UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

LUCAS ALVES SARMENTO PIRES

ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO CRESCIMENTO DO CRÂNIO DE RATOS

SUBMETIDOS A DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO

Niterói, RJ
2019
 LUCAS ALVES SARMENTO PIRES

ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO CRESCIMENTO DO CRÂNIO DE RATOS

SUBMETIDOS A DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO

Dissertação submetida ao Programa de Pós

Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense como parte
dos requisitos necessários à obtenção do Grau
de Mestre. Área de Concentração: Ciências
Médicas.

ORIENTADOR: PROF. DR. MARCIO ANTONIO BABINSKI

COORIENTADOR: PROF. DR. VINICIUS SCHOTT GAMEIRO

Niterói, RJ
2019
 LUCAS ALVES SARMENTO PIRES

ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO CRESCIMENTO DO CRÂNIO DE RATOS

SUBMETIDOS A DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO

Dissertação submetida ao Programa de Pós

Graduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal Fluminense como parte
dos requisitos necessários à obtenção do Grau
de Mestre. Área de Concentração: Ciências
Médicas.

Aprovado em 30 de janeiro de 2019.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________________________

Prof. Dr. Alair Augusto Sarmet Moreira Damas dos Santos

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF

____________________________________________________________________

Prof. Dr. Marcelo Abidu-Figueiredo

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO - UFRRJ

____________________________________________________________________

Prof. Dr. Renato Luiz Silveira

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF

Niterói
2019
 Dedico este trabalho a Deus por me dar
força e esperança nessa jornada.
 AGRADECIMENTOS

O primeiro agradecimento irá para Deus, pois essa trajetória inteira jamais teria
acontecido sem que Ele me guiasse para tal.
Gostaria de agradecer a minha família, em especial, meus pais - Valdinete e Paulo
Roberto - por nunca me desmotivarem, por mais difíceis que as coisas tenham ficado com o
passar dos anos.
Agradeço ao meu orientador, conselheiro e amigo Marcio Babinski por nunca ter
duvidado da minha capacidade e sempre ter me incentivado.
Agradeço também aos professores Carlos Chagas, Jorge Manaia e Vinícius Schott
pela força e ajuda. Em especial, agradeço ao professor Albino Fonseca por ter auxiliado na
técnica histológica.
Agradeço ao staff inteiro da Pós Graduação em Ciências Médicas por terem me dado
a oportunidade de realizar e concluir este trabalho e a CAPES/CNPQ pelo incentivo
financeiro dado. Devo agradecer, também, aos colegas da Radiologia do Hospital
Universitário Antônio Pedro, por terem cedido espaço para a realização de parte desta
dissertação.
Por fim, gostaria de agradecer a todos aqueles que deram apoio direta ou
indiretamente. Espero que saibam o quão foram importantes para a conclusão deste trabalho.
 “Dê-me, Senhor, agudeza para entender, capacidade para
reter, método e faculdade para aprender, sutileza para interpretar,
graça e abundância para falar. Dê-me, Senhor, acerto ao começar,
direção ao progredir e perfeição ao concluir”.

Tomás de Aquino (1225-1274)

 RESUMO

A desnutrição é um problema de saúde pública mundial. Dados da Organização Mundial de

Saúde relatam que aproximadamente um quarto das crianças menores que 5 anos possuem
alguma forma de retardo em seu crescimento. Estudos experimentais demonstram alterações
estruturais, metabólicas e funcionais em diversos sistemas causadas pela desnutrição materna
durante o período gestacional e durante o período de aleitamento. No entanto, há escassez na
literatura a respeito dos efeitos crônicos da desnutrição durante o período de lactação no
tecido ósseo. O objetivo deste trabalho é verificar as alterações morfométricas do crânio de
ratos Wistar adultos cujas progenitoras foram desnutridas durante a lactação. Trinta e seis
ratos recém-nascidos foram divididos em três grupos: grupo controle, no qual a mãe recebeu
dieta comercial regular contendo 23% de proteína em quantidades ilimitadas; grupo restrição
proteico-calórica, no qual a mãe recebeu uma dieta comercial contendo 8% de proteína em
quantidades ilimitadas; o grupo com restrição calórica, no qual a mãe recebeu uma dieta
comercial contendo 23% de proteína em quantidades limitadas. Essas dietas foram
administradas somente durante o período de amamentação. Após o desmame, todos os ratos
receberam a mesma dieta que o grupo controle até os 180 dias de idade. Em seguida, os ratos
foram eutanasiados, seus crânios foram excisados e mensurados através de imagens
radiográficas e paquímetro digital. Posteriormente, seus crânios foram descalcificados com
ácido nítrico (5%) e amostras histológicas foram obtidas. A espessura do crânio, o número de
lacunas vazias e o tamanho destas lacunas foram verificados. Foi realizado o teste ANOVA
seguido pelo teste de Newman-Keuls para fins de comparação. Observou-se que o crânio dos
grupos restrição de proteíco-calórica e restrição calórica foi menor em relação ao grupo
controle, assim como a análise histológica demonstrou menor espessura do násion e bregma
do grupo restrição proteíco-calórica quando comparados com o grupo controle. Em resumo, a
desnutrição materna durante o período de lactação causou efeitos em longo prazo na
morfologia craniana de ratos Wistar. Estes efeitos não puderam ser revertidos após a
regulação da dieta.

Palavras-chave: Ratos Wistar. Crânio. Desnutrição Materna. Lactação. Histomorfometria.

 ABSTRACT

Malnutrition is a global public health problem. Data from the World Health Organization
report that approximately one quarter of children under the age of 5 have some form of
retardation in their growth. Experimental studies demonstrate structural, metabolic and
functional changes in several tissues caused by maternal malnutrition during the gestational
period and during the lactation period. However, there is a lack in the literature regarding the
chronic effects of malnutrition during the lactation period in bone tissue. Thirty-six newborn
Wistar rats were divided into three groups: control group, in which the mother received a
regular commercial diet containing 23% of protein in unlimited amounts; protein-energy
restriction group, in which the dam received a commercial diet containing 8% of protein in
unlimited amounts; the energy restricted group, in which the dam received a commercial diet
containing 23% of protein in limited amounts. After weaning, all rats received the same diet
as the control group until 180 days of age. Then, the rats were euthanized; their skulls were
excised and measured by radiographic images and digital caliper. Subsequently, their skulls
were decalcified with nitric acid (5%) and histological samples were obtained. The thickness
of the skull, the number of empty lacunae and the size of these lacunae were verified. The
ANOVA test was performed, followed by the Newman-Keuls test for comparison purposes. It
was observed that the cranium of the protein-calorie restriction and caloric restriction groups
was smaller in relation to the control group. The histological analysis also demonstrated a
reduced thickness of the nasion and bregma from the protein-calorie restriction group when
compared with the control group. In summary, maternal malnutrition during the lactation
period had long-term effects on the cranial morphology of Wistar rats. These effects could not
be reversed after dietary regulation.

Keywords: Wistar rats. Skull. Maternal malnutrition. Breastfeeding. Histomorphometry.

 LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Composição da dieta normoproteica e hipoproteica, p. 21

TABELA 2 – Composição da mistura de vitaminas, p. 22
TABELA 3 – Composição da mistura de minerais, p. 23
TABELA 4 – Pontos de reparo para realização das mensurações macroscópicas, p. 25
TABELA 5 – Resultados morfométricos dos ratos adultos (180 dias), p. 36
TABELA 6 – Espessura do crânio nos três grupos, p. 40
 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (L1, L2, L3, L4 e C4), p. 26

Figura 2 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (C3, C5 e C6), p. 27
Figura 3 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A1, A2, C1 e C2), p. 28
Figura 4 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A4 e A5), p. 29
Figura 5 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A3 e C7), p. 30
Figura 6 – MORFOMETRIA NA RADIOGRAFIA, p. 30
Figura 7 – PONTOS DE CORTE HISTOLÓGICO, p. 31
Figura 8 – MENSURAÇÃO DA ESPESSURA DOS OSSOS, p. 32
Gráfico 1 – PESO TOTAL DOS ANIMAIS AO TÉRMINO DO ESTUDO, p. 34
Gráfico 2 – PESO TOTAL DOS CRÂNIOS AO TÉRMINO DO ESTUDO, p. 35
Figura 9 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO CONTROLE, p. 37
Figura 10 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO RESTRIÇÃO
CALÓRICA, p. 38
Figura 11 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO RESTRIÇÃO
PROTEÍCO-CALÓRICA, p. 39
Gráfico 3 – ESPESSURA DO CRÂNIO NOS PONTOS ESTUDADOS DOS 3 GRUPOS, p.
41
 LISTA DE ABREVIATURAS

A1 – Altura 1
A2 – Altura 2
A3 – Altura 3
A4 – Altura 4
A5 – Altura 5
C – Grupo controle
C1 – Comprimento 1
C2 – Comprimento 2
C3 – Comprimento 3
C4 – Comprimento 4
C5 – Comprimento 5
C6 – Comprimento 6
C7 – Comprimento 7
L1 – Largura 1
L2 – Largura 2
L3 – Largura 3
L4 – Largura 4
MS – Ministério da Saúde
OMS – Organização Mundial de Saúde
RC – Grupo restrição calórica
RPC – Grupo restrição protéico-calórica
vs – Versus
 SUMÁRIO

1 JUSTIFICATIVA, p. 14
2 OBJETIVOS, p. 15
2.1 OBJETIVO GERAL, p. 15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 15
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p. 16
3.1 TECIDO ÓSSEO E O CRÂNIO, p. 16
3.2 O ALEITAMENTO MATERNO, p. 17
3.3 A DESNUTRIÇÃO MATERNA E SEUS EFEITOS, p. 18
4 MATERIAIS E MÉTODOS, p. 20
4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS, p. 20
4.2 AMOSTRA E DIETA, p. 20
4.3 EUTANÁSIA, MORFOMETRIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO, p. 23
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 32
5 RESULTADOS, p. 34
5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA, p. 34
5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA, p. 37
6 DISCUSSÃO, p. 42
7 CONCLUSÕES, p. 46
8 OBRAS CITADAS, p. 47
9 ANEXOS, p. 52
9.1 APROVAÇÃO EM COMITÊ DE ÉTICA, p. 52
9.2 PROTOCOLO DE CONVÊNIO DE PESQUISA, p. 53
9.3 PROTOCOLO DE DOAÇÃO DE MATERIAIS, p. 54
9.4 E-MAIL PARA O COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADOS EM ANIMAIS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, p. 55
9.5 RESPOSTA DO COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADO EM ANIMAIS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, p. 56
 14

1 JUSTIFICATIVA

Apesar das taxas de desnutrição materna terem declinado nas duas últimas
décadas, essa condição ainda prevalece em países de baixa e média renda (Black et al.,
2013). Dados mais recentes da Organização Mundial de Saúde (OMS) demonstram que
24.7% das crianças menores de 5 anos possuem retardo no crescimento, enquanto que
15.1% das crianças menores de 5 anos estão desnutridas. Além disso, somente 37% dos
recém-nascidos são amamentados de forma exclusiva até os 6 meses de idade (World
Health Organization, 2014).
Estudos prévios demonstram inúmeras alterações estruturais, metabólicas e
funcionais em diversos sistemas causadas pela desnutrição materna durante o período
gestacional (Confortim et al., 2017; Howie et al., 2012; Mehta et al., 2002) e durante o
período de aleitamento (Babinski et al., 2016; Gautsch et al., 1999; Passos et al., 2000;
Ramos et al., 2000; Schultz et al., 2017).
De modo geral, são numerosos os estudos a respeito da desnutrição materna,
porém, poucos trabalhos avaliaram os efeitos da desnutrição materna durante o período
de lactação. São ainda mais escassos aqueles que avaliam tais efeitos no crânio
(Fernandes et al., 2008; Luna et al., 2016). Ainda, estudos realizados em ossos como o
fêmur, a tíbia e a mandíbula, demonstraram a ação deletéria da desnutrição durante e
após o período de lactação (Alippi et al., 1999; Alippi et al., 2002; Babinski et al., 2016;
Bozzini et al., 2011; Degani Junior et al., 2011; Giglio et al., 1998; Shin et al., 2015).
Logo, a falta de informações na literatura relativas ao crescimento e
desenvolvimento morfológico e estrutural do crânio sob um quadro de desnutrição,
associadas ao enorme significado do estudo dos efeitos da desnutrição materna e suas
consequências para o crescimento fetal motivou a realização desse estudo.
 15

2 OBJETIVOS
.

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar as alterações morfométricas do crânio da prole de ratos que sofreram

desnutrição no período de aleitamento e que receberam dieta normocalórica e
normoproteica após o desmame até a idade adulta.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar e comparar as alterações no crescimento ósseo do crânio de filhotes na

idade adulta (180 dias) relacionando as possíveis alterações morfológicas e
morfométricas.
Avaliar macroscopicamente as possíveis alterações a longo prazo causadas em
filhotes de ratas desnutridas durante o período de aleitamento.
Verificar as possíveis alterações microscópicas no tecido ósseo do crânio em
ratos cujas progenitoras foram submetidas à desnutrição no período de lactação.
 16

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 TECIDO ÓSSEO E O CRÂNIO

O tecido ósseo é responsável pelo suporte e proteção dos tecidos moles, como o
sistema nervoso e o conteúdo da caixa torácica. Possuem função hematopoiética e
possuem papel essencial na dinâmica do movimento (Junqueira & Carneiro, 2013).
Além disso, os ossos funcionam como depósitos de cálcio, fosfato e outros íons,
tornando-os imprescindíveis para a manutenção da concentração desses íons no corpo
humano (Junqueira & Carneiro, 2013; Tortora & Derrickson, 2014).
O tecido ósseo é composto por osteócitos, osteoblastos, osteoclastos e matriz
óssea (formada essencialmente por íons de cálcio e fosfato). Esta última é responsável
pela rigidez do osso (Junqueira & Carneiro, 2013).
O surgimento do tecido ósseo se dá por meio de duas distintas formas: através da
ossificação intramembranosa, que ocorre no interior de uma membrana conjuntiva ou
através da ossificação endocondral, que parte de um molde de cartilagem hialina. A
ossificação intramembranosa ocorre nos ossos que compõem o neurocrânio, e a
ossificação endocondral ocorre em alguns ossos que compõem o víscerocrânio e em
ossos curtos e longos que compõem o esqueleto apendicular (Junqueira & Carneiro,
2013; Pires et al., 2016; Testut & Latarjet, 1958)
O desenvolvimento dos ossos é dependente de uma relação harmoniosa entre
processos de criação e destruição tecidual. Esse processo é influenciado por diversos
fatores, dentre eles o estímulo hormonal, hábitos de vida e hábitos alimentares (Testut &
Latarjet, 1958; Tritos & Klibanski, 2016; Weaver, 2017).
O crânio humano é formado por um conjunto de 26 ossos, e é dividido em
neurocrânio (8 ossos) e víscerocrânio (14 ossos). O crânio se articula com a primeira
vértebra cervical da coluna vertebral através da articulação atlanto-occipital. Todos os
ossos do crânio, com excessão da mandíbula, articulam-se entre si através de
articulações fibrosas, bastante resistentes e pouco móveis (Testut & Jacob, 1952; Testut
& Latarjet, 1958).
 17

Em ratos Wistar, o crânio se demonstra similar ao de humanos no que se refere

ao número de ossos e nomenclatura, porém, este possui diferenças como a presença de
um osso pre-esfenóide e um basiesfenóide, ao invés do osso esfenoide, que se deve a
ausência de união de pontos de ossificação, como ocorre em humanos (Greene, 1935;
Testut & Latarjet, 1958).
Outras diferenças podem ser encontradas no osso temporal, que é formado por
peças ósseas que se ossificam isoladamente, criando um “complexo” temporal, além da
presença de um osso supranumerário: o interparietal (Greene, 1935; Testut & Latarjet,
1958; Wysocki, 2008) (Greene, 1935; Testut e Latarjet, 1958; Wysocki, 2008).
Ainda, muitas estruturas podem aparecer em crânios humanos como variações
anatômicas vestigiais, por exemplo, o processo paramastóideo e o osso interparietal (os
inca) (Greene, 1935; Testut & Latarjet, 1958; Tubbs et al., 2016).

3.2 O ALEITAMENTO MATERNO

De acordo com o Ministério da Saúde (MS), o aleitamento é um processo que

implica em um relacionamento sadio entre mãe e filho que por sua vez influencia não
somente o estado nutricional da criança, como também outros sistemas de seu
organismo (Brasil, 2009; World Health Organization, 2000).
A OMS e o MS preconizam o aleitamento materno exclusivo até os 6 meses de
idade, e este aleitamento pode se tornar complementar a outro tipo de dieta até os 2 ou 3
anos de idade (Brasil, 2009; World Health Organization, 2000; World Health
Organization, 2002).
O período de lactação é essencial para o desenvolvimento geral da criança, e, é
imprescindível para evitar diarréias, infecções e alergias, além de diminuir o risco de
diabetes, hipertensão, hipercolesterolemia e obesidade. Ainda, o período de aleitamento
exclusivo previne mortes infantis (Jeong et al., 2017; Kavle et al., 2018; Victora et al.,
2016)
Sabe-se que a dieta da lactante influencia diretamente na quantidade e na
qualidade do leite oferecido, portanto, é necessário a maior ingestão de calorias e
 18

proteínas e o consumo de uma dieta variada de modo a manter a oferta de leite de

qualidade para o filho (Ares Segura et al., 2016; Plecas et al., 2014).
Em ratos, o período de aleitamento é de 21 dias, o que torna este animal propício
para experimentos relacionados à esse momento, além de fácil acesso e manuseio do
modelo experimental (Quinn, 2005; Vandamme, 2014).

3.3 A DESNUTRIÇÃO MATERNA E SEUS EFEITOS

A desnutrição é caracterizada com uma ingesta pobre de nutrientes essenciais e

necessários para a manutenção da saúde. Pode ser causada tanto pela ausência de
alimento, em países subdesenvolvidos, ou por hábitos alimentares inadequados, em
países desenvolvidos, em especial, devido ao advento das “fast-foods”, pois são de fácil
acesso e não requerem esforço da parte do consumidor (Ahsan et al., 2017; Kavle et al.,
2018).
A desnutrição é uma das principais causas de morte entre crianças e ainda
persiste nos dias atuais. Esse fato é preocupante, pois o estado nutricional é de extrema
importância para a saúde de um indivíduo, seja adulto ou criança (Ahsan et al., 2017;
Black et al., 2013; Kavle et al., 2018).
Inúmeras deficiências nutricionais durante a gestação e lactação, como por
exemplo, a anemia e a desnutrição, implicam em uma diminuição no peso total do feto,
assim como diminuição na sua capacidade de desenvolvimento, com subsequente
alteração no binônimo materno-fetal (Francisqueti et al., 2012; Haileslassie et al., 2013;
Rodriguez et al., 1991).
Além disso, estudos em animais mostraram que a diminuição da massa corporal
do grupo estudado em relação ao grupo controle permanece até a idade adulta, mesmo
que os animais submetidos à desnutrição proteica materna durante o aleitamento
consumissem dieta normal após o desmame. Ao atingirem a idade adulta, a massa
corporal média dos animais em estudo era cerca de 10% menor que o grupo controle
(Passos et al., 2000).
O estado nutricional também influencia no tempo de hospitalização e risco de
óbito no intra e pós-operatório. Estudos mostram que os pacientes que possuem um
 19

déficit nutricional apresentam recuperação cirúrgica retardada, o que gera oneração

maior às instituições hospitalares (Kyle & Coss-Bu, 2010; Mamun et al., 2011). Esse
dado é de extrema relevância, pois, no Brasil, o número de cirurgias de cesarianas varia
de 35% a 65%, de acordo com a região (Ramires de Jesus et al., 2015).
A desnutrição materna durante o período de aleitamento pode causar inúmeras
alterações em diversos sistemas na prole de animais, a saber: diminuição da secreção de
insulina (Barbosa et al., 2002), comportamento depressivo e de ansiedade (Belluscio et
al., 2014), alterações no desenvolvimento do sistema nervoso e da mielinização das
fibras dos axônios (Belluscio et al., 2014; Noback & Eisenman, 1981; Plagemann et al.,
2000), retardo no desenvolvimento de reflexos neurológicos (Belluscio et al., 2014),
diminuição de fibras musculares no músculo estriado esquelético (Confortim et al.,
2017), disfunções no sistema reprodutor (Brasil et al., 2005; Howie et al., 2012; Ramos
et al., 2010), déficit no crescimento do tecido hepático (Lee et al., 2016)) e desregulação
da glândula tireóide (Ramos et al., 1997; Ramos et al., 2000).
No tecido ósseo, estudos demonstraram que a desnutrição crônica em ratos que
estão na idade de crescimento afeta de forma negativa o crescimento (densidade óssea)
e a força da mandíbula (Bozzini et al., 2011) e a espessura de vértebras (Hengsberger et
al., 2005).
Estudos em que a restrição proteico-calórica foi realizada nas parturientes
durante o período de lactação são escassos, porém, trabalhos que avaliaram o
crescimento da mandíbula (Alippi et al., 1999; Degani Junior et al., 2011), tíbia
(Fernandes et al., 2007), crânio (Fernandes et al., 2008; Luna et al., 2016) e fêmur
(Babinski et al., 2016; Schultz et al., 2017) demonstraram os efeitos prejudiciais e
irreversíveis em muitos dos casos, porém, vale ressaltar que muitos destes estudos
foram realizados à curto prazo, portanto, não observaram alterações em ratos adultos.
 20

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para o cuidado e uso de animais
experimentais do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro sob o nº CEUA/036/2010 (Anexo 1) e compõe o protocolo de
colaboração científica entre a Universidade do Estado do Rio de Janeiro e Universidade
Federal Fluminense (Anexos 2 e 3). Não foi necessária nova aprovação em comitê de
ética conforme parecer do Coordenador do Comitê de Ética em Animal da Universidade
Federal Fluminense (Anexos 4 e 5).
O manejo dos animais ocorreu de acordo com os princípios descritos em “The
guide for the care and use of laboratory animals” (Bayne, 1996), “CIOMS Ethical code
for animal experimentation” (Howard-Jones, 1985) e “Use of animals in experimental
surgery” (Schanaider & Silva, 2004).

4.2 AMOSTRA E DIETA

Seis ratas Wistar fêmeas, nulíparas, foram mantidas em biotério com

temperatura padronizada (25°C com variabilidade de 10°C para mais ou para menos) e
ciclo claro-escuro (7:00-19:00). Aos três meses de idade (90 dias) estes animais
acasalaram na proporção de duas fêmeas para um macho, recebendo ração comercial
(23% de proteína) até o nascimento dos filhotes, quando então, foram divididas em 3
grupos de estudo:
• Grupo controle (C): com livre acesso à água e à dieta normal (ração
comercial com 23% de proteína);
• Grupo restrição proteico-calórica (RPC): com livre acesso à água e à
dieta hipoproteica (8% de proteína);
• Grupo restrição calórica (RC): com livre acesso à água, porém submetido
à dieta normal (ração comercial com 23% de proteína) restrita às mesmas
quantidades ingeridas no dia anterior pelo grupo RPC.
 21

Dessa maneira, os três grupos foram compostos por 12 filhotes machos cada,
associados à uma progenitora na proporção de um pra seis, pois, alguns autores afirmam
que esse número confere maior potencial lactotrófico (Fishbeck & Rasmussen, 1987).
A dieta hipoproteica foi preparada manualmente e administrada no dia do
nascimento dos filhotes. Sua composição pode ser verificada na Tabela 1. A fonte
proteica (8%) desta dieta foi ração comercial macerada (Labina® - Purina Nutrimentos
LTDA) e as calorias foram compensadas através de acréscimo de amido de milho, a fim
de se obter uma dieta hipoproteica e isocalórica. Para avaliar a eficácia das dietas, os
animais foram pesados em intervalos de 4 dias durante o estudo.
As vitaminas e os minerais foram suplementados de maneira a se obter a mesma
composição da ração comercial, mostrada nas Tabelas 2 e 3, que é baseada nas
recomendações do National Research Council e National Institute of Health - USA
(Reeves et al., 1993).

Tabela 1 – Composição da dieta normoproteica e hipoproteica

Dieta (kg)
Nutriente
Normoproteica Hipoproteica
Energia total (kcal) 4070,4 4070,4
Proteína (%) 23,0 8,0
Hidratos de Carbono (%) 66,0 81,0
Lipídeos (%) 11,0 11,0
Proteína (g) 230,0 80,0
Hidratos de Carbono (g) 676,0 826,0
Lipídeos (g) 50,0 50,0
Mistura de Vitaminas (g) 4,0 4,0
Mistura de Sais Minerais (g) 40,0 40,0
 22

Tabela 2 – Composição da mistura de vitaminas

Vitaminas g/kg de mistura
Ácido Nicotínico 3,000
Ácido Pantotênico 1,600
Piridoxina - B6 0,700
Tiamina - B1 0,600
Riboflavina 0,600
Ácido Fólico 0,200
Biotina 0,020
Cianocobalamina - B12 2,500
Vitamina E (500 UI/g) 15,00
Vitamina A (500,000 UI/g) 0,800
Vitamina D (400,000 UI/g) 0,250
Vitamina K 0,075
Fonte: Reeves et al. (1993).
 23

Tabela 3 – Composição da mistura de minerais

Minerais g/kg de mistura
Carbonato de cálcio, 40,04% Ca 357,00
Fosfato de Potássio, 22,76% P; 28,73% K 196,00
Citrato de Potássio, 36,16% K 70,78
Cloreto de Sódio, 39,34% Na; 60,66% Cl 74,00
Sulfato de Potássio, 44,87% K; 18,39% S 46,60
Óxido de Magnésio, 60,32% Mg 24,00
Citrato de Ferro, 16,5% Fé 6,06
Carbonato de Zinco, 52,14% Zn 1,65
Carbonato de Manganês, 47,79% Mn 0,63
Carbonato de Cobre, 57,47% Cu 0,30
Iodeto de Potássio, 59,3% I 0,01
Selenato de Sódio, 41,79% Se 0,010
Paramolibidato de Amônio, 54,34% Mo 0,008
Fonte: Reeves et al. (1993).

4.3 EUTANÁSIA, MORFOMETRIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

Ao final da lactação, os filhotes de todos os grupos foram desmamados e

passaram a receber a mesma ração normoproteica do grupo controle (23% de proteína),
sendo acompanhados até 180 dias de idade, quando foram eutanasiados com
pentobarbital (0,15 ml/100g/peso corporal). A escolha do tempo de duração do estudo
foi baseada no trabalho de Quinn (2005), que sugeriu que um rato de 180 dias de idade
é equivalente a um jovem adulto de 18 anos.
O crânio de cada animal foi excisado e fixado em formol a 10% e
posteriormente macerado com o propósito de obter crânios secos. Em seguida, os
parâmetros morfométricos presentes na Tabela 4 e ilustrados nas Figuras 1, 2, 3, 4 e 5
foram mensurados com o auxílio de um paquímetro digital (Mitutoyo Sul Americana
Ltda®, São Paulo, Brasil) e através de radiografias (Philips®, Digital Diagnost® -
 24

ELEVA® 2.1) em duas incidências: perfil e superior, ambas representadas na Figura 6.

Para as radiografias, foram utilizados foco fino, 5 miliampere/s e 10 quilovolts.
 25

Tabela 4 – Pontos de reparo para realização das mensurações macroscópicas.

Parâmetro Definição

Altura 1 (A1) Distância entre a ponta superior da crista occipital externa e o nível do
forame magno (altura máxima do neurocrânio, nível occipital da caixa
craniana);
Altura 2 (A2) Distância entre a borda ântero-medial da bula timpânica direita e a superfície
mais dorsoventral do crânio (altura máxima do neurocrânio, nivel parietal da
caixa craniana);
Altura 3 (A3) Distância entre as paredes superior e inferior direita da órbita - nível da
fissura infraorbitária (altura máxima da cavidade orbital);
Altura 4 (A4) Distância entre a espinha nasal posterior e o bregma (altura máxima do
neurocrânio, nível frontoparietal do caixa craniana);
Altura 5 (A5) Distância entre a espinha nasal posterior e o lambda (altura máxima do
neurocrânio, nível parieto-occipital da caixa craniana);
Comprimento 1 Distância entre a protuberância occipital externa e a margem alveolar do
(C1) osso incisivo (comprimento retangular máximo do neurocrânio);
Comprimento 2 Distância entre a protuberância occipital externa e a margem alveolar do
(C2) osso incisivo (comprimento dorsoventral máximo do neurocrânio);
Comprimento 3 Distância entre o aspecto mais ventral do forame magno e da margem do
(C3) osso alveolar incisivo no plano mediano (comprimento máximo do
neurocrânio basal);
Comprimento 4 Distância da ponta mais ventral do osso nasal até a sutura frontonasal
(C4) (comprimento máximo do osso nasal);
Comprimento Distância entre a espinha nasal posterior e a margem alveolar do osso
5 (C5) incisivo (comprimento máximo do osso palatino);
Comprimento 6 Distância entre o aspecto mais ventral do forame magno e a espinha nasal
(C6) posterior (comprimento máximo do osso esfenoide);
Comprimento 7 Distância entre o aspecto mais ventral da margem infraorbital e supraorbital
(C7) do lado direito (comprimento máximo da cavidade orbital);
Largura 1 (L1) Distância entre a margem direita e esquerda da sutura nasomaxilar no nível
da borda infraorbital medial (largura nasal);
Largura 2 (L2) Distância entre a face lateral da borda infraorbital pré-maxilar direita e
esquerda (largura do pré-maxilar);
Largura 3 (L3) Distância entre a região mais estreita (linha temporal, nível da sutura
processo zigomático-malar) à direita e à esquerda do osso frontal (largura
frontal);
Largura 4 (L4) Distância entre borda ântero-medial da bula timpânica direita e a borda
ântero-medial da bula timpânica esquerda.
Fonte: Fernandes et al. (2008).
 26

Figura 1 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (L1, L2, L3, L4 e C4)

Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no

presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
 27

Figura 2 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (C3, C5 e C6)

Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no

presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
 28

Figura 3 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A1, A2, C1 e C2)

Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no

presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
 29

Figura 4 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A4 e A5)

Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no

presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
 30

Figura 5 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A3 e C7)

Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no

presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.

Figura 6 – MORFOMETRIA NA RADIOGRAFIA

Exemplificação das mensurações realizadas através da radiografia. Fonte: Dados

do estudo.
 31

Para a análise histomorfométrica, as amostras foram descalcificadas em uma

solução de ácido nítrico a 5%. Após isso, foram realizadas secções frontais de 5µm de
espessura de quatro regiões da díploe do neurocrânio (násion, bregma, vértex e ínion,
Figura 7) e estes fragmentossofreram preparação histológica de rotina e posterior
inclusão em parafina (Behmer et al., 1975).

Figura 7 – PONTOS DE CORTE HISTOLÓGICO

Regiões de cortes coronais para análise histológica. Legenda: 1: násion; 2:

bregma; 3: vertex; 4: ínion. Adaptado de Greene (1935).

Após este processamento e subsequente corte, os fragmentos foram corados com

hematoxilina & eosina (H&E) (Bancroft & Stevens, 1996) e levadas ao microscópio de
luz para observação e captura de imagens para serem analisadas pelo software ImageJ®
(versão 1.52, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA).
Cinco mensurações aleatórias foram realizadas em cinco campos aleatórios de
cada lâmina (aumento de 40X), conforme exemplifica a Figura 8. Estes dados foram
expressos em milímetros (mm).
 32

Figura 8 – MENSURAÇÃO DA ESPESSURA DO OSSO

Exemplificação de como a espessura do crânio nos quatro pontos (ínion, bregma,

vértex e násion) foi obtida. Aumento de 40X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do
estudo.

As lacunas foram analisadas em cinco campos aleatórios do osso cortical

(aumento de 100X), seu tamanho foi expresso em micrômetros (µm) e a quantidade de
lacunas vazias (proporção entre lacunas preenchidas e lacunas vazias) foi expressa em
percentual. Estes parâmetros histomorfométricos foram baseados no artigo de Vidal et
al. (2012).
As imagens para análise foram obtidas em microscópio óptico Olympus
acoplado a uma câmera de vídeo Sony CCD, sendo a imagem dos campos
microscópicos transferida para um monitor.

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada com auxílio do programa estatístico IBM SPSS
(versão 21, Armonk, New York, USA). Os dados apresentados neste trabalho estão sob
o formato de média e desvio padrão (média±desvio padrão ou percentual±desvio
padrão). O teste estatístico de ANOVA (análise de variância) seguido pelo teste de
Newman-Keuls foi utilizado para comparar as médias entre os três grupos estudados.
 33

O teste qui-quadrado foi utilizado para comparar o percentual de lacunas vazias

entre os grupos. O teste de Bland-Altman foi utilizado para comparar os dados
morfométricos coletados via mensuração com paquímetro e via mensuração através de
radiografias.
Para todas as análises estatísticas, o valor de p < 0,05 foi considerado
estatisticamente significativo.
 34

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA

O peso médio em grama dos animais ao término do estudo foi de 483,2 ±47,6,
415,7± 39,8 e 402,7±42,87 para os grupos C, RC e RPC, respectivamente (Gráfico 1).
Quando o grupo C foi comparado com os grupos RC e RPC houve diferença
significativa (p < 0,05), porém, quando o grupo RC foi comparado com o grupo RPC,
não houve (p > 0,05).
Gráfico 1 – PESO TOTAL DOS ANIMAIS AO TÉRMINO DO ESTUDO

Peso total dos ratos no último dia de estudo (em gramas). As diferenças entre o
grupo C e os grupos RC e RPC foram significativas. Já as diferenças entre o grupo RC e
o grupo RPC não foram estatisticamente significativas. Fonte: Dados da pesquisa.

A média do peso dos crânios foi de 9,17±1,87 g, 8.96±3,55 g e 7,98±2,13 g para

os grupos C, RC e RPC, respectivamente. Esses valores não tiveram diferenças
estatisticamente significativas (p > 0,05). O peso dos animais e o peso do crânio pode
ser conferido no Gráfico 2.
 35

Gráfico 2 – PESO TOTAL DOS CRÂNIOS AO TÉRMINO DO ESTUDO

Peso total dos crânios nos três grupos (em gramas). Não houve diferença
significativa. Fonte: Dados do estudo.

Em relação às medidas de altura, foi observado que houve uma redução

estatisticamente significativa (p < 0,05) entre o grupo C e o grupo RPC em todas as
mensurações realizadas. Quando o grupo C foi comparado com o grupo RC, somente a
medida A3 foi estatisticamente significativa (p < 0,05). Quando o grupo RC foi
comparado com o grupo RPC, as mensurações A1 e A1 foram estatisticamente
significativas (p < 0,05).
Em relação ao comprimento, foi observada redução estatisticamente significativa
nas medidas C3, C5 e C6 quando o grupo C foi comparado com o grupo RC (P < 0,05).
Quando o grupo C foi comparado com o grupo RPC, as medidas C3, C4, C5 e C6
tiveram diferenças significativas (p < 0,05). Porém, quando o grupo RC foi comparado
com o grupo RPC, nenhuma mensuração teve diferença significativa (p > 0,05).
Ao compararmos a largura do crânio dos grupos C e RC, somente a largura do
pré-maxilar (L2) teve alterações estatisticamente significativas (p < 0,05). Quando o
grupo C foi comparado com o grupo RPC, as medidas L1, L2 e L3 tiveram diferenças
estatisticamente significativas (p < 0,05). Ao compararmos o grupo RC com o grupo
RPC, não houve diferença significativa (p > 0,05) em nenhuma mensuração.
A média e a análise estatística para cada mensuração pode ser conferida na
Tabela 5.
 36

Tabela 5 – Resultados morfométricos (em milímetros) dos ratos adultos (180 dias)
Grupos Valor de p

Parâmetro C RC RPC C vs C vs RC vs

RC RPC RPC

Altura 1 12,49±0,42 12,17±0,29 11,29±0,38 > 0,05 < 0,05 < 0,05

Altura 2 14,93±0,59 14,70±0,28 14,29±0,87 > 0,05 < 0,05 < 0,05

Altura 3 4,97±0,32 4,58±0,22 4,49±0,25 < 0,05 < 0,05 > 0,05

Altura 4 13,49±0,37 13,29±0,34 13,02±0,60 > 0,05 < 0,05 > 0,05

Altura 5 18,03±0,58 17,70±0,40 17,10±0,70 > 0,05 < 0,05 > 0,05

Comprimento 1 48,06±1,37 47,52±1,05 47,43±0,99 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Comprimento 2 47,81±1,45 47,17±1,00 47,14±0,95 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Comprimento 3 45,79±1,37 44,91±1,03 44,74±1,06 < 0,05 < 0,05 > 0,05

Comprimento 4 19,64±0,71 19,04±0,83 18,83±0,46 > 0,05 < 0,05 > 0,05

Comprimento 5 26,92±0,79 26,59±0,61 26,47±0,52 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Comprimento 6 27,04±0,81 26,72±0,59 26,73±0,54 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Comprimento 7 6,25±0,31 5,85±0,35 5,59±0,22 < 0,05 < 0,05 > 0,05

Largura 1 4,48±0,19 4,38±0,22 4,17±0,22 > 0,05 < 0,05 > 0,05

Largura 2 8,03±0,23 7,69±0,16 7,61±0,13 < 0,05 < 0,05 > 0,05

Largura 3 7,40±0,19 7,25±0,21 7,09±0,22 > 0,05 < 0,05 > 0,05

Largura 4 17,06±0,41 17,16±0,25 17,00±0,34 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Resultados expressos em milímetros através de média±desvio padrão (12

animais por grupo). Legenda: C: grupo controle; RC: grupo restrição calórica; RPC:
grupo restrição protéico-calórica Fonte: Dados da pesquisa.

Não houve diferenças significativas entre as mensurações realizadas com auxílio

do paquímetro digital e as mensurações feitas através de radiografias (p > 0,05).
 37

5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA

Foi observado nas imagens histológicas que os grupos RC e RPC tiveram uma
proporção maior de lacunas vazias no osso cortical do que o grupo C (Figuras 9, 10 e
11). As proporções de lacunas vazias para os grupos C, RC e RPC foram: 7,65%±2,23,
8,36%±3,67, e 10,41%±2.91, respectivamente. Essa diferença não foi estatisticamente
significativa (p > 0,05).

Figura 9 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO

CONTROLE

Há uma pouca proporção de lacunas vazias (seta preta) no grupo controle.

Aumento de 100X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do estudo.
 38

Figura 10 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO

RESTRIÇÃO CALÓRICA

Há uma proporção de lacunas vazias (setas pretas) ligeiramente maior que o

grupo controle. Aumento de 100X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do estudo.
 39

Figura 11 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO

RESTRIÇÃO PROTEÍCO-CALÓRICA

Observe o número abundante de lacunas vazias (setas pretas) no crânio dos ratos
do grupo RPC. Aumento de 100X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do estudo.

Já a análise histomorfométrica do tamanho das lacunas revelou uma área média

de 6,72±3,23 µm, 8,13±2,81 µm e 9,54±3,77 µm para os grupos C, RC e RPC,
respectivamente, sem alterações estatisticamente significativas (p > 0,05).
Em relação à espessura, houve diferença significativa entre o vertex nos três
grupos (p < 0,05). Ainda, houve diferença significativa (p < 0,05) entre o grupo C e o
grupo RPC no que tange a análise do bregma e násion. A média detalhada de todas as
mensurações pode ser conferida na Tabela 6 e no Gráfico 3.
 40

Tabela 6 – Espessura do crânio nos três grupos.

Grupos Valor de p
Região C RC RPC C vs C vs RC vs
RC RPC RPC
Bregma 0,30±0,03 0,29±0,04 0,27±0,02 > 0,05 < 0,05 < 0,05
Ínion 0,37±0,01 0,37±0,04 0,35±0,04 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Násion 0,34±0,04 0,32±0,03 0,32±0,01 < 0,05 < 0,05 > 0,05
Vertex 0,26±0,03 0,24±0,02 0,21±0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05
Resultados expressos em média±desvio padrão (12 animais por grupo). Legenda:
C: grupo controle; RC: grupo restrição calórica; RPC: grupo restrição protéico-calórica
Fonte: Dados da pesquisa.
 41

Gráfico 3 – ESPESSURA DO CRÂNIO NOS PONTOS ESTUDADOS DOS

3 GRUPOS

Gráfico representando a espessura média de cada grupo nas regiões estudadas. Fonte: Dados da
pesquisa.
 42

6 DISCUSSÃO

O período de amamentação é essencial para o correto desenvolvimento do

recém-nascido, uma vez que beneficia múltiplos sistemas do organismo. Sabe-se que a
dieta da mãe afeta diretamente a qualidade e a quantidade do leite produzido. Apesar
disso, há taxas significativas de desnutrição materna em países desenvolvidos e em
desenvolvimento (Ahsan et al., 2017; Ares Segura et al., 2016; Haileslassie et al., 2013;
Jeong et al., 2017; Kavle et al., 2018; Rajendram et al., 2017).
Os efeitos da desnutrição materna durante a gravidez têm sido amplamente
estudados na literatura. Esses estudos comprovaram a teoria do “metabolic imprinting”
(ou programação fetal), na qual os efeitos causados durante a vida intrauterina podem
induzir distúrbios metabólicos em períodos tardios (Barker, 2000; Barker, 2012; Hyde
et al., 2017; Kumar et al., 2017; Lee et al., 2016; Rajendram et al., 2017).
No entanto, estudos mostraram que o período de lactação também é um
momento crítico para induzir alterações de desenvolvimento em diversos tecidos. Dessa
maneira, o “metabolic imprinting” pode ocorrer até o final do período de amamentação
(Babinski et al., 2016; Confortim et al., 2017; Fernandes et al., 2008; Fernandes et al.,
2007; Luna et al., 2016; Natt et al., 2017; Qasem et al., 2016; Schultz et al., 2017;
Victora et al., 2016).
O presente estudo mostrou que o crânio no grupo RPC foi significativamente
menor do que nos grupos C ou RC, em especial, no que tange a altura. Além disso, a
espessura média do crânio foi significativamente menor no grupo RPC em duas regiões,
das quatro analisadas. Portanto, foi observado um impacto negativo no crescimento do
crânio causado pela restrição proteico-calórica materna durante o período de lactação, o
que corrobora para a extensão do período de programação fetal até o fim da
amamentação.
O estudo realizado por Ramirez Rozzi et al. (2005) demonstrou mudanças
relacionadas ao tamanho, e não à forma, do crânio do macaco-esquilo submetido à uma
dieta pobre em proteína. O que vai de acordo com nossos resultados, visto que não
foram observadas mudanças na forma do crânio de ratos Wistar.
 43

Luna et al. (2016), em um estudo realizado com ratos Wistar, demonstrou

também que houve diminuição significativa de diversos parâmetros anatômicos no que
tange o tamanho do crânio desses animais. Apesar disso, os autores associaram a
desnutrição durante o período de gravidez, lactação e à intervenção cirúrgica de
fechamento das artérias uterinas. Este estudo é bastante interessante e permite certa
comparação com o presente trabalho devido ao fato de que foi realizado à longo prazo
(210 dias), e o método de mensuração também foi o mesmo: a radiografia.
Ambos os estudos supracitados demonstram que apesar das diferenças
metodológicas, os efeitos causados pela desnutrição materna no período de aleitamento
são similares, em especial, à longo prazo, um tema pouco explorado na literatura.
O “catch-up growth” é considerado como o crescimento compensatório durante
a janela de recuperação após uma determinada restrição de crescimento. Pode ser
completo (tipo A) quando o animal atinge o tamanho adulto normal ou incompleto (tipo
B), quando este não consegue atingir a curva de crescimento normal. O conceito de
“catch-up growth” foi bem explicado por Boersma & Wit (1997) e está diretamente
relacionado com o conceito de programação fetal.
Muito se sabe sobre o “catch-up growth”, no entanto, há incerteza se esta
retomada no crescimento (tipo A) é possível ou não, pois há um mosaico de resultados
diferentes na literatura, especialmente quando ambos os períodos (gravidez e
amamentação) são considerados separadamente (Alippi et al., 1999; Babinski et al.,
2016; Qasem et al., 2016; Schultz et al., 2017).
Quando utilizamos este termo no presente estudo, o conceito de “catch-up
growth” é considerado como o período em que o crescimento do crânio dos ratos dos
grupos RC e RPC levaria para atingir o crescimento do crânio dos animais do grupo C.
Um estudo anterior realizado por Fernandes et al. (2008) observou resultados
semelhantes aos nossos, embora em ratos jovens (21 dias). Quando seus resultados são
comparados com os apresentados neste estudo, fica claro que o “catch-up growth” não
foi possível, uma vez que essas mudanças no crescimento do crânio se perpetuaram
mesmo após a ingestão de dieta regular dos ratos adultos após o aleitamento.
O estudo das lacunas que circundam o osteócito é usado para medir as alterações
patológicas no tecido ósseo causadas pela osteoporose, por exemplo. Portanto, pode ser
 44

um indicador de anormalidades no osso (Bai et al., 2016; van Oers et al., 2015). Uma
porcentagem ligeiramente maior de lacunas vazias pôde ser observada nos grupos RC e
RPC. Embora não tenham sido estatisticamente significantes, esses resultados podem
indicar que houve de fato uma lesão no tecido ósseo causada pela desnutrição materna
durante o período de lactação.
Além disso, alguns autores propuseram o estudo do tamanho das lacunas. O
estudo realizado por Babinski et al. (2018), em ratos desnutridos durante a
amamentação, evidenciou um aumento significativo do tamanho das lacunas na porção
cortical do fêmur dos animais em restrição proteico-calórica, assim como o fêmur dos
animais em restrição calórica, quando comparados com o grupo controle. Neste estudo,
os autores propuseram uma possível relação entre a lacuna e a osteoporose, ou, seu
início.
Da mesma maneira, foram encontradas lacunas de tamanho maior no grupo RPC
em comparação com o grupo RC e o grupo C. Apesar disso, nossos resultados não
necessariamente corroboram que tenha ocorrido o mesmo tipo de degeneração óssea,
visto que o fêmur se trata de um osso longo e sujeito a carga e turnover celular intenso
(Babinski et al., 2018), enquanto que os ossos do crânio são ossos planos e que não
recebem cargas contínuas (Testut & Latarjet, 1958).
Lacunas maiores podem ser indicadores de degradação de tecido ósseo, como
por exemplo, uma hipomineralização do osso e reabsorção óssea, demonstrado por
alguns estudos experimentais (Bonivtch et al., 2007). Porém, ainda há divergências
sobre esse fato na literatura, e ainda é motivo de pesquisas inovadoras com o propósito
de elucidar o real significado da histomorfometria das lacunas dos osteócitos (Dong et
al., 2014; Mader et al., 2013).
Outro ponto importante de se conhecer os efeitos gerados pela desnutrição
durante a lactação é a relação direta que o crânio possui com o desenvolvimento do
sistema nervoso central (SNC). Dessa maneira, sabe-se que algumas condições ósseas
podem levar a má formação nervosa, como por exemplo, a sinostose prematura, que, em
alguns casos, pode causar distúrbios cognitivos, visuais, de audição e linguagem, assim
como aumento da pressão intracraniana (Ghizoni et al., 2016).
 45

Esta relação fica evidente quando observamos o exemplo contrário: o

desenvolvimento anormal do SNC pode ser encontrado na doença Zika, que por sua
vez, origina a microcefalia (Nunes et al., 2016).
O presente trabalho não nos permite realizar esse tipo de discussão, mas, sabe-se
que esses fatores estão intimamente relacionados devido a uma provável causa genética,
porém, não existe ainda resposta concreta a respeito dessa relação ontogênica (Ghizoni
et al., 2016).
Podemos explorar esse fato a partir da comparação dos achados presentes nesse
estudo com os trabalhos realizados por Belluscio et al. (2014) e Natt et al. (2017), que
observaram comportamentos depressivos e de ansiedade, assim como diminuição de
reflexos e raciocínio em ratos cujas progenitoras foram desnutridas durante o período
perinatal.
 46

7 CONCLUSÕES

Em suma, o presente trabalho observou que a desnutrição durante o período de

aleitamento causou mudanças macro e microscópicas no crânio da prole. Houve uma
redução sensível no tamanho do crânio, em especial nas medidas relacionadas à altura,
assim como a redução na espessura do bregma e násion, evidenciadas pela análise
histológica.
O presente trabalho observou também que tais alterações não foram recuperadas
na idade adulta mesmo após a normalização da dieta, o que corrobora negativamente
para a teoria de “catch-up growth”.
 47

8 OBRAS CITADAS

1. Ahsan S, Mansoori N, Mohiuddin SM, Mubeen SM, Saleem R, Irfanullah M.

Frequency and determinants of malnutrition in children aged between 6 to 59 months in
district Tharparkar, a rural area of Sindh. J Pak Med Assoc. 2017;67(9):1369-73.
2. Alippi RM, Meta MD, Boyer PM, Bozzini CE. Catch-up in mandibular growth
after short-term dietary protein restriction in rats during the post-weaning period. Eur J
Oral Sci. 1999;107:260-4.
3. Alippi RM, Meta MD, Olivera MaI, Bozzini C, Schneider P, Meta IF, et al.
Effect of protein-energy malnutrition in early life on the dimensions and bone quality of
the adult rat mandible. Arch Oral Biol. 2002;47(1):47-53.
4. Ares Segura S, Arena Ansótegui J, Díaz-Gómez NM, en representación del
Comité de Lactancia Materna de la Asociación Española de Pediatría. The importance
of maternal nutrition during breastfeeding: Do breastfeeding mothers need nutritional
supplements? An Pediatr (Barc). 2016;84(6):347.e1-e7.
5. Babinski MA, Andrade VMV, Fernandes MAS, Mendes JGC, Babinski MSD,
Pires LAS, et al. The cortical matrix of femur in adult-aged Wistar rats is critically
affected by maternal malnutrition during lactation period. Int J Morphol.
2018;36(4):1285-9.
6. Babinski MSD, Ramos CF, Fernandes RMP, Cardoso GP, Babinski MA.
Maternal Malnutrition Diet During Lactation Period Leads to Incomplete Catch-Up
Growth in Femur of the Pups at Adulthood. Int J Morphol. 2016;34(1):71-7.
7. Bai R, Feng W, Liu WL, Zhao ZH, Zhao AQ, Wang Y, et al. Roles of osteocyte
apoptosis in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head. Genet Mol Res.
2016;15(1).
8. Bancroft JD, Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. 4 ed.
New York: Churchill Livingstone; 1996.
9. Barbosa FB, Capito K, Kofod H, Thams P. Pancreatic islet insulin secretion and
metabolism in adult rats malnourished during neonatal life. Br J Nutr. 2002;87(2):147-
55.
10. Barker DJ. In utero programming of cardiovascular disease. Theriogenology.
2000;53(2):555-74.
11. Barker DJ. Sir Richard Doll Lecture. Developmental origins of chronic disease.
Public Health. 2012;126(3):185-9.
12. Bayne K. Revised Guide for the Care and Use of Laboratory Animals available.
American Physiological Society. Physiologist. 1996;39(4):199,208-11.
13. Behmer OA, Tolosa EMC, Freitas Neto AG. Manual de técnicas para histologia
normal e patológica. São Paulo: Edusp; 1975.
14. Belluscio LM, Berardino BG, Ferroni NM, Ceruti JM, Canepa ET. Early protein
malnutrition negatively impacts physical growth and neurological reflexes and evokes
anxiety and depressive-like behaviors. Physiol Behav. 2014;129:237-54.
 48

15. Black RE, Victora CG, Walker SP, Bhutta ZA, Christian P, de Onis M, et al.
Maternal and child undernutrition and overweight in low-income and middle-income
countries. Lancet. 2013;382(9890):427-51.
16. Boersma B, Wit JM. Catch-up Growth. Endocr Rev. 1997;18(5):646-61.
17. Bonivtch AR, Bonewald LF, Nicolella DP. Tissue strain amplification at the
osteocyte lacuna: A microstructural finite element analysis. J Biomech.
2007;40(10):2199-206.
18. Bozzini CE, Champin G, Alippi RM, Bozzini C. Bone mineral density and bone
strength from the mandible of chronically protein restricted rats. Acta Odontol
Latinoam. 2011;24(3):223-8.
19. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de
Atenção Básica. Saúde da criança: nutrição infantil: aleitamento materno e alimentação
complementar Brasília: Editora do Ministério da Saúde. 2009.
20. Brasil FB, Faria TS, Costa WS, Sampaio FJ, Ramos CF. The pups' endometrium
morphology is affected by maternal malnutrition during suckling. Maturitas.
2005;51(4):405-12.
21. Confortim HD, Jeronimo LC, Centenaro LA, Pinheiro PF, Matheus SM,
Torrejais MM. Maternal protein restriction during pregnancy and lactation affects the
development of muscle fibers and neuromuscular junctions in rats. Muscle Nerve.
2017;55(1):109-15.
22. Degani Junior HVM, Nunes VA, Bezerra EC, Ramos CF, Rodrigues MR,
Abidu-Figueiredo M, et al. Maternal Food Restriction During Lactation Reduces
Mandible Growth of the Female Offspring in Adulthood: Experimental and
Morphometric Analysis. Int J Morphol. 2011;29(2):598-603.
23. Dong P, Haupert S, Hesse B, Langer M, Gouttenoire PJ, Bousson V, et al. 3D
osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical
bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 2014;60:172-85.
24. Fernandes RM, Abreu AV, Silva RB, Silva DF, Martinez GL, Babinski MA, et
al. Maternal malnutrition during lactation reduces skull growth in weaned rat pups:
experimental and morphometric investigation. Anat Sci Int. 2008;83(3):123-30.
25. Fernandes RMP, Abreu AV, Schanaider A, Soares Jr ER, Peçanha GCA,
Babinski MA, et al. Effects of Protein and Energy Restricted Diet During Lactation
Leads to Persistent Morphological Changes on Tibia Growth in the Weaned Pups. Int J
Morphol. 2007;25(3):565-71.
26. Fishbeck KL, Rasmussen KM. Effect of repeated cycles on maternal nutritional
status, lactational performance and litter growth in ad libitum-fed and chronically food-
restricted rats. J Nutr. 1987;117(11):1967-75.
27. Francisqueti FV, Rugolo LMSS, Silva EGd, Peraçolli JC, Hirakawa HS. Estado
nutricional materno na gravidez e sua influência no crescimento fetal. Rev Simbio-
Logias. 2012;5(7):74-86.
28. Gautsch TA, Kandl SM, Donovan SM, Layman DK. Growth Hormone Promotes
Somatic and Skeletal Muscle Growth Recovery in Rats Following Chronic Protein-
Energy Malnutrition. J Nutr. 1999;129(4):828-37.
29. Ghizoni E, Denadai R, Raposo-Amaral CA, Joaquim AF, Tedeschi H, Raposo-
Amaral CE. Diagnosis of infant synostotic and nonsynostotic cranial deformities: a
review for pediatricians. Rev Paul Pediatr. 2016;34(4):495-502.
 49

30. Giglio MJ, Lazzari RN, Rebok E. Skeletal-unit growth in the mandible of rats
given diphenylhydantoin. Arch Oral Biol. 1998;43(5):379-87.
31. Greene EC. Anatomy of the Rat. Trans Am Phil Soc. 1935;27:iii-370.
32. Haileslassie K, Mulugeta A, Girma M. Feeding practices, nutritional status and
associated factors of lactating women in Samre Woreda, South Eastern Zone of Tigray,
Ethiopia. Nutr J. 2013;12:28.
33. Hengsberger S, Ammann P, Legros B, Rizzoli R, Zysset P. Intrinsic bone tissue
properties in adult rat vertebrae: modulation by dietary protein. Bone. 2005;36(1):134-
41.
34. Howard-Jones N. A CIOMS ethical code for animal experimentation. WHO
Chron. 1985;39(2):51-6.
35. Howie GJ, Sloboda DM, Vickers MH. Maternal undernutrition during critical
windows of development results in differential and sex-specific effects on postnatal
adiposity and related metabolic profiles in adult rat offspring. Br J Nutr.
2012;108(2):298-307.
36. Hyde NK, Brennan-Olsen SL, Bennett K, Moloney DJ, Pasco JA. Maternal
Nutrition During Pregnancy: Intake of Nutrients Important for Bone Health. Matern
Child Health J. 2017;21(4):845-51.
37. Jeong G, Park SW, Lee YK, Ko SY, Shin SM. Maternal food restrictions during
breastfeeding. Korean J Pediatr. 2017;60(3):70-6.
38. Junqueira LC, Carneiro J. Histologia básica. 12 ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan; 2013.
39. Kavle JA, Mehanna S, Khan G, Hassan M, Saleh G, Engmann C. Program
considerations for integration of nutrition and family planning: Beliefs around maternal
diet and breastfeeding within the context of the nutrition transition in Egypt. Matern
Child Nutr. 2018;14(1):e:12469.
40. Kumar A, Sharma S, Kar P, Agarwal S, Ramji S, Husain SA, et al. Impact of
maternal nutrition in hepatitis E infection in pregnancy. Arch Gynecol Obstet.
2017;296(5):885-95.
41. Kyle UG, Coss-Bu JA. Nutritional assessment and length of hospital stay.
CMAJ. 2010;182(17):1831-2.
42. Lee S, You YA, Kwon EJ, Jung SC, Jo I, Kim YJ. Maternal Food Restriction
during Pregnancy and Lactation Adversely Affect Hepatic Growth and Lipid
Metabolism in Three-Week-Old Rat Offspring. Int J Mol Sci. 2016;17(12).
43. Luna M, Quintero F, Cesani M, Fucini M, Guimarey L, Prio V, et al.
Craneofacial effect of prenatal growth retardation and postnatal undernutrition in
craniofacial growth. Rev Argent Antropol Biol. 2016;18(1).
44. Mader KS, Schneider P, Muller R, Stampanoni M. A quantitative framework for
the 3D characterization of the osteocyte lacunar system. Bone. 2013;57(1):142-54.
45. Mamun AA, Callaway LK, O'Callaghan MJ, Williams GM, Najman JM, Alati
R, et al. Associations of maternal pre-pregnancy obesity and excess pregnancy weight
gains with adverse pregnancy outcomes and length of hospital stay. BMC Pregnancy
and Chilbirth. 2011;11:62.
46. Mehta G, Roach HI, Langley-Evans S, Taylor P, Reading I, Oreffo ROC, et al.
Intrauterine Exposure to a Maternal Low Protein Diet Reduces Adult Bone Mass and
Alters Growth Plate Morphology in Rats. Calcif Tissue Int. 2002;71(6):493-8.
 50

47. Natt D, Barchiesi R, Murad J, Feng J, Nestler EJ, Champagne FA, et al.
Perinatal Malnutrition Leads to Sexually Dimorphic Behavioral Responses with
Associated Epigenetic Changes in the Mouse Brain. Sci Rep. 2017;7(1):11082.
48. Noback CR, Eisenman LM. Some Effects of Protein-Calorie Undernutrition on
the Developing Central Nervous System of the Rat. Anat Rec. 1981;201(1):67-73.
49. Nunes ML, Carlini CR, Marinowic D, Neto FK, Fiori HH, Scotta MC, et al.
Microcephaly and Zika virus: a clinical and epidemiological analysis of the current
outbreak in Brazil. J Pediatr (Rio J). 2016;92(3):230-40.
50. Passos MCF, Ramos CF, Moura EG. Short and long term effects of malnutrition
in rats during lactation on the body weight of offspring. Nutr Res. 2000;20(11):1603-12.
51. Pires LAS, Teixeira ÁR, Leite TFO, Babinski MA, Chagas CAA. Morphometric
aspects of the foramen magnum and the orbit in Brazilian dry skull. Int J Med Res
Health Sci. 2016;5(4):34-42.
52. Plagemann A, Harder T, Rake A, Melchior K, Rohde W, Dörner G.
Hypothalamic Nuclei Are Malformed in Weanling Offspring of Low Protein
Malnourished Rat Dams. J Nutr. 2000;13D(10):2582-9.
53. Plecas D, Plesinac S, Kontic-Vucinic O. Nutrition in pregnancy: Basic principles
and recommendations. Srp Arh Celok Lek. 2014;142(1-2):125-30.
54. Qasem RJ, Li J, Tang HM, Pontiggia L, D'Mello A P. Maternal protein
restriction during pregnancy and lactation alters central leptin signalling, increases food
intake, and decreases bone mass in 1 year old rat offspring. Clin Exp Pharmacol
Physiol. 2016;43(4):494-502.
55. Quinn R. Comparing rat's to human's age: how old is my rat in people years?
Nutrition. 2005;21(6):775-7.
56. Rajendram R, Preedy VR, Patel V, editors. Diet, Nutrition, and Fetal
Programming. 1 ed: Humana Press; 2017.
57. Ramires de Jesus G, Ramires de Jesus N, Peixoto-Filho FM, Lobato G. Cesarean
rates in Brazil: what is involved? BJOG. 2015;122(5):606-9.
58. Ramirez Rozzi FV, Gonzalez-Jose R, Pucciarelli HM. Cranial growth in normal
and low-protein-fed Saimiri. An environmental heterochrony. J Hum Evol.
2005;49(4):515-35.
59. Ramos CF, Babinski MA, Costa WS, Sampaio FJ. The prostate of weaned pups
is altered by maternal malnutrition during lactation in rats. Asian J Androl.
2010;12(2):180-5.
60. Ramos CF, Lima APS, Teixeira CV, Brito PD, Moura EG. Thyroid function in
post-weaning rats whose dams were fed a low-protein diet during suckling. Braz J Med
Biol Res. 1997;30:133-7.
61. Ramos CF, Teixeira CV, Passos MC, Pazos-Moura CC, Lisboa PC, Curty FH, et
al. Low-protein diet changes thyroid function in lactating rats. Proc Soc Exp Biol Med.
2000;224(4):256-63.
62. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey Jr GC. AIN-93 Purified diets for laboratory
rodents: final report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Commitee
on the reformulation of the AIN-76 rodent diet. J Nutr. 1993;123(11):1939-51.
63. Rodriguez OTS, Szarfarc SC, Benicio MHdA. Anemia e desnutrição maternas e
sua relação com o peso ao nascer. Rev Saúde Pública. 1991;25(3):193-7.
64. Schanaider A, Silva PC. Use of animals in experimental surgery. Acta Cir Bras.
2004;19(4):441-7.
 51

65. Schultz G, Medeiros F, Arcoverde M, Cavalcante MA, Pires L, Babinski M, et

al. Chronic Effects of Maternal Malnutrition during Lactation: Severe Influences on
Cortical Bone Mass of Wistar Rats Femur. J Clin Diagn Res. 2017;11(11):5-8.
66. Shin MY, Kang YE, Kong SE, Ju SH, Back MK, Kim KS. A case of low bone
mineral density with vitamin d deficiency due to prolonged lactation and severe
malnutrition. J Bone Metab. 2015;22(1):39-43.
67. Testut L, Jacob O. Tratado de anatomía topográfica con aplicaciones
médicoquirúrgicas. 8 ed. Barcelona: Salvat; 1952.
68. Testut L, Latarjet A. Tratado de Anatomía Humana. 8 ed. Barcelona: Salvat;
1958.
69. Tortora GJ, Derrickson B. Principles of anatomy & physiology. 14 ed. United
States of America: John Wiley & Sons; 2014.
70. Tritos NA, Klibanski A. Effects of Growth Hormone on Bone. Prog Mol Biol
Transl Sci. 2016;138:193-211.
71. Tubbs RS, Shoja MM, Loukas M, editors. Bergman’s Comprehensive
Encyclopedia of Human Anatomic Variation. New Jersey: John Wiley & Sons; 2016.
72. van Oers RF, Wang H, Bacabac RG. Osteocyte shape and mechanical loading.
Curr Osteoporos Rep. 2015;13(2):61-6.
73. Vandamme TF. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied
Sci. 2014;6(1):2-9.
74. Victora CG, Bahl R, Barros AJD, França GVA, Horton S, Krasevec J, et al.
Breastfeeding in the 21st century: epidemiology, mechanisms, and lifelong effect.
Lancet. 2016;387(10017):475-90.
75. Vidal B, Pinto A, Galvão MJ, Santos AR, Rodrigues A, Cascão R, et al. Bone
histomorphometry revisited. Acta Reumatol Port. 2012;37:294-300.
76. Weaver CM. Nutrition and bone health. Oral Dis. 2017;23(4):412-5.
77. World Health Organization. Collaborative Study Team on the Role of
Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant
and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled
analysis. Lancet. 2000;355:451-5.
78. World Health Organization. Nutrient adequacy of exclusive breastfeeding for the
term infant during the first six months of life. Geneva 2002.
79. World Health Organization. World Health Statistics. 2014.
80. Wysocki J. Topographical anatomy and measurements of selected parameters of
the rat temporal bone. Folia Morphol (Warsz). 2008;67(2):111-9.
 52

9 ANEXOS

9.1 APROVAÇÃO EM COMITÊ DE ÉTICA

 53

9.2 PROTOCOLO DE CONVÊNIO DE PESQUISA

 54

9.3 PROTOCOLO DE DOAÇÃO DE MATERIAIS

 55

9.4 E-MAIL PARA O COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADOS EM ANIMAIS DA

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
 56

9.5 RESPOSTA DO COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADO EM ANIMAIS ANIMAL

DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE