Este documento descreve os procedimentos para realizar um teste de sensibilidade a antibióticos utilizando o método de difusão em agar. O experimento envolve a preparação de meios de cultura, a coleta de amostras, o isolamento de bactérias e a realização de coloração de Gram para identificação.
Este documento descreve os procedimentos para realizar um teste de sensibilidade a antibióticos utilizando o método de difusão em agar. O experimento envolve a preparação de meios de cultura, a coleta de amostras, o isolamento de bactérias e a realização de coloração de Gram para identificação.
Este documento descreve os procedimentos para realizar um teste de sensibilidade a antibióticos utilizando o método de difusão em agar. O experimento envolve a preparação de meios de cultura, a coleta de amostras, o isolamento de bactérias e a realização de coloração de Gram para identificação.
Este documento descreve os procedimentos para realizar um teste de sensibilidade a antibióticos utilizando o método de difusão em agar. O experimento envolve a preparação de meios de cultura, a coleta de amostras, o isolamento de bactérias e a realização de coloração de Gram para identificação.
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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA FLUMINENSE
CURSO TÉCNICO EM QUÍMICA - MÓDULO II
MICROBIOLOGIA II
AÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
Nome do aluno:Denis Carvalho Rangel
Nome do professor: Natalia Deus de Oliveira Crespo Turno:Tarde
Local: LAB de Microbiologia
Data:30/05/2022 TÍTULO DO EXPERIMENTO: AÇÃO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
1. OBJETIVOS
Determinar a sensibilidade de um microrganismo a determinados agentes antimicrobianos
pelo método de difusão.
Identificar a área que corresponde ao halo de inibição do agente antimicrobiano na
prática.
Determinar as condições necessárias para realização do antibiograma de bactérias
aeróbicas e anaeróbicas facultativas.
2. MATERIAIS, VIDRARIAS e UTENSÍLIOS
3 becker de vidro de 500 ml 2 beckers de alumínio para descarte 6 beckers de 100ml 1 frasco para reagente de 500ml 1 becker de 1000ml 2 frascos para reagente de 200ml 2 beckers de vidro de 250ml 1 frasco para reagente de 250ml 2 beckers de alumínio para descarte 1 swab 4 macropipetadores 1 alça de Nichrome 4 pipetas graduadas de 10 ml 1 caneta 1 proveta de 1000ml 1 pinça de metal 1 proveta de vidro de 500 ml 4 frascos de antibiótico 1 proveta de 250ml 2 pipetas de plastico de 100 μl 3 tripés metálicos 1 micropipetador 100μl 3 telas de amianto 1 pipeta Pasteur caixa de fósforo 2 lâminas de vidro 4 espátulas tipo canaleta 2 alças de Drigalski 1 pissete de 500ml 4 placas de Petri 1 bastão de polipropileno 3 bastões de plástico papel de filtro papel kraft fita zebrada para autoclave 1 tesoura barbante 3 suportes para tubo de ensaio de metal 4 tubos de ensaio de vidro com tampa rosqueável 10x100
3. EQUIPAMENTOS 1 Microscópio bioval 110 volts 1 Bico de Bunsen 1 Estufa para cultura bacteriológica Olidef cz 220 volts 1 Autoclave vertical phoenix 220 volts 1 Balança semi analitica 110 Volts BG 2000 GEHAKA 4. REAGENTES E SOLUÇÕES Soluções para a coloração de Gram: I. Cristal violeta: corante de Gram a) Cristal violeta................10 g Álcool etílico 95o............200 mL b) Oxalato de amônio.......8 g Água deionizada..........1000 mL Para uso, misturar a) e b), deixar em repouso por 24 horas e filtrar antes de usar. Guardar em frascos âmbar
II. Lugol - Mordente
Iodo metálico.................3 g Iodeto de potássio.........6 g Água destilada..............900 mL Misturar o iodeto na água até completa dissolução, acrescentar o iodo metálico e misturar até dissolver completamente.
III. Descorante - Diferenciador
Álcool etílico a 95o ou partes iguais de acetona e álcool etílico
IV. Contracorante Fucsina Fucsina básica.................1 g Água deionizada...............1000 mL Dissolva a fucsina na água deionizada. Guardar em frascos âmbar.
V. Safranina Safranina ............................5 g Etanol 95º ..........................100 mL Água deionizada..................1000 mL Dissolva a safranina no álcool e adicione a água deionizada depois. Guardar em frascos âmbar. —--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Óleo de imersão 0,98 kg/L Antibióticos: tetraciclina TET 30, Ampicilina AMP 10, Gentamicina GEN 10, Eritromicina ERI 15
5. MEIOS DE CULTIVO Ágar Sal manitol (Kasvi): Composição:Cloreto de Sódio (75,00), D-Manitol (10,00), Digestivo Pancreático de Caseína (5,00), Digestivo Péptico de Tecido Animal (5,00), Extrato de Carne (1,00), Vermelho Fenol (0,025), Ágar Bacteriológico 15,00 Validade: 29/09/2019
Ágar EMB (Himedia):
Composição:Peptona (10.000), Fosfato dipotássico (2.000), Lactose (10.000), Eosina - Y (0,400), Azul de metileno (0,065), Ágar (15.000) Validade: Janeiro de 2014
7. PROCEDIMENTO 7.1 - Preparo e esterilização de meios de cultivo solidificados necessários para a atividade experimental Determinar o volume necessário para realizar o experimento para cada meio de cultura solidificado citado a seguir: - Agar manitol - Agar eosina azul de metileno - Agar APC acrescido de 2% de extrato de levedura Em seguida calcular a massa de cada meio e/ou componente necessária para que o meio seja preparado na concentração desejada. Os meios citados devem ser aquecidos e ao entrarem em ebulição deve-se marcar 1 minuto sempre sob constante agitação. Curso Técnico em Química - MICROBIOLOGIA II IFFluminense campus Campos Centro Após a fervura cada meio de cultura deve ser transferido para frascos de meio de cultura ou frascos de reagentes e ser imediatamente identificado com os seguintes dados: - módulo - turno - inicial do nome dos alunos - grupo 1 ou 2 - nome do meio - data A tampa do frasco deve ser parcialmente fechada, envolvida com papel Kraft ou similar. O papel deve ser fixado ao frasco com auxilio de um barbante amarrado na forma de laço. Os frascos devem receber fita para autoclave e serem encaminhados para esterilização em autoclave a 121ºC , 1,1 atm, por 15 minutos. 7.2 - Preparo e esterilização de meios de cultivo solidificados necessários para a atividade experimental Consultar o professor para determinar o volume de caldo que deve ser transferido para tubos de ensaio de 10 x 100 mm. Calcular o volume total de caldo necessário para todos os alunos da bancada. Realizar o cálculo para verificar a massa de caldo a ser pesada. Geralmente o caldo glicosado não vem pronto, é necessário pesar os componentes um a um para o preparo deste caldo. Depois de pesada a massa acrescentar o volume de água deionizada e misturar. O caldo preparado pode ser transferido para os tubos de ensaio com auxílio de pipetas sorológicas, micropipetas ou dispensador (verificar com o professor). Folgar a tampa dos tubos de ensaio contendo o caldo e inseri-los em Becker de alumínio de 250 mL ou 500 mL. Cobrir os Beckers de alumínio com papel Kraft, arramar com barbante (laço) e identificar o Becker com os dados do item 3.1. Colocar fita de autoclave no Becker. Autoclavar os tubos de ensaio. 7.3 - Preparo e esterilização de meios de cultivo solidificados necessários para a Consultar o professor para determinar o volume de meio SIM que deve ser transferido para tubos de ensaio de 10 x 100 mm. Calcular o volume total de meio SIM necessário para todos os alunos da bancada. Realizar o cálculo para verificar a massa de meio a ser pesada. Depois de pesada a massa acrescentar o volume de água deionizada e misturar. O meio SIM deve ser aquecido sob agitação e ao entrar em ebulição deve-se marcar 1 minuto. O meio preparado deve ser transferido ainda quente para os tubos de ensaio com auxílio de pipetas sorológicas e macropipetador. Folgar a tampa dos tubos de ensaio contendo o meio e inseri-los em Becker de alumínio de 250 mL ou 500 mL. Cobrir os Beckers de alumínio com papel Kraft, arramar com barbante (laço) e identificar o Becker com os dados do item 3.1. Colocar fita de autoclave no Becker. Autoclavar os tubos de ensaio. 7.4 - Montagem e esterilização de Placas de Petri Realizar a montagem conforme a técnica, embalar e esterilizar. 7.5 - Coleta de amostra da mucosa nasal Plaquear o meio agar manitol através de manobra asséptica realizada próxima a chama do bico de Bunsen. Aguardar 15 minutos para que o meio solidifique e em seguida dividir a placa em 4 quadrantes. Com auxílio de swab coletar amostra da mucos nasal em condições assépticas. O swab deve ser introduzido na mucosa e girado por 30 segundos. A seguir deve-se passar o swab em placa de Agar manitol inoculando através da técnica de esgotamento do inóculo em estrias. Armazenar a placa em estufa bacteriológica a 37ºC por 48 horas. 7.6 – Isolamento de coliformes Plaquear o meio agar eosina azul de metileno (agar EMB) e aguardar solidificar por 15 minutos. Em seguida, dividir a placa em 4 quadrantes. Retirar uma alçada de caldo nutritivo contendo cultura de coliforme e inocular pela técnica de esgotamento do inóculo no ágar EMB através de manobras assépticas. Curso Técnico em Química - MICROBIOLOGIA II IFFluminense campus Campos Centro Incubar a 37ºC por 48 horas. 7.7 - Identificação de Staphylococcus e de coliformes Observar macroscopicamente o crescimento em meios de cultivo ágar manitol e ágar eosina azul de metileno após 48 horas de incubação. Anotar alterações de coloração ocorridas nos meios de cultivo. Através de manobra asséptica observar as colônias formadas e anotar suas características. Observar a placa de agar manitol e verificar se possui pelo menos 4 colônias idênticas de Staphylococcus para realizar a próxima etapa. O mesmo deve ser feito para a escolha das colônias no ágar eosina azul de metileno. 7.8 – Preparo de esfregaço, fixação e coloração de GRAM a partir de colônias de Staphylococcus e de coliformes Realizar esfregaço, fixação e coloração pelo método de Gram da colônia escolhida no ágar manitol. Repetir o procedimento para a placa de Petri contendo ágar eosina azul de metileno. Armazenar as lâminas em estojo apropriado. 7.9 – Inoculação e observação macroscópica em caldo glicosado Transferir, em condições assépticas, uma colônia de Staphylococcus para tubo de ensaio contendo caldo glicosado com o auxílio de uma alça de nichrome. Identificar o tubo. O tubo de caldo glicosado contendo amostra de Staphylococcus deverá ser armazenado em incubadora com agitação (shaker) a 37ºC e agitado por 48 horas. A partir de cultura obtida no ágar EMB, o aluno deverá transferir através de condições assépticas uma colônia de coliforme para tubo contendo caldo glicosado. O aluno deverá anotar as características da colônia escolhida. O tubo de caldo glicosado contendo a amostra de coliforme deverá ser incubado por 48 horas a 37oC em estufa bacteriológica. Após 48 horas verificar se houve turvação nos caldos glicosados inoculados. 7.10 – Inoculação e observação macroscópica de crescimento em meio SIM Transferir, em condições assépticas, uma colônia de Staphylococcus para tubo de ensaio contendo meio SIM com o auxílio de uma agulha de nichrome, numa profundidade de 1 cm. Identificar o tubo. Repetir o procedimento para a cultura de coliformes. Os tubos de meio SIM deverão ser incubados por 48 horas a 37oC em estufa bacteriológica. Após 48 horas verificar se houve crescimento somente no local da picada ou se o crescimento foi difuso no meio. 7.11 – Teste da catalase Com auxílio de uma pipeta Pasteur transferir uma gota de água oxigenada para o centro de duas lâminas e em seguida através de manobra asséptica coletar com auxílio de alça de nichrome uma colônia de Staphylococcus e mergulhá-la na solução de água oxigenada de uma lâmina. Observar. Repetir o procedimento para a cultura de coliforme. Observar a formação de bolhas devido ao desprendimento de gás oxigênio. Este procedimento pode ser realizado gotejando a água oxigenada diretamente sobre a colônia contida na placa de Petri. A desvantagem desta técnica é perder a cultura da placa devido a ação oxidativa da água oxigenada. 7.12 - Antibiograma a. Preparo dos discos dos agentes antimicrobianos. Preparar discos de papel de filtro com o diâmetro de 0,5mm (furador). Armazenar Estes discos em placas de Petri, embalar com papel Kraft e autoclavar. Para o ensaio com os agentes antimicrobianos deve-se escolher as substâncias cujo poder antimicrobiano será testado. Estas substâncias (soluções) devem ser transferidas cada uma para a sua placa de Petri contendo discos estéreis através de manobra asséptica. Os discos devem ser removidos das placas (um a um) com auxílio de uma pinça metálica, aguarde alguns segundos para eliminar o excesso do produto no disco de papel. Antibióticos Esta etapa pode não ser realizada para os antibióticos caso o professor forneça para a turma discos impregnados de antibióticos comprados prontos. A variedade de cada substância será determinada pelo professor. b. Inoculação da amostra no meio Ágar para contagem de microrganismos (A.P.C.) acrescido de 2% de extrato de levedura. Plaquear o agar APC e aguardar 15 minutos para que solidifique. Dividir a placa em quatro quadrantes e numerá-los. Transferir 0,3 mL da cultura crescida em caldo glicosado a ser testada para a placa de Petri. Espalhar com auxílio de uma alça de Drigalsky a amostra do microrganismo-teste sobre a superfície do meio estéril contido na placa. Este procedimento poderá ser repetido de acordo com o número de placas de Petri que o professor irá determinar para teste com cada microrganismo. As pipetas sorológicas devem ser inseridas em provetas contendo solução de hipoclorito imediatamente após a inoculação. As ponteiras devem ser transferidas para Becker de alumínio imediatamente após o seu uso. As alças de Drigalski devem ser imediatamente transferidas para Becker de vidro de 1000 mL contendo solução de hipoclorito de sódio. c. Adição do agente antimicrobiano. Através de manobra asséptica, colocar no centro de cada quadrante, os discos com os agentes antimicrobianos utilizando uma pinça metálica. Anote na sua apostila o número do quadrante e o antibiótico/antisséptico/desinfetante adicionado. Incubar em estufa regulada a 37oC por no máximo 48 h. d. Observação macroscópica do crescimento Observar através de manobra asséptica as placas de Petri para verificar a ação de cada agente antimicrobiano sobre o microrganismo pesquisado. Nas placas onde houver inibição por efeito de antibióticos, meça o halo formado com o auxílio de uma régua. O diâmetro do halo tem que ser expresso em milímetros. Consulte a tabela em anexo para comprovar a sensibilidade do microrganismo testado aos antibióticos. Se foi realizado o teste com antissépticos ou desinfetantes basta anotar se houve ou não halo de inibição
8. REAÇÕES
1 H2O2 -> 1 H2O + 0,5 O2
9. CÁLCULOS E RESULTADOS CÁLCULOS DO PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO
Ágar manitol (1 Placa por aluno):
VF= 13 x 20ml = 260 ml 111g -> 1000ml x -> 260ml x= 28,86g
Ágar EMB( Eosina Azul de Metileno) (1 Placa por aluno):
VF= 260ml 36g -> 1000ml x -> 260ml x= 9,36g
Meio S.I.M (2 Tubos por aluno):
5ml x 26 = 130ml 36,3g -> 1000ml 130ml + 10ml = 140ml x -> 140ml VF: 140ml x= 5,08g APC + 2% Extrato de levedura (2 Placas por aluno): 2 x 13 = 26 26 x 20ml = 520ml VF: 520m
APC Extrato de Levedura
23,5g -> 1000ml 2g -> 100ml
x -> 520ml x -> 520ml x = 12,22g x = 10,4g
Caldo Glicosado (2 Tubos por aluno):
13 x 2 = 26 26 x 5 ml = 130ml 130ml + 10ml = 140ml VF: 140ml
Peptona Bacteriologica (10g/L) Extrato de levedura (5g/L) Glicose (5g/L)
10g -> 1000ml 5g -> 1000ml 5g -> 1000ml
x -> 140ml x -> 140ml x -> 140ml x= 1,4g x= 0,7g x= 0,7g
RESULTADOS
Identificação de Staphylococcus e Coliformes:
Staphylococcus: Meio de cultivo: Manitol Número de colônias: 60 Cor/Formato das colónias: Brancas, esféricas Cor do meio de cultivo: Laranja Coliformes: Meio de cultivo: EMB Número de colônias: 35 Cor/Formato das colônias: Verdes, Esféricas Cor do meio de cultivo: Vermelho Escuro
Teste de Catalase: Colônia de Staphylococcus: Positivo Colônia de Coliformes: Negativo
Observação macroscópica em caldo glicosado:
Tubo inoculado com Staphylococcus: Turbidez Positiva ++++ Tubo inoculado com Coliformes: Turbidez Positiva + (OBS: quanto mais ‘‘+’’, maior intensidade da turbidez) Observação macroscópica de crescimento em meio SIM: Tubo inoculado com Staphylococcus: Motilidade Negativa Tubo inoculado com Coliformes: Motilidade Positiva
Antibiograma:
Observação macroscópica do crescimento:
Staphylococcus Nome Halo de inibição(mm) Interpretação (S,I,R)
Agente Tetraciclina TET 30 32 mm Sensível
antimicrobiano 1
Agente Ampicilina AMP 10 4 mm Resistente
antimicrobiano 2
Agente Gentamicina GEN 10 19 mm Sensível
antimicrobiano 3
Agente Eritromicina ERI 15 Não teve Resistente
antimicrobiano 4
Coliforme Nome Halo de Inibição(mm) Interpretação (S,I,R)
Agente Tetraciclina TET 30 37 mm Sensível
antimicrobiano 1
Agente Ampicilina AMP 10 34 mm Sensível
antimicrobiano 2
Agente Gentamicina GEN 10 23 mm Sensível
antimicrobiano 3
Agente Eritromicina ERI 15 30 mm Sensível
antimicrobiano 4 Observação das lâminas preparadas por exame de imersão: Staphylococcus:
10. CONCLUSÕES Os microorganismos Coliforme foi sensível a todos os antibióticos utilizados. Os microorganismos Staphylococcus foi sensível a metade dos antibióticos utilizados e resistente a outra metade. Devido ao álcool utilizado, os microorganismos Coliformes não foram descoloridos, assim, se mantendo na cor roxa, sendo que o coliforme é gram negativo. As colônias de Staphylococcus demonstraram catalase positiva, enquanto os coliformes demonstraram Catalase negativa 11. ESQUEMA Atividades de verificação
a. Explique por que se deve realizar a semeadura da amostra utilizando a alça de
Drigalsky? R: Pois a alça funciona como um ‘’rodo’’, espalhando a cultura por todo o meio de cultivo além de ser mais difícil de danificar o meio de cultivo utilizando a alça
b. Como podemos determinar se um microrganismo é sensível ou não a um
determinado antibiótico? R:pelo tamanho do halo de inibição, ao medir o halo de inibição em mm (milímetro) e comparar com a tabela é possível determinar o efeito do antibiótico no microorganismo
c. Mencione algumas limitações desta prática.
R:O alto custo dos antibióticos, a possível impureza dos meios de cultivo, a dificuldade de manuseio na operação do procedimento
d. Qual a importância da prova de pesquisa de agentes antimicrobianos?
R:para que seja possível descobrir a ação dos agentes microbianos em microorganismos, assim, evitando por exemplo a prescrição errada de um antibiótico
e. O que é halo de inibição?
R:é a área em volta do antibiótico em que não há crescimento bacteriano
g. Por que foi necessária a agitação do tubo de caldo glicosado contendo
Staphylococcus e não foi necessária para os coliformes? R:pois o oxigênio acelera o crescimento do staphylococcus
j. O que é antibiograma e para que serve?
R:O antibiograma é um experimento para descobrir o efeito de antibióticos em determinados microorganismos, e pode servir, por exemplo, para auxiliar um médico na decisão de qual remédio prescrever para um paciente
k. Quais são os antibióticos beta-lactâmicos? Qual o seu modo de ação?
R:Os betas lactâmicos são medicamentos indicados para tratamento de infecções causadas por cocos gram positivos em pacientes não alérgicos, eles inibem a síntese da parede celular bacteriana
l. Qual a diferença entre agente bactericida e bacteriostático?
R: Agente bactericida: mata a bactéria, Agente bacteriostático: inibe a reprodução da bactéria
m. Dos antibióticos testados na experiência acima, qual seria o mais indicado para o tratamento da infecção causada pela linhagem de coliforme testada? Por que? R: A Tetraciclina TET 30, pois ela foi o antibiótico que gerou o maior halo de inibição entre os antibióticos testados P. Faça um esquema da parede de uma bactéria Gram-positiva e de uma bactéria Gram-negativa? R: Gram-positiva:
