISE THAÍS HERPICH, filha de Eliani Marilei Freitag e de Guido Herpich,

nasceu em Marechal Cândido Rondon, estado do Paraná, no dia 13 de fevereiro de
1988.
Concluiu o Ensino Fundamental, em 2001, e o Ensino Médio, em 2004,
ambos no Colégio Evangélico Martin Luther.
Recebeu o título de Engenheira Agrônoma, em dezembro de 2008, pela
Faculdade Assis Gurgacz (FAG), em Cascavel, Paraná.
Também em 2008, iniciou sua atividade profissional na Cooperativa Central
de Pesquisa Agrícola (Coodetec), trabalhando com tecnologias relacionadas a
duplo-haplóides em trigo e milho.
Em março de 2010, ingressou no Curso de Mestrado do Programa de Pós-
Graduação em Genética e Melhoramento, da Universidade Estadual de Maringá, em
Maringá, estado do Paraná.

vi
 SUMÁRIO

SUMÁRIO ................................................................................................................. vii

LISTA DE QUADROS ................................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... x
RESUMO.................................................................................................................... xi
ABSTRACT............................................................................................................... xii
1.INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 2
2.1. Biologia floral do milho ...................................................................................... 2
2.2. Polinização e fertilização .................................................................................. 4
2.3. Maturação e constituintes da semente ............................................................. 5
2.4. Melhoramento do milho .................................................................................... 6
2.5. Haplóides e duplo-haplóides............................................................................. 7
2.5.1. Sementes haplóides: formação e identificação ....................................... 8
2.5.2. Histórico do emprego dos duplo-haplóides ............................................. 9
2.5.3. Obtenção de haplóides gimnogenéticos através da indução in vivo ..... 10
2.5.4. Duplicação cromossômica .................................................................... 13
2.5.5. Importância dos duplo-haplóides .......................................................... 13
2.6. Utilização de marcadores SSR na seleção de haplóides e DH ...................... 14
3. MATERIAL E METODOS ..................................................................................... 16
3.1. Local ............................................................................................................... 16
3.2. Indução de haploidia ....................................................................................... 16
3.3. Identificação das sementes potencialmente haplóides ................................... 16
3.4. Métodos de duplicação cromossômica ........................................................... 17
3.4.1.Tratamento 1: testemunha ..................................................................... 17
3.4.2. Tratamento 2: imersão das sementes em solução de colchicina .......... 17
3.4.3. Tratamento 3: germinação em papel germitest .................................... 18
3.4.4. Tratamento 4: imersão das plântulas em colchicina ............................. 19
3.4.5. Tratamento 5: injeção de colchicina nas plantas .................................. 19
vii
 3.5. Caracterização fenotípica das plantas haplóides e DH................................... 19
3.6. Identicação de plantas haplóides ou DH através de marcadores SSR ........... 20
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 22
4.1. Eficiência na indução de haploidia .................................................................. 22
4.2. Duplicação cromossômica .............................................................................. 28
4.3. Seleção de plantas haplóides por meio de marcadores SSR ......................... 31
4.4. Comparação dos três métodos de seleção e obtenção de sementes DH ...... 34
5. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 37
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 38

viii
 LISTA DE QUADROS

Quadro 1– Sementes potencialmente haplóides selecionadas em cada indutor

cruzado com as diferentes populações ......................................... .... 24
Quadro 2 - Avaliação fenotípica das plantas potencialmente haplóides. ....... .... 25
Quadro 3 - Duplicação cromossômica de sementes potencialmente haplóides
induzidas pelo Stockc 6 ................................................................. .... 28
Quadro 4 - Duplicação cromossômica de sementes potencialmente haplóides
induzidas pelo KHI ........................................................................ .... 29
Quadro 5 - Número de marcadores SSR utilizados na identificação de plantas
DH em cada população. ............................................................... .... 31
Quadro 6 - Marcadores microssatélites utilizados na identificação de plantas
haploides ou DH ........................................................................... .... 31
Quadro 7 - Número de haplóides ou DH selecionados na análise fenotípica e
molecular e coincidência entre as duas análises ......................... .... 33

ix
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Corte realizado acima do embrião para melhor absorção da

solução de colchicina .................................................................... .... 18
Figura 2 - A) Expressão de antocianina nas sementes; B) Sementes sem
expressão de antocianina.............................................................. .... 22
Figura 3 - A) semente híbrida, B) potencialmente haplóide e C) semente sem
expressão de antocianina.............................................................. .... 23
Figura 4 - Diferença fenotípica entre planta híbrida e planta haplóide, oriundas
do cruzamento com o genitor Stock 6 ........................................... .... 26
Figura 5 - Plantas haplóides oriundas do cruzamento com o genitor KHI .... .... 27
Figura 6 - Amostras de sementes submetidas ao tratamento 2 em que se
observa a injúria causada pelo corte profundo ............................. .... 29
Figura 7 - Padrão obtido com o marcador umc 1797 para plantas oriundas do
cruzamento entre Stock 6 e P3. 1, 2, 3, 4, 5 e 7: híbridos; 6:
haplóide ou ................................................................................... .... 32
Figura 8 - Padrão obtido com o marcador bnlg 1031 para plantas oriundas do
cruzamento entre KHI e P21. 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 12, 15 e 18:
híbridos; 5, 6, 10, 11, 13, 14, 16 e 17: haplóides ou DH ............... .... 32
Figura 9 - Avaliação de três métodos de seleção de haplóides para o
indutor Stock 6 ............................................................................. .... 34
Figura 10 - Avaliação dos três métodos de seleção de haplóides para o
indutor KHI .................................................................................. .... 35
Figura 11 - Espigas colhidas nas plantas autofecundadas. Somente a espiga nº
2 foi oriunda de uma planta caracterizada fenotipicamente e
molecularmente como DH ............................................................. .... 36

x
 RESUMO

HERPICH, Monise Thaís, M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, maio de 2012.

Obtenção de linhagens duplo-haplóides de milho. Orientador: Ronald José Barth
Pinto. Conselheiros: Ivan Schuster e Carlos Alberto Scapim.

A tecnologia de produção de Duplo-Haplóides (DH) tem sido utilizada por empresas

de melhoramento de milho em função da possibilidade de reduzir o tempo e o custo
despendidos na obtenção de linhagens. A implantação de uma rotina de produção
de linhagens duplo-haplóides em programas de melhoramento de milho no Brasil
depende do estabelecimento de protocolos eficientes. Este trabalho foi realizado
com dois objetivos: 1) avaliar a eficiência da obtenção de linhagens duplo-haplóides
de milho, utilizando dois indutores e cinco métodos de duplicação cromossômica; 2)
identificar marcadores moleculares microssatélites (SSR) para auxiliar a seleção
fenotípica de plantas haploides ou DH. Para tanto, foi avaliada a eficiência na
indução de haplóides utilizando híbridos do programa de melhoramento de milho da
Coodetec e os indutores de haploidia Stock 6 e KHI, obtendo assim
sementes/plantas haplóides gimnogenéticas. Para a duplicação cromossômica,
foram utilizados cinco métodos, sendo a colchicina empregada como agente
antimitótico. A identificação de haplóides ou DH foi realizada por meio da análise
fenotípica e do uso de marcadores SSR. O indutor de haploidia KHI apresentou
melhor desempenho na indução de haplóides gimnogenéticos de milho. Os métodos
de duplicação cromossômica apresentaram baixa eficiência, necessitando, assim, da
otimização de protocolos. Os marcadores moleculares microssatélites utilizados
foram eficazes na identificação das plantas haplóides ou DH, auxiliando na seleção
fenotípica.

Palavras-chave: Zea mays (L.), duplo-haplóides, melhoramento genético.

xi
 ABSTRACT

HERPICH, Monise Thaís, M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, may, 2012.

Obtaining double haploid lineages of maize. Advisor: Ronald José Barth Pinto.
Committee members: Ivan Schuster and Carlos Alberto Scapim.

The production of double-haploids (DH) being used by maize companies due to the
possibility of reducing time and cost spent in obtaining inbred lines. The
implementation of routine production of double haploids lines in maize breeding
programs in Brazil depends on the establishment of efficient protocols. This work was
conducted with two objectives: 1) evaluate the efficiency of obtaining double-haploid
lines in maize using two inductors and five methods of chromosome doubling; 2)
identify SSR markers to assist phenotypic selection of haploid plants or DH. To this
end, was evaluated the efficiency in induction of haploids using hybrid of maize
breeding program of Coodetec and the inductors of haploidy Stock 6 and KHI,
thereby obtaining seeds/plants genotyping haploids. To the chromosome duplication
was used five methods, and colchicine used as antimitotic agent. The identification of
haploids or DH was performed by phenotypic analysis and the use of microsatellite
molecular markers (SSR). The inductor of haploidy KHI presented the best
performance in the induction of genotyping haploids of maize. The methods of
chromosome duplication had low efficiency, requiring thus of optimizing protocols.
The used of microsatellite molecular markers shown to be efficient to identify the
haploids plants or DH, supporting phenotypic selection.

Key words: Zea mays (L.), double haploids, genetic improvement.

xii
 1. INTRODUÇÃO

A indução de haplóides seguida da diploidização cromossômica tem sido

uma importante estratégia para a obtenção de linhagens em programas de
melhoramento comercial de milho. Esta técnica consiste na obtenção de haplóides
de milho por meio do cruzamento de um híbrido de interesse com um indutor de
haploidia realizando-se em seguida a duplicação destes haplóides, para a obtenção
dos duplo-haplóides. O resultado esperado permite reduzir o tempo e custo de
obtenção de linhagens, melhorando, assim, a eficiência na produção de híbridos.
Quando se utiliza o processo tradicional, mesmo após seis a oito gerações de
autofecundação, ainda persistem locos em heterozigose.
Analogamente aos procedimentos adotados no sistema tradicional de
autofecundações manuais, o processo de obtenção de linhagens DH também
envolve uma etapa de seleção dos melhores genótipos. No entanto, essa seleção é
realizada em uma etapa posterior, após a obtenção e duplicação do indivíduo
haplóide. Por prescindir da necessidade de realização de autofecundações
sucessivas, no sistema DH, é possível avaliar um número bem maior de plantas.
Os marcadores moleculares representam uma ferramenta utilizada para
auxiliar a seleção fenotípica de plantas haplóides/DH. Eles contribuem para
identificação de plantas haploides/DH, minimizando, assim, a seleção de falso-
positivos.
A implantação de uma rotina de produção de linhagens duplo-haplóides em
programas de melhoramento de milho depende do estabelecimento de protocolos
eficientes.
Este trabalho foi realizado com os objetivos de avaliar a eficiência da
obtenção de linhagens duplo-haplóides de milho, utilizando dois indutores e cinco
métodos de duplicação cromossômica, assim como identificar marcadores SSR para
auxiliar a seleção fenotípica de plantas haplóides ou DH.

1
 2. REVISÃO DE LITERATURA

O milho é uma das principais culturas agrícolas do Brasil. Na safra 2011/12,

a área cultivada com milho no Brasil (primeira e segunda safra) deve chegar a 14,7
milhões de hectares e a produção deve chegar a 60,3 milhões de toneladas.

2.1. Biologia floral do milho

O milho (Zea mays L. spp mays) pertence à família Poaceae, também

conhecida como gramineae, com a subfamília Panicoideae, tribo Maydeae, gênero
Zea e espécie Zea mays. É uma espécie diplóide, com 2n = 20 cromossomos.
Classificada como espécie alógama, possui taxa de autofecundação inferior a 5%. O
vento é o principal agente de polinização (Marcos Filho, 2005).
O milho é uma planta monóica, isto é, apresenta os órgãos masculinos e
femininos separados, porém na mesma planta. Pendão ou flecha é o nome dado à
inflorescência masculina. O pendão se desenvolve no interior do colmo, até o
momento em que surge na extremidade da planta, momento considerado como o
início do florescimento e a sua formação ocorre por diferenciação do meristema
apical, que se inicia poucos dias após a emergência (Marcos Filho, 2005).
A inflorescência masculina consiste numa panícula. De um eixo central,
denominado ráquis, surgem várias ramificações laterais. Ao longo das ramificações,
estão localizadas as espiguetas, dispostas aos pares, sendo uma séssil e a outra
pedicelada. Os pares de espiguetas estão arranjados alternadamente. As espiguetas
possuem um par de brácteas protetoras chamadas glumas, em forma de bainha,
envolvendo duas pequenas flores. Cada flor é composta de lema e pálea, as quais
envolvem três estames, duas lodículas e um pistilo abortado (Viana et al., 1999;
McSteen et al., 2000).
A partir da diferenciação do estame, a sua extremidade superior dá origem à
antera. Nas anteras, estão presentes as células especializadas, denominadas
microsporócitos, e os grãos de pólen são produzidos por diferenciação a partir
destas células. Esses microsporócitos surgem a partir de inúmeras divisões
mitóticas da célula-mãe do grão de pólen e sofrem divisões meióticas, para dar
origem aos micrósporos (Viana et al, 1999).

2
 Após a abertura das espiguetas, na antese, as anteras sofrem ruptura de
uma de suas extremidades, a fim de permitir a saída dos grãos de pólen. A duração
total da floração de um pendão em um campo de milho pode variar de 10 a 20 dias.
Temperaturas elevadas podem encurtar estes períodos, enquanto temperaturas
mais amenas podem prolongá-los (Goodman e Smith, 1987). Em um pendão,
existem milhares de anteras. Cada antera produz, em média, 400 grãos de pólen e
cada planta produz milhões de grãos de pólen, o que possibilita uma enorme
eficiência do processo de polinização. Os grãos de pólen são transportados,
predominantemente, pelo vento, possibilitando a polinização cruzada (Luna et al.,
2001; Ramalho e Silva, 2004).
A inflorescência feminina, denominada espiga, ocorre por diferenciação das
gemas existentes nas axilas foliares do colmo. É constituída de palhas, sabugo e
flores femininas. A palha envolve firmemente a inflorescência, de modo que cada
bainha foliar é originada de um único nó. À medida que as bainhas surgem, uma se
sobrepõe à outra (Viana et al., 1999). O sabugo é um eixo ao longo do qual se
encontram reentrâncias ou alvéolos, nos quais se desenvolvem as espiguetas. Estas
estão dispostas aos pares, formando um espiral em torno do sabugo, o que faz com
que o número de fileiras de grãos presentes na espiga normalmente seja um número
par. A flor é parcialmente envolvida pela lema e pela pálea, apresentando um pistilo
funcional com ovário basal único e estilo longo.
O estilete se caracteriza por ser um filamento de conexão entre o estigma e
o ovário. O ovário situa-se na parte basal da flor, aderido ao sabugo, e é constituído
pela parede do ovário e do óvulo. O óvulo, por sua vez, tem na sua constituição, o
funículo, integumentos, micrópila, nucela e saco embrionário (Dumas e Mongensen,
1993).
O conjunto formado pelo estilo e estigma é denominado de cabelo ou barba
da espiga e fornece umidade aos grãos de pólen capturados, os quais germinam e
emitem o tubo polínico por meio de um poro germinativo. O estilo-estigma tem
tamanho variável, podendo atingir até 45 cm de comprimento (Mercer, 2001).
Os estilos e estigmas permanecem receptivos logo após a sua emergência
até por volta de 14 dias, dependendo das condições climáticas. Apenas a flor
superior de cada espigueta é funcional, pois a inferior geralmente encontra-se
atrofiada. A fecundação de todas as flores da espiga só será verificada se a
polinização for efetuada entre o sétimo e nono dia, aproximadamente. Quando não

3
fecundados, os estilos-estigmas começam a secar a partir da extremidade após o
período de alongamento (Cárcova et al., 2003).

2.2. Polinização e fertilização

Com o surgimento das inflorescências, inicia-se o processo de polinização e

fertilização, ocorrendo a liberação do pólen pelas inflorescências masculinas. O
pólen é carregado pelo vento até atingir o estilo-estigma de outra planta. A
polinização cruzada no milho é favorecida, pois a deiscência e dispersão do pólen
ocorrem aproximadamente de 2 a 3 dias, depende do genótipo, antes da
emergência do estilo-estigma, ocorrendo, portanto, o fenômeno da protandria. Pode
ocorrer autopolinização, desde que coincida o período de emergência do pólen com
a receptividade do estilo-estigmas. Embora a dispersão do pólen possa ocorrer por
até 14 dias em situação favoráveis, usualmente, ocorre por 5 a 8 dias (Viana et al.,
1999). O tempo necessário desde a polinização até a fertilização depende de fatores
como umidade, temperatura e constituição genética da planta (Goodman e Smith,
1987).
A liberação do pólen pode começar desde o nascer do sol até o meio-dia e é
usual que se complete com 4 a 5 horas. Quando as condições são muito favoráveis,
o pólen é viável no máximo por vinte e quatro horas, sendo que o clima seco e
quente causa uma redução na sua viabilidade (Bignotto, 2002).
A germinação do grão de pólen consiste na emissão do tubo polínico. O grão
de pólen adere aos estigmas por uma substância viscosa, ou citoplasma, com três
núcleos posicionados na sua extremidade. Um desses, chamado vegetativo, é
responsável pelo funcionamento da ponta apical, os outros dois núcleos,
denominados generativos, somente entram em ação no processo de fertilização
(Chang e Neuffer, 1992).
Ao aderir aos estigmas, o pólen penetra no interior do mesmo e atinge o
estilete, percorrendo toda a sua extensão até atingir a micrópila, no óvulo. No
decorrer desse processo, o tubo polínico, formado pela germinação do grão de
pólen, continua seu crescimento até penetrar no saco embrionário, onde sua
extremidade é rompida, liberando os dois núcleos generativos ou espermáticos. Um
dos núcleos espermáticos funde-se à oosfera para formar o zigoto, restaurando,
desse modo, o número diplóide de cromossomos próprio das células somáticas da

4
espécie (2n=20). O outro núcleo espermático funde-se aos dois núcleos polares de
tal modo que, posteriormente, essa estrutura triplóide forma o endosperma (Veit et
al., 1993).
A dupla fertilização resulta na formação do zigoto e do endosperma. O zigoto
origina o embrião híbrido, que contém 50% da informação dos cromossomos de
origem paterna e 50% de origem materna. Já no endosperma, 66,66% dos
cromossomos são de origem materna e apenas 33,33%, paterna (Veit et al., 1993).

2.3. Maturação e constituintes da semente

A semente de milho é um fruto tipo cariopse que apresenta como

característica a presença de uma única semente presa ao pericarpo em toda a sua
extensão (Smith et al., 2004). Logo após a fertilização, inicia-se a fase de
enchimento de grãos, desenvolvendo-se assim os componentes dos grãos, como
pericarpo, embrião e endosperma (Mercer, 2001). O desenvolvimento da semente
se completa cerca de 50 dias após a fertilização (Paterniani e Miranda Filho, 1987),
que ocorre entre 12 e 36 horas após a polinização (Chang e Neuffer, 1992).
Antes de se transformar em embrião, o zigoto sofre divisões celulares em
um processo de diferenciação, formando-se primeiro o pré-embrião, com forma e
características próprias da espécie, continuando seu crescimento e desenvolvimento
até a maturação completa da semente. A formação do endosperma ocorre
anteriormente e com maior rapidez, em relação à do embrião (Mercer, 2001).
Assim que ocorre a dupla fertilização, a estrutura celular formada na fusão
dos três núcleos primários do endosperma sofre inúmeros ciclos de divisão, fazendo
com que se amplie o número de núcleos livres, sem citocinese. Este processo ocorre
na região periférica da célula original (óvulo). Posteriormente, ocorre a citocinese,
quando os núcleos livres migram para diferentes regiões por meio de um grande
vacúolo central, até que o endosperma passe a ser constituído de inúmeras células
mononucleares (Guimarães, 1997; Lopes e Larkins, 1993).
As condições ambientais interferem nas fases de desenvolvimento da
semente, cuja duração total alcança aproximadamente 50 dias. Durante esse
período, o ovário aumenta o seu peso em mais de 1.400 vezes, provavelmente por
estar ocorrendo uma intensa atividade metabólica e divisão celular. A maximização
de acúmulo de matéria seca é visualmente perceptível quando surge a “camada de

5
abscisão” ou “camada preta”, indicando que o grão se encontra completamente
formado, atingindo a maturidade fisiológica (Vieira et al., 1995).
A camada externa da semente é o pericarpo, que deriva da parede do ovário
e pode ser incolor, vermelho, marrom, laranja ou variegado (Paterniani e Miranda
Filho, 1987).
A ponta da semente é a parte remanescente do tecido que conecta a
semente ao sabugo e permite uma rápida absorção de umidade. Dentro da semente,
está o endosperma e o embrião, sendo o endosperma responsável por
aproximadamente 85% do peso total do grão, o embrião 10% e o pericarpo 5%
(Kiesselbach, 1949).
O embrião é proveniente do crescimento e diferenciação do zigoto. Está
posicionado em uma depressão da face superior do endosperma perto da base da
semente. Nele se encontram as estruturas que originarão uma nova planta e que
serão ativadas quando esta for colocada em condições favoráveis à germinação
(Paterniani e Filho 1987). O embrião é constituído por um eixo embrionário e pelo
cotilédone. O eixo embrionário é constituído por várias estruturas: a plúmula ou
epicótilo, que se situa na extremidade superior, e origina as primeiras folhas. A
plúmula é envolta por uma bainha protetora chamada coleóptilo. Na extremidade
inferior, encontra-se a radícula, da qual serão originadas as raízes, inicialmente
envoltas por uma bainha chamada de coleorriza (Mercer, 2001).
O endosperma é triplóide, originado da fusão de dois núcleos femininos e
um núcleo masculino. Com exceção da(s) sua(s) camada(s) mais externa(s)
constituída(s) por uma ou algumas camadas de células de aleurona, o endosperma
é constituído principalmente de amido e pode apresentar cor branca, amarela ou
laranja (Brieger e Blumenschein, 1966).
As sementes de milho mantêm um alto nível de viabilidade (95-100%) por
até 6 anos em condições secas e frias. A redução do teor de umidade para menos
de 12% permite que a semente mantenha a viabilidade enquanto congelada
(Purseglove, 1972).

2.4. Melhoramento do milho

Várias metodologias são empregadas no melhoramento genético da cultura

do milho, tais como, seleção recorrente, retrocruzamento, produção de linhagens por

6
autofecundação e a utilização de duplo-haplóides para futura produção de híbridos
(Barbosa, 2009).
Existem diferentes fatores que interferem direta ou indiretamente no
progresso a ser obtido por seleção, merecendo destaque a intensidade de seleção,
as propriedades genéticas da população e as condições de ambiente (Paterniani e
Filho, 1987).
No Brasil, as pesquisas de melhoramento genético de milho iniciaram em
1932. O lançamento do primeiro híbrido duplo ocorreu em 1946 e o surgimento do
primeiro híbrido simples, em 1952. A tecnologia do milho híbrido explora a heterose
ou o vigor híbrido, oriunda do cruzamento de duas ou mais linhagens homozigotas.
Estas linhagens são obtidas após 6-7 gerações de autofecundação (Fancelli, 1994).
Nos últimos anos, o Brasil lidera os investimentos no desenvolvimento de
híbridos de milho tropical. É um mercado altamente competitivo. O milho híbrido
ocupa lugar de destaque entre as contribuições da ciência para a sociedade e tem
sido responsável por expressivos aumentos na produtividade dessa importante
cultura em todo o mundo (Barbosa, 2009).
A superioridade dos genótipos heterozigotos em relação aos demais foi
descoberta na cultura do milho no início do século XX. A partir de então, vários
estudos foram conduzidos, viabilizando a produção e a utilização comercial de
sementes híbridas. O sucesso dos programas de melhoramento de milho depende
do desenvolvimento de linhagens. Essas linhagens representam uma fonte
fundamental para os estudos em genética e melhoramento. Além de seu uso
extensivo na produção de híbridos, as linhagens são importantes nos estudos de
diversidade genética e desenvolvimento de mapas de ligação (Hallauer, 1990).
As considerações acima permitem concluir que a obtenção de linhagens a
serem utilizadas na obtenção de híbridos com alto desempenho produtivo,
representa uma das principais metas do melhoramento de milho (Miranda Filho e
Viégas, 1987).

2.5. Haplóides e duplo-haplóides

Uma planta haplóide tem somente metade do patrimônio genético, sendo,

portanto, estéril. A duplicação de seu número cromossômico de maneira
espontânea, ou induzida pela aplicação de colchicina, recupera a condição diplóide

7
e restaura a fertilidade. Esta planta, chamada duplo-haplóide, será totalmente
homozigota, uma vez que cada cromossomo terá sua cópia exata. Uma planta ou
semente obtida a partir de uma planta DH autopolinizada pode ser denominada
como planta duplo-haplóide. Uma planta é considerada DH se ela for fértil, mesmo
que toda a parte vegetativa da planta não consista das células com o grupo
duplicado de cromossomos. Por exemplo, uma planta será considerada uma planta
DH se contiver gametas viáveis, mesmo se for quimérica (Moraes-Fernandes, 1990).
A técnica de obtenção de linhagens DH de milho tem sido estudada
principalmente para reduzir o tempo na síntese de linhagens, nos programas de
melhoramento de milho. Além disso, a técnica requer menor área experimental nos
campos de melhoramento, resultando em economia de recursos da empresa
(Milach, 2007).
Segundo Strahwald e Geiger, 1988, a tecnologia permite que o melhorista
realize o testcross com linhagens homozigotas em vez de fazê-lo utilizando material
que ainda apresenta segregação.

2.5.1. Sementes haplóides: formação e identificação

Sementes haplóides maternais de milho são obtidas por meio de indução in

vivo, utilizando-se como polinizador uma linhagem com deficiência em um dos
núcleos polínicos. Obtêm-se, assim, uma semente com endosperma triplóide e
embrião haplóide.
O mecanismo molecular de indução de haplóides não foi totalmente
compreendido. No entanto, há indícios de que, em linhas haplóides, dois conjuntos
espermáticos sejam desenvolvidos com diferentes velocidades (Bylich e Chalyk,
1996). Como resultado, um dos espermas se desenvolve em um estágio pronto para
a fertilização, mas o outro não. A existência de somente um esperma normal em um
grão de pólen pode ser a razão para a quebra de fertilização dupla e o
desenvolvimento de grãos haplóides (Enaleeva e Tyrnov, 1996).
Os haplóides em milho ocorrem naturalmente a uma taxa aproximada de um
para cada mil sementes formadas (Chase, 1965). Contudo, algumas técnicas podem
ser utilizadas para aumentar essa frequência. Um desses métodos baseia-se no uso
de linhagens indutoras, que podem gerar haplóides maternos ou paternos,
dependendo do tipo de linhagem indutora empregada e do cruzamento empregado.

8
As plantas/sementes são posteriormente tratadas com agentes que duplicam o
genoma, como a colchicina, obtendo-se, em apenas uma geração, indivíduos
totalmente homozigotos (Barbosa, 2009).

2.5.2. Histórico do emprego dos duplo-haplóides

Segundo Belicuas (2007), a primeira ocorrência natural de haplóides foi

verificada em 1922, na espécie Datura stramonium, seguida por Nicotiana tabacum
(1924) e Triticum compactum (1926).
Conforme Belicuas (2007), os primeiros protocolos para a produção de
plantas haplóides em laboratório através de cultura de anteras foram desenvolvidos
entre 1964 e 1966. Na década de 1970 houve a conversão de haplóides estéreis (H)
em duplo-haplóides (DH). O lançamento da primeira cultivar utilizando DH foi em
Maris haplona de canola (1974).
Outra ocorrência de produção de haplóides foi desenvolvida por Kasha e Kao,
também na década de 1970, em cevada via hibridação com o método bulbosum. No
referido trabalho, o progenitor masculino foi Hordeum bulbosum, uma espécie de
cevada geralmente estéril e relativamente próxima à cevada cultivada. Neste caso
os haplóides são obtidos pela eliminação dos cromossomos de H. bulbosum.
Merecem ainda destaque os cruzamentos intergenéricos de trigo com milho,
utilizados para a produção de haplóides de trigo, seguindo o mesmo mecanismo.
Nos anos que seguem a década de 1980, diversos protocolos e inovações
tecnológicas para a obtenção de linhagens DH em mais de 200 espécies vegetais
foram divulgados (Forster et al., 2007). Contudo, somente nos últimos vinte anos sua
utilização se mostrou viável na produção de sementes melhoradas (Pierre, 2011).
DH também são utilizados na recuperação da fertilidade do híbrido entre
milheto e capim-elefante (Abreu, 2006).
A primeira planta haplóide de milho foi descrita por Stadler e Randolph, em
1929 (Röber et al., 2005). Chase (1952) foi pioneiro em propor o emprego de
haplóides de milho com o intuito de acelerar a obtenção de linhagens. O autor
identificou haplóides naturais e duplicou seu número cromossômico, para a
obtenção de DH.
Atualmente, a produção de linhagens DH in vivo por meio de indutores
gimnogenéticos é apontada como uma técnica de sucesso na cultura do milho,

9
independentemente do genótipo (Lashermes e Beckert, 1988; Chalyk, 1994;
Deimling, 1997; Bordes, 1997).

2.5.3. Obtenção de haplóides gimnogenéticos através da indução in vivo

Em um processo de autofecundação normal em espécies diplóides,

considerando apenas dois pares de locos independentes e segregando entre os
genitores (AAbb) e (aaBB), o genótipo recessivo aabb tem a probabilidade de ser
encontrado na proporção de ¹/16 em uma população F2. Porém, na indução de
haploidia, será de ¼ a probabilidade de ocorrência desse mesmo genótipo dentro da
população. Isso acontece devido à ausência dos heterozigotos, observando apenas
quatro genótipos homozigotos (AABB, AAbb, aaBB e aabb). Assim, com a obtenção
de linhagens, a variância aditiva é maximizada, os efeitos de dominância são
neutralizados e as vantagens na seleção de características quantitativas podem ser
superiores, uma vez que é realizada somente com base na aditividade, não havendo
a interferência dos efeitos de dominância e epistasia (Pinto, 2009).
A indução in vivo baseia-se na utilização de linhagens ou sintéticos indutores,
podendo gerar haplóides de origem materna (gimnogenéticas), como também de
origem paterna (androgenéticas). O desenvolvimento de uma variedade nomeada
como Stock 6 por Coe (1959), que autofecundada produzia frequência de haplóides
de 3,2%, abriu possibilidades do uso de polinizadores seletivos para aumentar a
frequência de haplóides. Assim, variedades indutoras de haploidia foram
desenvolvidas a partir desta variedade. Entretanto, o uso de duplo haplóides
continuou restrito pela dificuldade de geração de linhagens a partir destes haplóides
(Chase, 1969). A maioria das linhagens e dos sintéticos indutores de haploidia são
derivadas da linhagem temperada Stock 6, que gera haplóides de origem materna,
gimnogenéticos (Coe, 1959). A exemplo disso, tem-se o sintético indutor KHI. O
mecanismo de indução de haploidia dessa linhagem, Stock 6, não é bem conhecido
(Rotarenco et al., 2009). Acredita-se que os haplóides resultem de uma falha na
fertilização, devida ao gameta masculino ou feminino. Não ocorrendo a fertilização,
por um mecanismo também não elucidado, a oosfera cresce e se diferencia em um
“embrião” haplóide (Sarkar e Coe, 1966).
Outra linhagem indutora, também de clima temperado, denominada
Wisconsin-23 (W23), gera haplóides tanto de origem paterna, ou seja,

10
androgenéticos (Kermicle, 1969) como também haplóides de origem materna,
gimnogenéticos (Alekcevetch, 2011).
Incluem-se ainda como linhagens indutoras de haploidia para milho a MHI e
M741H, que produzem haplóides de origem materna (Eder et al, 2002), e os
indutores RWS (Roeber e Geiger, 2005), KEMS (Deimling e Geiger, 1997), KMS e
ZMS (Chalyk, 1994).
Na literatura estudada, não foi observado a presença do sintético indutor de
haploidia KHI como foco de pesquisa.
Para facilitar a identificação de sementes ou plantas haplóides/DH, fazendo
com que ocorra assim um melhor êxito na seleção fenotípica das plantas de
interesse, pode-se utilizar o marcador morfológico dominante do sistema R-navajo
(R1-nj), presente no loco R do cromossomo 10. Com este tipo de seleção ocorre,
portanto, a diminuição do número de indivíduos diplóides, os quais não são de
interesse.
O sistema desenvolvido por Nanda e Chase (1966) utiliza um parental
masculino denominado “Purple embryo Marker” ou “PEM, com a presença do gene
R1-nj, caracterizado por promover a pigmentação com antocianina no endosperma e
no embrião nas sementes diploides (Figura 1). Nas sementes haplóides, a
pigmentação está presente somente no endosperma, ficando com o embrião branco,
natural de sementes de milho (Nanda e Chase, 1966).
É importante ressaltar que o gene R1-nj apresenta algumas limitações, como
a dificuldade de isolamento de alguns genótipos haplóides, causada pela presença
de genes dominantes existentes no milho, C1-I, C2-Idf e In1-ID, que inibem a síntese
de antocianina (Figura 2) (Coe Junior, 1994).
Para que um marcador de antocianina funcione em milho, a ação de vários
alelos precisa ser considerada. A produção de pigmentos de antocianina em tecidos
de milho inclui os produtos de genes estruturais e reguladores. Genes estruturais,
tais como A1, A2, Bz1, Bz2 e C1, codificam as enzimas biossintéticas da via
metabólica. Os genes reguladores de antocianina encaixam-se em duas classes de
fatores de transcrição, C1/Pl1 e R1/B1, os quais interagem para ativar a transcrição
dos genes estruturais. Mais especificamente, a expressão de antocianina no grão
requer um alelo determinador de coloração no loco C1, tal como C1 ou C1-S (Cone
et al., 1986).

11
 O C1-S é dominante ao alelo C1 de tipo selvagem e apresenta pigmentação
intensificada (Cone et al., 1986). A expressão de C1, ao contrário, é dependente do
gene Vp1, que codifica um fator de transcrição que está envolvido na expressão de
genes durante a germinação de sementes. A especificidade da expressão de C1 em
grãos ocorre porque a expressão de Vp1 é limitada ao endosperma (aleurona) e
embrião (Hattori et al., 1992).
Um alelo, para ser útil no rastreamento haplóide/diplóide, deve conferir
coloração em ambos, endosperma (aleurona) e embrião. Coe et al. (1988) listaram
três tipos de alelos que conferem coloração em ambos, o R1-nj, R-scm e B-peru. O
R1-nj é o mais comumente usado para rastreamento haplóide/diplóide de sementes
maduras (Nanda e Chase, 1966).
Estudos demonstraram a possibilidade de aumentar a taxa de indução de
haploidia, utilizando linhagens indutoras de clima temperado que chegam a produzir
até 10% a 12% de haplóides, porém, com grande variação de acordo com o
genótipo empregado (Shatskaya et al., 1994). Após a obtenção e identificação das
mesmas, faz-se então a diploidização cromossômica (Milack, 2007).
O indutor de haploidia de origem de clima temperado, linhagem W23, produz
de 1% a 3% de grãos haplóides, o que teoricamente resulta em 2 a 6 haplóides
numa espiga contendo 200 grãos (Kermicle, 1969).
Lashermes e Beckert (1988) utilizaram marcadores fenotípicos para
identificar haplóides, mais especificamente os genes da ausência de lígula e glossy
(lg1, lg2 e gl1). Dependendo do genótipo, verificaram uma variação de 0,4 a 2,4% na
frequência de indução. Além disto, desenvolveram novas linhagens indutoras.
Produziram e avaliaram 29 linhagens e híbridos de linhagens indutoras com Stock 6.
Os autores observaram uma alta correlação entre as capacidades de indução das
gerações F2 e F3.
Chalyk (1994) avaliou plantas haplóides obtidas por meio do cruzamento com
um indutor ZMS durante dois anos (604 plantas no primeiro ano e em 1030 plantas
no segundo). Estimou a fertilidade de plantas haplóides, ou seja, a frequência de
duplo-haplóides espontâneos, e concluiu que a maioria das plantas haplóides é
macho estéril. Por outro lado, encontrou uma taxa de diploidização espontânea
variando entre 3,3 e 3,6%.

12
2.5.4. Duplicação cromossômica

Após a identificação de plantas haplóides, é necessário duplicar o número de

cromossomos, para a obtenção de plantas DH. Para isso, alguns métodos foram
desenvolvidos e consistem basicamente em emergir a plântula, ou semente ou até
mesmo injetar uma quantidade ideal de inibidores mitóticos como colchicina,
agentes antimicrotúbulos ou herbicidas antimicrotúbulos, pronamida, óxido nitroso,
carbanatos, benzamidas, ácidos benzóicos, entre outros nas plantas de interesse
(Deimling et al., 1997).
Outros agentes podem ser usados juntamente com os inibidores mitóticos
para melhorar a eficiência de duplicação. Estes agentes podem ser: dimetilsulfóxido
DMSO), adjuvantes, surfactantes e similares.
O agente antimitótico colchicina (C22H25N) é um alcalóide extraído de semente
e bulbos de uma liliácea (Colchicum autumnale). Atua no final da prófase mitótica,
inibindo a formação do fuso mitótico ou levando à formação de um fuso abortivo pela
precipitação das proteínas constituintes nas fibras do mesmo. Conseqüentemente, a
colchicina evita a migração dos cromossomos para os pólos da célula, formando
assim células com o número cromossômico duplicado (Jackson, 1976).
Segundo Deimling et al. (1997), a colchicina é um agente antimitótico, que atua
na organização das fibras do fuso durante a metáfase celular, impedindo a sua
formação e a consequente disjunção dos cromossomos filhos, resultando na
duplicação dos cromossomos. Estes autores conseguiram uma taxa de 67% de
plântulas com a fertilidade restaurada após o processo de duplicação de
cromossomos com colchicina.
Os trabalhos relacionados à indução de duplicação cromossômica, em milho,
são escassos na literatura e os protocolos relatados, ao serem testados, não
possibilitam alcançar os resultados esperados (Pierre, 2011).

2.5.5. Importância dos duplo-haplóides

A tecnologia de duplicação cromossômica de haplóides pode ser utilizada

para aumentar a eficiência de seleção, pois aumenta a variabilidade genética entre
famílias e diminui a discrepância residual, isto devido a fatores ambientais (Bordes et
al., 2007). E, ainda, segundo Chase et al. (1965), as linhagens provenientes de
culturas duplo-haplóides tendem a ter uma menor variância (causada por mutações)
13
do que linhagens desenvolvidas por métodos convencionais. É importante ressaltar
que os efeitos de dominância são neutralizados, trazendo vantagens na
manipulação de caracteres quantitativos, uma vez que a seleção é realizada
somente com base na aditividade, não havendo interferência dos efeitos de
dominância e epistasia.
Alguns pesquisadores argumentam que o processo drástico de endogamia,
aliado à ausência de seleção durante o processo provocado pelo uso da técnica de
D.H, reduz as chances de recombinações maiores em populações D.H quando
comparadas com populações convencionais (Barbosa, 2009). Os maiores “blocos de
ligação” seriam caracterizados por maiores valores de desequilíbrio de ligação entre
os locos.
Barbosa (2009) analisou dados de desequilíbrio de ligação nos cromossomos
de linhagens DH e linhagens convencionais (obtidas por autofecundação) e
constatou que os valores de DL nas linhagens D.H foram em geral mais altos que
nas convencionais. Estes resultados indicam que, para a obtenção de linhagens
D.H, a segregação/recombinação ocorre em blocos maiores, quando comparado
com as linhagens convencionais, e isso resulta em maior número de genes em
desequilíbrio de ligação.
Linhagens D.H podem herdar blocos gênicos inteiros sem ter ocorrido
recombinação, sugerindo que, no processo de obtenção de linhagens D.H, é mais
viável utilizar populações F2 do que F1, pois há maior probabilidade de ocorrência de
recombinações (Bernardo, 2003).

2.6. Utilização de marcadores SSR na seleção de haplóides e DH

A análise molecular da variabilidade do DNA permite determinar pontos de

referência nos cromossomos das espécies em estudo. Esses pontos são chamados
de marcadores moleculares (Pinto, 2009).
A partir década de 1990, foi obtido enorme e rápido progresso nas técnicas de
marcadores moleculares. Estas ferramentas são importantes por apresentarem
grande quantidade de polimorfismo, não sendo afetadas por variações ambientais
nem pelo estádio fenológico de desenvolvimento da planta.
Os marcadores podem ser classificados em dois grupos, conforme a
metodologia utilizada para identificá-los. Grupo 1 são aqueles obtidos por hibridação,

14
exemplos: marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e os
marcadores minissatélites, também conhecidos como VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats). Os marcadores pertencentes ao grupo 2 são obtidos por
amplificação de DNA, incluem-se, neste grupo, marcadores RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions),
STS (Sequence Tagged Sites), SSR (Simple Sequence Repeats, também
denominados microssatélites) e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
(Pinto, 2009).
Entre os marcadores moleculares inclusos no grupo 2, destacam-se os SSR
ou microssatélites. Os marcadores baseados em microssatélites estão sendo
desenvolvidos para aplicações de mapeamento genético em culturas de grande
expressão, tais como soja, arroz, milho e trigo. Tendo em vista a sua expressão co-
dominante e o seu multialelismo, possuem um grande conteúdo de informação de
polimorfismo (Pinto, 2009).
De acordo com Wrigley e Batey (1995), a eficiência de um marcador decorre
de pelo menos seis atributos: (a) não ser afetado pelo ambiente e pelo estádio de
desenvolvimento das plantas; (b) permitir alto grau de discriminação entre genótipos
e baixo dentro do genótipo; (c) compreender métodos rápidos e fáceis de execução;
(d) não estar sujeito à variação entre laboratórios; (e) apresentar ligação com
informações sobre caracteres qualitativos; e (f) possibilitar a utilização de testes
estatísticos objetivos para detectar misturas e o coeficiente de similaridade entre
genótipos.
Em virtude de atenderem a todos esses requisitos, numerosos microssatélites
foram desenvolvidos para milho e são hoje amplamente utilizados nessa cultura
(Sibov et al., 2003).
As vantagens oferecidas pelos marcadores moleculares, em relação aos
marcadores morfológicos, justificam o seu uso cada vez mais intensivo como
ferramenta cotidiana em programas de melhoramento de milho (Pinto, 2009).
A utilização dos marcadores moleculares como apoio na identificação de
indivíduos haplóides/duplo-haplóides tem sido demonstrada em estudos sobre o
assunto (Silva, 2009; Alekcevetch, 2010, Barbosa, 2009), uma vez que, na avaliação
fenotípica, observam-se algumas falhas na seleção de sementes ou plantas
haplóides e duplo-haplóides.

15
 3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Local

A pesquisa foi desenvolvida na Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola –

Coodetec, em Cascavel/PR e Palotina/PR.

3.2. Indução de haploidia

Foram utilizados dois indutores de haploidia: Stock 6 e KHI. O indutor Stock 6

foi utilizado para polinizar 18 populações F1 e o indutor KHI foi utilizado para
polinizar outras 18 populações F1. Essas populações foram identificadas de P1 a
P36.
Para a indução de haploidia foram cultivados lotes isolados de milho,
contendo as linhagens indutoras como polinizadores e as populações F1 como
fêmeas. Os lotes foram isolados de outros cultivos de milho por pelo menos 100 m
para evitar contaminação com pólen externo. Cada lote isolado foi composto por
oito fileiras de cinco metros de comprimento, sendo duas fileiras referentes às
populações intercaladas com duas linhas do indutor. As populações F1 foram
semeadas todas em uma única época e as fileiras dos indutores semeadas em
quatro épocas diferentes, uma fileira por semana, sendo a primeira semeadura na
mesma época da semeadura das populações F1. Foi conduzido um lote isolado
para cada indutor.
No momento da floração, as plantas das populações foram despendoadas,
para que fossem polinizadas pelos indutores. Uma vez que os indutores produzem
pouco pólen, a polinização foi auxiliada, transferido-se manualmente o pólen para os
estigmas das plantas F1.
Os lotes isolados foram conduzidos de acordo com as práticas
recomendadas para a cultura do milho.

3.3. Identificação das sementes potencialmente haplóides

Após a colheita das espigas obtidas dos cruzamentos, foi realizada a

contagem do número de sementes por espiga. As sementes selecionadas
visualmente foram classificadas em: a) sementes potencialmente haplóides

16
(presença de antocianina no endosperma e ausência no embrião); b) sementes
híbridas (presença de antocianina no endosperma e no embrião); c) contaminantes
(sementes que não apresentaram antocianina).
Após a identificação das sementes potencialmente haplóides, foram
selecionadas nove populações (seis cruzadas com o indutor Stock 6 e três cruzadas
com o indutor KHI). Aquelas populações que apresentaram maiores porcentagens
de sementes potencialmente haplóides induzidas e que apresentaram sementes
com boa qualidade (sem ataque de pragas, doenças e vigorosas), foram
selecionadas e suas sementes cultivadas, após dois meses do plantio as plantas
geradas foram avaliadas fenotipicamente e molecularmente como haplóides ou DH
(critérios de avaliação fenotípica item 3.5).

3.4. Métodos de duplicação cromossômica

As sementes potencialmente haplóides de nove populações foram

submetidas a cinco tratamentos para duplicação cromossômica.
As sementes potencialmente haplóides de cada população foram divididas
por cinco, para que cada tratamento tivesse o mesmo número de sementes de cada
população. Assim, 104 sementes potencialmente haplóides foram selecionadas das
populações P1 a P6 e 154 sementes potencialmente haplóides foram selecionadas
das populações P19, P20 e P21. As metodologias empregadas em cada tratamento
serão descritas a seguir:

3.4.1. Tratamento 1: testemunha

O método consistiu no plantio direto das sementes, sem aplicação de agente

químico para induzir a duplicação cromossômica. A semeadura foi realizada em
vasos, em casa de vegetação. O substrato em cada vaso foi constituído por uma
mistura de solo, areia e matéria orgânica, na proporção de 6:1:1.

3.4.2. Tratamento 2: imersão das sementes em solução de colchicina

Foi utilizado o método descrito por Gayen et al. (2010), com algumas
modificações. Inicialmente, 104 sementes potencialmente haplóides das seis
populações obtidas do indutor Stock 6 foram submetidas à desinfestação em álcool

17
70% durante 20 minutos, seguindo do mesmo tempo em hipoclorito de sódio
comercial 50%, acrescentando-se três gotas de tween 20. As sementes foram
lavadas três vezes com água destilada e autoclavada, ficando imersas por 48 horas.
Este procedimento também foi aplicado em 154 sementes de três populações
obtidas do indutor KHI. Após esse período, as sementes apresentavam-se
intumescidas, permitindo a realização de um corte no pericarpo e endocarpo, logo
acima do embrião (Figura 1), com a finalidade de aumentar a absorção da solução
de colchicina pelo embrião. As sementes foram imersas em solução de colchicina
0,06%, contendo 0,5% de dimetil sulfóxido (DMSO) por 15 horas. Completado este
período, as sementes foram lavadas três vezes em água corrente e semeadas em
vasos, em casa de vegetação, contendo, cada vaso, um substrato formado por uma
mistura de solo, areia e matéria orgânica, na proporção de 6:1:1.

Figura 1 - Corte realizado acima do embrião para melhor absorção da solução de

colchicina.

3.4.3. Tratamento 3: germinação em papel germitest

As sementes foram colocadas em papel germitest umedecido com colchicina

(concentração de 0,1%) e dimetil sulfóxido (0,5%). Foram utilizados 240 mL dessa
solução a cada quatro papéis germitest.
O conjunto foi acondicionado em um germinador com temperatura de 26o C.
Após quatro dias, as plântulas estabelecidas foram transplantadas para vasos
contendo uma mistura de solo, areia e matéria orgânica, na proporção de 6:1:1. A
seguir, os vasos foram colocados em casa de vegetação.

18
3.4.4. Tratamento 4: imersão das plântulas em colchicina

As sementes foram colocadas em papel germitest e acondicionadas em um

germinador a 26° C durante 3 dias. Quando o coleóptilo apresentava pelo menos 1
cm de comprimento, sua ponta foi excisada e as plântulas imersas por 12 horas em
solução de colchicina 0,06%, contendo 0,5% de DMSO (Deimling et al., 1997; Eder
e Chalyk, 2002). Essa etapa foi realizada à temperatura ambiente. Posteriormente,
as plântulas foram lavadas em água corrente por 20 minutos e em seguida
plantadas em vasos contendo uma mistura de solo, areia e matéria orgânica, na
proporção de 6:1:1. A seguir, os vasos foram colocados em casa de vegetação.

3.4.5. Tratamento 5: injeção de colchicina nas plantas

As sementes possivelmente haplóides foram semeadas em vasos, em casa

de vegetação, contendo uma mistura de solo, areia e matéria orgânica, na proporção
de 6:1:1. Quando as plantas encontravam-se no estádio V3, foi aplicado no ápice
das plantas uma solução de colchicina a 0,125% e 0,5% de DMSO (Zabirova,
1996).
Foram aplicados 2 ml da solução em cada planta, por meio da perfuração da
extremidade do colmo, utilizando-se um conjunto de seringa e agulha.

3.5. Caracterização fenotípica das plantas haplóides e DH

Todas as plantas estabelecidas após os tratamentos de duplicação

cromossômica foram identificadas individualmente após 2 meses do plantio. As
plantas foram caracterizadas como:
- híbridas: identificadas pelo alto vigor e produção de pólen (férteis). As
plantas híbridas provinientes do cruzamento com o indutor Stock 6 apresentam
coloração roxa no colmo e folhas.
- haplóides: identificadas pelo baixo vigor, ausência de pólen (estéris) e
coloração verde.
- duplo-haplóides: identificadas pelo vigor intermediário, férteis e coloração
verde.
Plantas caracterizadas fenotipicamente como haplóides ou duplo-haplóides e
que atingiram maturação fisiológica foram autofecundadas.

19
3.6. Identicação de plantas haplóides ou DH através de marcadores SSR

O processo de identicação de plantas haplóides ou DH através de

marcadores SSR iniciou com a extração de DNA das sementes dos parentais (nove
populações híbridas + linhagens indutoras Stock 6 e KHI), que deram origem às
plantas potencialmente haplóides.
Amostras de sementes das populações e dos indutores foram moídas e o
DNA extraído, utilizando o kit de extração Wizard Magnetic 96 DNA (Promega). Para
isso, 40mg das sementes de cada genitor foram acondicionados em microtubos.
Uma solução contendo 450 µl de Lysis Buffer A e uma esfera de vidro foi adicionada
em cada tubo, identificando-se cada tubo com o nome dos respectivos parentais. As
amostras foram agitadas no grinder por 2 minutos e em seguida centrifugadas a
5.000 rpm por 10 minutos. Foram transferidos 125 µl de cada amostra para uma
placa de 96 poços que vem junto com o kit, evitando-se contato com o pellet. Em
cada amostra, foram acrescentados 85 µl de uma solução contendo 12 µl de
Magnesil ressuspendida em 76,5 µl de Lysis Buffer B. A placa foi deixada em
temperatura ambiente por 5 minutos. Após este período, a placa foi colocada sobre
a estante magnética por 1 minuto. Em seguida, o líquido foi pipetado e descartado. A
placa foi retirada da estante magnética e, a seguir, foram adicionados 150 µl de
solução de lavagem em cada amostra (Wash Buffer), misturando por pipetagem por
10-15 segundos. Novamente foi colocada a placa sobre a estante magnética por 30
segundos, removendo posteriormente o líquido. Foram realizadas mais duas
lavagens, utilizando 100 µl de Wash Buffer. Após a última lavagem, colocou-se a
placa sobre a estante magnética e removeu-se a maior quantidade de líquido
possível. Após, a placa foi deixada para secar por 10 minutos em temperatura
ambiente.
Finalizando o processo de extração de DNA, a placa contendo as amostras
dos parentais foi removida da estante magnética, sendo adicionados 50 µl de TE. As
beats magnéticas foram ressuspendidas e as placas deixadas em temperatura
ambiente por 5 minutos. A placa foi então colocada novamente sobre a estante
magnética por 2 minutos e, por fim, o DNA purificado foi transferido para novos
microtubos identificados.

20
 O DNA de amostras de folhas de plantas potencialmente haplóides ou duplo-
haplóides foi extraído também de acordo com o protocolo descrito acima. A
quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose 0,8%.
Para as reações de PCR, utilizaram-se 30 ng de DNA, 3 mM de MgCl2, 2
mM de Tris, 5 mM de KCl, 250 µM de DNTP, 0,4 µM de cada primer (senso e
antisenso) e uma unidade de Taq DNA Polimerase, em um volume final de 20 µl.
As reações de PCR foram realizadas em um programa touchdown com 40
ciclos de amplificação. Este consistiu de quatro minutos iniciais para desnaturação a
94°C, seguido de 10 ciclos de 94°C por 20 segundos; 65°C por 20 segundos
(diminuindo-se 1oC a cada ciclo) e 72°C por 20 segundos e 30 ciclos a 94°C por 20
segundos; 55°C por 20 segundos e 75°C por 20 segundos. Por fim, foi realizada
uma etapa final de 72°C por 10 minutos. As amplificações foram realizadas em
termoclicador Veriti 96 (Applied Biosystems).
Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose 3%,
corados com brometo de etídio (0,5µg mL-1), utilizando-se tampão de corrida SB
0,5X. A visualização dos fragmentos foi feita em aparelho de fotodocumentação
Vilber Loumat (Marne-la-Vallee, França), sob luz ultravioleta.
Para identificar polimorfismos entre os genitores, 120 marcadores SSR
foram testados. Para a identificação de plantas haplóides ou duplo-haplóides, foram
utilizados primers com alelos em homozigose e polimórficos entre os parentais de
cada população.
No processo de caracterização dos indivíduos, as plantas potencialmente
haplóides ou duplo-haplóides, com genótipo heterozigoto para estes marcadores,
foram consideradas como híbridos entre a população F1 e o indutor de haploidia. As
plantas com genótipo homozigoto para estes marcadores foram consideradas como
haplóides ou duplo-haplóides.
As informações obtidas da análise molecular foram utilizadas para comparar
com a caracterização fenotípica.

21
 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Eficiência na indução de haploidia

Espigas geradas dos cruzamentos utilizando os indutores de haploidia e as

populações híbridas (fêmeas) apresentaram a expressão de antocianina em
algumas sementes, conferida pela presença do gene R1-nj (Figura 2-A). A inibição
da síntese da antocianina nas sementes pode ser devida à contaminação com pólen
externo ou influenciada pelo background genético do genitor feminino (Rabel, 2008)
(Figura 2-B).

A B
Figura 2 – A: Expressão de antocianina nas sementes. B: Sementes sem expressão
de antocianina.

A seleção fenotípica das sementes potencialmente haplóides pode

apresentar subjetividade, acarretando a contabilização de falso-positivos, pela
seleção de sementes haplóides que, quando cultivadas, foram caracterizadas como
híbridas. Assim, a visualização eficiente das sementes potencialmente haplóides
aumenta a eficiência da seleção e reduz com isso os custos de produção de DH.
Esta visualização eficiente decorre de processos que façam com que a pessoa que
está fazendo a seleção das sementes tenha um maior número de reais haploides
como resultado, isto pode ser, por exemplo, através de uma boa iluminação focada
na semente a ser visualizada.
A diferença da expressão de antocianina nas sementes pode ser visualizada
na Figura 3. Sementes que apresentaram algumas manchas roxas em seu

22
endosperma e embrião sem coloração foram classificadas como potencialmente
haplóides.

A B C
Figura 3 - A) semente híbrida, B) potencialmente haplóide e C) semente sem
expressão de antocianina - indutor Stock 6.

Com a seleção das sementes foi obtida a eficiência de cada indutor de

haploidia (Stock 6 e KHI) nas diferentes populações (Quadro 1).
A linhagem temperada, Stock 6 e o sintético também de clima temperado,
KHI, não apresentam uma alta produção de grãos, pois não são adaptadas ao clima
brasileiro. Por isso, ao invés do seu uso direto como indutoras de haploidia nos
programas de melhoramento de milho, pode ser em alguns casos, mais interessante
a realização de cruzamentos entre essas linhagens temperadas e híbridos
comerciais bem adaptados, para o desenvolvimento de linhagens tropicalizadas com
capacidade de indução de haploidia. Por outro lado, constatando a utilização de
materiais de indução de origem temperada, como o sintético KHI, verificou-se que
não houve necessidade em algumas situações de se fazer a tropicalização de
materiais indutores, já que este sintético desempenha um bom resultado de indução
de haplóides pois produz boa quantidade de pólen e não sofre com condições do
clima tropical.
As populações cruzadas com o indutor Stock 6 apresentaram 0,99% de
sementes potencialmente haploides. A população que alcançou elevado percentual
foi a P3 com 2,91% de sementes induzidas a haploidia. Para o indutor KHI, foram
obtidos 1,91% de sementes potencialmente haplóides, sendo a P19 com maior
número de sementes induzidas. O fato de as populações utilizadas na indução de

23
haploidia serem diferentes para os dois indutores pode ter influenciado no número
de sementes potencialmente haplóides obtidas.

Quadro 1 - Sementes potencialmente haplóides selecionadas em cada indutor

cruzado com as diferentes populações

Sementes
Total de Potencialmente
Indutor Populações potencialmente
sementes haplóides (%)
haplóides
P1 8908 144 1,61
P2 7108 99 1,39
P3 5074 148 2,91
P4 7848 69 0,87
P5 5661 33 0,58
P6 5407 53 0,98
P7 7590 38 0,50
P8 5351 6 0,11
P9 6165 42 0,68
P10 6113 12 0,20
Stock 6 P11 5275 19 0,36
P12 1344 7 0,52
P13 6875 16 0,23
P14 4364 10 0,23
P15 6185 11 0,18
P16 4231 21 0,50
P17 5267 6 0,11
P18 5264 4 0,08
Total 104030 1033 0,99
P19 4833 543 11,23
P20 5404 189 3,49
P21 4956 100 2,01
P22 5540 96 1,73
P23 3357 63 1,87
P24 4482 43 0,95
P25 2575 67 2,60
P26 5646 7 0,12
P27 3189 3 0,09
KHI
P28 6740 7 0,10
P29 7743 110 1,42
P30 6223 311 5,00
P31 7585 16 0,02
P32 2232 30 1,34
P33 5886 17 0,29
P34 4071 7 0,17
P35 1885 0 0,00
P36 1768 0 0,00
Total 84115 1609 1,91

24
 Para haver a confirmação do estado de haploidia por meio da análise
fenotípica, as sementes potencialmente haplóides selecionadas foram então
cultivadas e, como já mencionado, foi realizada após dois meses a avaliação
fenotípica das plantas potencialmente haplóides geradas, estas referentes às nove
populações selecionadas. Observou-se que as populações cruzadas com o indutor
KHI apresentaram maior número de plantas com características haplóides (Quadro
2), evidenciando a diferença na eficiência dos dois indutores utilizados.

Quadro 2 - Avaliação fenotípica das plantas potencialmente haplóides

Plantas Plantas Plantas

Indutor Populações potencialmente haplóides haplóides
haplóides germinadas selecionadas selecionadas (%)
P1 78 3 3,84
P2 58 5 8,62
P3 80 5 6,25
Stock 6
P4 35 3 8,57
P5 10 3 30,0
P6 35 2 5,71
P19 220 102 46,36
KHI P20 85 70 82,35
P21 18 10 55,55

O número de plantas selecionadas fenotipicamente como haplóides (Figura

4 e 5) foi menor que o número de sementes, devido à presença de falso-positivos. A
seleção baseada na expressão da antocianina no endosperma e sua ausência no
embrião é passível de erros, que podem ter ocorrido devido à inibição da expressão
da antocianina em alguns conjuntos genômicos. No entanto, é importante destacar
que o uso da antocianina é importante porque este marcador ajuda na pré seleção
de indivíduos haplóides, excluindo um grande número de sementes diplóides.
O marcador morfológico r-navajo, que confere a expressão da antocianina,
pode sofrer influência quando utilizados certos genomas, provocando variações na
coloração do endosperma e embrião ou, ainda, a inexistência da coloração (Silva,
2009).
A intensidade da expressão de antocionina contida nas sementes em cada
espiga (roxo mais forte e num grande número de sementes) também foi fator de
observação, já que primeiramente foram selecionadas as espigas com esta
característica de intensidade de coloração nas sementes. Estas espigas
apresentaram maior número de sementes potencialmente haplóides. Esta

25
observação pode ser levada em consideração ao se realizar a seleção dos melhores
genótipos maternos a serem empregados neste sistema de produção de DH, pois o
melhorista, ao utilizar espigas com intensidade de antocianina forte em suas
sementes, a exemplo deste caso, pode estar tendo vantagens quanto ao número de
sementes potencialmente haplóides obtidas.

Figura 4 - Diferença fenotípica entre planta híbrida e planta haplóide, oriundas do

cruzamento com o genitor Stock 6.

A presença de falso-positivos demonstra que o aperfeiçoamento do método

de seleção ou até mesmo a viabilização de outro método de seleção destas
sementes deve ser avaliado.
Comparando o número de sementes potencialmente haplóides selecionadas
com aquelas que germinaram, observou-se que a maior porcentagem de plantas
haplóides entre as populações induzidas pelo Stock 6 foi 30%, referente à P5.
Quando induzidas pelo KHI, a P20 destacou-se com 82,35% de plantas
potencialmente haplóides (Quadro 2).
A superioridade de KHI parece consistente porque o alto número de
populações usadas tende a minimizar o efeito das populações, que são distintas das
empregadas com Stock 6.

26
Figura 5 - Plantas haplóides oriundas do cruzamento com o genitor KHI.

Em pesquisas similares, (Bordes et al. 1997; Belicuas, 2007; Silva, 2009;

Alekcevetch, 2010), a indução de haplóides de milho foi obtida por meio de
diferentes indutores cruzados com diferentes híbridos. Primeiramente, foi realizado o
processo de indução de sementes haplóides e, posteriormente, houve a confirmação
da haploidia pela análise fenotípica das plantas estabelecidas.
Chase (1952) propôs uma metodologia de identificação de haplóides no
estádio de plântula, utilizando um sistema de marcadores fenotípicos, obtendo uma
taxa de ocorrência de haplóides de 0,1%.
A detecção confiável de haplóides no estádio de plântula é pré-requisito para
o uso de DH no melhoramento de milho. Bordes et al. (1997) utilizaram dois híbridos
com uma ampla base genética, identificados como CGT e DGT. Esses híbridos
foram polinizados com um indutor e produziram plântulas haplóides sob taxas de
0,64 e 0,93%, respectivamente.
Belicuas et al. (2007), utilizando o indutor W23 como fêmea e o híbrido
BRS1010 como macho, obtiveram um percentual de 0 a 51% de plantas haplóides
androgenéticas.
O cruzamento de duas linhagens indutoras, ZMS e KMS, ambas derivadas
da Stock 6, originou a linhagem MHI. Verificou-se que MHI apresenta, em média,
uma indução de haploidia de 6,5% (Chalyk 1999; Eder e Chalyk, 2002). A linhagem
indutora RWS, oriunda do cruzamento entre WS14 e KMS, apresentou de 8 a 10%
de haplóides gimnogenéticos (Röber et al., 2005).

27
 Alekcevetch (2010), ao testar dois indutores de haploidia, Stock 6 e W23,
obteve 0,0117% e 0,3359% de plantas haplóides gimnogenéticas, respectivamente.
Os resultados obtidos foram satisfatórios quando comparados com trabalhos
relacionados à indução de haploidia em milho.

4.2. Duplicação cromossômica

Utilizando o indutor Stock 6, foram observadas plantas DH, selecionadas

fenotipicamente em três tratamentos. Os tratamentos 1, 4 e 5 apresentaram 25%,
33,3% e 22,2% de plantas DH, respectivamente. Os tratamentos 2 e 3 não
apresentaram plantas DH (Quadro 3). A eficiência na obtenção de DH depende do
número de plantas realmente haplóides obtidas. Neste caso, esse número foi
reduzido, gerando poucas plantas DH.

Quadro 3 - Duplicação cromossômica de sementes potencialmente haplóides

induzidas pelo Stock 6

Trat.1 Trat. 2 Trat. 3 Trat. 4 Trat. 5

Classificação
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
Plantas possíveis
haplóides 101 96,2 1 0,95 68 65,3 37 35,5 89 84,7
germinadas
Plantas híbridas 95 94 1 100 65 95,5 32 86,4 84 94,3
Plantas haplóides 6 4 0 0 4 4,5 4 2,8 7 5,7
Plantas DH 2 25 0 0 0 0 2 33,3 2 22,2
Trat. 1: semeadura; Trat. 2: imersão das sementes em solução de colchicina; Trat. 3: germinação em
papel germitest; Trat 4: imersão das plântulas em colchicina e Trat. 5: injeção de colchicina nas
plantas.

O tratamento 2 apresentou somente uma planta germinada, possivelmente

devido à injúria causada nas sementes que foram excisadas acima do embrião para
melhor embebição em solução de colchicina (Figura 6).
Apesar de o solo utilizado nos vasos ser apropriado para a cultura, houve
uma reduzida taxa de germinação de sementes possíveis haplóides/DH. A reduzida
taxa de germinação pode ser atribuída à toxicidade decorrente dos tratamentos de
duplicação cromossômica com o uso de colchicina, associada aos danos mecânicos
causados nas sementes ou plântulas submetidas aos tratamentos 2 e 4. Portanto, é
recomendável a introdução de algumas mudanças nos protocolos dos tratamentos 2
e 4, objetivando maior número de plantas estabelecidas. Entre as modificações

28
sugeridas, deve-se mencionar a redução da concentração de colchicina, o uso
preventivo de defensivos e a redução na profundidade dos cortes feitos em
sementes e coleóptilos.

Figura 6 - Amostras de sementes submetidas ao tratamento 2, sendo observada a

injúria causada pelo corte profundo.

Mesmo com um número maior de plantas haploides selecionadas, os

tratamentos de duplicação aplicados nas sementes potencialmente haplóides
provenientes do indutor KHI resultaram em um número reduzido de plantas DH
(Quadro 4).

Quadro 4 - Duplicação cromossômica de sementes potencialmente haplóides

induzidas pelo KHI

Trat.1 Trat. 2 Trat. 3 Trat. 4 Trat. 5

Classificação
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

Plantas possíveis
haplóides 64 41,5 44 28,5 80 51,9 2 1,3 133 86,3
germinadas

Plantas híbridas 13 20,3 6 13,6 27 33,7 0 0 75 56,4

Plantas haplóides 47 73,4 34 77,2 48 60 1 50 52 39
Plantas DH 4 7,8 4 10,5 5 9,4 1 50 6 10,3
Trat. 1: semeadura; Trat. 2: imersão das sementes em solução de colchicina; Trat. 3: germinação em
papel germitest; Trat 4: imersão das plântulas em colchicina e Trat. 5: injeção de colchicina nas
plantas.

Todos os tratamentos apresentaram DH formados quando observados pela

análise fenotípica, sendo que os tratamentos 2, 4 e 5 apresentaram maiores
números destes DH (Quadro 4).

29
 Os resultados apresentados no Quadro 4 permitem novamente observar que
a germinação foi maior nos tratamentos em que as sementes e plântulas não foram
submetidas a qualquer tipo de corte antes da aplicação de colchicina (tratamentos 1,
3, e 5).
Quando utilizada nos demais tratamentos, a colchicina pode ter apresentado
efeito de toxidade nas sementes e plântulas.
Considerando os dois indutores e o total de plantas que receberam os
tratamentos de duplicação, 26 plantas foram selecionadas como DH por meio da
análise fenotípica das plantas estabelecidas (Quadro 3 e 4).
Utilizando a colchicina na duplicação cromossômica, Bordes et al. (1997)
verificaram que a recuperação da fertilidade masculina variou de 30 a 60%, de
acordo com o número de haploides detectados. Segundo os autores, a taxa de
recuperação de progênie foi influenciada pela base genética. O híbrido identificado
como DGT apresentou resultados melhores do que o híbrido CGT. O período de
crescimento também teve uma influência sobre a recuperação de espigas férteis. Os
autores observaram letalidade em plantas a uma taxa de 4,4 a 13,9% após a
utilização da colchicina no tratamento de duplicação. Nesse tratamento, as plântulas
foram imersas até a base em solução de 1,5 g de colchicina por litro, durante três
horas, em temperatura ambiente. Após este período, as plântulas foram transferidas
para vasos contendo substrato e aquelas que apresentaram pólen foram
autofecundadas. Estes resultados comparados com os obtidos neste trabalho foram
superiores quanto ao número de DH produzidos.
O tratamento 1 apresentou números próximos aos demais tratamentos,
sendo em alguns casos melhores, como quando comparados aos tratamentos 2 e 3
(Stock 6) e tratamento 4 (KHI).
Chase et al. (1952) relataram a obtenção de DH espontâneos a uma taxa de
10. Essa diferença pode decorrer da capacidade específica de resposta do genótipo
utilizado.
Considerando a variação nos resultados descritos até o momento pela
literatura e a escassa disponibilidade de informações metodológicas, é possível
concluir que outros protocolos alternativos devem ser testados para otimizar a
duplicação cromossômica das plantas, tendo em vista um maior sucesso na
obtenção de DH.

30
4.3. Seleção de plantas haplóides por meio de marcadores SSR

Foram testados 120 marcadores microssatélites entre os parentais Stock 6,

P1, P2, P3, P4, P5 e P6 e 48 marcadores entre os parentais KHI, P19, P20 e P21.
Foram selecionados os que apresentaram polimorfismo entre os genitores (Quadro
5).
Quadro 5 - Número de marcadores SSR utilizados na identificação de plantas DH
em cada população

Indutores Populações Marcadores testados Marcadores polimórficos

P1 120 15
P2 120 11
Stock 6 P3 120 16
P4 120 15
P5 120 14
P6 120 14
P19 48 5
KHI P20 48 5
P21 48 5

Para todas as populações foi possível encontrar marcadores informativos. O

marcador bnlg 1031 apresentou polimorfismo em oito populações, não sendo
polimórfico somente entre os genitores Stock 6 e P6.
Entre os marcadores polimórficos, selecionou-se um ou dois marcadores
que foram utilizados para amplificação na população (Quadro 6).

Quadro 6 - Marcadores SSR utilizados na identificação de plantas haploides ou DH

Populações Marcadores Utilizados

P1 bnlg 1671
P2 umc 1133
P3 umc 1797
P4 umc 1657
P5 bnlg 1671
P6 umc 1016
P19 bnlg 1031 e PHI 028
P20 bnlg 1031
P21 bnlg 1031

31
 As plantas haplóides ou DH foram identificadas visualmente através da
produção de pólen e confirmadas por meio dos marcadores SSR (Quadro 7).

P3 1 2 3 4 5 6 7

Figura 7 - Padrão obtido com o marcador umc 1797 para plantas oriundas do
cruzamento entre Stock 6 e P3 - 1, 2, 3, 4, 5 e 7: híbridos; 6: haplóide ou DH.

As plantas foram avaliadas como híbridos, haplóides ou duplo haplóides

(Figura 6 e 7).

KHI P21 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Figura 8 - Padrão obtido com o marcador bnlg 1031 para plantas oriundas do
cruzamento entre KHI e P21. 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 12, 15 e 18: híbridos; 5, 6, 10, 11, 13,
14, 16 e 17: haploides ou DH.

Na P20 o número de plantas haplóides ou DH selecionadas nos dois

métodos de seleção (fenotípica e molecular) foi igual, o que não significa que as
plantas classificadas como haplóides na análise fenotípica são as mesmas da
análise molecular. Neste caso, 58 plantas foram identificadas como haplóides tanto
fenotipicamente como molecularmente. Nas demais populações, as plantas
haplóides/DH identificadas na análise fenotípica foram as mesmas da análise
32
molecular. Verificou-se excesso de haplóides na análise fenotípica das plantas que,
quando submetidas à análise molecular, foram consideradas híbridas (Quadro 7).
No processo de avaliação da coincidência entre as duas análises, resumido
no Quadro 7, é interessante ressaltar que uma planta caracterizada como haplóide
na análise fenotípica pode não ter sido caracterizada como haplóide na análise
molecular, e vice-versa.

Quadro 7 - Número de haplóides ou DH selecionados na análise fenotípica e

molecular e coincidência entre as duas análises

Plantas potencialmente Análise Análise Coincidência entre

Populações
haplóides germinadas fenotípica molecular as duas análises
P1 78 6 4 4

P2 58 6 3 3

P3 80 2 2 2

P4 35 7 2 2

P5 10 3 3 3

P6 35 3 2 2

P19 220 122 61 61

P20 85 70 70 58

P21 18 10 8 8

Observou-se que o número de plantas haplóide/DH detectadas pela

avaliação fenotípica aproximou-se da molecular, sendo economicamente viável esse
tipo de avaliação. Contudo, os marcadores microssatélites auxiliaram na seleção de
plantas haplóides/DH, aumentando a eficiência da seleção e reduzindo o número de
falso-positivos da análise fenotípica.
Resultado semelhante foi obtido por Silva (2009), que avaliou a indução de
haploidia de sementes androgenéticas de milho. O autor observou que os
marcadores moleculares específicos codominantes foram eficientes na identificação
de plantas haplóides. Da mesma forma, trabalhando com plantas haplóides
gimnogenéticas, Alekcevetch (2010) verificou que os marcadores SSR foram
eficientes na confirmação de genótipos haplóides ou DH de milho.

33
4.4. Comparação dos três métodos de seleção e obtenção de sementes DH

Para comparar os três métodos de seleção de haplóides/DH (seleção de

sementes potencialmente haplóides, seleção fenotípica das plantas potencialmente
haplóides e seleção molecular), foram consideradas apenas as sementes
potencialmente haplóides que germinaram, pois somente foi possível analisar a sua
haploidia quando as plantas foram estabelecidas.
Observou-se que o número de sementes potencialmente haplóides é elevado
quando comparado ao número de plantas haplóides detectadas pela avaliação
fenotípica e molecular (Figura 9 e 10).

Figura 9 - Avaliação de três métodos de seleção de haplóides para o indutor Stock 6.

Nas populações induzidas pelo Stock 6, geralmente, foi observada uma

maior presença de falso-positivos, em comparação às populações oriundas do
indutor KHI.
Nas populações induzidas pelo KHI, a P19 apresentou maior número de
falso-positivos, sendo 220 sementes potencialmente haplóides germinadas, 102
plantas caracterizadas fenotipicamente como haplóides/DH e 61 plantas com essas
características identificadas na análise molecular. A seleção de haplóides/DH nas

34
populações induzidas pelo KHI apresentou menor número de falso-positivos. Logo,
de acordo com este critério, o uso do indutor KHI foi mais vantajoso que o emprego
dos outros indutores.
O número de plantas selecionadas fenotipicamente como haplóides/DH foi
semelhante ao da análise molecular, evidenciando a importância da avaliação
fenotípica e do uso dos marcadores, que contribuíram para aumentar a eficiência da
seleção.

Figura 10 - Avaliação dos três métodos de seleção de haplóides para o indutor KHI.

Todas as plantas caracterizadas fenotipicamente como DH foram

autopolinizadas. No entanto, considerando que, em razão da metodologia
empregada no presente trabalho, as análises moleculares das plantas foram
efetuadas paralelamente, algumas plantas autopolinizadas foram consideradas
híbridas na análise molecular
Pode-se, de acordo com os resultados obtidos, observar que, das 26
plantas DH selecionadas fenotipicamente, somente sete foram identificadas como
homozigotas na análise molecular, produzindo pólen e qualificando-se, portanto,
como DH. No entanto, destas, constatou-se somente uma planta autofecundada.
Uma das causas possíveis para este resultado foi a protandria, ou seja, a ausência
de pólen viável quando os estigmas finalmente estivessem receptivos. Os efeitos da
protandria podem ter sido agravados pela temperatura elevada dentro da casa de

35
vegetação, colaborando para a rápida inviabilidade do pólen. Observou-se também
que muitos pendões tornaram-se secos antes que as polinizações fossem
finalizadas.
As 19 plantas restantes identificadas fenotipicamente como DH, foram
híbridas na análise molecular (Quadro 3 e 4).
A única planta autofecundada caracterizada fenotipicamente e
molecularmente como DH pertenceu à P19 (Figura 2), que produziu uma espiga
contendo 51 sementes, das quais 30 apresentaram antocianina e 21 apresentaram
tegumento amarelo, característica das sementes do genitor feminino (Figura 12). O
motivo da presença de algumas sementes contendo expressão de antocianina
possivelmente se deve à contaminação de alguns estilos-estigmas com pólen
externo. Por outro lado, aquelas que apresentaram coloração normal, a exemplo do
genitor fêmea, foram devido à autofecundação da planta da população P19
constatada fenotipicamente e molecularmente como DH.

Figura 11 - Espigas colhidas nas plantas autofecundadas. Somente a espiga nº 2 foi

oriunda de uma planta caracterizada fenotipicamente e molecularmente como DH.

Em estudos posteriores, estas sementes serão semeadas e avaliadas,

dando continuidade às demais etapas de obtenção de linhagens DH.
Na figura a seguir verifica-se as características das espigas provindas das
autofecundações realizadas, com destaque para a número 2, provinda de DH.

36
 5. CONCLUSÕES

O indutor de haploidia KHI apresentou melhor desempenho na indução de

haplóides gimnogenéticos de milho.
Os métodos de duplicação cromossômica apresentaram baixa eficiência,
sendo oportuno, portanto, o desenvolvimento de uma otimização dos protocolos.
Os marcadores moleculares microssatélites utilizados demonstraram ser
eficazes na identificação das plantas haplóides ou duplo-haplóides auxiliando a
seleção fenotípica.

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