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MICROBIOTA NORMAL DO TRATO INTESTINAL

 Nas fezes habitam várias espécies de bactérias (1011 bactérias/grama de fezes),

além de outros microrganismos.

Universidade Federal do Pará  A Microbiota Normal (microbioma humano) do intestino do homem é

Instituto de Ciências Biológicas constituída por bactérias, tais como:

 ENTEROBACTÉRIAS: Escherichia coli não diarreiogênica, Klebsiella

sp, Proteus sp, Enterobacter sp, Serratia sp etc.
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BGN
 Cocos anaeróbios: Peptococcus sp, Peptoestreptococcus sp.
ENTEROBACTÉRIAS
 Outros Gêneros: Bacteroides sp, Clostridium sp, Lactobacillus sp,
Profª Drª Karla Ribeiro Enterococcus sp, Pseudomonas sp.
ICB/UFPA

1 2

Fonte: https://repositorio.ul.pt/bitstream/10451/36100/1/MICF_Ana_Patricia_Gomes.pdf

3 4

ENTEROPATÓGENOS
ENTEROBACTÉRIAS
Ensaios
 Na etiologia bacteriana das infecções intestinais, as bactérias mais Biológicos
 ENTEROBACTERIACEAE é uma família de bactérias
frequentemente envolvidas são:
Gram-negativas muito abundante, incluindo uma grande
variedade de bactérias patogênicas.
 ENTEROBACTÉRIAS:  Os gêneros e espécies têm sido classificados através de:
 E. coli diarreiogênicas (EPEC, EIEC, ETEC, EHEC/STEC,
 Técnicas de Coloração.
EAEC); Shigella sp; Salmonella spp; Yersinia
Exames
enterocolitica.  Provas Bioquímicas/Metabólicas.
Fenotípicos
 Estruturas antigênicas: O, K e H.
 Campylobacter spp.
 Vibrio cholerae e outras espécies.  Técnicas Moleculares  PCR/ Nested-PCR;
 Clostridium difficile; Clostridium perfringens; e outros. Hibridização, Sequenciamento de Material Genético
e outras provas.

5 6

1
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ENTEROBACTÉRIAS ENTEROBACTÉRIAS

227 espécies

Fonte: https://www.catalogueoflife.org/data/taxon/623ZT
Fonte: http://www.catalogueoflife.org/col/browse/tree?f03760b2e684f3a3f0b3eb6e338f175c

7 8

BACTÉRIAS GRAM-
FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE Vibrios Campylobacter jejuni
NEGATIVAS Vibrio cholerae

IRAS – Enterobactérias (99%) É o maior grupo de Bacilos Gram-negativos

de interesse clínico ...
COCOS COCOBACILOS
Escherichia coli
Os gêneros têm sido classificados de
Gênero Klebsiella sp acordo com as propriedades bioquímicas BACILOS
N. meningitidis
Gênero Salmonella sp (provas metabólicas), estrutura antigênica N. gonorrhoeae
Haemophylus influenza,
Pasteurella, Brucella,
(soroaglutinação), hibridização e Bordetella pertussis
Gênero Shigella sp sequenciamento do material genético …
Gênero Citrobacter sp
Apesar da complexidade da família
(numerosa) menos de 20 espécies são ENTEROBACTÉRIAS LACTOSE + LACTOSE -
Gênero Enterobacter sp
responsáveis por mais de 95% das infecções. OXIDASE - OXIDASE -
Gênero Morganella sp …
Gênero Proteus sp Habitat: São ubiquitários (solo, água,
vegetação, microbiota do trato intestinal de
Gênero Serratia sp
animais e homem) (*Coliformes totais e
Gênero Providencia sp termotolerantes). http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/MODULO2/isolamento.htm
Fonte: http://www.ibb.unesp.br/Home/Departamentos/MicrobiologiaeImunologia/aula_enterobacteriaceae.pdf

9 10

FLUXOGRAMA DA COPROCULTURA COPROCULTURA

FLUXOGRAMA DO EXAME
Meios de
FEZES
Enriquecimento Meios Seletivos  COLETA E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS.
Caldo Selenito 35-37 0C/24-48h Ágar SS
Caldo Tetrationato Ágar MacConkey
Caldo Rappaport Ágar EMB
 PROCEDIMENTO LABORATORIAL

Bacterioscopia Coloração de Gram.

UFC
Isolamento (cultura da amostra).
SÉRIE BIOQUIMICA
Identificação de Enteropatógenos.

SOROLOGIA Soroaglutinação.
PESQUISA DE TOXINAS
PESQUISA DE FATORES DE VIRULÊNCIA Outras provas.

11 12

2
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FASES DOS EXAMES LABORATORIAIS EXAMES LABORATORIAIS

As etapas dos exames laboratoriais podem ser divididas em três grandes
categorias: a fase pré-analítica, a analítica e a pós-analítica.
Fase pré-analítica  engloba desde a indicação pré-teste, passando pela
solicitação/requisição do exame, orientação ao paciente, coleta da amostra
biológica, sequência de tubos, identificação, triagem, acondicionamento,
transporte, até a entrada do material para a análise laboratorial.
Fase analítica  etapa de execução do exame no laboratório (*calibração e
manutenção dos equipamentos).
Fase pós-analítica  laudos (*laudos incompletos; erros nos valores de
referência).

Fonte: https://books.scielo.org/id/tzvzr/pdf/sousa-9788575416419-14.pdf
https://books.scielo.org/id/bskw2/pdf/sousa-9788575416426.pdf
https://books.scielo.org/id/tzvzr/pdf/sousa-9788575416419.pdf

13 14

COPROCULTURA ETAPAS DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO

Exame das Fezes

BACTERIOSCOPIA (GRAM)

Bacilos Gram-negativos

CULTURA
Provas Bioquímicas/Enzimáticas/Metabólicas
Meios de Enriquecimento, Seletivos
e Diferenciais/Indicadores

PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
Fenotípica // Genotípica
16

15 16

ETAPA DE ISOLAMENTO
PROVAS BIOQUÍMICAS

 As provas bioquímicas (provas metabólicas / enzimáticas) são

amplamente utilizadas em associação com os resultados obtidos através da
coloração e cultivos, servindo como prova definitiva na identificação das
bactérias isoladas, visto que as propriedades metabólicas são únicas para
cada espécie.
 Esta classificação das bactérias em relação as suas características
bioquímicas se dá porque os microrganismos apresentam tipos diferentes de
vias metabólicas para obtenção de energia (fermentação, respiração, ou
ambas), bem como podem possuir enzimas específicas utilizadas no
processo de metabolização dos diferentes substratos contidos nos meios de
cultura.
 Os testes bioquímicos para identificação são divididos em: tipos de
metabolismo e atividade enzimática.
Fonte: VERMELHO, A.B. et al. Práticas de Microbiologia. 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
Fonte: https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/5309098/mod_resource/content/1/Metabolismo%20microbiano%201.pdf

17 18

3
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DIFERENCIAÇÃO BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTÉRIAS

PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA
Catalase; fermentação de carboidratos; teste de utilização do citrato;
presença de descarboxilase; teste da urease; teste da β-galactosidade
(ONPG); teste do Indol; Liquefação da gelatina (gelatinase); produção de
H2 S (gás sulfídrico); teste do vermelho de metila; teste da
oxidase/fermentação (O/F); entre outros.

Fonte: https://educapes.capes.gov.br/bitstream/capes/704405/2/Guia_Ident_Enterobact%C3%A9rias%202021%20Karla%20Tereza.pdf

19 20

MATERIAL BIOLÓGICO

 Amostra de Fezes  aproximadamente um a dois gramas de fezes

(equivalente a 1 colher de sobremesa) são coletadas no início do quadro
diarreico, e antes da antibioticoterapia.
 É importante informar que não se deve exceder a quantidade de fezes a ser
colocada no frasco.
 A positividade da cultura diminui com o tempo devido a redução do
número de bactérias eliminadas.
 Fezes SEM CONSERVANTE devem ser encaminhadas à temperatura ambiente (20 a 25
SOROLOGIA Ag/Ac ºC), e processadas no máximo dentro de 1 hora após a coleta.
 *Pode armazenar sob refrigeração até o exame.
 Fezes COM CONSERVANTE podem ser mantidas refrigeradas de 2 a 8 °C por até 24
horas.
 *Conservante das fezes / exame parasitológico: MIF é a abreviação de mercúrio, iodo e
formol).

21

21 22

BACTERIOSCOPIA Coloração de Gram

MATERIAL BIOLÓGICO
 Apenas como orientação, sem valor diagnóstico. A presença de
Conservantes mais comuns leucócitos em grande quantidade pode sugerir infecção por germes
invasores.
 Glicerina tamponada Salmonella spp; Shigella sp.
 Pode orientar também sobre as características da microbiota normal
sugerindo a etiologia da diarreia.
 Meio Cary Blair é o melhor meio de transporte.
 Fazer uma suspensão das fezes em solução salina estéril;
 As amostras de fezes para pesquisa de Clostridium difficile devem preparar o esfregaço e corar pelo método de Gram.
ser mantidas de preferência sem conservantes, refrigeradas (2 a 8 °C)
até 12 horas.

 Para pesquisa de Vibrio sp a amostra de fezes ou swab retal deve ser

encaminhada em Meio de Cary Blair à temperatura ambiente (20 a
25 °C).
Fonte: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=C31sug-770g
https://www.youtube.com/watch?v=mF3jAU6Dy4I

23 24

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ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO

MEIOS DE CULTURA
1. Etapa de ISOLAMENTO:
 Cultura bacteriana Ágar MacConkey/Ágar SS/Ágar EMB.
 Meios Diferenciais Ágar MacConkey (MC) e Ágar EMB.
 Cultura bacteriana em meios de enriquecimento Caldo Selenito,
Caldo GN, Caldo Rappaport, etc. ... meios de enriquecimento.
 Meios Seletivos Ágar Salmonella-Shigella (SS); Ágar Hektoen
Enteric (HE); Ágar XLD (Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato), Ágar
2. Etapa de IDENTIFICAÇÃO: Verde Brilhante (Salmonella spp; exceto S. Typhi e S. Paratyphi).
 Provas Bioquímicas/Metabólicas. Ágar TCBS isolamento de Vibrio sp, Aeromonas sp.
 Sorologia.
e Plesiomonas sp.
 Pesquisa de Toxinas: ELISA e Cultura de Células.
 Caldos de Enriquecimento: Selenito; Selenito Cistina; Rappaport,
3. Pesquisa de Fatores de Virulência: através dos métodos Caldo Tetrationato; Caldo GN, Caldo APT e outros.
moleculares.

25 26

PRINCIPAIS MEIOS DE CULTURA MEIOS DE CULTURA DE ISOLAMENTO

MEIOS NUTRIENTES INIBI BACTÉRIAS BACTÉRIAS
DETECÇÃO
DORES INIBIDAS ESTIMULADAS Enterobactérias (Ágar MacConkey e Ágar SS)
Fermentação
Ágar Eosina Eosina
Lactose, Lactose
Azul Metileno Azul de GP Enterobactéria
Sacarose Fermentação
(EMB) Sacarose Metileno

Sais Enterobactéria
Ágar Fermentação Biliares Outras GN
Lactose Cristal GP
MacConkey Lactose
Violeta

Fermentação Sais Shigella sp

Ágar Salmonella
Lactose Lactose Biliares Coliformes Salmonella sp Vibrio sp (TCBS) e Aeromonas sp (Ágar SS, ASAp (Ágar Seletivo
Shigella (SSA) GP
Produção H2S Citrato Na para Pseudomonas sp e Aeromonas sp)
Ágar Tiossulfato Caseína, Citrato Na
Citrato Bile extrato de Fermentação Colato Na
levedura, Bílis de GP Vibrio sp
Sacarose sacarose
(TCBS) sacarose bovino

Caseína, GP
Ágar Cistina Lac extrato de GN
Fermentação
Eletrólito Defic. carne, L- - -
Lactose
(CLED) cistina, lactose

27 28

MORFOLOGIA DAS UFC - COLÔNIAS

E. coli LAC + / MC

Klebsiella sp LAC + / MC

29 30

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E. coli LAC + / MC

Salmonella spp

Ágar MC

E. coli LAC + / EMB

Ágar SS

31 Fonte: https://www.microbiologyinpictures.com/index.php

31 32

LACTOSE LACTOSE
POSITIVA NEGATIVA

PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA

ENTEROBACTÉRIAS
Escherichia coli Shigella sp
Klebsiella sp Salmonella spp
Enterobacter sp Proteus sp
Serratia sp Providencia sp
Morganella sp

33 34

Ágar TSI
Provas de Identificação Bioquímica Glicose Tabela de Identificação Bioquímica
Sacarose
Lactose
Manita
Maltose
Indol
Vermelho de Metila (VM)
Voges Proskauer (VP)
Nitrato
Motilidade
Citrato
Ureia
Fenilalanina
Lisina
Arginina
Ornitina
Teste da Oxidase

35 36

6
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Ágar Açúcar Triplo Ferro (Ágar TSI)

 Semeadura semear em profundidade com um filamento reto, seguindo

estrias no ápice. Incubar a 35 ± 2 ºC/24h.
 Fundamento:
 Fermentação de açúcares (glicose, lactose e/ou sacarose),
acidificando o meio e provocando a viragem do indicador de pH
(vermelho de fenol) para amarelo.
 Produção de gás: a partir da fermentação dos açúcares.
 Produção de H2S: redução de Tiossulfato de Sódio com produção de
H2S que reage com o ferro formando sulfeto de ferro e enegrecendo o
meio.
 A bactéria que fermenta um carboidrato produz ácido ou ácido e gás
como produtos finais da reação.

Fonte: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/06/TSI_Triple_Sugar_Iron_510111.pdf
Fonte: https://spdbcfmusp.files.wordpress.com/2014/09/iras_modulodeteccaobacterias.pdf

37 38

Ágar Açúcar Triplo Ferro (Ágar TSI) Bactéria Ápice Base Gás H 2S
S. flexeneri alcalina ácido
 Leitura: E. coli ácido ácido +
Proteus mirabilis alcalino ácido +
 Fermentação da Glicose (0,1%):
ácido na base (amarelo) e alcalino na S. Typhymurium alcalino ácido +
superfície (vermelho). P. aeruginosa alcalino alcalino

 Fermentação da Lactose e/ou

Sacarose (1,0%): ácido na base e na
Ápice
superfície (meio todo amarelo).

 Produção de gás: formação de

bolhas de ar ou rachaduras no meio.

 Produção de H2S: cor negra no

Base
meio.
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=dJPjLKiLRRc

39 40

Ágar Açúcar Triplo Ferro (Ágar TSI)

Ápice

Base

41 42

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Ágar Açúcar Triplo Ferro (Ágar TSI)

43 44

Fermentação de Açúcares
Ágar Açúcar Triplo Ferro (Ágar TSI)
(Glicose, Lactose, Sacarose, Manitol, etc.)

 Semeadura semear em meio líquido (*técnica de difusão) (Caldo)

(base + açúcar). Incubar a 35 ± 2 ºC/24h.
1 2 3 4 5 6 7
 Fundamento fermentação do carboidrato/açúcar com produção
de ácidos, acidificando o meio e provocando a viragem do indicador
de pH (vermelho de fenol) para amarelo; com produção de gás ou não.
 A presença de gás é detectada no tubo de Durham, o qual é
colocado invertido no tubo com o meio de cultura (Glicose),
que coletará o gás produzido na fermentação.

 Leitura:
LEITURA: Ápice / Base
Tubo 1: róseo / meio estéril Tubo 2: Ac/Acg Prova Positiva: meio de cultura amarelo (ácido).
Tubo 3: Al/Ac H2S↓ Tubo 4: Al/Ac H2S↑ Prova Negativa: meio de cultura vermelho (alcalino).
Tubo 5: Ac/Acg H2S Tubo 6: Al/Acg H2S↑
Tubo 7: Al/Ac

45 46

Fermentação de Açúcares
(Glicose, Lactose, Sacarose, Manitol, etc.) HIDRÓLISE DA UREIA

 Semeadura semear em Caldo ou Ágar Ureia (*no caldo / técnica

de difusão; ágar / estria no ápice/bisel). Incubar
a 35 ± 2 ºC/24h.

 Fundamento hidrólise da ureia pela ação da enzima urease

bacteriana, formando carbonato de amônia, alcalinizando
fortemente o meio e provocando a viragem do indicador de pH
(vermelho de fenol) para vermelho (pink).

 Leitura:
Glicose + Prova Positiva meio de cultura vermelho (alcalino/pink).
gás no tubo
de Durham
Prova Negativa meio de cultura permanece inalterado (cor de
pêssego/claro).
1: Pos/Gás 2: Pos 3: Neg
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=xJcSCxiMKrk

47 48

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PROVA DO INDOL
HIDRÓLISE DA UREIA

 Semeadura semear em Caldo Indol (Triptone a 1%) ou Meio

SIM (Indol + Motilidade). Incubar a ± 2 ºC/24h.
Ágar Ureia Caldo Ureia
 Fundamento degradação do aminoácido triptofano pela
enzima triptofanase, com produção de INDOL (+ ác. pirúvico e amônia)
que reage com o p-dimetilaminobenzaldeído (Reativo de Kovacs).

 Leitura adicionar 4 gotas do Reativo de Kovacs:

Prova Positiva: anel vermelho na superfície do meio.

Prova Negativa: anel amarelo-castanho.

49 50

PROVA DO INDOL PROVA DO VERMELHO DE METILA (VM)

 Semeadura semear em Caldo de Clark & Lubs. Incubar a 35 ±

2 ºC/24h (*48 horas).

 Fundamento fermentação da Glicose com produção de ácidos

mistos (orgânicos: fórmico, láctico e o acético / succínico) em
quantidades elevadas, que mesmo sendo o meio tamponado, ocorre a
acidificação (pH abaixo de 4.5).

 Leitura: Acrescentar 2 a 5 gotas de uma solução hidroalcoólica de

vermelho de metila:

Caldo Triptone a 1% Meio SIM

Prova Positiva: cor vermelho
Prova Negativa: cor amarelo
(Motilidade + Indol)
Fonte: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/Vermelho_de_Metila_Solucao_570200.pdf
Vídeo / Prova do MIO - https://www.youtube.com/watch?v=DJp8M_m_SXo

51 52

PROVA DE VOGES PROSKAUER (VP)

PROVA DO VERMELHO DE METILA (VM)
 Semeadura semear em Caldo de Clark & Lubs. Incubar a 35 ± 2 ºC/24h (*48
horas).

 Fundamento fermentação da glicose com produção de acetoína (acetil-metil-

carbinol) que dá origem ao butilenoglicol e diacetila, na presença de ar e em meio
alcalino. A diacetila é um produto de cor vermelha sob a ação catalítica do alfa naftol
(*metabolização da glicose pela via butilenoglicólica).

 Reativo de BARRIT:
 Solução A: solução alcoólica a 5% de alfa naftol (α-naftol a 5%);
 Solução B: solução aquosa de KOH a 40%.

 Leitura Acrescentar o Reativo de BARRIT (4 gotas da solução A e 2 gotas da

solução B). (*2 a 5 gotas de cada reativo). Agitar suavemente o tubo e deixar em
Positiva Negativa repouso por até 15 min. para desenvolvimento da cor.
Prova Positiva: cor vermelha.
Prova Negativa: cor amarela.
Fonte: https://publica.ciar.ufg.br/ebooks/iptsp/bacteriologia_basica/artigo_1.html

53 54

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PROVA DE VOGES PROSKAUER (VP)

Positivo Negativo

https://pt.slideshare.net/damoPortoGama/voges-proskauer-vp

55 56

MOTILIDADE
PROVA DO VM & VP
 Semeadura semear por picada em profundidade no Meio Motilidade
(semissólido) ou meio SIM (Sulfito/Indol/Motilidade). Incubar a 35 ± 2
ºC/24h.
VP
VM  Fundamento as bactérias móveis, quando semeadas em meio
semissólido difundem-se no meio, turvando-o. As imóveis crescem apenas no
local da semeadura (picada em profundidade).
 Leitura:
Prova Positiva: crescimento fora do ponto da picada (móveis).
Prova Negativa: crescimento restrito ao ponto da picada (imóveis).
POS NEG
O meio SIM é um meio semissólido usado para
determinação da produção de indol, H2S e motilidade. É
utilizado na identificação de bactérias Gram negativas.

Meio MIO: produção de Indol, Motilidade e Ornitina.

57

57 58

PROVA DO CITRATO DE SIMMONS

MOTILIDADE

 Semeadura semear estrias na superfície de Ágar Citrato de

Simmons. Incubar a 35 ± 2 ºC/24h.

 Fundamento utilização do citrato de sódio como fonte de

carbono, e do nitrogênio inorgânico como fonte de nitrogênio,
alcalinizando o meio e provocando a viragem do indicador de pH
POS NEG (azul de bromotimol) para azul.

 Leitura:
Prova Positiva: há crescimento e o meio torna-se azul (reação
alcalina).
Prova Negativa: não há crescimento e o meio permanece verde.
SIM: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/06/SIM.pdf
MIO: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/mio_motilidade_indol_ornitina_bula_25012019.pdf
https://www.ufrgs.br/aulaspraticasdemip/?page_id=27

59 60

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PROVA DO CITRATO DE SIMMONS PROVA DO MALONATO

 Semeadura semear estrias na superfície de Ágar Malonato

Negativo Positivo (Caldo Malonato/difusão) (sais e ésteres de ácido malônico/ácido orgânico).
Incubar a 35 ± 2 ºC/24-48h.

 Fundamento utilização do malonato como fonte de carbono e do

nitrogênio inorgânico como fonte de nitrogênio, alcalinizando o meio
e provocando a viragem do indicador de pH (azul de bromotimol)
para azul.

 Leitura:
Prova Positiva: há crescimento e o meio torna-se azul (reação alcalina).
Prova Negativa: não há crescimento e o meio permanece verde.
https://publica.ciar.ufg.br/ebooks/iptsp/bacteriologia_humana/artigo_1.html
https://www.renylab.ind.br/wp-content/uploads/2018/05/%C3%81GAR-CITRATO.pdf

61 62

PROVA DA FENILALANINA
PROVA DO MALONATO
 Semeadura semear estrias na superfície de Ágar Fenilalanina
(no ápice). Incubar a 35 ± 2 ºC/24h.

Positivo Negativo  Fundamento desaminação oxidativa da fenilalanina, pela ação

da enzima fenilalanina desaminase, com produção de ácido fenil
pirúvico, acidificando o meio.
 A prova de fenilalanina desaminase testa a capacidade de um organismo para produzir esta
enzima, que remove o grupo amina do aminoácido fenilalanina e o libera na forma de amônia
livre. Como resultado desta reação, o ácido fenilpirúvico também é produzido.

 Leitura acrescentar 5 gotas de Cloreto Férrico a 10%.

Prova Positiva: cor verde na superfície do meio.

Prova Negativa: cor inalterada.
https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/06/Fenilalanina_agar_510170.pdf

63 64

PROVA DA FENILALANINA

Fonte: https://publica.ciar.ufg.br/ebooks/iptsp/bacteriologia_humana/artigo_1.html

65 66

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PROVA DO NITRATO
PROVA DO NITRATO
 Semeadura semear em Caldo ou Ágar Nitrato. Incubar a 35 ± 2
ºC/24-48h.

 Fundamento redução do nitrato a nitrito, pela enzima nitrato

redutase.
 Leitura: Adicionar o Reativo de Griess-Islova
 2/3 gotas da solução A (ácido sulfanílico)
 2/3 gotas da solução B (alfa-naftilamina).
 Os reativos A e o B em presença de nitritos formam uma coloração
vermelha, que indicará a redução do nitrato.

Prova Positiva: cor vermelha, fugaz. Positivo Negativo

Prova Negativa: cor inalterada.

67 68

Teste de Descarboxilação de Aminoácidos Teste de Descarboxilação de Aminoácidos

Lisina – Arginina e Ornitina Lisina – Arginina e Ornitina

 Este teste é utilizado para detectar a habilidade de um microrganismo

descarboxilar um aminoácido (usualmente a lisina, arginina e ornitina) para formar
uma amina, resultando na alcalinização do meio no qual o microrganismo se
desenvolve. É utilizado para fazer diferença entre os membros da família das
Enterobactérias.

69 70

Descarboxilases (Lisina, Ornitina e Arginina Descarboxilases)

Descarboxylase Base Moeller ..................... 10,5 g (*Caldo)

Água destilada ............................................. 1000 mL
Procedimento de preparo do meio.

 Distribuir em frascos de l00 mL. Juntar 1,0g dos L-

aminoácidos desejados (lisina, arginina, ornitina); ou
2,0g dos DL-aminoácidos correspondentes.
Normalmente a adição de ornitina pode exigir um
ajuste do pH (6,0) com hidróxido de sódio, pela sua
maior acidez.
 Distribuir 4 mL em tubos 13 x 100 mm de tampa de
rosca, ou juntar óleo de vaselina em tubos
embuchados com algodão. Usar como controle tubos
com o meio básico sem adição de aminoácidos.
Autoclavar a 120°C, 10 minutos.
 O teste positivo é indicado pelo desenvolvimento de
comparação acentuadamente púrpura nos tubos com
aminoácidos, em comparação com os tubos-controle,
em média 48 horas após a inoculação
https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Decarboxylase-Broth-Protocol.pdf?ext=.pdf

71 72

12
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Descarboxilação de Aminoácidos  L - Lisina Descarboxilação de Aminoácidos  L - Ornitina

 Semeadura semear no caldo (*ou Ágar) com altas concentrações do
aminoácido (base + aminoácido + indicador de pH  púrpura de
 Fundamento da Prova da Ornitina fermentação da glicose com
bromocresol). Incubar a 35 ± 2 ºC/24h.
produção de ácido, acidificando o meio, com viragem do indicador de pH
(o meio muda de púrpura para amarelo). Se a bactéria contém a enzima
 Fundamento da Prova da Lisina: fermentação da glicose com produção
descarboxilase, ocorre descarboxilação da ORNITINA com formação da
de ácido, acidificando o meio, com viragem do indicador de pH (o meio
respectiva amina (PUTRESCINA), esta neutraliza os ácidos produzidos
muda de púrpura para amarelo). Se a bactéria contém a enzima
na fermentação da glicose, alcalinizando o meio e proporcionando a
descarboxilase, há liberação de CO2 e descarboxilação da LISINA com
viragem do indicador de pH (o meio muda de amarelo para púrpura,
produção da respectiva amina (CADAVERINA), esta neutraliza os ácidos
novamente).
produzidos na fermentação da glicose, alcalinizando o meio e
proporcionando a viragem do indicador de pH (o meio muda de amarelo
 Leitura:
para púrpura, novamente).
Prova Positiva: cor púrpura ou violeta.
Prova Negativa: cor amarela
 Leitura: Prova Positiva: cor púrpura ou violeta.
Prova Negativa: cor amarela.

73 74

Descarboxilação de Aminoácidos  L - Arginina Descarboxilação de Aminoácidos

(L-Lisina, L-Ornitina, L-Arginina)
 Fundamento da Prova da Arginina fermentação da glicose com
produção de ácido, acidificando o meio, com viragem do indicador de pH (o
meio muda de púrpura para amarelo). Se a bactéria contém a enzima Prova LIA Prova LIA
descarboxilase, ocorre descarboxilação da ARGININA com formação da Positiva Negativa
respectiva amina (AGMANTINA), esta neutraliza os ácidos produzidos na
fermentação da glicose e alcaliniza o meio, proporcionando a viragem do
indicador de pH (o meio muda de amarelo para púrpura, novamente).

 Leitura:
Prova Positiva: cor púrpura ou violeta.
Prova Negativa: cor amarela

75 76

TESTE DA OXIDASE Procedimento:

 Retire uma fita e feche imediatamente o frasco.
 Com uma alça de platina (bastão de vidro ou madeira), faça um esfregaço da
 A determinação da OXIDASE é um teste diferencial importante na
bactéria a ser identificada na fita.
identificação de bactérias Gram-negativas.
 Não utilize nenhum tipo de alça ou bastão que contenha vestígios de ferro, pois
 As bactérias que produzem a enzima oxidase apresentam um sistema de este irá catalisar a reação de oxidação do reagente, resultando em reação falso-
transporte de elétrons denominado sistema citocromo oxidase. positiva.
 Neste sistema, os aceptores eletrônicos naturais podem ser substituídos  Na mesma fita, faça controle positivo com Pseudomonas aeruginosa e
por substratos artificiais, que na presença de oxigênio atmosférico, são controle negativo com E. coli.
oxidados pela citocromo oxidase, formando um composto colorido.
Leitura: A leitura é feita em poucos segundos.

 ß Oxidase (+): O esfregaço bacteriano na fita apresenta coloração rosa, que após
alguns minutos pode mudar para preta.
 ß Oxidase (–): O esfregaço bacteriano não apresenta alteração de cor.
Precauções:
Após leitura, a fita deve ser descartada conforme as recomendações vigentes para
resíduos de serviços de saúde (*autoclave).
Fonte: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/tira_de_oxidase_570661.pdf
Vídeo 1: https://www.youtube.com/watch?v=lpb08AARxVQ Vídeo 2: https://www.youtube.com/watch?v=ebzuCGoyMLA Fonte: https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/tira_de_oxidase_570661.pdf

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TABELA DE IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS

Prova do IMViC Lactose Glicose H2S Uréia Triptofa- Mobili- Indol Lisina Citrato
Bactérias com no dade Descarb
produção o-xilase
de gás

 A - INDOL = POS Escherichia + + - - - + + + -

 B - VM = POS Klebsiella + + - + - - - - +
 C - VP = NEG Enterobacter + + - - - + - - +
 D - Citrato = NEG
Citrobacter + + + - - + - - +

Arizona + + + - - + - + +

Shigella - - - - - - - - -

Edwardsiella - + + - - + + + -
Sugestivo de Salmonella - + + - - + - + +
E. coli
Serratia - + - - - + - + -
Grupo Coliformes Proteus - + + + + + + - +

Providencia - + - - + + + - -

Yersinia - - - + - - - - -

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IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA

 Dentro da família Enterobacteriaceae, encontram-se conjuntos de

amostras bacterianas bioquimicamente homogêneas e
 Sorologia após identificação da bactéria proceder a sorologia
sorologicamente relacionadas, que constituem os gêneros e,
caso o resultado seja positivo para E. coli, Salmonella spp ou
segundo alguns critérios, podem dividir-se em espécies.
Shigella sp, utilizando a prova de aglutinação em lâmina.
 As amostras relacionadas bioquimicamente são divididas em
subgrupos ou tipos, por critério sorológico, de acordo com a
presença dos antígenos somático (O), flagelar (H) e de
envoltório ou capsula (K). Desse modo, os sorotipos são
divisões baseadas no relacionamento antigênico, enquanto os
biotipos são amostras do mesmo sorotipo que diferem em
características bioquímicas.

 *Linhagens / Espécie (cepa; estirpe): biotipo; sorotipo/sorovar.

 Escherichia coli O157:H7 (*STEC).

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 PESQUISA DE TOXINAS

KIT sorológico para Salmonella Typhi - Typhidot Termolábil (LT) aglutinação passiva do látex ou ELISA.
Termoestável (ST) de E. coli enterotoxigênica ELISA.

 PESQUISA DE FATORES DE VIRULÊNCIA (E. coli, Shigella sp).

a) Capacidade de interação celular: cultura de células HeLa, Caco-2, Vero.
b) Produção de toxinas:
- Termolábil (LT): aglutinação passiva do látex ou ELISA.
- Termoestável (ST) de E. coli enterotoxigênica: ELISA.
c) Capacidade de resistência ao soro humano normal.
d) Pesquisa de estruturas de superfície: Fímbrias, Proteínas de Membrana
Vídeos: Externa (OMPs), LPS.
https://www.youtube.com/watch?v=JGwwN3AXNMY
https://www.youtube.com/watch?v=NBMuswPV4KU
https://www.youtube.com/watch?v=6vZ5oERZe4s
e) Pesquisa de genes de virulência: sondas genéticas.

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PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS PARA ISOLAMENTO E

IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROPATÓGENOS BACTERIANOS
ROTEIRO PRÁTICO
FEZES
a) Semear as Fezes em:
MEIOS DE ENRIQUECIMENTO AGAR MC Ágar MacConkey / EMB e
AGAR MC SORBITOL 1º Dia Ágar SS / Meios de Enriquecimento
35-37°C/18-24h AGAR SS FEZES DIARREICAS
APA PH 8,5 SELENITO
3ª feira b) Incubar a 35 ºC/24h.
35-37ºC/6-8h 35-37ºC/18- 24 h 35-37ºC/18- 24 h
CISTINA
*Bacterisoscopia
TCBS GSP ASAp AGAR SS TSI + LIA
AGAR XLD
35-37ºC/18-24h
KLIGLER
TSI + LIA TSI+LIA
PROVAS  Observar as características macroscópicas/morfologia das UFC;
LIA BIOQUÍMICAS
2º Dia  Realizar a coloração de Gram da UFC selecionada;
4ª feira  Fazer o repique da UFC selecionada para os tubos das Provas
+ TESTE DE OXIDADE + PROVAS SOROLOGIA PARA
Bioquimica Bioquímica
BIOQUÍMICAS Shigella, Salmonella,  Bioquímicas; e incubar na estufa a 35 ºC/24 horas;
Víbrios Aeromonas EPEC, EIEC, EHEC
 Realizar o Teste da Oxidase.
SOROLOGIA PARA
Identificação em lâmina Salmonella:
c/ antisoro de V.cholerae Antisoros Polivalentes e
Sorogrupo 0:1 Monovalentes
3º Dia  Colocar os reativos e fazer a leitura da Série Bioquímica semeada;
6ª feira  Utilizar a Tabela de Identificação de Enterobactérias;
+ -
Antisoro  Fazer Leitura e Interpretação dos Resultados.
0:139

Sorotipagem do V.cholerae
Inaba Fonte: MSc. Cintya de Oliveira Souza
Ogawa (BAIP/IEC).

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OUTROS MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO

& SISTEMA AUTOMATIZADO

1. Meio RUGAI
2. EPM MILI CITRATO
3. Meios Cromogênicos
4. Sistema Automatizado

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MEIO IAL/RUGAI Meio de Rugai MEIO IAL/RUGAI - Leitura

(*modificado por Pessoa e Silva)
(Pessoa e Silva)
(Meio de IAL – Instituto Adolfo Lutz)
Identificação Presuntiva

Procedimento (*nove provas): com o

auxílio de uma alça de inoculação
(platina), coletar inóculo da colônia a ser
pesquisada e semear através de picada até
o fundo do tubo; em seguida realizar
estrias na superfície do Meio de Rugai.
Incubar em estufa a 35 ± 2 ºC/24h. cera de
carnaúba

Meio Rugai é presuntivo  necessidade de provas

complementares: Citrato de Simmons, a DNAse,
oxidase e a fermentação da lactose.

Fonte: http://biomedicinabrasil.blogspot.com/2011/04/meio-ial-rugai.html

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Meio IAL/Rugai
MEIO IAL/RUGAI - Teste Presuntivo para Enterobactérias (Pessoa e Silva)
8 Provas Bioquímicas

Fonte: http://www.microclinica.ufsc.br/index.php/tab/1/

91 92

Meio EPM MILI - Citrato

Fonte: http://www.probac.com.br/mais.htm

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Meio MILI Meios de Cultura Cromogênicos

A identificação presuntiva é baseada

nas diferentes colorações das colônias
bacterianas, causada pelas reações
enzimáticas espécie ou gênero
específico com substratos
Motilidade
Lisina
Triptofanase
incorporados no meio de cultura,
descarboxilase
necessitando apenas de poucas provas
adicionais confirmatórias.

Motilidade – amostras
móveis se difundem à partir Descarboxilases
Indol – anel de indol faz
promovem remoção de
do inóculo inicial – turvando parte da molécula de
o meio. CO2 dos a.a. – produz
triptofano. Triptofanase age
amina alcalinizando o
Amostras imóveis somente no a.a. – libera anel pirrólico.
meio – cor púrpura
crescem no local onde Coloca-se reativo de Kovacs
Se a.a. não é utilizado, – reage com indol – anel
foram semeadas
através da fermentação vermelho
da glicose, acidifica-se o
meio – amarelo nos 2/3
inferiores
http://www.plastlabor.com.br/produtos-diagnostico/meios-de-cultura-cromog%C3%AAnicos/2

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AUTOMAÇÃO EM MICROBIOLOGIA

Painel para Enterobactérias

http://slideplayer.com.br/slide/1255653/

Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/1255653/
http://www.probac.com.br/docs/catalogo_new.pdf

97 98

Sistema Automatizado
VITEK 2 - bioMérieux

Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/1255653/
https://store.pda.org/TableOfContents/ERMM_V2_Ch01.pdf
https://slideplayer.com.br/slide/1255653/

99 100

REFERÊNCIAS
SISTEMA API 20 E
 BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia Clinica para o
Controle de Infecção Relacionada a Assistência à Saúde. Modulo 6: Detecção e
Identificação de Bactérias de Importância Brasília: Anvisa, 2013.
 OPLUSTIL, Carmem Paz; ZOCCOLI, Cássia Maria; TOBOUTI, Nina Reiko;
SINTO, Sumiko Ikura. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 3 ed.
São Paulo: SARVIER, 2010.
 VERMELHO, A.B. et al. Práticas de Microbiologia. 6 ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2006.
 WINN, W.C.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; KONEMAN, E.W.; PROCOP. G.W.;
SCHRECKENBERGER, P.C.; Woods, G.L. Koneman - Diagnóstico
Microbiológico: texto e atlas colorido. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2018.

SITES DE CONSULTA:
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/MODULO2/introducao.htm

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VÍDEOS Microbiologia Automação

https://www.biomerieux.com.br/produto/vitekr-2
https://www.youtube.com/watch?v=HljNRejPDrU
https://www.youtube.com/watch?v=xlGo5M_1Stw
https://www.youtube.com/watch?v=0DyufjF-P84

PROBAC LABORCLIN NEWPROV

Microbiologia

http://www.probac.com.br/Anexos/Bulas/Identifica%C3%A7%C3%A3o/EPM-
MILi%20Rev.02.pdf
http://www.probac.com.br/Anexos/Bulas/Soros/Soro%20E.coli%20O157%20Rev%2003
.pdf
http://www.probac.com.br/Anexos/Bulas/Identifica%C3%A7%C3%A3o/Oxidase%20-
%20Rev%2003.pdf
http://www.probac.com.br/Download/pt-BR
https://www.laborclin.com.br/
https://www.laborclin.com.br/documentos/
http://www.newprov.com.br/index.php/produtos/listagem/categoria%7Cmicrobiologia

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