Tese Motta, 2018

UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
TESE
OCORRÊNCIA, RESISTÊNCIA, VIRULÊNCIA E DIVERSIDADE

GENÉTICA DE Staphylococcus pseudintermedius ORIUNDOS DE
PROCESSOS INFECCIOSOS EM ANIMAIS DE COMPANHIA
Cássia Couto da Motta
2018
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
OCORRÊNCIA, RESISTÊNCIA, VIRULÊNCIA E DIVERSIDADE

GENÉTICA DE Staphylococcus pseudintermedius ORIUNDOS DE
PROCESSOS INFECCIOSOS EM ANIMAIS DE COMPANHIA
CÁSSIA COUTO DA MOTTA
Sob a orientação da Professora

Miliane Moreira Soares de Souza
e Coorientação da Professora
Shana de Mattos de Oliveira Coelho
Tese submetida como requisito parcial

para obtenção do grau de Doutora em
Ciências, no Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias.
Seropédica, RJ
Abril de 2018
“A vida não é fácil para
nenhum de nós. Temos que ter
persistência e, acima de tudo,
confiança em nós mesmos.”
(Marie Curie)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela minha vida e saúde para seguir esta caminhada.
À Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, pela incrível experiência de vida. Lugar
que por onze anos foi a minha segunda casa, onde amadureci, cresci profissionalmente e fiz
amizades para vida toda. Esse lugar mágico ficará gravado na alma e deixará marcas eternas em
mim.
Aos meus pais, meus maiores incentivadores, Humberto Machado da Motta e Tânia Lúcia
Gonçalves Couto da Motta, por me mostrarem que a maior herança que se deixa aos filhos é a
educação. Por nunca terem medido esforços para que eu pudesse ter acesso ao bom ensino, mesmo
nos momentos mais difíceis e, principalmente, pelo amor incondicional. Aos meus avós, o meu
muito obrigado pelo carinho, por participarem da minha educação e formação como ser humano.
Vocês estarão eternamente em meu coração.
Ao meu marido e companheiro há nove anos, Herbet Pereira dos Santos. Obrigada por todo
o amor, respeito e paciência. Pelos os anos que estamos juntos, fortalecendo e incentivando um ao
outro.
À minha orientadora, Dra. Miliane Moreira Soares de Souza, por ser meu exemplo de
profissional e pela confiança depositada. Muito obrigada por acreditar no meu trabalho e permitir
que ele fosse conduzido sob sua orientação.
À equipe do laboratório de Medicina Veterinária Preventiva da Iowa State University (ISU,
EUA), sob a orientação da Dr. Catherine Mary Logue, que me acolheu, possibilitando a realização
de parte deste estudo, e participou dos cinco meses mais especiais da minha vida.
À coorientadora, Dra. Shana de Mattos de Oliveira Coelho, pelos conselhos e incentivo.
Muito obrigada.
À professora Dra. Irene da Silva Coelho, pelo carinho, paciência e vontade desmedida em
cooperar para o sucesso deste trabalho! Muito obrigada.
Às amiga e companheira de laboratório Bianca Soares, pela amizade e colaboração com as
análises de diversidade, sendo fundamental para conclusão deste estudo.
Às amigas e companheiras de laboratório Dayanne Melo e Marisol Gómez, pela amizade
e colaboração. Vocês foram especialmente importantes ao longo deste estudo.
A todos os amigos e colegas de Pós-Graduação e laboratório, Bruno Oliveira, Daniel Paiva,
Felipe Carlos Dubenczuk, Greiciane Bronzato, Mário Makita, Mario Bonci e Ramon Pimenta.
Obrigada por tornarem o trabalho mais prazeroso e colaborativo.
A todos os estagiários do LABAC VET que colaboraram com este trabalho, em especial
Thomas Santos e Richard Garcia, por toda ajuda, disponibilidade e capacidade. Vocês foram
essenciais.
Aos ex e atuais residentes do Programa de Residência Multiprofissional em Medicina
Veterinária da UFRRJ, que não medem esforços para a realização de um bom trabalho. Obrigada
pelo suporte e colaboração para a realização deste estudo.
Aos professores e funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia
Veterinária pela amizade e carinho.
A toda equipe do Laboratório de Diagnóstico Veterinário Vet Análises, pelo apoio,
amizade e pelo prazer que é trabalhar com vocês.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da UFRRJ e funcionários, pelas
condições que recebemos para trabalhar e estudar.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à
Coordenação De Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de estudos,
patrocínios e fomentos agraciados durante o doutorado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelos
patrocínios e fomentos agraciados durante o doutorado.
Por fim, a todos que de alguma forma contribuíram para a conclusão deste ciclo. Meus
sinceros agradecimentos.
BIOGRAFIA
Cássia Couto da Motta ingressou no curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal

Rural do Rio de Janeiro no ano de 2007, diplomando-se em janeiro de 2012. Em 2008, foi
estagiária no Laboratório de Quimioterapia Experimental em Parasitologia Veterinária do
Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, da Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro. Estagiou no Laboratório de Bacteriologia Veterinária, do período de 2009 a 2011,
realizando projetos na área de mastite bovina. Foi bolsista de iniciação científica do CNPq de 2010
a 2011, com projeto intitulado “Caracterização genotípica da resistência e virulência em isolados
de Staphylococcus spp. a partir de mastite bovina como subsídio para implementação de Boas
Práticas de Ordenha.”, sob a orientação da professora Dra. Miliane Moreira Soares de Souza. Em
2012, ingressou no Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV – UFRRJ),
nível Mestrado (bolsa CNPq), sob a orientação da professora Dra. Miliane Moreira Soares de
Souza. Após a conclusão do Metrado, em 2014, iniciou sua pesquisa de Doutorado (bolsa
CNPq/PPGCV – UFRRJ). Durante o curso de Pós-Graduação ministrou aulas teórico-práticas na
disciplina Bacteriologia Veterinária na UFRRJ, sob a orientação da professora Dra. Miliane
Moreira Soares de Souza, além de outras colaborações na mesma instituição, na disciplina
Microbiologia Básica sob a orientação da professora Dra. Shana Mattos de Oliveira Coelho. No
período compreendido entre abril e setembro de 2017 realizou doutorado “sanduíche” pela CAPES
(Processo no 88881.135567/2016-01) na Iowa State University (EUA), desenvolvendo o projeto
intitulado “Tipagem e análise genotípica de resistência e virulência em Staphylococcus
pseudintermedius oriundos de processos infecciosos em animais de companhia”, sob a orientação
das professoras Dra. Catherine Mary Logue e Dra. Miliane Moreira Soares de Souza.
RESUMO
MOTTA, Cássia Couto da. Ocorrência, resistência, virulência e diversidade genética de

Staphylococcus pseudintermedius oriundos de processos infecciosos em animais de
companhia. 2018. 90 p. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias). Instituto de Veterinária,
Departamento de Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica,
RJ, 2018.
No Brasil, a prevalência de Staphylococcus pseudintermedius meticilina-resistentes como causa de

processos infecciosos em animais de companhia permanece desconhecida. A emergência de MRSP
é um desafio para a Medicina Veterinária, uma vez que pode acarretar falhas terapêuticas. O
presente estudo fornece uma visão da ocorrência de cepas MRSP multirresistentes oriundas de
amostras clínicas caninas e felinas do Rio de Janeiro, Brasil. Um total de 92 isolados de S.
pseudintermedius foi investigado quanto à formação de biofilme, presença de genes de virulência
que codificam enterotoxinas estafilocócicas (sea, seb, sed, sec, seccanine e se-int), leucocidinas
(lukS-lukF, lukE-lukD e lukM), hemolisinas (hla, hlb, hld, hlg, hglv) e toxinas esfoliativas (eta, etb,
etd, siet e exi), suscetibilidade à meticilina e presença dos genes mec. O estudo da diversidade
genética foi realizado com as cepas MRSP através da tipagem do SCCmec, do gene spa e das
técnicas de PFGE e MLST. A maioria dos isolados avaliados (93,0%; 81/87) foi classificada como
produtora de biofilme, em diferentes intensidades. Dentre os genes de virulência pesquisados,
97,8% (90/92) dos isolados amplificaram o gene siet, que codifica uma toxina esfoliativa de S.
pseudintermedius, 87,0% (80/92) amplificaram o gene se-int, relacionado à produção de
enterotoxina nessa espécie, e 12,0% (11/92) o gene que codifica o bicomponente da leucotoxina
LukE-LukD (lukE/D) em S. aureus. Nenhum isolado amplificou os demais genes de virulência
pesquisados. Quanto à resistência à meticilina, 22 (23.9%) foram identificados como MRSP por
difusão em disco, microdiluição em caldo e presença do gene mecA. Após a tipificação do
SCCmec, o tipo de cassete frequentemente encontrado foi o II-III (81,8%; 18/22), seguido de
SCCmec não-tipáveis (13,6%; 3/22) e de SCCmec IV (4,5%; 1/22). Além disso, foi observada
multirresistência em todas as cepas MRSP. Quatro tipos de spa intimamente relacionados foram
detectados: t02 (72,2%; 13/18), t15 (16,6%; 3/18), t05 (5,6%; 1/18) e t06 (5,6%; 1/18). A técnica
de PFGE permitiu a identificação de dois clones, além de outras duas cepas relacionadas. Através
da tipagem por MLST, três STs/CCs (ST/CC71, ST265/CC258 e ST282/CC45) que nunca foram
reportados em cepas MRSP brasileiras oriundas de processos infecciosos puderam ser detectados.
Além desses, dois novos STs (NST) foram identificados e serão submetidos ao curador da base do
banco de dados do MLST. A predominância da linhagem mundialmente disseminada ST/CC71-
spat02-SCCmecII-III (54,5%; 12/22) dentre as cepas avaliadas foi revelada. A análise comparativa
dos métodos de tipagem utilizados evidenciou a importância da combinação de técnicas para a
compreensão da estrutura populacional de cepas MRSP. Os resultados obtidos confirmam a
necessidade do monitoramento de patógenos multirresistentes e de mais estudos no Brasil que
busquem determinar a prevalência e as características de MRSP em animais de companhia,
fornecendo dados de que subsidiarão medidas preventivas e de controle.
ABSTRACT
MOTTA, Cássia Couto da. Occurrence, resistance, virulence and genetic diversity of
Staphylococcus pseudintermedius originated from clinical specimens of companion animals.
2018. 90 p. Thesis (Ph.D. in Veterinary Science) Veterinary Institute, Department of Animal
Parasitology, Federal Rural University of Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2018.
In Brazil, the prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) as a

cause of infectious diseases in companion animals remains unknown. The emergence of MRSP is
a challenge in veterinary medicine as multidrug resistant strains may potentially result in treatment
failures. This study provides an overview of the occurrence and characterization of multidrug-
resistant MRSP strains from canine and feline clinical samples in Rio de Janeiro, Brazil. A total of
92 S. pseudintermedius isolates were investigated for biofilm formation, presence of virulence
genes (sea, seb, sed, sec, seccanine, se-int, lukS-lukF, lukE-lukD, lukM, hla, hlb, hld, hlg, hglv, eta,
etb, etd, siet and exi), methicillin susceptibility and presence of mec genes. Most of the isolates
(92.0%, 81/88) were classified as biofilm producers. Among the virulence genes detected, 97.8%
(90/92) of the isolates amplified the siet gene, which encode an exfoliated toxin of S.
pseudintermedius, 87.0% (80/92) the se-int gene, a enterotoxin-gene related, and 12.0% (11/92)
the gene encoding the LukE-LukD leukotoxin (lukE/D) bicomponent of S. aureus. No isolates
amplified the remaining virulence genes. Regarding methicillin resistance, 22 (23.9%) were
identified as MRSP by both methods tested (disk diffusion and broth dilution) and by the presence
of the mecA gene. These strains were submitted to SCCmec typing which revealed that the
dominant SCCmec were type II-III (81,8%; 18/22), followed by non-typeable SCCmec (13,6%;
3/22) and SCCmec IV (4,5%; 1/22). Furthermore, multidrug resistance (MDR) was found in all
MRSP isolates. Four types of closely related spa were detected: t02 (72.2%, 13/18), t15 (16.6%,
3/18), t05 (5.6%, 1/18) and t06 (5.6%; 1/18). PFGE analysis allowed the identification of two
clones and two related strains. MLST typing revealed three STs/CCs (ST/CC71, ST265/CC258,
and ST282/CC45) never reported in Brazilian MRSP strains from clinical specimens. In addition,
two new STs (NSTs) have been identified and will be submitted to the curator of the MLST
database. The predominance of the ST/CC71-spat02-SCCmecII-III (54.5%, 12/22) worldwide
strain among the strains evaluated was revealed. The comparative analysis of the typing methods
used evidenced the importance of combined analysis for understanding the population structure of
MRSP. The results confirm the importance of monitoring multidrug-resistant pathogens and the
need of further studies in Brazil to determine the prevalence and the characteristics of MRSP in
companion animals from this region, providing data that will support preventive and control
measures.
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AMH Ágar Müeller-Hinton

AMVF Ágar Manitol Vermelho de Fenol
BHI Infuso Cérebro Coração
CC Complexo Clonal
ccr “Cassete Chromossome Recombinases”
CIP Ciprofloxacina
CLO Cloranfenicol
CLSI “Clinical and Laboratory Standards Institute”
CMH Caldo Müeller-Hinton
DNA Ácido Desoxiribonucléico
dNTP Desorribonuleotídeo trifosfatado
ECN Estafilococos Coagulase-Negativos
ECP Estafilococos Coagulase-Positivos
ERI Eritromicina
GEN Gentamicina
h Horas
HVPA Hospital Veterinário de Pequenos Animais
H2O Água
IS431 Ilha de patogenicidade 431
KAN Kanamicina
KOH Hidróxido de potássio
LIN Lincomicina
m/s etros/segundo
mg Miligrama
MgCl2 Cloreto de magnésio
min Minuto (s)
ml Mililitro (s)
mM Milimolar
mm Milímetro (s)
MALDI-TOF MS Espectrometria de Massa por Tempo de Vôo de Ionização/Desorção por
Laser Assistida por Matriz (“Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–
Time of Flight Mass Spectrometry”)
MRSA Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (“Methicillin resistant
Staphylococcus aureus”)
MRSP Staphylococcus pseudintermedius resistentes à meticilina (“Methicillin
resistant Staphylococcus pseudintermedius”)
NaCl Cloreto de sódio
ng Nanogramas
nm Nanômetro
OXA Oxacilina
pb Pares de base
PBP Proteína Ligadora de Penicilina (“Penicillin Binding Protein”)
PCR Reação em Cadeia de Polimerase (“Polymerase Chain Reaction”)
PEN Penicilina
PFGE Eletroforese em Campo Pulsado (“Pulsed-Field Gel Electrophoresis”)
pH Potencial hidrogeniônico
rpm Rotação por minuto
SCCmec Cassete cromossômico estafilocócico mec (“staphylococcal cassette
chromosome”)
s Segundo (s)
SDS Dodecil sulfato de sódio
ST Tipo de Sequência (“Sequence Type”)
TE Tris EDTA
TET Tetraciclina
TSA Ágar Tripticase de Soja
U Unidade
USA “United States of America”
UI Unidades internacionais
V Voltagem
μg Micrograma
μl Microlitro
ºC Graus Celsius
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 2,0 % dos produtos de amplificação do 26
gene nuc (926 pb). M: Marcador de tamanho molecular (Hi-Lo Dna
Marker – 10.000 pb); 1: Controle positivo (Staphylococcus
pseudintermedius CD93); 2 – 9: Isolados positivos (Staphylococcus
pseudintermedius); Br: Branco.
gene siet (359 pb). M: Marcador de tamanho molecular (Bionexus™
Hi-Lo DNA Marker – 10.000 pb); 1 – 3: Staphylococcus
pseudintermedius positivos para o gene siet; Br: Branco.
gene se-int (874 pb). Br: Branco; 1 – 3: Staphylococcus
pseudintermedius positivos para o gene se-int; M: Marcador de
tamanho molecular (Bionexus™ Hi-Lo DNA Marker – 10.000 pb).
gene lukE/D (269 pb). 1 – 3: Staphylococcus pseudintermedius
positivos para o gene lukE/D; 4 e 5: Staphylococcus pseudintermedius
negativos para o gene lukE/D; Br: Branco; M: Marcador de tamanho
molecular (Bionexus™ Hi-Lo DNA Marker – 10.000 pb).
Figura 5 Ensaio de difusão em disco (DD) de oxacilina (1 g). Isolado 31
Staphylococcus pseudintermedius resistente.
Figura 6 Ensaio de microdiluição em caldo para determinação da CIM. Br: 31
Branco (água mili-Q); CP: Controle Positivo (Staphylococcus aureus
subsp. aureus ATCC® 33591TM); 1-10: Isolados S. pseudintermedius
resistentes à oxacilina (diferentes concentrações).
Figura 7 Dendograma de similaridade gerado a partir da técnica de PFGE 37
através do método UPGMA e complemento do índice de Dice
(Bionumerics, Versão 6.6 Applied Math®, Austin, TX; 1% de
tolerância e otimização de 0,5%). Ponto de corte ao nível de 85% de
similaridade genética (linha de cor vermelha). Tipos de SCCmec, spa
e agrupamentos gerados a partir dos padrões de restrição enzimática.
a Sítio de infecção não informado; b não-tipável; c cepa não clivada
pela enzima SmaI.
Figura 8 (A) Gráfico de torta representando os tipos de sequência (STs) das 40
cepas MRSP avaliadas. (B) Aplicação do algoritmo PHILOViZ,
mostrando a estrutura populacional e retratando a distribuição clonal
das cepas MRSP investigadas. Cada tipo de sequência é representado
por um círculo e dentro de cada um estão inseridas as cepas
representantes. Os retângulos na cor verde destacam as cepas do grupo
III e os retângulos na cor azul destacam as do grupo X, de acordo com
o padrão de restrição obtido com a técnica de PFGE. As cepas que não
puderam ter o ST determinado e deverão gerar novos STs (NST) foram
demonstradas com por única cor (azul claro) e as que apresentaram
combinações exatas foram representadas pelo círculo azul escuro.
ÍNDICE DE QUADROS
Pág.
Quadro 1. Resultados esperados na identificação fenotípica das espécies de ECP 16
Quadro 2. Iniciadores e ciclos empregados para identificação genotípica 17
Quadro 3. Interpretação dos escores resultantes da avaliação proteômica por MALDI- 17
TOF MS
Quadro 4. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação dos genes de 19
virulência
Quadro 5. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação dos genes mec 21
Quadro 6. Iniciadores e ciclos empregados para a tipificação dos elementos SCCmec 22
Quadro 7. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação do gene spa 23
Quadro 8. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação por PCR dos sete loci 25
para tipificação por MLST
ÍNDICE DE TABELAS
Pág.
Tabela 1. Isolamento de Staphylococcus pseudintermedius por sítio de infecção 27

e espécie animal
Tabela 2. Produção de biofilme nos isolados de Staphylococcus 27
pseudintermedius por sítio de infecção
Tabela 3. Identificação por MALDI-TOF MS, perfil de resistência à meticilina e 33
tipos de SCCmec
Tabela 4. Tipo de SCCmec e perfil de resistência das 22 cepas MRSP 34
investigadas
Tabela 5. Origem e tipos de spa das cepas avaliadas 35
Tabela 6. Perfil alélico gerado através da tipagem por MLST 39
Tabela 7. Origem, perfis de virulência, resistência e tipagem molecular das 24 42
cepas de Staphylococcus pseudintermedius investigadas
SUMÁRIO
Pág.
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO DE LITERATURA 2
2.1 Taxonomia 2
2.1.1 Gênero Staphylococcus sp. 2
2.1.2 Staphylococcus pseudintermedius 2
2.2 Identificação de Staphylococcus pseudintermedius 3
2.3 Patogenicidade e potencial zoonótico 5
2.4 Fatores de virulência 6
2.5 Staphylococcus pseudintermedius meticilina-resistentes (MRSP) e multirresistência 8
2.6 Tipagem molecular de cepas MRSP 9
2.6.1 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (“Pulsed Field Gel Electrophoresis” – 9
PFGE)
2.6.2 Tipagem do gene spa 10
2.6.3 Tipagem da Sequência Multilocus (“Multilocus Sequence Typing” – MLST) 11
2.6.4 Tipagem do cassete cromossômico mec (SCCmec) 12
3. OBJETIVOS 13
4. MATERIAL E MÉTODOS 14
4.1. Amostragem 14
4.1.1 Isolamento e identificação presuntiva de Staphylococcus coagulase-positivos 14
4.1.2 Prova do hidróxido de potássio (KOH) 3% e prova da catalase 14
4.1.3 Prova da coagulase 15
4.1.4 Prova de suscetibilidade à bacitracina e à polimixina 15
4.1.5 Prova de Voges-Proskauer e fermentação de manose e maltose 15
4.2. Identificação molecular de Staphylococcus pseudintermedius 16
4.2.1 Liberação do DNA bacteriano por lise térmica 16
4.2.2 Identificação pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerase 16
Chain Reaction” – PCR)
4.2.3 Identificação proteômica por MALDI-TOF MS 17
4.3. Detecção da produção de “slime” em microplaca de poliestireno 18
4.4. Detecção de genes de virulência 18
4.5. Detecção fenotípica da resistência aos antimicrobianos 19
4.5.1 Difusão em disco de oxacilina 19
4.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para oxacilina 20
4.5.3 Detecção da resistência à vancomicina por Ágar Screen 20
4.5.4 Antibiograma automatizado para detecção de isolados multirresistentes 20
4.6. Detecção de genes mec 21
4.7. Caracterização dos cassetes cromossômicos mec (SCCmec) 21
4.8. Estudo da diversidade de cepas MRSP 22
4.8.1 Tipagem pelo gene spa 22
4.8.2 Eletroforese em Campo Pulsado (“Pulsed-field Gel Electrophoresis” – PFGE) 23
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 26
5.1. Identificação de Staphylococcus pseudintermedius e perfil das amostras clínicas 26
5.2. Detecção da produção de “slime” em microplaca de poliestireno 27
5.3. Detecção genotípica de fatores de virulência 28
5.4. Detecção da resistência aos antimicrobianos 30
5.4.1 Detecção fenotípica da resistência à meticilina 30
5.4.2 Detecção do gene mecA e caracterização dos cassetes SCCmec 31
5.4.3 Detecção de multirresistência nas cepas MRSP 33
5.5. Estudo da diversidade das cepas MRSP 34
5.5.1 Tipagem do gene spa 34
5.5.2 Eletroforese em Campo Pulsado (“Pulsed-field Gel Electrophoresis” – PFGE) 35
5.5.4 Análise comparativa dos perfis genéticos gerados pelas técnicas de tipagem 41
molecular
6. CONCLUSÕES 46
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 47
ANEXOS 68
1 INTRODUÇÃO
Staphylococcus pseudintermedius é comumente presente na pele e mucosas de cães e é o

patógeno bacteriano mais frequentemente isolado de amostras clínicas caninas. Embora os cães
sejam os hospedeiros naturais, pode colonizar e infectar outras espécies animais, principalmente
gatos e também humanos. Produz diversos fatores de virulência e também é capaz de formar
biofilmes, no entanto, a maioria desses fatores de S. pseudintermedius ainda não foi totalmente
caracterizada. Esse patógeno é primariamente associado a infecções de pele e ouvidos, mas também
pode estar envolvido em diversos outros quadros, que podem ter o tratamento complicado se a cepa
envolvida for resistente à meticilina (MRSP).
Mais de uma década após a descrição e a reclassificação dessa espécie, a heterogeneidade
dos membros do Grupo Staphylococcus intermedius (SIG) e a ausência de “kits” e sistemas
comerciais de identificação acessíveis e acurados dificultam a diferenciação fenotípica entre as
espécies, que segue como um desafio ao diagnóstico veterinário. A notada importância desse
agente para a Medicina Veterinária de pequenos animais e os frequentes casos de infecções
associadas a cepas multirresistentes reforçam a necessidade da acurada identificação dos isolados
provenientes de amostras clínicas.
O surgimento de bactérias multirresistentes representa um dos principais problemas para a
Medicina Veterinária de pequenos animais, uma vez que a distribuição e a prevalência desses
organismos em espécimes clínicos animais são relativamente desconhecidas, assim como a
presença e circulação de genes como o mecA, implicado na resistência à meticilina, e seu potencial
de propagação em animais de companhia.
O gene mecA está localizado em um elemento genético móvel, denominado cassete
cromossômico estafilocócico mec (“staphylococcal cassette chromosome” – SCCmec), de
diferentes tipos, que pode ser transferido e se integrar ao genoma de diferentes espécies de
estafilococos. Esse cassete pode carrear ainda outros elementos genéticos, que codificam
resistência a diversas classes de antimicrobianos e a transferência horizontal do gene mecA e desses
elementos genéticos inseridos no SCCmec, resultou na disseminação mundial de clones meticilina
e multirresistentes. Em MRSP são descritos diferentes tipos de elementos SCCmec, no entanto,
dados de frequência e distribuição desses elementos em cepas brasileiras permanecem pouco
conhecidos. Diferentes técnicas têm sido empregadas para caracterizar e determinar a diversidade
genética de cepas MRSP. A Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (“Pulsed Field Gel
Electrophoresis” – PFGE), a tipagem do gene spa, a Tipagem da Sequência Multilocus
(“Multilocus Sequence Typing” – MLST) e a tipagem do cassete SCCmec são os métodos
frequentemente utilizados e que têm possibilitado a comparação mundial de cepas, estudos acerca
da estrutura populacional, bem como a discussão dos mecanismos de evolução desses patógenos.
O presente trabalho avaliou a ocorrência de MRSP multirresistentes oriundos de amostras
clínicas de cães e gatos, visando o estudo da diversidade genética dessas cepas através da detecção
de fatores de virulência e tipagem do gene spa, do SCCmec e através das técnicas PFGE e MLST.
1
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Taxonomia
2.1.1 Gênero Staphylococcus sp.
Bactérias do gênero Staphylococcus, pertencente à família Staphylococcaceae, são cocos

Gram positivos arranjados principalmente de forma irregular, com aparência semelhante a “cachos
de uva”. São ainda anaeróbios facultativos, imóveis, não esporulados, produtores da enzima
catalase e resistentes à bacitracina (0,04 UI) (MARKEY et al., 2013).
O gênero Staphylococcus está presente na pele e microbiota nasal, causando infecções
oportunistas em seres humanos e vários animais (SASAKI et al., 2010). Colonizam as mucosas,
especialmente de mamíferos e aves, onde eventualmente podem ocasionar um processo infeccioso
em decorrência de alterações teciduais do hospedeiro, como traumas (GRIFFETH et al., 2008).
Infecções estafilocócicas estão entre as doenças oportunistas mais comuns, o que tem levado a
práticas de controle desses patógenos, tanto em hospitais veterinários quanto em humanos
(WEESE, 2012).
De acordo com o “List of Prokaryotic Names With Standing in Nomenclature” (2018),
pertencem a esse gênero 52 espécies e 28 subespécies que habitam diferentes ambientes e espécies
animais. O gênero é subdividido em dois grupos, com base na produção da enzima coagulase, cuja
função é formar coágulos de fibrina no tecido do hospedeiro, dificultando seu reconhecimento e
fagocitose por parte do sistema fagocitário mononuclear (SOARES, 2010).
De modo geral, sete espécies de estafilococos coagulase-positivos (ECP) têm sido
identificadas: Staphylococcus aureus, S. intermedius, S. delphini, S. pseudintermedius, S. schleiferi
subsp. coagulans, S. hyicus e S. lutrae (SASAKI et al., 2010; DEVRIESE et al., 2005; FRENEY
et al., 1999), além da espécie coagulase-variável S. agnetis (TAPONEN et al., 2012). As espécies
de estafilococos tendem a apresentar especificidade quanto ao hospedeiro. Por exemplo, as espécies
predominantes em ruminantes, suínos, cães e pombos são S. aureus, S. hyicus, S. pseudintermedius
e S. intermedius, respectivamente (SASAKI et al., 2007a; FITZGERALD; PENADÉS, 2008;
SASAKI et al., 2010). Entretanto, é possível isolar a mesma espécie bacteriana de quadros clínicos
em diferentes hospedeiros animais. Nesses casos, a bactéria pode apresentar variações decorrentes
dessa adaptação (PANTOSTI, 2012; SPOOR et al., 2013).
O outro grupo de bactérias pertencentes a esse gênero compreende as muitas espécies de
estafilococos coagulase-negativos (ECN), que podem ser divididas em dois grupos dependendo da
sensibilidade à novobiocina. Staphylococcus sensíveis à novobiocina incluem S. epidermidis, S.
haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis e os resistentes são as espécies S. saprophyticus e S.
xylosus (HEILMANN; PETERS, 2000; VON EIFF et al., 2005; LONGAUEROVA, 2006;).
Durante muito tempo, as espécies de ECP eram implicadas como patogênicas, enquanto as espécies
de ECN eram consideradas saprófitas e raramente patogênicas. Nos últimos anos, entretanto, a
importância das espécies de ECN implicadas em infecções animais, como por exemplo, na mastite
bovina, tem aumentado, pois compõem a microbiota natural da pele e mucosa desses animais,
ordenhadores, além de estarem presentes no ambiente no qual o animal está inserido (SOARES et
al., 2008).
2.1.2 Staphylococcus pseudintermedius
Staphylococcus pseudintermedius foi primeiramente descrito como S. intermedius por

Hajek (1976) a partir de amostras de cães, pombos, martas e cavalos. Durante décadas, S.
2
intermedius foi considerada a principal espécie de Staphylococcus associada a infecções de pele e
tecidos moles em cães até que Devriese e colaboradores (2005) demonstraram que S. intermedius
é, na verdade, um grupo heterogêneo de bactérias. Esse estudo descreveu a nova espécie S.
pseudintermedius, que até então era classificada com S. intermedius, através da hibridização de
DNA e sequenciamento do gene 16S rRNA.
Essa descoberta fomentou estudos subsequentes que avaliaram a diversidade fenotípica e
genotípica observada em isolados de S. intermedius e levaram a criação do Grupo S. intermedius
(SIG), o qual é constituído de três espécies estreitamente relacionadas: S. intermedius, S.
pseudintermedius e S. delphini (SASAKI et al., 2007b; BANNOEHR et al, 2007). A partir dessas
pesquisas, S. pseudintermedius foi reconhecido como a causa comum de infecções cutâneas em
cães e foi proposto que todos os isolados caninos sejam denominados como S. pseudintermedius,
a menos que métodos de tipagem genotípica revelem o contrário (DEVRIESE et al., 2009).
Devriese e colaboradores (2005) também avaliaram as características de crescimento e
bioquímicas de S. pseudintermedius, que formam colônias não pigmentadas em ágar Sangue de
Carneiro e são cercadas por uma zona de dupla hemólise. Dentre outras características, são catalase
positivos, coagulase positivos, fator “clumping” negativo, fortes produtores de DNase e sensíveis
à novobiocina. São ainda positivos nos testes de produção de acetoína (prova de Voges-Prokaeur),
b-glicosidase, arginina, urease, redução de nitrato e ONPG (b-galactosidase). Produzem ácidos a
partir de glicerol (fraca e tardiamente), ribose, galactose, D-glicose, D- fructose, D-mannose,
mannitol (fraca e tardiamente), N-acetilglicosamina, maltose, lactose, sacarose, trealose e D-
turanose (fraca e tardiamente). O conteúdo G+C do seu DNA é 38 mol%.
2.2 Identificação de Staphylococcus pseudintermedius
Historicamente, membros do gênero Staphylococcus eram classificados e diferenciados

com base na variedade de suas características fenotípicas, como morfologia de colônias e reações
bioquímicas que realizam (CAPURRO, 2009). Staphylococcus pseudintermedius apresenta
colônias de tamanho médio, não pigmentadas e geralmente cercadas por dupla hemólise em ágar
Sangue de Carneiro: incompleta (beta-hemólise) e completa (alfa-hemólise) (BANNOEHR;
GUARDABASSI, 2012). No entanto, a heterogeneidade do Grupo SIG e a dificuldade de
diferenciação fenotípica entre as espécies representam um desafio ao diagnóstico veterinário
(SASAKI et al., 2010).
Diversos métodos de identificação de Staphylococcus spp. estão disponíveis atualmente.
Sistemas automatizados e “kits” comerciais encontram-se no mercado e são utilizados por
inúmeros laboratórios. Todavia, a interpretação dos resultados pode ser subjetiva, levando a erros,
além de possuírem baixa acurácia devido ao limitado número de testes bioquímicos que possuem,
reduzindo assim a quantidade de espécies detectáveis (ZADOKS; WATTS, 2009). Como
consequência, S. pseudintermedius pode ser erroneamente identificado como ECN, uma vez que
esses sistemas são frequentemente padronizados para a diferenciação rápida entre S. aureus e ECNs
desse patógeno em amostras clínicas humanas (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012).
Diferentes provas bioquímicas podem ser realizadas para a diferenciação das espécies de
Staphylococcus, como por exemplo: prova da coagulase, produção de acetoína, beta-galactosidase,
suscetibilidade à polimixina B (300 UI) e à novobiocina (5 μg), fermentação de manitol e
fermentação de maltose (MARKEY et al., 2013). No entanto, a ausência de marcadores
bioquímicos únicos (SASAKI et al., 2010) dificulta a diferenciação fenotípica entre os membros
do grupo SIG (DEVRIESE et al., 2009). A ausência de sistemas de identificação comerciais
apropriados para patógenos de importância veterinária leva ao diagnóstico epidemiológico de S.
3
pseudintermedius, uma vez que as outras espécies do grupo SIG não costumam causar infecções
em cães (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012).
A taxonomia do gênero Staphylococcus foi melhor esclarecida nos últimos anos, graças ao
emprego de técnicas moleculares que permitiram relacionar ou comparar resultados de testes
fenotípicos e genotípicos (LANGE et al, 2011). A descrição de S. pseudintermedius, sua
consequente reclassificação (DEVRIESE et al., 2005) e o reconhecimento da importância de S.
schleiferi sub. coagulans como causador de infecções em cães (FRANK et al., 2003; MAY et al.,
2005) quebraram importantes paradigmas na microbiologia veterinária.
Tendo em vista a dificuldade de discriminação pela identificação bioquímica, novas
tecnologias têm sido desenvolvidas para superar essas limitações e assim possibilitar uma melhor
diferenciação das espécies. Dentre esses métodos, a análise comparativa das sequências de
determinados genes conservados tem sido empregada com a finalidade taxonômica e filogenética,
como por exemplo, o sequenciamento do gene que codifica o RNA ribossomal 16S, que é altamente
conservado entre as espécies (LANGE et al, 2011). As sequências obtidas são comparadas às
depositadas em bancos de dados internacionais, como o National Center for Biotechnology
Information (NCBI), permitindo a inferência da espécie. Porém, técnicas como essa são
relativamente onerosas e consomem bastante tempo (SALGADO, 2013). Desse modo, reações em
cadeia da polimerase (PCR) da região intergênica 16-23S e iniciadores espécie-específicos surgem
como alternativas mais acessíveis (JOUSSON et al., 2007), porém ainda muito pouco utilizadas
por laboratórios brasileiros de diagnóstico microbiológico veterinário. Diversos genes para
identificação bacteriana estão disponíveis na literatura, dentre eles os genes hsp60, tuf, femA, orfX,
Sa442, rpoB, sodA, dnaJ e nuc (VOYTENKO et al., 2006; SHAH et al., 2007; GHEBREMEDHIN
et al., 2008; AL-TALIB et al., 2009; REISCHL et al., 2009; BODE et al., 2012;), além dos genes
como nuc, 23S rDNA e coa, de S. aureus, que podem ser usados para identificação da espécie
(HOOKEY et al, 1998; STRAUB et al., 1999; CIFTCI et al, 2009).
Atentos à necessidade de padronização para a identificação genotípica das diferentes
espécies de ECP de importância veterinária, Sasaki e colaboradores (2010) desenvolveram uma
PCR multiplex (M-PCR) baseada na amplificação dos genes nuc, codificador de uma
termonuclease. Esse método mostrou-se sensível (99,8%) e específico (100%), podendo ser
utilizado para a identificação de S. pseudintermedius e diferenciação das demais espécies do grupo
SIG.
Outro método utilizado para diferenciação de S. pseudintermedius das demais espécies de
ECP é a técnica de PCR associada ao polimorfismo dos tamanhos de fragmentos de restrição
(RFLP-PCR), que tem sido padronizada para os mais diversos genes nos últimos anos e possui
alguns alvos moleculares, como por exemplo, o gene pta (BANNOEHR et al., 2009), kat
(BLAIOTTA et al, 2010) e o gene groEL (BARROS et al., 2007).
Atualmente, outra técnica vem sendo introduzida em laboratórios de diagnóstico humano e
animal, devido ao seu custo-benefício e abordagem rápida e precisa (BANNOEHR;
GUARDABASSI, 2012). A espectrometria de massa MALDI-TOF MS, ou Espectrometria de
Massa por Tempo de Vôo de Ionização/Desorção por Laser Assistida por Matriz, vem ganhando
cada vez mais destaque pelo uso na identificação de diferentes microrganismos ao nível de espécie.
Vantagens como quantidade mínima de amostra necessária para identificação, baixo custo de
execução, níveis insignificantes de resíduos químicos e biológicos gerados e tempo
extraordinariamente curto para obtenção de resultados (CHERKAOUI et al., 2010; ALATOOM et
al., 2011; CARBONNELLE et al., 2011), atraem bastante atenção para essa ferramenta. Os
resultados produzidos são de elevada acurácia em relação à identificação de espécies dentro dos
diversos gêneros bacterianos (PIGNONE et al., 2006; FRIEDRICHS et al., 2007; BARBUDDHE
4
et al., 2008; ILINA et al., 2009; NAGY et al., 2009), possibilitando assim, uma identificação
bacteriana mais precisa, mesmo em culturas mistas (BIZZINI; GREUB, 2010). Os espectros, que
são gerados após o processamento pelo equipamento e análise pelo programa, são então
comparados aos de cepas de referência de seu banco de dados, permitindo a identificação do
microrganismo. É importante ressaltar que essa identificação depende da padronização e
atualização regular do banco de dados (GUARDABASSI et al., 2017), especialmente para
discriminação dos membros do grupo SIG (DECRISTOPHORIS et al., 2011; MURUGAIYAN et
al., 2014).
Apesar do baixo custo de execução, a principal desvantagem dessa tecnologia ainda é o
elevado custo do equipamento e sua implementação, que a torna praticamente inviável para
pequenos e médios laboratórios de diagnóstico veterinário (GUARDABASSI et al., 2017),
especialmente no Brasil.
2.3 Patogenicidade e potencial zoonótico
Staphylococcus pseudintermedius é comensal da pele e mucosas de cães saudáveis,

incluindo folículos pilosos, sacos conjuntivais, narinas, cavidade bucal e região perianal (VAN
DUIJKEREN et al., 2011; BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Como os demais membros do
gênero, é um patógeno oportunista, capaz de causar doença quando há um desequilíbrio na
resistência natural do hospedeiro ou quando a barreira da pele é alterada (BANNOEHR;
GUARDABASSI, 2012). Dermatite atópica, procedimentos médicos ou cirúrgicos e doenças
imunossupressoras são exemplos de fatores predisponentes à infecção (BANNOEHR;
GUARDABASSI, 2012). Fazakerley e colaboradores (2009, 2010) demostraram que os
percentuais de colonização são maiores em cães com dermatite atópica quando comparado com
indivíduos saudáveis, principalmente em sítios como ouvidos e sacos conjuntivais, como
desmonstrado por Furiani e colaboradores (2011). Quanto à colonização por MRSP, os principais
fatores de riscos associados são a hospitalização prévia do animal e a terapia antimicrobiana nos
últimos seis meses (NIENHOFF et al., 2011a)
Esse patógeno é o mais frequentemente isolado de amostras clínicas caninas e é
primariamente associado a infecções de pele (piodermite, infecções teciduais e abscessos) e
ouvidos (otite externa), mas também pode causar infecção em outros tecidos e cavidades, podendo
ser transmitido na comunidade ou em ambiente hospitalar (COX et al., 1984; MORRIS et al., 2006;
WEESE; VAN DUIJKEREN, 2010; BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Além de ser a
principal causa de piodermite canina, S. pseudintermedius também é frequentemente isolado de
amostras de infecções do trato urinário e pode ser um fator de complicação na pododermatite
plasmocítica linfocítica responsiva a imunomoduladores (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012).
Embora os cães sejam os hospedeiros naturais, esse ECP pode colonizar e infectar outras
espécies animais, principalmente gatos e também humanos (VAN HOOVELS et al., 2006;
KADLEC et al., 2010). Staphylococcus pseudintermedius e S. aureus são as espécies de ECP que
compõem a microbiota comensal da pele em gatos, mas não há consenso na literatura veterinária
sobre qual dessas é dominante e fatores geográficos devem ser considerados (ABRAHAM et al.,
2007). Nesses animais, S. pseudintermedius pode causar infecções teciduais, rinite, nefrite,
pneumonia, infecções de trato urinário e septicemia (WETTSTEIN et al., 2008; KADLEC et al.,
2010; POMBA et al., 2010). Dentre as infecções teciduais, é ocasionalmente isolado a partir de
piodermite felina (LOEFFLER et al., 2007), lesões dérmicas inflamatórias como placa eosinofílica,
úlceras, granulomas, dermatite miliar, alopecia auto infligida (psicogênica), pruridos não lesionais
e otite inflamatória (ABRAHAM et al., 2007). Apesar de serem menos colonizados e infectados
5
por S. pseudintermedius (COUTO et al., 2011; NIENHOFF et al., 2011b), gatos apresentam risco
significativo de desenvolverem infecções por MRSP de origem hospitalar ou clínica (NIENHOFF
et al., 2011b; LEHNER et al., 2014). No entanto, infecções por S. pseudintermedius em felinos
parecem ser menos frequentes que as causadas por S. haemolyticus, S. felis e S. simulans
(BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012).
Desde o primeiro relato de infecção humana por S. pseudintermedius (VAN HOOVELS et
al., 2006), infecções têm sido ocasionalmente relatadas e muitas vezes estão diretamente
relacionados ao contato próximo com um cão (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Estudos
demonstram que tutores de cães portadores de infecções causadas por S. pseudintermedius e
veterinários são mais propensos a serem nasalmente colonizados por esse agente do que outros
indivíduos (FRANK et al., 2009; ISHIHARA et al., 2010; WALTHER et al., 2012).
Infecções por S. pseudintermedius associadas a feridas decorrentes de mordidas de cães e
procedimentos pós-mastoidectomia, onicólise, otite externa, sinusite, bacteremia, pneumonia
adquirida em hospital e abscesso cerebral já foram descritas em humanos (BARNHAM &
HOLMES, 1992; LEE, 1994; VANDENESCH et al., 1995; GERSTADT et al., 1999; TANNER et
al., 2000; KIKUCHI et al., 2004; POTTUMARTHY et al., 2004; ATALAY et al., 2005;
KEMPKER et al., 2009). Também já foram relatadas associadas a dispositivos cardíacos em
pacientes idosos e a cateter em uma criança com hemofilia (VAN HOOVELS et al., 2006;
CHUANG et al., 2010; RIEGEL et al., 2011). Dois casos de infecção por MRSP foram descritos
em pacientes com sinusite e, em um deles, num primeiro momento, S. pseudintermedius foi
erroneamente identificado como MRSA (KEMPKER et al., 2009; STEGMANN et al., 2010),
sugerindo que pode haver uma subnotificação de casos devido identificação errônea do agente.
Recentemente, Somayaji e colaboradores (2016) relataram 24 casos de infecções humanas
provocadas por S. pseudintermedius no Canadá, a maioria associada a infecções de pele e tecidos
moles, sendo que em três deles a cepa envolvida era multirresistente. Infecções humanas causadas
por MRSP em pacientes sem nenhum contato com cães sugerem que seres humanos podem,
eventualmente, ser colonizados por MRSP (KELESIDIS & TSIODRAS, 2010; SOMAYAJI et al.,
2016) e que a transmissão homem a homem pode ocorrer (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012),
apesar da sua importância como patógeno zoonótico ser menor que a de MRSA (WEESE; VAN
DUIJKEREN, 2010).
2.4 Fatores de virulência
Microrganismos patogênicos desenvolvem uma série de estratégias de sobrevivência para

colonizar determinados sítios do hospedeiro mediante a aquisição de uma variedade de fatores de
virulência, que facilitam sua aderência às células epiteliais, permitem a invasão das defesas
fagocíticas, a colonização dos tecidos e favorecem sua persistência extracelular (MARQUES et al.,
2013). A adesão do microrganismo às células epiteliais do hospedeiro é uma etapa necessária à
colonização e ao estabelecimento da infecção, sendo mediada por proteínas, como as de ligação do
fibrinogênio, da fibronectina e do colágeno, presentes na superfície bacteriana e que reconhecem
moléculas da célula hospedeira promovendo a colonização (FOSTER, 2009; DUBIN et al., 2013).
Além das proteínas, um mucopolissacarídeo extracelular denominado “slime” relacionado
à produção do biofilme também pode ser produzido durante as etapas iniciais da infecção.
(ARCIOLA et al., 2015). Sua produção é considerada um importante fator de virulência em
estafilococos, especialmente S. aureus e S. epidermidis, pois possibilita a adesão a superfícies,
como a de dispositivos médicos (por exemplo, cateteres e implantes), favorecendo a persistência
desses agentes e a ocorrência de infecções nosocomiais (OTTO, 2013). Além disso, biofilmes
6
bacterianos também são formados em superfícies de mucosas e tecidos, como pele, ouvidos, tratos
urinário e respiratório, entre outros, resultando em infecções crônicas, recorrentes e difíceis de
tratar, uma vez que a ação de antimicrobianos sobre biofilmes é bastante limitada. Esse complexo
sistema, além de constituir uma barreira física, parece regular, através de múltiplos mecanismos,
os alvos antimicrobianos celulares e a expressão de genes de resistência, como a do gene mecA
(AN; FRIEDMAN, 1998; MCCARTHY et al., 2015). Recentemete, Pompilio e colaboradores
(2015) demonstram a habilidade de uma cepa de S. pseudintermedius oriunda de infecção tecidual
humana em formar biofilme maduro in vitro e resistente a antibióticos em concentrações acima
daquelas observadas no soro, incluindo linezolida, tigeciclina e vancomicina, que são considerados
antibióticos de “último recurso” para a medicina contra estafilococos resistentes à meticilina.
Uma vez estabelecidos no tecido, estafilococos são capazes de secretar diversos outros
fatores para obter nutrientes, invadir, sobreviver e disseminar. Esses fatores incluem enzimas e
exotoxinas, tais como: hemolisinas, leucocidinas e DNases (MARQUES, 2016). A principal função
dessas proteínas é converter os tecidos locais do hospedeiro em nutrientes necessários à sua
multiplicação e por isso, são responsáveis pelos efeitos patológicos observados durante o
desenvolvimento da infecção (HAVERI et al., 2008; EL-SAYED et al., 2006). A maioria desses
fatores de virulência extracelulares são codificados por elementos genéticos móveis, tais como:
plasmídeos, transposons e integrons, que facilitam a disseminação horizontal de populações de
estafilococos (MARQUES, 2016).
Muitos dos fatores de virulência de S. aureus tem sido descritos em S. pseudintermedius
(FOSTER, 2009), incluindo enzimas como coagulase, termonuclease e proteases, proteínas de
superfície similares ao fator “clumping” (proteínas de superfície de S. pseudintermedius – Sps) e à
proteína A, além de toxinas como as citotoxinas, toxinas esfoliativas e enterotoxinas (HAJEK et
al., 1976; RAUS et al., 1983; EDWARDS et al., 1997; TERAUCHI et al., 2003a; TERAUCHI et
al., 2003b; FUTAGAWA-SAITO et al., 2004; FUTAGAWA-SAITO et al., 2006; LAUTZ et al,
2006; WLADYKA et al., 2008; FUTAGAWA-SAITO et al., 2009; GEOGHEGAN et al., 2009;
BANNOEHR et al., 2011a; BANNOEHR et al., 2011b; PIETROCOLA et al., 2015). No entanto,
a maior parte dos fatores de virulência de S. pseudintermedius ainda não foi caracterizada em
detalhes (MELTER et al., 2017).
Dentre os fatores encontrados especificamente em S. pseudintermedius está a variante da
enterotoxina estafilocócica do tipo C (SEC canine) identificada em isolados de piodermite canina
(EDWARDS et al., 1997) e que compartilha a capacidade de induzir vômitos e proliferação de
linfócitos T com as demais enterotoxinas estafilocócicas (BANNOEHR et al., 2012). No entanto,
sua prevalência na população de S. pseudintermedius é variável (FUTAGAWA-SAITO et al.,
2004; YOON et al., 2010; BANNOEHR et al., 2012). Outra enterotoxina de S. pseudintermedius,
SE-int, e gene seu relacionado, se-int, foram identificados, com significativa homologia entre SE-
int e as enterotoxinas estafilocócicas SEC (59– 61% de identidade) e SEB (56,6% de identidade).
(FUTAGAWA-SAITO et al., 2004).
Quanto às toxinas esfoliativas, SIET (toxina esfoliativa de S. pseudintermedius) foi
caracterizada (LAUTZ et al., 2006) associada à eritema, esfoliação e formação crostas, sintomas
semelhantes aos observados na piodermite canina, na síndrome da pele escaldada em humanos e
na epiderme exsudativa porcina (TERAUCHI et al., 2003). No entanto, em estudo subsequente, a
aplicação intradérmica da toxina recombinante em cães saudáveis não foi capaz de produzir os
sintomas clínicos ou as lesões histopatológicas (IYORI et al., 2011), de modo que o papel biológico
de SIET permanece não totalmente elucidado (BANNOEHR et al., 2012). Outras duas toxinas
esfoliativas de S. pseudintermedius foram indentificadas em isolados de piodermite canina: EXI
(FUTAGAWA-SAITO et al., 2009) ou ExpA (IYORI et al., 2011) e ExpB (IYORI et al., 2011).
7
Quando aplicada em cães saudáveis, a forma recombinante de EXI produziu lesões erosivas e
alterações histopatológicas, além de possuir efeito sobre um tipo de desmogleína tecidual (Dsg-1),
o que não foi observado quando SIET recombinante foi aplicada (IYORI et al., 2011).
2.5 Staphylococcus pseudintermedius meticilina-resistentes (MRSP) e multirresistência
A relevância de S. pseudintermedius sp. como patógeno em diversos quadros infecciosos

em animais de companhia também está relacionada ao seu potencial de resistência aos
antimicrobianos (WEESE; VAN DUIJKEREN, 2010). Essa resistência tem sido desenvolvida em
diferentes patógenos bacterianos devido, principalmente, ao uso inapropriado desses fármacos em
humanos e animais, propiciando seleção de isolados multirresistentes e o consequente
comprometimento da eficácia do tratamento (VENTOLA, 2015).
Os beta-lactâmicos, por sua grande variedade, representam a maior e mais amplamente
utilizada classe de antimicrobianos. Pertencem a esse grupo os antibióticos que apresentam o anel
beta-lactâmico em sua estrutura, sendo a penicilina a principal família. Essa se divide em três
grupos: penicilinas naturais (ex. penicilinas G e V), aminopenicilinas (ex. ampicilina e amoxicilina)
e penicilinas anti-estafilocócicas, como a oxacilina e a meticilina, sendo esta última não utilizada
no Brasil (BLACK, 2002; LOWY, 2003). Além das penicilinas, também pertencem a esse grupo
as cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos.
Resistência à oxacilina, que representa um marcador para avaliação da resistência cruzada
com os demais antimicrobianos dessa classe, foi primeiramente descrita em 1961, entre isolados
de S. aureus de infecções nosocomiais (JEVONS et al., 1961). O primeiro S. aureus meticilina (ou
oxacilina) resistente (MRSA/ORSA) isolado de animais surgiu em 1972, detectado em leite de
vacas com mastite (DEVRIESE et al., 1972). Desde então, diferentes espécies de animais
domésticos têm sido implicadas como potenciais reservatórios de bactérias resistentes pertencentes
a esse gênero (BAPTISTE et al., 2005; VENGUST et al., 2006; LEONARD; MARKEY 2008;
WEESE; VAN DUIJKEREN, 2010).
A emergência mundial de MRSP tornou-se um dos principais problemas para a Medicina
Veterinária de pequenos animais (POMBA et al., 2017) e as infecções causadas por esse agente,
um desafio à parte. Essa resistência deve-se principalmente a dois mecanismos distintos: a
produção da enzima beta-lactamase, codificada pelo gene blaZ, e a produção da proteína ligante de
penicilina adicional de baixa afinidade (PBP2a), a qual é codificada pelo gene mecA e regulada
pelos genes mecI e mecRI. A PBP2a determina resistência à oxacilina devido sua afinidade
reduzida aos beta-lactâmicos, podendo realizar as reações de transpeptidação quando as PBPs
normais estão bloqueadas pela droga, permitindo a síntese do peptidoglicano no processo de
formação da parede celular bacteriana e conferindo resistência a todos os antimicrobianos da classe
dos beta-lactâmicos (PEHLIVANOGLU; YARDIMCI, 2012).
O gene mecA está localizado em um elemento genético móvel, denominado cassete
cromossômico estafilocócico mec (“staphylococcal cassette chromosome” – SCCmec), de
diferentes tipos, que pode ser transferido via plasmídeo, transposons ou elementos genéticos
móveis, e se integrar ao genoma bacteriano (KATAYAMA et al., 2001; TURLEJ et al., 2011). O
cassete mec é formado por dois componentes principais: o complexo mec, composto pela ilha de
patogenicidade IS43, pelo gene mecA e seus reguladores mecI e mecRI; e pelo complexo ccr que
codifica as recombinases do cassete cromossômico, as quais são responsáveis pela correta excisão
e consequentemente integração desse elemento no cromossoma estafilocócico (HIRAMATSU et
al. 2014).
8
O cassete mec pode carrear ainda outros elementos genéticos como Tn554, pUB110 e
pT181, que codificam resistência às outras classes de antimicrobianos. Por exemplo, os genes erm,
que são os responsáveis pela resistência cruzada, expressa de maneira constitutiva ou induzida, a
macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B (MLSB), estão localizados no Tn554, presente no
SCCmec tipos II e III (ITO et al., 2001; ROBERTS, 2008). A transferência horizontal do gene
mecA em estafilococos, e dos elementos genéticos inseridos no SCCmec, resultou então na
disseminação mundial de clones oxacilina e multirresistentes, tornando-se uma dificuldade
adicional para o controle de infecções causadas por esse agente (ITO et al., 2001). Essa
multirresistência é frequentemente observada em cepas MRSP (PERRETEN et al., 2010;
RUSCHER et al., 2010; MOODLEY et al., 2013), que também constituem um reservatório de
genes de resistência para outros estafilococos (POMBA et al., 2017).
Atualmente, existem 11 tipos de elementos SCCmec em MRSA, originados da
recombinação de oito diferentes complexos de genes ccr e seis diferentes genes do complexo mec
(International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome Elements – IWG-SCC,
2018). Em MRSP são descritos diferentes tipos de elementos SCCmec (II–III, III, IV, V, VII),
assim como elementos não tipáveis (NT) (DESCLOUX et. al., 2008; BLACK et al., 2009;
PERRETEN et al., 2010, 2013), com significativa variabilidade na sua distribuição dentre os clones
de MRSP mundialmente reportados (DOS SANTOS et al., 2016). No entanto, dados de frequência
e distribuição desses elementos em cepas brasileiras permanecem pouco conhecidos.
2.6 Tipagem molecular de cepas MRSP
A tipagem molecular de microrganismos tem o papel principal de avaliar as relações

genéticas entre os isolados e possibilitar a compreensão do parentesco clonal entre as cepas, o que
é essencial para determinar a fonte e as rotas de infecção, identificar um surto, traçar rotas de
transmissão, reconhecer cepas particularmente virulentas e avaliar a eficácia das medidas de
controle (PÉREZ-LOSADA et al., 2013).
Diferentes métodos têm sido utilizados para caracterizar e determinar a diversidade genética
de cepas bacterianas. Cada método tem suas vantagens e limitações, e nenhum utilizado de forma
isolada combina elevado poder discriminatório, completa portabilidade interlaboratorial, fácil
execução e baixo custo (SOARES, 2017). Desse modo, devido à especificidade variável e
diferentes estruturas alvo, a escolha dos métodos de tipagem deve obedecer ao objetivo do estudo
(FESSLER et al., 2011).
Além dos conhecidos desafios na identificação de S. pseudintermedius, existe a necessidade
de padronização de métodos de tipagem que possibilitem a investigação epidemiológica e o
monitoramento de MRSP (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Dentre os métodos
comumente utilizados para a caracterização de S. pseudintermedius estão o PFGE (Eletroforese em
Gel de Campo Pulsado – “Pulsed Field Gel Electrophoresis”), a tipagem do gene spa, o MLST
(Tipagem da Sequência Multilocus – “Multilocus Sequence Typing”) e a tipagem do cassete
SCCmec (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012).
2.6.1 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (“Pulsed Field Gel Electrophoresis” – PFGE)
O PFGE é reconhecidamente um dos métodos mais discriminatórios para tipagem

bacteriana e particularmente indicado para monitoramento e investigações de surtos
(BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). A técnica foi desenvolvida por Schwartz e Cantor (1984)
e é baseada na análise dos perfis gerados pela atuação da enzima de restrição no DNA bacteriano.
9
O organismo é incorporado em agarose, seguindo-se as etapas de lise e digestão do DNA
cromossomal com enzimas de restrição. A principal enzima de restrição utilizada para
Staphylococcus spp. é a SmaI, que reconhece e cliva sequências CCC-GGG do DNA. Peças dessa
agarose contendo fragmentos do DNA cromossomal são inseridos nos poços de um gel de agarose,
onde os fragmentos são revelados em padrões de bandas, através de um aparelho que regula a
direção da corrente de acordo com um padrão pré-determinado. Um dos modelos mais comumente
utilizados no PFGE é sistema de campo elétrico homogéneo (CHEF), no qual o DNA, que
apresenta carga negativa, é direcionado através de um plano de uma matriz de gel de agarose ao
polo positivo. Em contraste a eletroforese convencional, no qual a corrente elétrica é aplicada no
gel em uma única direção, a corrente no PFGE é fornecida em pulsos que se alternam entre três
conjuntos de eletrodos, resultando em um alto nível de resolução dos fragmentos (ANDREI et al.,
2006; TENOVER et al.,1997).
De acordo com Tenover e colaboradores (1995), os padrões de bandas de um isolado são
então comparados com os de outro para determinar se há relação entre eles, sendo considerados
“clones” no PFGE as cepas que apresentem o mesmo padrão de fragmentação com a devida
correspondência de tamanho entre as bandas. Mutações pontuais, deleções, inserções e perda ou
aquisição de plasmídeos poderiam acarretar menores diferenças nos perfis sem produzir novos
subtipos. Isolados que diferem em duas ou três bandas (consistente em um evento genético) são
considerados intimamente relacionados, enquanto a diferença de quatro a seis bandas (dois eventos
genéticos) resulta num possível parentesco. Os isolados são considerados sem parentesco caso o
padrão no PFGE difere de sete ou mais bandas (três ou mais eventos genéticos).
A técnica tem sido utilizada com sucesso em investigações epidemiológicas de curto prazo,
provando ser um método bastante preciso e reprodutível (RANJBAR et al., 2014). No entanto,
demanda um intensivo trabalho laboratorial, múltiplos dias para realização do procedimento,
pessoal qualificado para interpretar os resultados e auxílio de um “software” para análise do padrão
de bandas (GOERING, 2010). Além disso, possui baixa portabilidade interlaboratorial (RANJBAR
et al., 2014). Até o momento, não existe um protocolo de PFGE padronizado para S.
pseudintermedius e maioria dos protocolos utilizados foi desenvolvida para estudos em S. aureus,
o que dificulta a comparação de resultados entre os estudos e a divulgação dos mesmos
(BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012; ABOU-ELNAGA, 2017).
2.6.2 Tipagem do gene spa
Diferentemente da técnica de PFGE, um protocolo específico de tipagem através do gene

spa foi desenvolvido (MOODLEY et al, 2009) e pode ser facilmente empregada para a tipificação
de cepas de MRSP (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Essa abordagem baseada em
sequência de um único locus utiliza os mesmos princípios da tipificação do gene spa de S. aureus
e foi desenvolvida a partir da descoberta de um homólogo da proteína A estafilocócica no genoma
de S. pseudintermedius (MOODLEY et al, 2009). A proteína A estafilocócica é uma proteína
estável da parede celular e é composta de três regiões: (i) sequencia C terminal; (ii) região X; e (iii)
sequencia N-terminal. A região X é a única região polimórfica e sua função não é conhecida.
Através da amplificação, sequenciamento e análise dessa região polimórfica X, sequências
de repetição em tandem são visualmente identificadas, recebem um código e o tipo de spa é
determinado numericamente dependendo da composição e da ordem dessas repetições
(MOODLEY et al, 2009). A principal vantagem da tipagem do gene spa sobre o PFGE é a
possibilidade de coletar e armazenar essas informações sobre repetições e códigos em um banco
de dados “online”, acessível a qualquer um que disponha de acesso a internet (http://www.pse-
10
spa.org) (MOODLEY et al, 2009). Mas, apesar do seu poder discriminatório ser comparável ao
PFGE, não é efetivo para a tipagem de isolados sensíveis à meticilina (MOODLEY et al, 2009).
2.6.3. Tipagem da Sequência Multilocus (“Multilocus Sequence Typing” – MLST)
A fim de superar a insuficiência na portabilidade das abordagens tradicionais, o método

MLST foi desenvolvido (MAIDEN et al., 1998), sendo amplamente utilizado em estudos
epidemiológicos, de evolução e genética populacional. Essa técnica analisa a variação de sequência
em genes que evoluem lentamente, com acurácia, elevado poder discriminatório e portabilidade
das sequências de DNA (SOLYMAN et al., 2013). Baseia-se na comparação de sequências de
DNA de cerca de 500 pb de, no mínimo, sete genes altamente conservados (“housekeeping genes”),
que são amplificados por PCR e em seguida sequenciados. Os genes de manutenção são
frequentemente selecionados pois são mais conservados e estão presentes em todos os isolados da
mesma espécie. A relação genética entre as cepas é determinada pela análise das sequências dos
múltiplos genes, os quais são comparados pela substituição de nucleotídeo na sequência, resultando
em um perfil alélico ou sequência tipo (“sequence type” – ST) da bactéria analisada. As cepas são
agrupadas no mesmo complexo clonal (CC) caso possuam de cinco a sete genes de manutenção
com sequências idênticas (DEURENBERG et al., 2008). Parentesco entre STs pode ser revelado
usando o método de agrupamento com base em tipos relacionados ao algoritmo de sequência,
(eBURST ou a mais recente versão otimizada global, goeBURST) inferindo padrões de
descendência evolutiva entre isolados por um modelo de expansão clonal e diversificação e
atribuindo aos complexos clonais (FRANCISCO et al., 2012).
O primeiro protocolo de MLST desenvolvido para estudos populacionais de membros do
grupo SIG era baseado em quatros loci e forneceu informações valiosas sobre a estrutura genética
dessas espécies (BANNOEHR et al., 2007). Esse esquema possibilitou a detecção de dois
importantes clones epidêmicos de MRSP: ST68, na América do Norte e ST71, na Europa
(PERRETEN et al., 2010). No entanto, o método posteriormente desenvolvido para S.
pseudintermedius e baseado em sete loci (SOLYMAN et al., 2013) aumentou o poder
discriminatório e ampliou o conhecimento sobre aa dinâmica populacional, mostrando que S.
pseudintermedius possui grande diversidade genética.
Em recente uma revisão sistemática, dos Santos e colaboradores (2016) forneceram
evidências, através da análise de 503 STs depositados na base de dados do MLST, de que S.
pseudintermedius possui estrutura populacional epidêmica, a qual linhagens de MRSP bem-
sucedidas com características específicas quanto à resistência antimicrobiana, diversidade genética
e distribuição geográfica, emergiram e diversificaram-se rapidamente em uma população
fracamente ou não clonal, através de múltiplas aquisições de SCCmec e outros elementos genéticos
móveis. Isso contrasta com o que é observado em S. aureus, que exibe baixas taxas de
recombinação (VOS; DIDELOT, 2009) e linhagens clonais discretas, que diversificam radialmente
de ancestrais filogeneticamente bem suportados (FEIL et al., 2003; FEIL et al., 2004) e sugere a
grande capacidade de transferência horizontal de genes em S. pseudintermedius (MCCARTHY ET
AL., 2015; DOS SANTOS et al., 2016).
A principal vantagem do MLST é que o método é altamente reprodutível e os dados
produzidos não são ambíguos, uma vez a nomenclatura é internacionalmente padronizada. Além
disso, as sequências de alelos e perfis ST estão disponíveis em grandes bases de dados centrais
(http://pubmlst.org e www.mlst.net) que podem ser facilmente consultadas. No entanto, o elevado
custo apresenta-se como uma limitação, principalmente pelo sequenciamento de número
11
considerável de loci por isolado, custos esses que tendem a ser ainda mais elevados dependendo
do país onde o estudo é conduzido.
2.6.4 Tipagem do cassete cromossômico mec (SCCmec)
Cepas de Staphylococcus sp. também podem ser tipificadas através da detecção do cassete
mec por PCR. Os elementos que compõem o SCCmec são altamente diversos quanto à organização
estrutural e conteúdo genético, mas compartilham várias características, como: (i) carreamento do
gene mecA em um complexo-mec, (ii) carreamento do (s) gene (s) ccr em um complexo-ccr, (ii)
integração em um sítio específico no cromossomo estafilocócico, referido como sequência do sítio
de integração para SCC, que serve como alvo para recombinação mediada por ccr e (iv) a presença
de sequências de repetição direta de flanqueamento contendo a sequência do sítio de integração
(IWG-SCC, 2009). Esses elementos são classificados em tipos que são definidos pela combinação
de: (i) tipo do complexo-ccr, que é representado pelo alótipo do gene ccr e (ii) classe do complexo-
mec, que são os elementos-chave responsáveis pela integração e excisão do SCCmec e do fenótipo
de resistência a beta-lactâmicos, respectivamente (IWG-SCC, 2009).
Além dos complexos ccr e mec, SCCmec também possui três “regiões de junção”,
conhecidas como “regiões J”: J1 (anteriormente L-C) situa-se entre a junção cromossômica direita
e o complexo-ccr, J2 (C-M) está entre o complexo-ccr e o complexo-mec e J3 (I-R) entre o
complexo-mec e a junção cromossômica esquerda (IWG-SCC, 2009). Essas regiões constituem
componentes não essenciais do cassete, podem conter determinantes adicionais da resistência
antimicrobiana e suas variações dentro do mesmo complexo mec-ccr são usadas para definir os
subtipos de de cassete (IWG-SCC, 2009).
Diferentes protocolos de detecção desenvolvidos originalmente para tipificação do
SCCmec em cepas de MRSA (OLIVEIRA et al., 2001; ZHANG et al., 2005; KONDO et al., 2007;
MILHEIRIÇO et al., 2007) têm sido utilizados na caracterização de MRSP. Dez tipos de SCCmec
(I–X) têm sido identificados com base no perfil alélico do gene da recombinase (ccr) e na classe
do complex mec, além de subtipos dependendo das variações em três regiões de junção (J1-J3)
(BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Alguns tipos de SCCmec observados em MRSP
correspondem a tipos previamente encontrados em MRSA (como o SCCmec V em ST68),
enquanto outros são encontrados somente em cepas MRSP (como o SCCmec II-III em ST71),
sendo esse elemento uma combinação do SCCmec II de S. epidermidis e III de S. aureus.
(DESCLOUX et al., 2008; BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Outros, no entanto, não são
tipáveis quando os esquemas de tipagem desenvolvidos para essas espécies são utilizados (BLACK
et al., 2009; PERRETEN et al., 2010; RUSCHER et al., 2010)
Em estudos prévios, o sequenciamento do genoma confirmou seis tipos em cepas MRSP:
SCCmec tipo II-III e tipo VII (DESCLOUX et al., 2008); tipo V (BLACK et al., 2009);
ψSCCmec57395 (PERRETEN et al., 2013); tipo IV(MCCARTHY et al., 2015); e tipo AI16-
SCCczrAI16-CI (CHANCHAITHONG et al., 2016).
3 OBJETIVOS
12
3.1. Objetivo geral
Avaliar o perfil de virulência, resistência antimicrobiana e diversidade de cepas de

Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) associados a processos infecciosos em animais de
companhia.
3.2. Objetivos específicos
• Avaliar, fenotipicamente, a formação de biofilme e detectar genes de virulência associados

à produção de enterotoxinas estafilocócicas, leucodinas, hemolisinas e toxinas esfoliativas;
• Avaliar, fenotipicamente, a resistência à meticilina em isolados de S. pseudintermedius
oriundos de processos infecciosos em animais de companhia;
• Detectar a presença do gene mecA e tipificar os elementos SCCmec em cepas MRSP;
• Determinar a ocorrência de multirresistência em cepas de MRSP;
• Formar perfis genéticos através da detecção de genes de virulência, tipagem do SCCmec,
do spa, por PFGE e MLST;
• Determinar as linhagens circulantes de MRSP.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
13
4.1. Amostragem
Os isolados de S. pseudintermedius estudados foram obtidos a partir de 169 amostras

clínicas. Dessas, 164 (164/169) eram oriundas de processos infecciosos em animais de companhia
atendidos no Hospital Veterinário de Pequenos Animais (HVPA) da Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro (UFRRJ) nos anos de 2014 e 2015. Essas amostras foram enviadas ao Laboratório
de Microbiologia do Programa de Residência em Microbiologia da UFRRJ para identificação do
agente etiológico envolvido. Os 188 Staphylococcus spp. identificados das 164 amostras clínicas
foram estocados a – 20oC em caldo Infuso de Cérebro e Coração (BHI – KASVI®) acrescido de
glicerol 45%. Após identificação preliminar por espectrometria de massa MALDI-TOF, 87
isolados pertencentes ao grupo SIG foram selecionados para o presente estudo. Também foram
estudados cinco Staphylococcus spp. oriundos de cinco amostras clínicas (5/169) de processos
infecciosos em animais de companhia enviadas a um laboratório comercial na cidade do Rio de
Janeiro no ano de 2017, totalizando 92 isolados investigados. A origem desses isolados, os sítios
de infecção e tipos de amostra encontram-se detalhados no Anexo A. Com o objetivo de estabelecer
um padrão de diferenciação, bem como avaliar uma possível similaridade entre isolados de origens
diferentes, a cepa MRSP S231 (mecA positiva, SCCmec II-III e resistência a CLO, CIP, ERI, GEN,
KAN, LIN, PEN, TET) oriundo de amostra de mastite bovina subclínica foi incluída para o estudo
da diversidade. O presente estudo foi submetido ao Comitê de Ética da UFRRJ (número do
protocolo: CEUA 1652171215).
Este estudo segue a nomenclatura utilizada por Tenover e colaboradores (1995), a qual o
termo “isolado” refere-se à cultura pura de bactérias obtidas por subcultura de uma única colônia
para o qual não há informações disponíveis além do gênero e espécie. Já termo “cepa” (ou
“estirpe”) refere-se à um isolado ou grupo de isolados que podem ser distinguidos de outros do
mesmo gênero e espécie por características fenotípicas e/ou genotípicas, sendo uma subdivisão
descritiva de uma espécie.
4.1.1 Isolamento e identificação presuntiva de Staphylococcus coagulase-positivos
As amostras clínicas foram submetidas à rotina de identificação que consistiu no isolamento

primário em ágar Base para Sangue (KASVI®) acrescido de 5% de sangue de carneiro desfibrinado.
As placas foram incubadas a 35 ± 2oC por 24 horas. Após a identificação presuntiva das colônias,
essas foram submetidas ao método de coloração de Gram para confirmação das suas características
morfotintoriais. Os cocos Gram-positivos foram então repicados em ágar seletivo Manitol
Vermelho de Fenol (AMVF) (microMED, ISOFAR®) acrescido de 7,5% de NaCl e incubados 35
± 2oC por 24 horas para obtenção de culturas de Staphylococcus spp. Após incubação, foi realizada
observação das características das colônias e fermentação, ou não, do manitol (KONEMAN et al.,
2008).
4.1.2 Prova do hidróxido de potássio (KOH) 3% e prova da catalase
A prova do hidróxido de potássio foi efetuada através da adição de um fragmento da colônia

bacteriana a uma gota de KOH a 3% sobre uma lâmina. A não formação de um gel viscoso indicou
um resultado negativo. No teste da catalase, um fragmento de colônia bacteriana foi adicionado a
algumas gotas de peróxido de hidrogênio (H2O2). A formação de bolhas indicou teste positivo e
presença da enzima catalase (KONEMAN et al., 2008). A cepa Staphylococcus aureus subsp.
aureus ATCC® 25923TM foi utilizada como controle (KOH 3% negativo, catalase positiva).
14
4.1.3 Prova da coagulase
O teste para detecção da coagulase foi realizado utilizando o crescimento bacteriano obtido
em 1 ml de caldo BHI BHI (HIMEDIA®) incubado a 35 ± 2oC por 24 horas. Uma alíquota de 200
μl de cada amostra foi adicionada a 200 μl de plasma de coelho (Larboclin®), seguida de incubação
35 ± 2 oC por 6 horas, para visualização do coágulo (KONEMAN et al., 2008). A cepa
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 25923TM foi utilizada como controle (coagulase
positiva).
4.1.4 Prova de suscetibilidade à bacitracina e à polimixina
Uma suspensão direta da colônia equivalente à escala 0,5 de McFarland foi distribuída por
toda a superfície de uma placa de Petri contendo ágar Müeller Hinton (AMH – KASVI®) com o
auxílio de um “swab”. Os discos de bacitracina 0,04 UI e polimixina 300 µg (Sensifar, Cefar®)
foram depositados sobre a superfície do meio, contendo o inóculo. Após incubação por 24 horas a
35 ± 2oC, a zona de inibição ao redor do disco foi observada e medida. Os estafilococos são
resistentes à bacitracina e crescem até a borda do disco, enquanto que os micrococos são sensíveis
e apresentam halo de, no mínimo, 10 mm (KONEMAN et al., 2008; MARKEYet al., 2013).
Staphylococcus pseudintermedius é sensível à polimixina, apresentando halo  10 mm (MARKEY
et al., 2013). A cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 25923TM foi utilizada como
controle (resistente à bacitracina e à polimixina).
4.1.5 Prova de Voges-Proskauer e fermentação de manose e maltose
Os isolados de ECP foram bioquimicamente identificados através das provas de Voges-

Proskauer (VP), fermentação da maltose e manose (KONEMAN et al., 2008). As cepas S.
pseudintermedius CD93 e Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 25923TM foram utilizadas
como controles.
A prova de Voges-Proskauer foi realizada utilizando-se 1 ml de Caldo MR-VP (Vetec
Química Fina®). A utilização da glicose, apresentando como produto final a acetoína, é indicada
pela coloração rosa após a adição de 100 μl de α-naftol a 5% e 300 μl de KOH (40%) no caldo
contendo o inóculo incubado por 24 horas a 35 ± 2oC.
A fermentação dos açúcares manose e maltose foi avaliada utilizando caldo base contendo o
indicativo de pH vermelho de fenol (microMED, ISOFAR®) e o açúcar a 1%. A produção de ácido,
indicada pela diminuição do pH e consequente mudança de cor, foi avaliada após 24 horas à
temperatura de 35 ± 2oC. O Quadro 1 mostra os resultados esperados na identificação fenotípica
das espécies de ECP (DEVRIESE et al., 2005; MARKEY et al., 2013).
Quadro 1. Resultados esperados na identificação fenotípica das espécies de ECP
15
Coagulase Bacitracina Polimixina VP Manitol Manose Maltose Identificação
+ R S - (+) + +/- S. pseudintermedius
+ R S fraco ND ND -/fraco S. intermedius
+ R ND - + + + S. delphini
+ R R + + + + S. aureus
+ R ND - +/- - + S. aureus subsp. anaerobicus
+ R ND + (+) + - S. schleiferi subsp. coagulans
+/- R R - - + - S. hyicus
ND: Não determinado; R: Resistente; S: Sensível; (+) 11 a 89% de isolados positivos.
4.2 Identificação molecular de Staphylococcus pseudintermedius
Os isolados foram reativados em ágar Tripticase de Soja (TSA – BD Difco™) e

posteriormente submetidos à liberação do DNA bacteriano por lise térmica para as análises
genotípicas.
4.2.1 Liberação do DNA bacteriano por lise térmica
Para liberação do DNA bacteriano, foi utilizada metodologia proposta por Velasco e
colaboradores (2015), com algumas modificações. Cada isolado foi cultivado em microtubos
contendo 1 ml de caldo Infuso de Cérebro e Coração (BHI – BD Difco™) a 35 ± 2oC por 24 horas.
Após incubação, os cultivos foram submetidos à centrifugação a 30.000 ×g durante 2 minutos e
30 segundos. O sobrenadante foi descartado, adicionou-se 200 µl de água ultrapura, seguida de
agitação em “vortex”, incubação a 100 oC por 10 minutos em bloco de aquecimento do tipo
termobloco (ou banho seco) e nova centrifugação a 30.000 ×g por 2 minutos e 30 segundos. Por
fim, 180 µl do DNA sobrenadante foi adicionado a um novo microtubo e armazenado a -20 oC.
4.2.2 Identificação pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerase Chain

Reaction” – PCR)
A caracterização genotípica foi realizada pela amplificação utilizando iniciadores específicos

para o gênero Staphylococcus (ZHANG et al., 2004), e para a espécie Staphylococcus
pseudintermedius (SASAKI et al., 2010) (Quadro 2). A cepa S. pseudintermedius CD93 foi
utilizada como padrão para amplificação do gene nuc.
Foram utilizadas as seguintes concentrações de reagentes nas reações de PCR: Tampão
DreamTaq 10X (2,0 mM MgCl2, Thermo Fischer Sientific), 0,5 mM de dNTP (Invitrogen®), 1,25
U DreamTaq DNA Polimerase (Thermo Fischer Sientific), 0,4 μM de cada iniciador, água mili-
Q para completar um volume total de reação de 25 µl e 2 µl do DNA total liberado. Os fragmentos
foram avaliados por eletroforese em gel de agarose a 2%. O marcador de tamanho molecular de
10.000 pb (Bionexus™ Hi-Lo DNA marker) foi utilizado. Após a eletroforese, o gel foi corado
em solução de brometo de etídio (1,5 μg/ml) de etídio por 20 minutos. A imagem do mesmo foi
capturada pelo fotodocumentador Omega Lum™ G Imaging System (Alpegen®).
Quadro 2. Iniciadores e ciclos empregados para identificação genotípica

Gene Espécie Sequência dos iniciadores (5’-3’) Ciclo
16
(Tamanho do
fragmento)
95ºC 5 min (94°C
16S rRNA AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA 30 s, 58°C 30 s,
Staphylococcus spp.
(756pb) CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC 72°C 1 min) x 30 e
72 ºC 10 min
95°C 2 min (95°C
nuc TRG GCA GTA GGA TTC GTT AA 30 s, 56°C 35 s e
S. pseudintermedius
(926 pb) CTT TTG TGC TYC MTT TTG G 72°C 1 min) x 30 e
72°C 2 min
4.2.3 Identificação proteômica por MALDI-TOF MS
A identificação proteômica pela técnica do Tempo de Vôo de Ionização/Desorção por Laser

Assistida por Matriz (MALDI-TOF MS) foi realizada em duas etapas. Na primeira, todos os
isolados fenotipicamente identificados foram submetidos a essa avaliação no Laboratório de
Investigação em Microbiologia Médica (LIMM) do Instituto de Microbiologia Paulo Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) para triagem inicial, uma vez que que banco de
dados do equipamento (MALDI-TOF LT Microflex Bruker, Bruker®) desse laboratório não é
padronizado para a apropriada diferenciação entre os membros do grupo SIG.
Os isolados que posteriormente apresentaram-se resistentes à meticilina foram então
identificados quanto à espécie pelo MALDI-TOF MS do Laboratório do Dr. Qijing Zhang
(Veterinary Microbiology & Preventive Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State
University – ISU, EUA), que possuía banco de dados atualizado e adequadamente padronizado
para a precisa diferenciação entre os membros do grupo SIG.
Em ambas as etapas, os isolados foram cultivados em ágar BHI (KASVI®) a 35 ± 2oC por
24 horas. Cada cultura bacteriana foi transferida, em duplicata, para a microplaca (96 MSP, Bruker
- Billerica, EUA) e, ao sedimento bacteriano, foi adicionada uma solução de lise (ácido fórmico
70%, Sigma-Aldrich®) em quantidade suficiente para cobri-lo. Em seguida, 1 μl de solução da
matriz (ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico diluído em acetonitrila 50% e ácido trifluoracético
2,5%, Sigma-Aldrich®) foi utilizado para cobrir o extrato bacteriano, para finalmente ser
processado. Os espectros de cada amostra foram gerados em um espectrômetro de massa (MALDI-
TOF LT Microflex Bruker, Bruker®) equipado com laser de 337 nm de nitrogênio no modo linear
controlado pelo programa FlexControl 3.3 (Bruker®). Os espectros foram coletados na faixa de
massas entre 2.000-20.000 m/s e posteriormente, analisados pelo programa MALDI Biotyper 2.0
(Bruker®), com as configurações padronizadas para identificação bacteriana. O programa confronta
os espectros da amostra desconhecida com amostras de referência em um banco de dados. Os
resultados obtidos variam em uma escala que vai de zero a três, sendo que quanto maior o valor,
mais confiável é a identificação (Quadro 3).
Quadro 3. Interpretação dos escores resultantes da avaliação proteômica por MALDI-TOF MS

Escore Interpretação Símbolo Cor
2.00 – 3.00 Alta confiança (+++) Verde
1.70 – 1.99 Baixa confiança (+) Amarelo
0.00 – 1.69 Nenhuma identificação possível (-) Vermelho
4.3. Detecção da produção de “slime” em microplaca de poliestireno
17
A formação de “slime” em microplaca foi avaliada quantitativamente através de
metodologia descrita por Marques et al. (2013). Os isolados testados foram repicados em ágar
Sangue de Carneiro 5% (AS) por 24 horas a 35 ± 2oC e as colônias crescidas foram inoculadas em
ágar BHI e também incubadas a 35 ± 2oC por 24 horas. As culturas bacterianas foram ajustadas a
escala 0,5 de McFarland e diluídas 1:10 em caldo Tripticase de Soja (TS) (MERCK®) com adição
de 0,24% de glicose. Alíquotas de 200 μl dessa suspensão foram inoculadas em microplacas de
poliestireno estéreis com 96 poços (Zellkultur-Testplatten, TPP®) e incubadas por 24 horas a 35 ±
2oC sem agitação. Após incubação, esse material foi desprezado e os poços foram lavados 2 vezes
com 200 μl de solução salina estéril, secos em estufa a 65oC por 1 hora e corado com 200μl de
safranina 1% por 15 minutos. Os poços foram lavados três vezes com água destilada e secos à
temperatura ambiente. A absorbância foi determinada à 490 nm em leitor de ELISA (Multiskan™
GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific™). Poços não inoculados contendo caldo
TSA com 0,24% de glicose serviram como branco. Os isolados foram testados em triplicata e a
média dos três valores de absorbância obtidos foi calculada para cada isolado avaliado. As cepas
foram classificadas quanto à intensidade de formação de biofilme de acordo com os seguintes
valores de absorbância obtidos: forte ≥ 0.3; moderado ≥ 0.2 e <0.3 e fraco ≥ 0.1 e <0.2 (MARQUES
et al., 2013).
4.4. Detecção de genes de virulência
A técnica de PCR foi realiazada utilizando os iniciadores descritos no Quadro 4, para a

detecção dos seguintes genes de virulência:
• Enterotoxinas estafilocócicas – sea, codificador da enterotoxina do tipo A (SEA), seb
(SEB), sec (SEC), seccanine (enterotoxina do tipo C em S. pseudintermedius), sed (SED),
e se-int (enterotoxina em S. pseudintermedius – SE-int);
• Leucocidinas – lukS-lukF (leucocidina Panton-Valentine), lukE-lukD, (bicomponente
da leucotoxina LukE-LukD em S. aureus) e lukM (leucocidina M);
• Hemolisinas – hla (alfa-hemolisina) hlb (beta-hemolisina), hld (delta-hemolisina), hlg
(gama-hemolisina), hglv (variante da gama-hemolisina);
• Toxinas esfoliativas – eta, que codifica toxina esfoliativa do tipo A (ETA), etb (ETB),
etd (ETD), siet (toxina esfoliativa de S. pseudintermedius) e exi (toxina esfoliativa de
S. pseudintermedius).
Foram utilizadas as seguintes concentrações de reagentes: Tampão 1 X (Thermo Fischer

Sientific), 0,4 µM de cada iniciador, 0,5 mM de dNTP (Invitrogen), 1,25 mM de MgCl2, 0,5 U
de Taq DNA Polimerase (Thermo Fischer Sientific), água mili-Q para completar um volume total
de reação de 25 µl e 2 µl do DNA total liberado. Os fragmentos foram avaliados por eletroforese
em gel de agarose a 2%. O marcador de tamanho molecular de 10.000 pb (Bionexus™ Hi-Lo DNA
marker ) foi utilizado. Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,5
μg/ml) por 20 minutos. A imagem do mesmo foi capturada pelo fotodocumentador Omega Lum™
G Imaging System (Alpegen®).
Quadro 4. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação dos genes de virulência

Gene Sequência dos iniciadores (5’ – 3’) Referência* Ciclo
18
(Tamanho do
fragmento)
sea TTG CAG GGA ACA GCT TTA GGC AAT C
(252 pb) TGG TGT ACC ACC CGC ACA TTG A
95 ºC 5 min (95°C 1min,
seb GAC ATG ATG CCT GCA CCA GGA GA 1 60 °C 1 min, 72 °C 1 min)
(355 pb) AAC AAA TCG TTA AAA ACG GCG ACA CAG x 35 e 72 ºC 10 min
sed GAA AGT GAG CAA GTT GGA TAG ATT GCG GCT AG
(830 pb) CCG CGC TGT ATT TTT CCT CCG AGA G
95°C 10 min (95ºC 1 min,
sec CTT GTA TGT ATG GAG GAA TAA CAA
2 68°C 45 s, 72°C 1 min) x
(283 pb) TGC AGG CAT CAT ATC ATA CCA
15 e 72ºC 10 min
97 ºC 5 min (92 ºC 30 s,
seccanine GTA ATT TTG ATA TTC GCA CT
3 40 ºC 1 min, 72 ºC 1 min)
(793 pb) TAT CAA AAT CGG ATT AAC A
x 45 e 72 ºC 5 min
95 ºC 5 min (95°C 30 s,
se-int TAT AGG TAC CCT TGG ACT TTT GGA TG
4 55 °C 30 s, 72 °C 2 min)
(874 pb) TGG CGA GCT CCA AAT CCA TTA GCC
x 30 e 72 ºC 10 min
lukS-PV–lukF- 94 ºC 5 min (94°C 30 s,
ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A
PV 5 55 °C 30 s, 72 °C 1 min)
GCA TCA AST GTA TTG GAT AGC AAA AGC
(433 pb) x 30 e 72 ºC 7 min
94 ºC 30 s (94°C 30 s, 55
lukE-lukD TGA AAA AGG TTC AAA GTT GAT ACG AG
°C 30 s, 72 °C 30 s) x 30
(269 pb) TGT ATT CGA TAG CAA AAG CAG TGC A
e 72 ºC 1 min
95 ºC 10 min (95°C 20 s,
lukM TGG ATG TTA CCT ATG CAA CCT AC
54 °C 30 s, 72 °C 30 s) x
(780 pb) GTT CGT TTC CAT ATA ATG AAT CAC TAC
30 e 72 ºC 5 min
hla CTG ATT ACT ATC CAA GAA ATT CGA TTG
(209 pb) CTT TCC AGC CTA CTT TTT TAT CAG T M-PCR 94 ºC 5 min
hlb GTG CAC TTA CTG ACA ATA GTG C (94°C 30 s, 63 °C 30 s, 72
(309 pb) GTT GAT GAG TAG CTA CCT TCA GT °C 1 min) x 30 e 72 ºC 7
6
hld AAG AAT TTT TAT CTT AAT TAA GGA AGG AGT G min
(111 pb) TTA GTG AAT TTG TTC ACT GTG TCG A
hlg GTC AYA GAG TCC ATA ATG CAT TTA A M-PCR 94 ºC 5 min
(535 pb) CAC CAA ATG TAT AGC CTA AAG TG (94°C 30 s, 48 °C 30 s, 72
hglv GAC ATA GAG TCC ATA ATG CAT TYG T °C 1 min) x 30 e 72 ºC 7
(390 pb) ATA GTC ATT AGG ATT AGG TTT CAC AAA G min
eta ACT GTA GGA GCT AGT GCA TTT GT
(190 pb) TGG ATA CTT TTG TCT ATC TTT TTC ATC AAC
95 ºC 5 min (95°C 30 s,
etb CAG ATA AAG AGC TTT ATA CAC ACA TTA C
55 °C 30 s, 72 °C 2 min)
(612 pb) AGT GAA CTT ATC TTT CTA TTG AAA AAC ACT C
x 30 e 72 ºC 10 min
etd AAC TAT CAT GTA TCA AGG
7
(376 pb) CAG AAT TTC CCG ACT CAG
94 ºC 3 min (94 °C 30 s,
siet ATG GAA AAT TTA GCG GCA TCT GG
8 56 °C 30 s, 72 °C 1 min)
(359 pb) CCA TTA CTT TTC GCT TGT TGT GC
x 30 e 72 ºC 5 min
94 ºC 5 min (94 °C 30 s,
exi AGT AAC AAA CTA TCA CAT AGC G
9 53 °C 30 s, 72 °C 1 min)
(455 pb) TTA ACA GGT TAT AAC GTC CCC
x 35 e 72 ºC 10 min
* 1. CAMPBELL et al., 2008; 2. MONDAY et al., 1999; 3. EDWARDS et al., 1997; 4. BEXLEY et al., 2013; 5. LINA et al., 1999;
6. JARRAUD et al., 2002; 7. YAMAGUCHI et al., 2002; 8. LAUTZ et al., 2006; 9. MELTER et al., 2017.
4.5. Detecção fenotípica da resistência aos antimicrobianos

4.5.1 Difusão em disco de oxacilina
Todos os isolados foram submetidos a técnica de difusão em disco com o antimicrobiano

oxacilina. O ensaio foi realizado através da distribuição dos isolados provenientes de suspensões
diretas das colônias equivalentes à escala 0,5 de McFarland sobre a superfície de placas contendo
AMH (BD Difco™), onde foram depositados os discos de oxacilina (1 μg) (OxoidTM). Após
19
incubação por 18 horas a 35 ± 2oC, os halos (diâmetros) formados ao redor dos discos foram
observados e medidos em milímetros. Isolados que apresentaram halos  17 mm foram
classificados como resistentes (CLSI VET01S ED3, 2015). A cepa Staphylococcus aureus subsp.
aureus ATCC® 33591TM foi usada como controle positivo (resistente).
4.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para Oxacilina
O método da microdiluição em caldo foi utilizado para a determinação da concentração

inibitória mínima de oxacilina nos isolados (CLSI VET01S ED3, 2015; CLSI M100, 2017). Para
isso a solução estoque de oxacilina (1,0 mg/ml) foi diluída nas concentrações 0,25µg/ml, 0,5µg/ml,
1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml, 4,0 µg/ml, 8,0 µg/ml, 16 µg/ml, 32 µg/ml, 64 µg/ml, 128 µg/ml, 256 µg/ml
e 512 µg/ml em caldo Müeller Hinton (CMH – BD Difco™) arcrescido de 2% NaCl. Após os
processos de inoculação e incubação por 24 horas a 35 ± 2oC a leitura foi realizada por visualização
de turbidez. Isolados que apresentaram valores de CIM  0,5 g/ml foram classificados como
resistentes (CLSI VET01S ED3, 2015). A cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC®
33591TM foi usada como controle positivo (resistente).
4.5.3 Detecção da resistência à vancomicina por Ágar Screen
O Ágar “Screen” com vancomicina foi utilizado para a detecção de Staphylococcus spp.
resistentes ou com reduzida suscetibilidade a esse antimicrobiano. O teste foi realizado de acordo
com o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI M100, 2017), através da inoculação de
isolados provenientes de suspensões diretas das colônias equivalentes à escala 0,5 de McFarland
sobre a superfície do ágar BHI (KASVI) suplementado com 6 μg/ml de vancomicina. Essas placas
foram incubadas a 35oC ± 2oC por 24 horas e após esse período, um exame cuidadoso foi realizado
para verificar a presença de pequenas colônias ou crescimento em filme, o que caracteriza
resistência. As cepas Enterococcus faecalis ATCC® 29212TM (sensível) e E. faecalis ATCC®
51299TM (resistente) foram usadas como controles.
4.5.4 Antibiograma automatizado para detecção de isolados multirresistentes
A resistência aos antimicrobianos cloranfenicol, ciprofloxacina, daptomicina, eritromicina,

gentamicina, kanamicina, lincomicina, linezolida, nitrofurantoína, penicilina,
quinupristina/dalfopristina, tetraciclina, tigeciclina e vancomicina foi analisada por diluição em
caldo através do sistema automatizado Sensititre Authomated System (Sensititre AIMTM) com
painel de antibióticos NARM para bactérias Gram positivas (CMV3AGPF; Sensititre, Thermo
Fischer Sientific). As microplacas foram incubadas a 35 ± 2oC por 24 horas. A CIM foi
interpretada automaticamente pelo Sensititre OptiReadTM, de acordo com parâmetros
determinados pelo CLSI VET01S ED3 (2015). Isolados foram considerados multirresistentes
quando exibiram resistência a pelo menos um agente em três ou mais classes de antimicrobianos
diferentes (MAGIORAKOS et al., 2012).
4.6. Detecção de genes mec
20
Foi realizada a técnica de PCR para amplificação dos genes mecA (GEHA et al., 1994),
mecA variante (MELO et al., 2014) e mecC (STEEGER et al., 2012) (Quadro 5). Foram utilizadas
as seguintes concentrações de reagentes: Tampão 10X (Thermo Fischer Sientific), 0,5 µM de
cada iniciador, 0,5 mM de dNTP (Invitrogen), 1,25 mM de MgCl2, 0,5 U de Taq DNA Polimerase
(Thermo Fischer Sientific), água mili-Q para completar um volume total de reação de 25 µl e 2
µl do DNA total liberado. Os fragmentos foram avaliados por eletroforese em gel de agarose a 2%.
O marcador de tamanho molecular de 10.000 pb (Bionexus™ Hi-Lo DNA marker) foi utilizado.
Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,5 μg/ml) por 20
minutos. A imagem do mesmo foi capturada pelo fotodocumentador Omega Lum™ G Imaging
System (Alpegen®). As cepas Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 33591TM,
Staphylococcus aureus MO48A e Staphylococcus aureus BAA 2312 foram usadas como controles
positivos para a presença dos genes mecA, mecA variante e mecC, respectivamente.
Quadro 5. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação dos genes mec

Gene
(Tamanho do Sequência dos iniciadores (5’ – 3’) Ciclo
fragmento)
95ºC 5 min (94°C 30 s,
mecA GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A
58°C 30 s, 72 °C 1 min) x
(310 pb) CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A
30 e 72ºC 10 min
95°C 5 min (94°C 1 min,
mecA variante CAG GCA TGC AGA AAA ATC AA
55°C 1 min, 72°C 1 min) x
(809 pb) TTG AGT CGA ACC AGG TGA TG
30 e 72°C10min
94ºC 15 min (94ºC 30 s,
mecC GAA AAA AAG GCT TAG AAC GCC TC
50ºC 1 min, 72ºC 1 min) x
(718 pb) CCT GAA TC[W] GCT AAT AAT ATT TC
35 e 72ºC 10 min
4.7. Caracterização dos cassetes cromossômicos mec (SCCmec)
Para a caracterização dos cassetes cromossômicos mec (SCCmec), reações de PCR

“multiplex” (Quadro 6) foram conduzidas de acordo com Milheiriço e colaboradores (2007).
Foram utilizadas as seguintes concentrações de reagentes nas reações de PCR: DreamTaq PCR
Master Mix (tampão DreamTaq 2X; 1,6 mM dNTP; 4 mM MgCl2 – Thermo Fischer Sientific),
0,4 μM de cada iniciador, água mili-Q para completar um volume total de reação de 25 µl e 2 µl
do DNA total liberado. Os fragmentos foram avaliados por eletroforese em gel de agarose a 2%.
O marcador de tamanho molecular de 10.000 pb (Bionexus™ Hi-Lo DNA marker ) foi utilizado.
Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,5 μg/ml) por 20 minutos.
A imagem do mesmo foi capturada pelo fotodocumentador Omega Lum™ G Imaging System
(Alpegen®). A cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 33591TM foi usada como
controle (SCCmec tipo III).
Quadro 6: Iniciadores e ciclos empregados para a tipagem dos elementos SCCmec
21
Iniciadores Tipo de
(Tamanho do Sequência dos iniciadores (5’ – 3’) SCCmec, Ciclo
fragmento) região
(1) CIF2 F2
TTC GAG TTG CTG ATG AAG AAG G
CIF2 R2 I, região J1
ATT TAC CAC AAG GAC TAC CAG C
(495 pb)
(2) ccrC F10
GTA CTC GTT ACA ATG TTT GG V, complexo
ccrC R13
ATA ATG GCT TCA TGC TTA CC ccr
(449 pb)
(3) RIF5 F10
TTC TTA AGT ACA CGC TGA ATC G
RIF5 R13 III, região J3
ATG GAG ATG AAT TAC AAG GG
(414 pb)
(4) SCCmec V J1 F
TTC TCC ATT CTT GTT CAT CC
SCCmec V J1 R V, região J1
AGA GAC TAC TGA CTT AAG TGG
(377 pb)
dcs F2
CAT CCT ATG ATA GCT TGG TC I, II, IV, e VI, 94ºC 12 min
(5) dcs R1
CTA AAT CAT AGC CAT GAC CG região J3 (94°C 30 s, 53°C
(342 pb)
30 s, 68°C 3 min)
(6) ccrB2 F2
AGT TTC TCA GAA TTC GAA CG II e IV, x 25 e 72ºC 10
ccrB2 R2
CCG ATA TAG AA[W] GGG TTA GC complexo ccr min
(311 pb)
(7) kdp F1
AAT CAT CTG CCA TTG GTG ATG C
kdp R1 II, região J1
CGA ATG AAG TGA AAG AAA GTG G
(284 pb)
(8) SCCmec III J1 F
CAT TTG TGA AAC ACA GTA CG
SCCmec III J1 R III, região J1
GTT ATT GAG ACT CCT AAA GC
(243 pb)
(9) mecI P2
ATC AAG ACT TGC ATT CAG GC II e III,
mecI P3
GCG GTT TCA ATT CAC TTG TC complexo mec
(209 pb)
(10) mecA P4 Controle
TCC AGA TTA CAA CTT CAC CAG G
mecA P7 positivo
CCA CTT CAT ATC TTG TAA CG
(162 pb) interno
4.8. Estudo da diversidade das cepas MRSP

4.8.1 Tipagem pelo gene spa
A tipagem molecular pelo gene spa foi realizada conforme descrito por Moodley e
colaboradores (2009). Os isolados que foram negativos para o gene spa utilizando os iniciadores
descritos por Moodley e colaboradores (2009) foram submetidos à PCR para detecção desse gene
utilizando os iniciadores desenhados por Ruscher e colaboradores (2010). Os iniciadores e
condições utilizados para amplificação da região variável X do gene spa estão descritos no Quadro
7. Foram utilizadas as seguintes concentrações de reagentes nas reações de PCR: Tampão
DreamTaq 10X (2,0 mM MgCl2, Thermo Fischer Sientific), 0,5 mM de dNTP (Invitrogen®), 1,25
U DreamTaq DNA Polimerase (Thermo Fischer Sientific), 0,4 μM de cada iniciador, água mili-
Q para completar um volume total de reação de 25 µl e 2 µl do DNA total liberado. Os fragmentos
10.000 pb (Bionexus™ Hi-Lo DNA marker ) foi utilizado. Após a eletroforese, o gel foi corado
em solução de brometo de etídio (1,5 μg/ml) por 20 minutos. A imagem do mesmo foi capturada
pelo fotodocumentador Omega Lum™ G Imaging System (Alpegen®).
22
Quadro 7. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação do gene spa
Gene
(Tamanho do Sequência dos iniciadores (5’ – 3’) Referência* Ciclo
fragmento)
95 ºC 10 min (95 °C 30 s, 58
spa ACC TGC GCC AAG TTT CGA TGA AG
1 °C 30 s, 72 °C 1 min) x 30 e
(750 – 810 pb) CGT GGT TTG CTT TAG CTT CTT GGC
72 ºC 10 min
94 ºC 5 min (94 °C 30 s, 57
spa AAG TAG TGA TAT TCT TGC T
2 °C 30 s, 72 °C 30 s) x 25 e 72
(303 – 392 pb) CCA GGT TGA ACG ACA TGC AT
ºC 10 min
*1. MOODLEY et al., 2009; 2. RUSCHER et al., 2010.
Os produtos de PCR foram purificados através da ExoSAP-IT® (USB Corporation,

Cleveland, Ohio), conforme recomendação do fabricante. As fitas “foward” e “reverse” foram
sequenciadas (método de Sanger) pelo “DNA Facility of the Iowa State University Office of
Biotechnology”. As sequências foram alinhadas utilizando o programa MEGA versão 7.0 e
visualmente analisadas pela combinação de repetições de sequências de 30 pb descritas para S.
pseudintermedius (MOODLEY et al., 2009) e disponíveis no site http://www.pse-spa.org/, que
possui um banco de dados específico para a tipagem por spa para essa espécie. A combinação das
repetições resulta em diferentes tipos de spa (t01 – t074, tyA e tyB).
4.8.2 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (“Pulsed-field Gel Electrophoresis” – PFGE)
O protocolo utilizado para a tipagem das amostras foi o preconizado para Staphylococcus
aureus pelo “Center for Disease and Control and Prevention” (CDC), com modificações (Velasco
et al., 2015). Os isolados foram inoculados em placas de ágar Tripticase de Soja (TSA), e
incubados a 37oC por 18 a 24 horas. A cepa Salmonella sorotipo Branderup H9812 foi utilizada
como controle e foram preparadas de acordo com “PulseNet One-Day (24-28h) Standardized by
Laboratory Protocol for Molecular Subtyping of Escherichia coli O157:H7, nonon-typhoidal
Salmonella serotypes and Shigella sonnei by Pulsed Field Gel Electrophoresis”.
Com o auxílio de um “swab”, as colônias dos isolados e do controle foram coletadas e
ressuspendidas em 2 ml de tampão de suspensão celular (“Cell Suspencion Buffer” – CSB; 100
mM Tris: 100 mM EDTA, pH 8,0) de autoclavado e posteriormente ajustados no
espectrofotômetro (Absorbância = 0,9 a 1,1 a 610 nm). Em seguida, 200 μl da suspensão de células
ajustadas foi transferida para um microtubo contendo 300 μl de TE (10 mM Tris HCl; 1 mM
EDTA, pH8,0) e 3 μl de lisostafina para os isolados de S. pseudintermedius e 10 μl de Proteínase
K para os controles de S. ser. Braenderup. Posteriormente adicionou-se 300 μl de SeaKem® Gold
Agarose equilibrados a temperatura de 55 oC à suspensão ajustada. Após homogeinização, a
mesma foi depositada nos moldes de “plugs”. Para cada isolado, foram preparados dois “plugs”.
Para o preparo da agarose, alguns aspectos foram considerados, uma vez que a concentração
da agarose depende do tipo de isolado. Para S. pseudintermedius, foi utilizada a concentração de
1,8% e, para os controles, 1% acrescido de 1% de SDS. Após a solidificação, os “plugs” dos
isolados de S. pseudintermedius foram transferidos em tubos Falcon contendo 3 ml de tampão de
Lise (6 mM Tris HCl; 1M NaCl; 100 mM EDTA; 0,5% de Brij-58; 0,2% Desoxilato de Sódio;
0,5% Lauril- sarcosina de sódio), e incubados a 37oC por 4 horas. Já os “plugs” dos controles de
Salmonella ser. Braenderup foram depositados em 3 ml de outro tampão de lise (50 mM Tris; 50
mM EDTA, pH = 8,0 + 1% sarcosil), foram incubados a 54oC em banho maria e agitados
vigorosamente por 2 horas.
23
Para a lavagem dos “plugs” dos isolados de S. pseudintermedius foram realizadas quatro
lavagens utilizando em cada uma 6 ml de TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA, pH8,0), num
intervalo de 30 minutos entre cada. Já nas lavagens dos “plugs” controles de S. ser. Braenderup
foram realizadas seis lavagens utilizando em cada 6 ml de água Mili-Q nas duas primeiras,
seguidas de quatro lavagens com TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA, pH8,0), num intervalo de
10 minutos entre cada. Após a lavagem dos “plugs”, os mesmos foram estocados em TE e
refrigerados a 4oC.
Para a digestão enzimática, uma porção de aproximadamente 2 mm de cada “plug” foi
cortada com o auxilio de bisturi estéril. Cada porção foi depositada posteriormente em microtubo
contendo 100 μl da mistura para a digestão enzimática (S. pseudintermedius: 1,5 μl de SmaI, 10 μl
de Tango Buffer e 88,5 μl de água Mili-Q; controles de Salmonella ser. Braenderup: 2,5 μl de
XbaI, 10 μl de Tango Buffer e 87,5 μl de água Mili-Q). Os isolados de S. pseudintermedius foram
incubados a 25oC e os controles a 37oC por 3 horas. Após o período de digestão, os “plugs” foram
lavados com TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA, pH8,0) e armazenados.
Para a Eletroforese em Gel de Campo Pulsado, os “plugs” foram acomodados na superfície
dos dentes do pente e deixados alguns minutos à temperatura ambiente para secar. Foi preparado
o tampão de eletroforese 0,5X TBE e essa concentração do tampão foi utilizada para o preparo do
gel 1% SeaKem® Gold Agarose.
Após a mistura do gel alcançar uma temperatura de 55oC a 60oC, o mesmo foi depositado
lentamente na cama contendo o pente com “plugs” aderidos aos dentes. Dessa forma, o gel
solidifica com os “plugs” já inseridos nos poços. Em seguida, foi realizada a Eletroforese em Gel
de Campo Pulsado, seguindo os parâmetros para CHEF DR-II, DR-III e CHEF Mapper (Volts =
200 (6v/cm; 14oC, transferência inicial = 5 segundos; transferência final = 40 segundos; tempo de
eletroforese 18 horas).
Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,5 μg/ml) por 20
minutos e a imagem do mesmo foi capturada pelo fotodocumentador Omega Lum™ G Imaging
System (Alpegen®), que foi avaliada pelo programa Bionumerics (Versão 6.6 Applied Math®,
Austin, TX) para a determinação das bandas. Para o cálculo da similaridade, utilizou-se o
complemento do índice de Dice, com 1% de tolerância e otimização de 0,5%. Utilizou-se o método
UPGMA (“Unweighted-Pair Group Method”) para a construção do dendograma e, para o
agrupamento, foi considerado o ponto de corte ao nível de 85% de similaridade genética
(GRÖNTHAL et al., 2015). As cepas com diferenças em até três bandas foram consideradas
intimamente relacionadas (TENOVER et al., 1995).
4.8.3 Tipagem da Sequência Multilocus (“Multilocus Sequence Typing” – MLST)
A técnica de MLST foi realizada conforme metodologia descrita por Solyman e

colaboradores (2013). Os Iniciadores e ciclos empregados encontram-se descritos no Quadro 8.
Foram utilizadas as seguintes concentrações de reagentes nas reações de PCR: Tampão DreamTaq
10X (2,0 mM MgCl2, Thermo Fischer Sientific), 0,5 mM de dNTP (Invitrogen®), 1,25 U
DreamTaq DNA Polimerase (Thermo Fischer Sientific), 0,4 μM de cada iniciador, água mili-Q
para completar um volume total de reação de 25 µl e 2 µl do DNA total liberado. Os fragmentos
10.000 pb (Bionexus™ Hi-Lo Dna marker ) foi utilizado. Após a eletroforese, o gel foi corado
em solução de brometo de etídio (1,5 μg/ml) por 20 minutos. A imagem do mesmo foi capturada
pelo fotodocumentador Omega Lum™ G Imaging System (Alpegen®).
24
Os produtos de PCR foram purificados através da ExoSAP-IT® (USB Corporation,
Cleveland, Ohio), conforme recomendação do fabricante. As fitas “foward” e “reverse” foram
sequenciadas (método de Sanger) pelo “DNA Facility of the Iowa State University Office of
Biotechnology”. As sequências foram alinhadas utilizando o programa MEGA versão 7.0 e os
números de alelos e tipo de sequência (ST) foram determinados através do site
http://pubmlst.org/spseudintermedius/ da Universidade de Oxford para S. pseudintermedius. Com
base nos dados do alelo, a árvore de extensão mínima foi construída usando o algorítimo
PHYLOViZ (http://www.phyloviz.net/) (FRANCISCO et al., 2012).
Quadro 8. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação por PCR dos sete loci para tipagem
por MLST
Gene
(Tamanho do Sequência dos iniciadores (5’ – 3’) Referência* Ciclo
fragmento)
tuf CAA TGC CAC AAA CTC G
(500 pb) GCT TCA GCG TAG TCT A
95 ºC 2 min (95°C 1min, 55 °C
cpn60 GCG ACT GTA CTT GCA CAA GCA
1 1 min, 72 °C 1 min) x 30 e 72
(552 pb) AAC TGC AAC CGC TGT AAA TG
ºC 7 min
pta GTG CGT ATC GTA TTA CCA GA AGG
(570 pb) GCA GAA CCT TTT GTT GAG AAG C
purA GAT TAC TTC CAA GGT ATG TTT
(490 pb) TCG ATA GAG TTA ATA GAT AAG TC
fdh TGC GAT AAC AGG ATG TGC TT
95°C 1 min e 30 s (52ºC 30 s,
(408 pb) CTT CTC ATG ATT CAC CGG C
2 72°C 1 min, 94°C 30 s) x 35, 52
ack CAC CAC TTC ACA ACC CAG CAA ACT
ºC 30 s e 72 ºC 5 min
(680 pb) AAC CTT CTA ATA CAC GCG CAC GCA
sar GGA TTT AGT CCA GTT CAA AAT TT
(521 pb) GAA CCA TTC GCC CCA TGA A
*1. BANNOEHR et al., 2007; 2. SOLYMAN et al., 2013
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Identificação de Staphylococcus pseudintermedius e perfil das amostras clínicas
25
Das 169 amostras clínicas investigadas, 84,0% (142/169) eram oriundas de processos
infecciosos em cães e 16,0% (27/169) em gatos. Das 164 amostras (164/169) enviadas ao
Laboratório de Microbiologia do Programa de Residência em Microbiologia UFRRJ nos anos de
2014 e 2015, isolou-se 188 Staphylococcus spp. que foram preliminarmente identificados por
espectrometria de massa MALDI-TOF no LIMM/UFRJ. Desses, 87 (46,7%; 87/188) eram
pertencentes ao grupo SIG e foram selecionados para o presente estudo. Também foram estudados
cinco Staphylococcus spp. oriundos de cinco amostras clínicas (5/169) de processos infecciosos
em animais de companhia enviadas a um laboratório comercial na cidade do Rio de Janeiro no ano
de 2017, totalizando 92 isolados investigados. Desses, 81 (88,0%; 81/92) eram provenientes de
amostras de processos infecciosos em cães e 11 (12,0%; 11/92) em gatos.
Os 92 isolados foram confirmados quanto ao gênero e espécie através da técnica de PCR,
ao amplificarem fragmentos de 756 pb do gene 16S rRNA e de 926 pb compatíveis com o esperado
para o gene nuc de S. pseudintermedius (Figura 1).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Br
1000 pb
500 pb
Figura 1. Eletroforese em gel de agarose 2,0 % dos produtos de amplificação do gene nuc (926
pb). M: Marcador de tamanho molecular (Hi-Lo Dna Marker – 10.000 pb); 1: Controle positivo
(Staphylococcus pseudintermedius CD93); 2 – 9: Isolados positivos (Staphylococcus
pseudintermedius); Br: Branco.
A Tabela 1 detalha o número de amostras clínicas positivas para S. pseudintermedius por

sítio de infecção e espécie animal afetada. Nota-se que a maioria das amostras caninas positivas
para S. pseudintermedius (78,3%; 72/81) foi obtida de processos infecciosos em pele (45,7%;
42/81), ouvido (19,6%; 18/81) e trato urinário (13,0%; 12/81), em concordância com relatos que
apontam esses como os principais sítios de infecção por S. pseudintermedius (WEESE; VAN
DUIJKEREN, 2010; BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). Já a maioria das amostras felinas
positivas para esse patógeno eram do trato urinário (90,9%; 10 /11) e essa diferença pode ser
explicada pelo fato de processos infecciosos em pele e otite serem mais frequentes em cães que em
gatos (MORRIS et al., 2006).
Tabela 1. Isolamento de Staphylococcus pseudintermedius por sítio de infecção e espécie animal
Sítio de infecção Número de amostras (%) Cães (%) Gatos (%)
26
Pele 43 (46,7) 42 (45,7) 1 (1,1)
Trato urinário 22 (23,9) 12 (13,0) 10 (10,9)
Ouvido 18 (19,6) 18 (19,6) 0 (0,0)
Osso 3 (3,3) 3 (3,3) 0 (0,0)
Vagina 2 (2,2) 2 (2,2) 0 (0,0)
Útero 1 (1,1) 1 (1,1) 0 (0,0)
Líquido sinovial 1 (1,1) 1 (1,1) 0 (0,0)
Pulmão 1 (1,1) 1 (1,1) 0 (0,0)
NI 1 (1,1) 1 (1,1) 0 (0,0)
Total 92 (100%) 81 (88%) 11 (12%)
NI: Não informado.
5.2 Detecção da produção de “slime” em microplaca de pliestireno
A capacidade de formação de biofilme varia entre as espécies e em S. pseudintermedius

não foi completamente caracterizada (SINGH et al., 2013). Buscando avaliar o potencial de
produção de biofilme em S. pseudintermedius, os 87 isolados obtidos de amostras clínicas enviadas
ao Laboratório de Microbiologia do Programa de Residência em Microbiologia foram submetidos
ao ensaio de detecção fenotípica da produção desse fator em microplaca. Os cinco isolados obtidos
de amostras clínicas enviadas ao laboratório comercial situado no Rio de Janeiro não foram
avaliados. A Tabela 2 mostra os percentuais de produção de biofilme pelos isolados avaliados de
acordo com o sítio de infecção.
Tabela 2. Produção de biofilme nos isolados de Staphylococcus pseudintermedius por sítio de

infecção
Número de produtores de biofilme (%)

Sítio de infecção
Fracos Fortes Moderados Não produtores
Pele 24 (27,6) 12 (13,8) 4 (4,6) 3 (3,4)
Trato urinário 5 (5,7) 7 (8,0) 6 (6,9) 0 (0,0)
Ouvido 9 (10,3) 3 (3,4) 3 (3,4) 3 (3,4)
Osso 3 (3,4) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Vagina 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (1,1) 1 (1,1)
Útero 1 (1,1) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Líquido sinovial 1 (1,1) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Pulmão 1 (1,1) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Total = 87 (100%) 44 (50,6%) 22 (25,3%) 14 (16,1%) 7 (8,0%)
Foi possível determinar que a maioria dos isolados avaliados (93,0%; 81/87) produziu
biofilme em diferentes intensidades. Em relação ao percentual de produção, houve semelhança com
o reportado na literatura. Singh e colaboradores (2013) reportaram 96% de positividade ao
avaliarem a capacidade de formação de biofilme em 140 cepas canadenses e americanas de S.
pseudintermedius suscetíveis (MSSP) e resistentes (MRSP) à meticilina. Semelhantemente,
Bardiau e colaboradores (2013) encontraram 100% (200/200) de produção de biofilme dentre cepas
MSSP e MRSP oriundas do Japão. Osland e colaboradores (2012), ao avaliarem cepas MRSP da
Noruega, encontraram 100% (23/23) de produção de biofilme. Em outro estudo, com cepas
27
polonesas de S. pseudintermedius oriundas de cães saudáveis e infectados, Garbacz e colaboradores
(2013) também encontraram 100% (123/123) de produção de biofilme. A habilidade de S.
pseudintermedius, especialmente MRSP, em produzir biofilme já foi associada à maior persistência
e disseminação dessas cepas (OSLAND et al., 2012)
Quanto à intensidade, a maior parte dos isolados avaliados foi classificada como fraco
(50,6%) ou forte (25,3%) produtor de biofilme, o que difere da maioria dos relatos, que reportam
produção predominantemente forte ou moderada entre S. pseudintermedius (OSLAND et al., 2012;
BARDIAU et al., 2013; SINGH et al., 2013; GARBACZ et al., 2013). Isso pode ser explicado pela
diferença entre as metodologias utilizadas, uma vez que, no presente estudo, o ensaio empregado
foi padronizado para a detecção em S. aureus (MARQUES et al., 2013). Visando a uma detecção
mais adequada para S. pseudintermedius, os isolados serão, em etapa futura, submetidos à avaliação
da formação de biofilme de acordo com metodologia e critérios de interpretação descritos por
Stepanovic e colaboradores (2007).
5.3 Detecção genotípica de fatores de virulência
Os 92 isolados foram submetidos a reações de PCR para detecção dos genes codificadores
dos diferentes fatores de virulência de S. pseudintermedius. Dentre os genes de virulência
pesquisados, 97,8% (90/92) dos isolados amplificaram o gene siet (Figura 2), que codifica uma
toxina esfoliativa de S. pseudintermedius, 87,0% (80/92) o gene se-int (Figura 3), relacionado à
produção de enterotoxina, e 12,0% (11/92) o gene que codifica o bicomponente da leucotoxina
LukE-LukD (lukE-lukD) (Figura 4). M 1 2 3 Br
1000 pb
500 pb
400 pb
300 pb
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose 2,0 % dos produtos de amplificação do gene siet (359
pb). M: Marcador de tamanho molecular (Bionexus™ Hi-Lo DNA Marker – 10.000 pb); 1 – 3:
Staphylococcus pseudintermedius positivos para o gene siet; Br: Branco.
Br 1 2 3 M
28
1000 pb
750 pb
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 2,0 % dos produtos de amplificação do gene se-int (874
pb). Br: Branco; 1 – 3: Staphylococcus pseudintermedius positivos para o gene se-int; M: Marcador
de tamanho molecular (Bionexus™ Hi-Lo DNA Marker – 10.000 pb).
1 2 3 4 5 Br M
1000 pb
500 pb
300 pb
200 pb
Figura 4. Eletroforese em gel de agarose 2,0 % dos produtos de amplificação do gene lukE/D (269
pb). 1 – 3: Staphylococcus pseudintermedius positivos para o gene lukE/D; 4 e 5: Staphylococcus
pseudintermedius negativos para o gene lukE/D; Br: Branco; M: Marcador de tamanho molecular
(Bionexus™ Hi-Lo DNA Marker – 10.000 pb).
Além das tradicionais toxinas estafilocócicas (leucocidinas, hemolisinas e superantígenos)

principalmente estudadas e relatadas em S. aureus, fatores de virulência específicos de S.
pseudintermedius, como a leucotoxina LukI (análoga da leucocidina “Panton-Valentine”), as
toxinas esfoliativas SIET e EXI, e algumas enterotoxinas (SE-int, SECcanine) têm sido estudadas
(FITZGERALD, 2009; FUTAGAWA-SAITO et al., 2009).
A toxina exfoliativa de S. pseudintermedius (SIET) foi originalmente descoberta em
isolados oriundos de piodermite canina e é sorologicamente distinta das outras toxinas esfoliativas
estafilocócicas, como as encontradas em S. aureus (ETA, ETB e ETC) (TERAUCHI et al., 2003a).
Lautz e colaboradores (2006) detectaram esse gene em aproximadamente metade dos 45 S.
29
pseudintermedius isolados de pele/infecções teciduais e otite externa. No presente estudo, foi
possível detectar o gene siet em quase todos os isolados avaliados (90/92), em concordância com
Yoon e colaboradores (2010), que relataram a presença desse gene no genoma de todos os 74 S.
pseudintermedius investigados. Perreten e colaboradores (2010) também encontraram o gene siet
em todos os 146 S. pseudintermedius estudados, bem como AnandaChitra e colaboradores (2016)
em todos os 91 S. pseudintermedius. Não foi possível observar uma correlação entre o sítio de
origem da amostra com a presença do gene siet, uma vez que apenas dois isolados, um de ouvido
e outro de urina, foram negativos. O papel biológico e a relevância clínica desse fator de virulência
ainda não foram completamente esclarecidos (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012;
ANANDACHITRA et al., 2016)
Futagawa-Saito e colaboradores (2004) descreveram a presença do gene se-int e da
enterotoxina SE-int em todos os isolados de S. pseudintermedius oriundos de cães negativos para
o gene SEC e SECcanine. Demonstraram ainda significativa homologia entre essa proteína e as
enterotoxinas estafilocócicas SEC (59– 61% de identidade) e SEB (56,6% de identidade). De modo
similar, o presente estudo encontrou significativa prevalência (87,0%) do gene se-int, bem como a
ausência dos genes das demais enterotoxinas testadas.
Onze isolados investigados (12,0%) amplificaram o gene lukE/D, que codifica o
bicomponente da leucotoxina LukE-LukD, um importante fator de virulência envolvido na
letalidade das infecções sanguíneas (bacteremia) por S. aureus (ALONZO et al., 2012). LukED
age matando neutrófilos e facilitando a multiplicação bacteriana no sítio de infecção. Não foram
encontrados dados na literatura acerca da detecção desse fator de virulência em isolados de S.
pseudintermedius. Dentre os isolados de S. pseudintermedius avaliados por Gómez-Sanz e
colaboradores (2011) e por Gharsa e colaboradores (2013), nenhum amplificou esse gene. Desse
modo, até onde consta, esse é o primeiro relato da detecção do gene lukE/D na espécie estudada, o
que requer uma análise de sequenciamento genético complementar.
Nenhum isolado amplificou os demais genes de virulência pesquisados (sea, seb, sec,
seccanine, sed, lukS/F, lukM, hla, hlb, hld, hlg, hlgv, eta, etb, etd e exi) e outros estudos também
relatam a ausência desses em cepas de S. pseudintermedius. Yoon e colaboradores (2010), também
não encontraram os genes sea, seb, sec, sed e see, codificadores de toxinas estafilocócicas, bem
como o gene tst, responsável pela toxina da síndrome do choque tóxico, TSST-1. Gómez-Sanz e
colaboradores (2011), não detectaram os genes seccanine e exi, tampouco nenhum outro gene
relacionado à produção de toxinas e somente duas cepas carreavam o gene hlgv.
É notória a necessidade de mais pesquisas a fim de identificar e caracterizar melhor os
fatores de virulência presentes em S. pseudintermedius, buscando determinar a prevalência e o
papel biológico que desempenham na patogênese das doenças.
5.4 Detecção da resistência aos antimicrobianos

5.4.1 Detecção fenotípica da resistência à meticilina
Dos 92 S. pseudintermedius submetidos à detecção fenotípica da resistência à meticilina

através do teste de difusão em disco (DD) de oxacilina, 23,9% (22/92) foram resistentes a esse
antimicrobiano (Figura 5) e em seguida submetidos ao ensaio de microdiluição em caldo para
determinação da CIM (Figura 6). Desses, 77,3% (17/22) apresentaram CIM maior ou igual a 512
µg/ml, 18,2% (4/22) CIM de 0,5 µg/ml e 4,5% (1/22) CIM de 128 µg/ml.
30
Figura 5. Ensaio de difusão em disco (DD) de oxacilina (1 g). Isolado Staphylococcus
pseudintermedius resistente.
Br CP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
16 g/ml
8 g/ml
4 g/ml
2 g/ml
1 g/ml
0,5 g/ml
0,25 g/ml
0 g/ml
Figura 6. Ensaio de microdiluição em caldo para determinação da CIM. Br: Branco (água mili-Q);
CP: Controle Positivo (Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 33591TM); 1-10: Isolados S.
pseudintermedius resistentes à oxacilina (diferentes concentrações).
5.4.2 Detecção do gene mecA e caracterização dos cassetes SCCmec
A presença de um gene não é necessariamente acompanhada por sua expressão fenotípica,

assim, todos os 92 S. pseudintermedius estudados, independente do resultado fenotípico, foram
submetidos à PCR para detecção dos genes mecA e mecC. O gene mecA foi encontrado em todos
os 22 isolados (100%) fenotipicamente resistentes à meticilina e não era carreado por isolados
sensíveis. Tal observação é corroborada por dados semelhantes reportados em outros estudos
(BEMIS et al., 2006; BOTONI et al., 2016; WORTHING et al., 2018), o que aponta para uma
31
expressiva correlação fenogenotípica nessa espécie, sugerindo que em cepas MRSP não existem
variantes gênicas que impliquem na não-detecção do gene mecA. Tal hipótese é suportada pela
não-detecção da variante ao utilizar os iniciadores desenvolvidos por Melo e colaboradores (2014).
Como esperado, o gene mecC não foi detectado em nenhum dos 92 isolados testados. O
gene mecC (mecALGA251), um homólogo do gene mecA, foi descrito em 2011 em linhagens de S.
aureus associadas a bovinos (GARCIA-ALVAREZ et al., 2011). Esse gene, que compartilha 70%
de homologia com o gene mecA e foi encontrado em um novo SCCmec (tipo XI), estava presente
em isolados S. aureus fenotipicamente resistentes aos beta-lactâmicos porém sem o gene mecA
(GARCIA-ALVAREZ et al., 2011).
Buscando uma identificação molecular ainda mais acurada, os 22 isolados resistentes foram
submetidos à identificação pelo MALDI-TOF MS no Laboratório do Dr. Qijing Zhang (Veterinary
Microbiology & Preventive Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University –
ISU, EUA), que também os identificou como pertencentes à espécie S. pseudintermedius. A partir
desse resultado, esses isolados foram confirmados como S. pseudintermedius meticilina-resistentes
(MRSP) e submetidos ao protocolo de tipificação do cassete SCCmec, que revelou que o tipo II-
III foi o predominantemente identificado (81,8%; 18/22).
O percentual de SCCmec II-III encontrado neste estudo está em concordância com a
literatura, que relata prevalência desse tipo de cassete em cepas MRSP, especialmente as
pertencentes ao complexo clonal (CC)/sequência tipo (ST) 71 (VAN DUIJKEREN et al., 2011;
DOS SANTOS et al., 2016; KIZERWETTER-ŚWIDA et al., 2017). Neste estudo, 13,6% (3/22)
dos MRSP apresentaram SCCmec não-tipável e 4,5% (1/22) o tipo IV. Elementos SCCmec não
tipáveis têm sido relatados em cepas MRSP (SASAKI et al., 2007a; BLACK et al., 2009;
PERRETEN et al., 2010; RUSCHER et al., 2010; KANG et al., 2017). SCCmec tipo IV também
tem sido reportado e é significativamente associado ao CC258 (DOS SANTOS et al., 2016) e a
seis STs diferentes (71, 106, 111, 112, 113, 116, 265) (PERRETEN et al., 2010; DOS SANTOS et
al., 2016).
Cabe ressaltar o elevado nível de resistência encontrado (CIM  8 µg/ml) em associação
ao SCCmec II-III. Sasaki e colaboradores (2007) também relataram alto nível de resistência à
oxacilina (CIM  8 µg/ml) em 15 das 18 cepas MRSP estudadas e dessas, 10 possuíam o
SCCmec III e em cinco o SCCmec não pode ser tipificado (NT). Apesar desse relato, não foram
encontrados outros estudos relacionando o alto nível de resistência à oxacilina a um determinado
tipo de SCCmec em cepas MRSP. Sabe-se que os genes reguladores mecI e mecRI, quando intactos,
regulam a expressão do gene mecA e consequente produção da PBP2a em Staphylococcus spp.
(HIRAMATSU et al. 2014). No entanto, em cepas MRSA, a variação no nível de resistência entre
clones não pode ser explicada somente pela regulação transcricional do gene mecA através da
atividade dos elementos regulatórios mecI e mecRI ou blaI e blaRI, mas também pela ocorrência
de mutações em diferentes genes, como os relacionados à divisão celular e os associados a
diferentes aspectos do metabolismo intermediário (DORDEL et al., 2014). Esses diferentes loci
constituem um conjunto adicional de determinantes genéticos essenciais para a expressão de
elevados níveis de resistência em subpopulações de estafilococos e mutações nesses determinates
poderiam desencadear um mecanismo de resposta bacteriana ao estresse (“stringent stress
response”), promovendo o aumento da transcrição e tradução de PBP2a (KIM et al., 2013;
DORDEL et al., 2014; KIM et al., 2017; PARDOS DE LA GANDARA et al., 2018).
Os escores obtidos pela identificação proteômica, o perfil de resistência à meticilina e os
tipos de SCCmec encontrados para cada MRSP encontram-se descritos na Tabela 3.
Tabela 3. Identificação por MALDI-TOF MS, perfil de resistência à meticilina e tipos de SCCmec
32
Cepa MALDI-TOF MS / Escore DDS OXA CIM OXA (µg/ml) mecA SCCmec
C11 Staphylococcus pseudintermedius 1.97 R   + II-III
VA1 Staphylococcus pseudintermedius 1.97 R   + II-III
C57 Staphylococcus pseudintermedius 2.01 R 128 + II-III
C25 Staphylococcus pseudintermedius 2.07 R 0,5 + IV
C27 Staphylococcus pseudintermedius 2.04 R 0,5 + NT
DDS OXA: Difusão em disco simples de oxacilina; CIM OXA: Concentração inibitória mínima de oxacilina; R: Resistente;
NT: não-tipável.
5.4.3 Detecção de multirresistência nas cepas MRSP
Todas as cepas MRSP isoladas no presente estudo (100%, 22/22) exibiram perfis de
multirresistência, sendo resistentes aos antimicrobianos ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina,
kanamicina, lincomicina, penicilina e tetraciclina. Além da resistência a esses antimicrobianos,
90,9% (20/22) foram também resistentes ao cloranfenicol e 9,1% (2/22) foram incluídas na
categoria intermediária.
Estudos anteriores desmontaram que cepas MRSP podem exibir resistência a várias classes
de antimicrobianos (DESCLOUX et al., 2008; SCHWARZ et al., 2008; WETTSTEIN et al., 2008;
DOS SANTOS et al., 2016). O padrão de multirresistência encontrado neste estudo foi resistência
a seis diferentes categorias: aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, lincosamidas, macrolídeos,
fenicóis e tetraciclinas. De modo semelhante, Penna e colaboradores (2013) encontraram
percentual considerável de multirresistência em cepas MRSP oriundas de lesões de pele
(piodermite) e otite em cães do Rio de Janeiro. Esses achados são preocupantes, pois mostram a
provável disseminação de MRSP em animais de companhia, especialmente cães, reduzindo
drasticamente as opções terapêuticas disponíveis para o tratamento dessas infecções.
Quanto à suscetibilidade aos demais antimicrobianos testados (daptomicina, linezolida,
nitrofurantoína, tigeciclina, quinupristina/dalfopristina e vancomicina), 100% (22/22) das cepas
MRSP foram sensíveis. As 22 cepas MRSP também foram submetidas à detecção de resistência
33
ou redução da suscetibilidade à vancomicina através do Ágar “Screen” e todos (100%; 22/22)
foram classificadas como sensíveis, uma vez que não foram observadas colônias ou crescimento
em filme na superfície do ágar. As características das 22 cepas MRSP encontram-se resumidas na
Tabela 4.
Tabela 4. Tipo de SCCmec e perfil de resistência das 22 cepas MRSP investigadas
Cepa Origem Tipo de amostra SCCmec Fenótipo de multirresistência

C11 Cão “Swab” cutâneo II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
C33 Gato Urina II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
C97 Cão “Swab” de abscesso II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
C140 Cão “Swab” otológico II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
C156 Cão Fragmento cutâneo e linfonodo II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
VA1 Gato Urina II-III CLOb, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
VA2 Cão Urina II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
VA6 Cão Urina II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
VA15 Gato Urina II-III CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
VA27 Cão “Swab” a II-III CLOb, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
C27 Cão “Swab” cutâneo NT CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
C25 Cão “Swab” cutâneo IV CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET
a Sítio
de infecção não informado.
b Resistênciaintermediária ao cloranfenicol.
CLO: cloranfenicol, CIP: ciprofloxacina, ERI: eritromicina, GEN: gentamicina, KAN: kanamicina, PEN: penicilina; LIN:
lincomicina, TET: tetraciclina, NT: não-tipável.
5.5 Estudo da diversidade das cepas MRSP

5.5.1 Tipagem do gene spa
As 22 cepas MRSP isoladas no presente estudo, além da MRSP S231 isolada de leite
bovino, foram submetidas à tipagem molecular através da amplificação, sequenciamento e análise
do gene spa. Dessas, seis (6/23) não puderam ser analisadas devido à baixa qualidade das
sequencias obtidas, totalizando 17 cepas (n=17) investigadas quanto ao perfil do gene spa.
Através dessa análise foi possível detectar quatro tipos diferentes de spa utilizando os
iniciadores desenhados por Moodley e colaboradores (2009) cujo tipo 2 (t02) foi o
predominantemente encontrado (76,5%; 13/17). Quanto às demais cepas analisadas, 11,8% (2/17)
possuíam o gene spa do tipo 15 (t15), 5,9% (1/17) o do tipo 5 (t05) e 5,9% (1/17) o do tipo 6 (t06).
A Tabela 5 resume os tipos de spa detectados nas cepas avaliadas. No Anexo B, encontram-se as
34
sequências obtidas e alinhadas pelo programa BioEdit versão 7.2 contendo as sequências de
repetições de 30 pb que determinam o tipo de spa.
Tabela 5. Origem e tipos de spa das cepas avaliadas
Cepa Origem Tipo de amostra spa Repetições

C11 Cão “Swab” cutâneo t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
C33 Gato Urina t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
C55 Cão “Swab” cutâneo t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
C56 Cão Secreção purulenta de joelho t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
C156 Cão Fragmento cutâneo e linfonodo t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
VA1 Gato Urina t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
VA15 Gato Urina t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
S231 Vaca Leite t02 r01 r02 r03 r03 r03 r06 r05
C27 Cão “Swab” cutâneo t15 r01 r02 r03 r03 r03 r03 r03 r06 r05
C81 Cão “Swab” cutâneo t15 r01 r02 r03 r03 r03 r03 r03 r06 r05
C46 Cão “Swab” cutâneo t05 r01 r02 r03 r03 r03 r03 r06 r05
VA27 Cão “Swab” * t06 r01 r02 r03 r03 r06 r05
C25 Cão “Swab” cutâneo NT -
C97 Cão “Swab” de abscesso NT -
C110 Cão “Swab” cutâneo NT -
C140 Cão “Swab” otológico NT -
VA2 Cão Urina NT -
VA6 Cão Urina NT -
*Sítio de infecção não informado.
NT: não-tipável.
Estudos relatam que o spa t02 é frequentemente associado a cepas MRSP da linhagem
europeia ST71 mundialmente disseminada (PERRETEN et al., 2010; FENG et al., 2012;
MOODLEY et al., 2013; HAENNI et al., 2014; WORTHING et al., 2018). A presença de padrões
similares de repetição entre os tipos t02, t05, t06 e t15 estes são intimamente relacionados, visto
que diferem apenas quanto ao número total de repetições r03 (RUSCHER et al., 2010; MOODLEY
et al., 2013; WORTHING et al., 2018).
5.5.2 Eletroforese em Campo Pulsado (“Pulsed-field Gel Electrophoresis” – PFGE)
Vinte e três cepas (n = 23), incluindo a MRSP S231, foram submetidas a tipagem através
da técnica de PFGE. Como os eventos relacionados a ocorrência de surtos não foram investigados
pelo presente estudo, a análise por PFGE concentrou-se na identificação de isolados geneticamente
relacionados.
35
Das 23 cepas, três (MRSP C25, C46 e C56) não foram clivadas pela enzima SmaI.
Metilação dos sítios de restrição no DNA é comumente reportada como razão para a falha na
digestão por certas endonucleases (BENS et al., 2006; BOSCH et al., 2010; GÓMEZ-SANZ et al.,
2010). Através da técnica de PFGE foi possível observar a considerável heterogeneidade genética
e agrupamento em 16 grupos (Figura 7).
36
cassia0817 cassia0817
Cepa Origem Amostra SCCmec spa Pulsotipos
C110 Cão “Swab” cutâneo II-III NT I
100
100
20
40
60
80
40
60
80
0
C110 C85 Cão . “Swab” cutâneo II-III t02 II
C85 S231 Vaca . Leite II-III t02
S231 C156 Cão . Fragmento cutâneo e linfonodo II-III t02 III
C156 C111 Gato . Urina II-III t02
C111 C128 Gato . Urina II-III t02 IV
C128 VA1 Gato . Urina II-III t02 V
VA1
C97 Cão . “Swab” de abscesso II-III NT VI
C97 .
VA15 Gato Urina II-III t02 VII
VA15 .
VA2 Cão Urina II-III NT VIII
O22A .
C33 Gato Urina II-III t02 IX
VA2 .
C57 Gato Urina II-II t02
C33 .
C57
VA6 Cão . Urina II-III NT X
VA6 C86 Cão . “Swab” cutâneo II-III t02
C86 C55 Cão . “Swab” cutâneo II-III t02 XI
C55
C155 C27 Cão . “Swab” cutâneo NT b t15 XII
C27 C140 Cão . “Swab” otológico II-III NT XIII
C140 C11 Cão . “Swab” cutâneo II-III t02 XIV
C11 C81 Cão . “Swab” cutâneo NT b t15 XV
C81 VA27 Cão . “Swab” a II-III t02 XVI
C90 C56 Cão . “Swab” cutâneo II-III t02 NC c
VA27
C25 Cão . “Swab” cutâneo IV NT NC c
C46 Cão “Swab” cutâneo NT b t02 NC c
Figura 7. Dendograma de similaridade gerado a partir da técnica de PFGE através do método UPGMA e complemento do índice de
Dice (Bionumerics, Versão 6.6 Applied Math®, Austin, TX; 1% de tolerância e otimização de 0,5%). Ponto de corte ao nível de 85%
de similaridade genética (linha de cor vermelha). Tipos de SCCmec, spa e agrupamentos gerados a partir dos padrões de restrição
enzimática. a Sítio de infecção não informado; b não-tipável; c cepa não clivada pela enzima SmaI.
37
As cepas MRSP S231 (isolada de amostra de leite bovino), C156 (fragmento cutâneo de
um cão) e C111 (urina de um gato) geraram pulsotipos (padrões de restrição) com similaridade de
no mínimo 85% e foram agrupadas no grupo III. MRSP S231 e C156 apresentaram ainda 90% de
similaridade. As três cepas, que possuem os mesmos tipos de SCCmec II-III, spa t02 e perfil de
multirresistência, diferem em três fragmentos e são consideradas intimamente relacionadas. A
diferença quanto à espécie hospedeira denota o potencial de disseminação de MRSP em populações
animais distintas.
As cepas MRSP C57 (isolada de amostra de urina de um cão), VA6 (urina de um gato) e
C86 (“swab” cutâneo de um cão) geraram pulsotipos com similaridade superior a 85%, sendo então
agrupadas em X. MRSP C57 e VA6 apresentaram o pulsotipo indistinguível (100% de
similaridade) e são consideradas idênticas. Ambas possuem o mesmo tipo de SCCmec II–III e o
mesmo perfil de multirresistência, no entanto, o tipo de spa da cepa VA6 não pôde ser determinado.
Já MRSP C86 (de SCCmec II–III; spa t02) é itimamente relacionada às cepas C57 e VA6, uma vez
que difere em apenas um fragmento (TENOVER et al., 1995).
5.5.3 Tipagem da Sequência Multilocus (“Multilocus Sequence Typing” – MLST)
Através da tipagem pela técnica MLST foi possível detectar cinco tipos diferentes de
ST/CC (Tabela 7), sendo a maioria das cepas (86,2%; 19/23) pertencentes ao ST/CC 71, seguido
dos STs 265 (4,3%; 1/23) e 282 (4,3%; 1/23). Uma cepa (4,3%; 1/23) não pôde ter o ST
determinado, uma vez que as sequências dos loci pta e purA apresentaram baixa qualidade de
sequenciamento e não puderam ser analisadas.
A linhagem de MRSP frequentemente encontrada neste estudo foi a ST71 (CC71), o que é
consistente com relatos em outros países (WORTHING et al., 2018; COUTO et al., 2016;
DAMBORG et al., 2016; HAENNI et al., 2014; BARDIAU et al., 2013; PERRETEN et al., 2010).
MRSP-ST71 foi primeiramente detectada em 2007 na Alemanha (LOEFFLER et al., 2007) e
rapidamente tornou-se uma linhagem prevalente em países europeus (PERRETEN et al., 2010).
Desde então, espalhou-se por outros países, sendo o clone de MRSP mais amplamente disseminado
e tendo sido isolado em 14 países diferentes na Europa, América do Norte e do Sul e Ásia (DOS
SANTOS et al., 2016). No Brasil, a Quitoco e colaboradores (2013), relataram a colonização por
MRSP-ST71 em um cão na cidade do Rio de Janeiro e, até o momento, o presente estudo é o único
no Brasil que avalia a ocorrência de MRSP-ST71 em amostras oriundas de diferentes processos
infecciosos de animais de companhia.
A linhagem ST265 (CC258) já foi detectada em cães na Dinamarca (DAMBORG et al.,
2016) e Holanda (DUIM et al., 2016), mas nunca fora do continente Europeu (DOS SANTOS et
al., 2016). Já a linhagem ST282 (CC45) foi relatada em mais de um continente (DOS SANTOS et
al., 2016) e, recentemente, foi detectada na Ásia (DUIM et al., 2018). Frente a esse contexto, a
detecção de duas cepas MRSP pertencentes ao ST265 e ST282 pelo presente estudo também
indicam um achado inédito no Brasil e, talvez, na América do Sul, sugerindo a disseminação global
de clones MRSP.
Para a cepa C27 (4,3%; 1/23), não foi possível atribuir um ST. Na busca por combinações
próximas, pôde-se observar que a cepa C27 variava em dois (ack e purA) dos sete loci do ST649.
Tendo em vista essa observação, as sequências dos sete loci serão cuidadosamente verificadas em
relação à diferenciação alélica para que sejam submetidas ao curador da base do banco de dados
do MLST (https://pubmlst.org/spseudintermedius/) e possa gerar um novo ST (NST). A Tabela 6
detalha os tipos de sequência para os diferentes loci e os STs obtidos.
38
Tabela 6. Perfil alélico gerado através da tipagem por MLST
Cepa Origem Amostra tuf cpn60 pta purA fdh ack sar ST
C11 Cão “Swab” cutâneo 1 9 2 1 1 3 2 71
C33 Gato Urina 1 9 2 1 1 3 2 71
C57 Gato Urina 1 9 2 1 1 3 2 71
C111 Gato Urina 1 9 2 1 1 3 2 71
C156 Cão Fragmento cutâneo e linfonodo 1 9 2 1 1 3 2 71
VA1 Gato Urina 1 9 2 1 1 3 2 71
VA2 Cão Urina 1 9 2 1 1 3 2 71
VA6 Cão Urina 1 9 2 1 1 3 2 71
VA15 Gato Urina 1 9 2 1 1 3 2 71
VA27 Cão “Swab” * 1 9 2 1 1 3 2 71
S231 Vaca Leite 1 9 2 1 1 3 2 71
C97 Cão “Swab” de abscesso 3 9 2 1 1 3 2 CC71
C110 Cão “Swab” cutâneo 1 9 2 1 1 - 2 CC71
C128 Gato Urina 1 9 2 1 1 - 2 CC71
C140 Cão “Swab” otológico 1 9 1 1 1 3 2 CC71
C27 Cão “Swab” cutâneo 2 3 4 7 5 1 1 NST
C81 Cão “Swab” cutâneo 2 3 - - 5 1 1 NT
*Sítio de infecção não informado.
NST: Novo ST; NT: não tipável
A Figura 8 ilustra a estrutura populacional das cepas avaliadas pela técnica de MLST, com
base na construção de uma árvore filogenética. Dos 19 MRSP que foram caracterizados com o
mesmo ST/CC71, a cepa C97 apresentava variação em um locus (tuf) e por esse motivo foi alocada
em um nodo (ou nó) diferente das demais. O mesmo foi observado para a cepa C140, que
apresentava variação em um locus (pta). Para as cepas C110 e C128, as sequências do locus ack
apresentavam baixa qualidade e não puderam ser utilizadas para a obtenção de um número de alelo
e consequente determinação do ST, sendo classificadas como pertencentes ao CC71 pela
combinação dos números de alelo obtidos para os demais loci.
39
A
Figura 8. (A) Gráfico de torta representando os tipos de sequência (STs) das cepas MRSP
avaliadas. (B) Aplicação do algoritmo PHILOViZ, mostrando a estrutura populacional e retratando
a distribuição clonal das cepas MRSP investigadas. Cada tipo de sequência é representado por um
círculo e dentro de cada um estão inseridas as cepas representantes. Os retângulos na cor verde
destacam as cepas do grupo III e os retângulos na cor azul destacam as do grupo X, de acordo com
o padrão de restrição obtido com a técnica de PFGE. As cepas que não puderam ter o ST
determinado e deverão gerar novos STs (NST) foram demonstradas com por única cor (azul claro)
e as que apresentaram combinações exatas foram representadas pelo círculo azul escuro.
40
5.5.4 Análise comparativa dos perfis genéticos gerados pelas técnicas de tipagem molecular
As 23 cepas estudadas foram divididas três perfis genéticos de virulência, três tipos de
SCCmec (incluindo NT), quatro tipos de spa, 16 pulsotipos (PFGE) e quatro STs/CC, incluindo
um novo ST (NST). A Tabela 7 detalha os resultados das técnicas de tipagem para cada cepa
avaliada.
41
Tabela 7. Origem, perfis de virulência, resistência e tipagem molecular das 24 cepas de Staphylococcus pseudintermedius investigadas
VIRULÊNCIA RESISTÊNCIA TIPAGEM MOLECULAR
Cepas Origem Amostra Perfil genético de
se-int siet Fenótipo de Resistência SCCmec spa PFGE MLST
virulência
C25 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET IV NT NC ST265
C27 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET NT t15 XII NST
C33 Gato Urina + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 IX ST71
C46 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET NT t05 NC ST282
C55 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 XI ST71
C56 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 NC ST71
C57 Gato Urina + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 X ST71
C81 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET NT t15 XV NT
C85 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 II ST71
C86 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 X ST71
C97 Cão “Swab” de abscesso + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III NT VI CC71
C110 Cão “Swab” cutâneo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III NT I CC71
C128 Gato Urina + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 IV CC71
C156 Cão Fragmento cutâneo e linfonodo + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 III ST71
VA2 Cão Urina + + 1 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III NT VIII ST71
C11 Cão “Swab” cutâneo - + 2 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 XIV ST71
C111 Gato Urina - + 2 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 III ST71
VA1 Gato Urina - + 2 CLO b, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 V ST71
VA6 Cão Urina - + 2 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III NT X ST71
VA15 Gato Urina - + 2 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 VII ST71
VA27 Cão “Swab” a - + 2 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t06 XVI ST71
S231 Vaca Leite - + 2 CLO b, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III t02 III ST71
C140 Cão “Swab” otológico - - 3 CLO, CIP, ERI, GEN, KAN, LIN, PEN, TET II-III NT XIII CC71
a Sítio de infecção não informado.
b Resistência intermediária ao cloranfenicol.
F: Forte, FR: Fraco, M: Moderado, NT: não tipável; NA: Não avaliado.
CLO: cloranfenicol, CIP: ciprofloxacina, ERI: eritromicina, GEN: gentamicina, KAN: kanamicina, PEN: penicilina; LIN: lincomicina, TET: tetraciclina.
42
O agrupamento das cepas de acordo com a distribuição dos genes de virulência produziu
três perfis distintos. O perfil 1 foi o predominantemente detectado (69,6%; 15/23) dentre as cepas
avaliadas e todas posuem o mesmo perfil de multirresistência. No entanto, apresentam diferenças
quanto ao hospedeiro, intensidade de produção de biofilme, tipos de SCCmec, pulsotipos e STs. O
perfil 2 foi detectado em sete cepas (29,2%; 7/24), que possuem o mesmo SCCmec do tipo II-III e
o mesmo ST/CC71. Já o perfil 3 foi detectado somente na cepa C140 (4,2%; 1/24). (definir esses
perfis). Em S. pseudintermedius, independentemente do “background” genético ou do perfil
resistência, uma variedade de fatores de virulência tem sido detectada (GHARSA et al., 2013). A
diferença quanto à presença ou não de genes de virulência dentro de um mesmo ST/CC poderia ser
explicada pelo fato dessas cepas estarem sob diferentes pressões ambientais, fato que já foi
observado em cepas de S. aureus (MELLES et al., 2004).
Quanto à tipagem do spa, foram detectados quatro diferentes tipos. O spa t02 foi o
predominantemente encontrado (76,5%; 13/17) e todas as cepas que possuem esse tipo, possuem
também o SCCmec II-III e fazem parte do ST/CC71. Esse achado está em concordância com a
literatura que relata o spa t02 e o SCCmec II-III frequentemente associados a cepas da linhagem
mundialmente disseminada MRSP-ST71 (PERRETEN et al., 2010; VAN DUIJKEREN et al.,
2011; FENG et al., 2012; MOODLEY et al., 2013; HAENNI et al., 2014; DOS SANTOS et al.,
2016; KIZERWETTER-ŚWIDA et al., 2017; WORTHING et al., 2018). As duas cepas que
possuem o spa t15 não puderam ter seus SCCmec determinados (NT) pela metodologia utilizada.
Dessas, a cepa MRSP C27 também não pôde ter o seu ST determinado, visto que varia em dois
loci do ST649 e, provavelmente, pertence a um novo ST (NST) que será depositado. Já a cepa C81
também não pôde ser atribuída a nenhum ST/CC, devendo ser submetida novamente ao protocolo
de tipificação por MLST. Os spa t05 e t06 foram observados em duas cepas MRSP: C46 (SCCmec
NT, ST282) e VA27 (SCCmec II-III, ST71), respectivamente. Estudos sugerem que os tipos t02,
t05, t06 e t15 são intimamente relacionados, uma vez que diferem somente quanto ao número total
de repetições r03 (RUSCHER et al., 2010; MOODLEY et al., 2013; WORTHING et al., 2018).
Além disso, o mesmo tipo de spa pode estar presente em STs e pulsotipos não relacionados
(PERRETEN et al., 2010), o que já foi reportado em MRSA e pode ser resultado de evolução
convergente e recombinação genética (STROMMENGER et al., 2008; GUARDABASSI et al.,
2009).
A técnica de PFGE gerou perfis distintos e revelou a heterogeneidade das cepas MRSP
avaliadas, em concordância com estudos prévios (SASAKI et al., 2007; BLACK et al., 2009;
NORSTRÖM et al., 2009; FENG et al., 2012; GRÖNTHAL et al., 2015; VENTRELLA et al.,
2017). Eventos genéticos como mutações pontuais, inserções e/ou deleções de DNA podem resultar
em diferenças no padrão de restrição no PFGE (TENOVER et al., 1995; ABOU-ELNAGA, 2017).
As cepas MRSP C57 e VA6 (grupo X) são idênticas pois apresentaram o mesmo pulsotipo. Além
disso, ambas possuem os mesmos SCCmec II-III, ST71 e perfil de multirresistência, diferindo
apenas quanto ao hospedeiro e perfil de genes de virulência. Cabe ressaltar que essas cepas foram
isoladas de dois animais diferentes, atendidos em locais diferentes (HVPA/UFRRJ em Seropédica
e clínica veterinária no Rio de Janeiro). Ainda nesse grupo, C86 é intimamente relacionada a C57
e VA6, diferindo em apenas um fragmento, o que pode ser resultado de um evento genético como
mutação ou inserção/deleção de DNA (TENOVER et al., 1995). Essa relação é evidenciada pelo
fato dessas três cepas possuírem os mesmos SCCmec II-III, spa t02, ST71 e basicamente o mesmo
perfil de multirresistência. MRSP S231, C156 e C111 fazem parte do grupo III e são intimamente
relaciondas, diferindo em três fragamentos. A cepa S231 (grupo III) é oriunda de amostra de leite
bovino e sabe-se que S. pseudintermedius não é a espécie de Staphylococcus spp. associada à
patogenia das mastites (ROBBERSON et al., 1996), sendo S. aureus o agente frequentemente
43
relatado (SAEI, 2012). No entanto, o único relato de S. pseudintermedius como causador de mastite
bovina caracterizou a cepa envolvida como MRSP-ST71, spa t02 e SCCmec II-III (PILLA et al.,
2013), curiosamente, os mesmos tipos de ST, spa e SCCmec caracterizados para S231. Esse achado
sugere o potencial de disseminação das cepas MRSP e a possível adaptação a diferentes
hospedeiros animais. Além disso, a presença de animais estranhos ao ambiente de ordenha, como
cães e gatos, pode contribuir para disseminação de S. pseudintermedius em bovinos.
Através da análise por MLST, detectou-se três diferentes tipos de ST/CC, além de um NST.
O ST/CC71 foi encontrado em 86,2% (19/23) das cepas e todas possuem o SCCmec do tipo II-III,
confirmando a conhecida associação entre esse cassete e o ST71 (DAMBORG et al., 2016). De
modo geral, as cepas apresentam o mesmo perfil de multirresistência e tipo de spa (t02), mas
diferem quanto ao hospedeiro, intensidade de produção de biofilme e perfil de virulência. A cepa
MRSP C25 (SCCmec IV) pertence ao ST265, cujo complexo clonal 258 (CC258) é
significativamente associado ao tipo de cassete encontrado neste estudo (DOS SANTOS et al.,
2016). A cepa MRSP C46 (ST282/CC45, spa t05) não pôde ter o SCCmec tipificado pela
metodologia utilizada. É interessante ressaltar que um novo tipo de SCCmec (ψSCCmec57395) foi
descrito especificamente em cepas MRSP (PERRETEN et al., 2013), sendo significativamente
associado ao CC45 (DOS SANTOS et al., 2016), de modo que a caracterização desse cassete por
metodologia adequada a sua detecção deverá ser realizada em etapa futura.
De todas as cepas MRSP oriundas de processos infecciosos em cães e gatos avaliadas,
56,5% (13/23) compartilham o mesmo ST71-spat02-SCCmecII-III e o mesmo perfil de
multirresistência, indicando que, assim como em outros países, essa é uma importante linhagem de
MRSP que pode estar presente nas populações de cães e gatos do Brasil. Além disso, sugere que
essas cepas podem ter evoluído de um ancestral comum. Em menor proporção, dois outros STs/CCs
foram encontrados. O CC258 tem sido frequentemente reportado na Europa e foi demonstrado,
através do MLST e agrupamento por eBURST, que esse CC pode estar substituindo o CC71 em
certos países europeus (DUIM et al., 2016; DOS SANTOS et al., 2016). Já CC45 é um clone bem
disseminado na Ásia (DOS SANTOS et al., 2016), o qual é associado ao ψSCCmec57395
(PERRETEN et al., 2013). A inédita detecção desses STs/CCs no Brasil sugere que essas cepas
podem ter sido introduzidas a partir de outros países. Entretanto, mais estudos são necessários para
inferir a dinâmica populacional e a prevalência desses e de outros CCs em cepas MRSP brasileiras.
As técnicas PFGE e MLST não tiverem uma boa correlação e esses resultados refletem que
a escolha do método de tipagem depende do tipo de estudo epidemiológico. Parte dessa não
correlação entre resultados de PFGE e MLST pode ser explicada pela diferença conceitual do termo
“clone”. De acordo com Tenover e colaboradores (1995), esse termo refere-se a isolados
relacionados, que são geneticamente indistinguíveis ou são tão similares que se presume que
derivam de um mesmo ancestral. Já pela técnica de MLST, um clone é definido com base no tipo
de sequência, portanto um isolado é definido como clone caso compartilhe o mesmo ST, permitindo
assim a identificação de linhagens genéticas que compartilham o mesmo ancestral (SOARES,
2017). Com base nessa definição, os clones incluem isolados com o mesmo tipo de sequência, mas
que não são necessariamente geneticamente idênticos (SPRATT, 2004). A diversificação do
genoma ancestral em decorrência de elevadas taxas de mutação e recombinação genética, bem
como o ganho ou a perda de elementos genéticos móveis pode resultar em um genoma altamente
variável, dificultando a definição de clone para esses microrganismos. Nesse sentido, a técnica de
PFGE permite a detecção de alterações genômicas mais frequentes e evidencia a diversidade entre
as cepas que partilham o mesmo ST (MURCHAN et al., 2003). A melhor compreensão do modo
como esses processos de evolução clonal contribui para a estruturação populacional pode ser
alcançada através de técnicas como o Sequenciamento Total do Genoma (“Whole Genome
44
Sequence” – WGS), que permite a investigação, em larga escala, dos mecanismos genéticos que
contribuem para a expansão clonal de certas linhagens de S. pseudintermedius (RILEY, 2016). No
entanto, deve-se ressaltar que para a realização de um estudo populacional, convém a combinação
de diferentes técnicas de tipagem.
A elevada prevalência de multirresistência (100%; 22/22) reportada neste e em outros
estudos (PERRETEN et al., 2010; BEN ZAKOUR et al., 2011; KADLEC et al., 2012; DUIM et
al., 2016; DOS SANTOS et al., 2016; VIDELA et al., 2017) evidencia que resistência a outras
classes de antimicrobianos é frequentemente encontrada em cepas MRSP. De modo geral, MRSP
exibem resistência à eritromicina, clindamicina, tetraciclina, sulfametoxazol + trimetoprim,
enrofloxacina, gentamicina, cloranfenicol e amicacina, mas com significativas diferenças quanto à
prevalência entre CCs diferentes, conforme demonstrado por dos Santos e colaboradores (2016).
Esses pesquisadores revelaram que MRSP-CC258 possui perfil de resistência diferente do que é
observado para cepas MRSP-CC71 e CC45. No entanto, no presente estudo, não foram observadas
variações nos perfis de resistência entre os STs/CCs detectados, sugerindo que a população MRSP
pode estar evoluindo para um perfil de resistência às mais variadas classes, restringindo ainda mais
as opções terapêuticas disponíveis. A rápida emergência de multirresistência tem sido associada ao
limitado número de elementos genéticos móveis e à pressão de seleção decorrente do uso de
inúmeras classes de antimicrobianos (MCCARTHY et al., 2015). Além dos impactos gerados para
o tratamento das infecções causadas por esses agentes, a emergência mundial de cepas MRSP
multirresistentes é uma preocupação para a saúde pública, seja pelos casos de infecção humana
resultantes da exposição a esses patógenos ou pela potencial transferência de elementos genéticos
entre espécies de Staphylococcus spp. de origem animal e humana (VIDELA et al., 2017).
MRSP é um patógeno nosocomial em ambientes veterinários de maneira comparável às
linhagens de MRSA adquiridas em hospitais na medicina humana (PERRETEN et al., 2010) e
embora um número considerável de estudos busque a compreensão da dinâmica populacional de
S. pseudintermedius, pouco se sabe sobre a distribuição de padrões clonais em cepas MRSP
brasileiras. Os resultados apresentados revelam a ocorrência de importantes linhagens de MRSP e
as principais características fenogenotípicas observadas que podem contribuir para sua expansão
clonal. Além disso, o perfil de multirresistência encontrado em STs não relacionados ressalta a
necessidade de vigilância epidemiológica contínua buscando determinar a prevalência de
populações clonais de MRSP e rastrear o surgimento de novas.
45
6 CONCLUSÕES
• Staphylococcus pseudintermedius são importantes produtores de biofilme.
• O elevado número de S. pseudintermedius portadores dos genes de virulência siet e se-int

reforça a necessidade de mais estudos para a melhor caracterização desses e de outros genes de
virulência presentes nessa espécie de estafilococo.
• A ocorrência de multirresistência a antimicrobianos em cepas MRSP estudadas é

considerável e o tipo de cassete SCCmec predominantemente encontrado foi o II-III.
• Quatro tipos de spa intimamente relacionados foram detectados, com predominância do

t02.
• Dois clones foram identificados pela técnica de PFGE, além de quatro cepas intimamente
relacionadas (grupos III e X).
• A tipagem por MLST revelou a presença de três STs/CCs (ST/CC71, ST265/CC258 e

ST282/CC45) nunca antes reportados em cepas MRSP brasileiras oriundas de processos
infecciosos em cães e gatos, com predominância da linhagem mundialmente disseminada
ST/CC71-spat02-SCCmecII-III.
• A análise comparativa dos métodos de tipagem utilizados revela a importância da

combinação de técnicas para uma compreensão mais ampla acerca da diversidade genética de
MRSP.
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67
ANEXOS
ANEXO A – Código, origem dos isolados, sítios de infecção e tipos de amostras.

Código do Código do
Origem Espécie Raça Sexo Idade Sítio de infecção Amostra
Isolado (UFRRJ) Isolado (ISU)
C6 8.61.3 HVPA/UFRRJ Cão Pinscher F NI Osso Fragmento ósseo
C8 8.61.5 HVPA/UFRRJ Cão Pastor Alemão F 11 anos Líquido sinovial Líquido sinovial
C9 8.61.6 HVPA/UFRRJ Gato PCB M 6 anos Trato urinário Urina
C10 8.61.7 HVPA/UFRRJ Cão NI NI NI Trato urinário Urina
C11 8.61.8 HVPA/UFRRJ Cão Poodle F 11 anos Pele “Swab” cutâneo
C14 8.61.9 HVPA/UFRRJ Cão SRD M 4 anos Ouvido “Swab” otológico
C16 8.61.10 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 2 anos Osso Swab de foco de fratura
C17p 8.61.11 HVPA/UFRRJ Cão Poodle F 11 anos Ouvido “Swab” otológico
C19 8.61.13 HVPA/UFRRJ Gato NI F 2 meses Trato urinário Urina
C20 8.61.14 HVPA/UFRRJ Cão NI M 1 mês Pele “Swab” cutâneo
C21 8.61.15 HVPA/UFRRJ Gato SRD NI NI Pele Fragmento cutâneo
C22 8.61.16 HVPA/UFRRJ Cão Poodle F NI Útero Punção uterina
C24 8.61.17 HVPA/UFRRJ Cão Cocker Spaniel F 9 anos Ouvido “Swab” otológico
C25 8.61.18 HVPA/UFRRJ Cão Pitt Bull F 4 meses Pele “Swab” cutâneo
C27 8.61.19 HVPA/UFRRJ Cão Poodle M 5 anos Pele “Swab” cutâneo
C28 8.61.20 HVPA/UFRRJ Cão Labrador F 3 anos Pele “Swab” cutâneo
C29 8.61.21 HVPA/UFRRJ Cão Beagle F NI Pele Fragmento cutâneo
C33 8.61.22 HVPA/UFRRJ Gato SRD M 3 anos Trato urinário Urina
C34 8.61.23 HVPA/UFRRJ Cão Pug F 9 meses Pele “Swab” cutâneo
C35 8.61.24 HVPA/UFRRJ Cão Sharpei F 2 meses Vagina “Swab” vaginal
C36 8.61.25 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 10 anos Pele “Swab” cutâneo
4 anos e 6
C37 8.61.26 HVPA/UFRRJ Cão Pug F Ouvido “Swab” otológico
meses
C38 8.61.27 HVPA/UFRRJ Cão Pinscher M 10 anos Pele “Swab” cutâneo
C40 8.61.28 HVPA/UFRRJ Cão Boxer F 4 anos Pele “Swab” cutâneo
68
1 ano e 7
C41 8.61.29 HVPA/UFRRJ Cão Pug F Pele “Swab” cutâneo
meses
C44 8.61.30 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 6 anos Pele Abscesso
C45 8.61.31 HVPA/UFRRJ Cão Bulldog Francês F 2 anos Pele “Swab” cutâneo
C46 8.61.32 HVPA/UFRRJ Cão Teckel M 2 anos Pele “Swab” cutâneo
C48 8.61.34 HVPA/UFRRJ Cão Pitt Bull F 9 anos Pele Fragmento cutâneo
C52 8.61.36 HVPA/UFRRJ Cão Bulldog Inglês F 7 anos Pele “Swab” cutâneo
C55 8.61.37 HVPA/UFRRJ Cão Bulldog Francês F 2 anos Pele “Swab” cutâneo
C56 8.61.38 HVPA/UFRRJ Cão Bulldog F 10 anos Pele Secreção purulenta de joelho
C57 8.61.39 HVPA/UFRRJ Gato PCB M 4 anos Trato urinário Urina
Fragmento de
C58 8.61.40 HVPA/UFRRJ Cão Pitt Bull M 11 anos Fragmento de nódulo
nódulo
C59 8.62.1 HVPA/UFRRJ Cão Golden Retriever F 5 anos Pele “Swab” cutâneo
C60 8.62.2 HVPA/UFRRJ Cão Bulldog F 10 anos Pele “Swab” de ferida
1 ano e 3
C61 8.62.3 HVPA/UFRRJ Gato SRD M Trato urinário Urina e coágulo
meses
C63 8.62.4 HVPA/UFRRJ Cão NI F 6 anos Ouvido “Swab” otológico
C65 8.62.5 HVPA/UFRRJ Cão Pastor Alemão M 3 meses Pulmão Secreção pulmonar
C67 8.62.7 HVPA/UFRRJ Cão Golden Retriever F 5 anos Pele “Swab” cutâneo
C70 8.62.8 HVPA/UFRRJ Gato SRD F 8 meses Trato urinário Urina
C80 8.62.11 HVPA/UFRRJ Cão Pinscher M 11 anos Trato urinário Urina
C81 8.62.12 HVPA/UFRRJ Cão Poodle M 4 anos Pele “Swab” cutâneo
C83 8.62.13 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 3 anos Ouvido “Swab” otológico
C85 8.62.14 HVPA/UFRRJ Cão Chow-Chow F 10 anos Pele “Swab” cutâneo
C86 8.62.15 HVPA/UFRRJ Cão Pitbull F 9 meses Pele “Swab” cutâneo
C87 8.62.16 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 3 anos Pele “Swab” de lesão
C93 8.62.18 HVPA/UFRRJ Cão Pinscher F 11 anos Trato urinário Urina
69
C97 8.62.19 HVPA/UFRRJ Cão SRD M NI Pele “Swab” de abscesso
C99 8.63.1 HVPA/UFRRJ Cão SRD M 1 ano Pele “Swab” cutâneo
C100 8.62.20 HVPA/UFRRJ Cão Chowchow F 1 ano Ouvido “Swab” otológico
C102 8.62.21 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 13 anos Osso “Swab” foco de fratura
C103 8.62.22 HVPA/UFRRJ Cão Labrador M 12 anos Pele “Swab” cutâneo
C104 8.62.23 HVPA/UFRRJ Cão Scooby M 3 anos Pele “Swab” de lesão
C105 8.63.2 HVPA/UFRRJ Cão Collie F 9 anos Pele “Swab” cutâneo
C106 8.62.24 HVPA/UFRRJ Cão SRD M 9 anos Pele Punção de abscesso
C110 8.62.25 HVPA/UFRRJ Cão Rottweiler M 4 meses Pele “Swab” cutâneo
C111 8.62.26 HVPA/UFRRJ Gato PCB F 2 anos Trato urinário Urina
C113 8.62.27 HVPA/UFRRJ Cão Pitt Bull M 1 ano Ouvido “Swab” otológico
C122 8.62.28 HVPA/UFRRJ Cão São Bernardo M 7 anos Trato urinário Urina
C125 8.62.29 HVPA/UFRRJ Cão Shih-Tzu F 5 anos Ouvido “Swab” otológico
C127 8.62.30 HVPA/UFRRJ Cão Yorkshire F 5 anos Trato urinário Urina
C128 8.62.31 HVPA/UFRRJ Gato SRD F 2 anos Trato urinário Urina
C130 8.62.32 HVPA/UFRRJ Cão Yorkshire Terrier F 3 anos Trato urinário Urina
C131 8.62.33 HVPA/UFRRJ Cão SRD M 9 anos Trato urinário Urina
1 ano 3
C133 8.62.35 HVPA/UFRRJ Cão Cane Corso F Vagina “Swab” vaginal
meses
C135 8.62.37 HVPA/UFRRJ Cão Beagle M 2 meses Trato urinário Urina
C144 8.63.4 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 9 anos Pele Secreção de abscesso
C145 CR 8.63.5 HVPA/UFRRJ Cão SRD M 5 anos Pele “Swab” cutâneo
1 ano 7
C150 8.63.7 HVPA/UFRRJ Cão SRD F Ouvido “Swab” otológico
meses
70
Fragmento cutâneo e
C156 8.63.9 HVPA/UFRRJ Cão Pit Bull F 8 anos Pele
linfonodo
C157 8.63.10 HVPA/UFRRJ Cão SRD F 4 anos Pele Fragmento de cutâneo
C160 8.63.13 HVPA/UFRRJ Cão Labrador M 9 anos Pele Fragmento cutâneo
VA1 8.63.18 Laboratório Privado Gato Persa M 11 meses Trato urinário Urina
VA2 8.63.19 Laboratório Privado Cão SRD F 16 anos Trato urinário Urina
VA6 8.63.23 Laboratório Privado Cão Beagle M NI Trato urinário Urina
VA15 8.63.32 Laboratório Privado Gato PCB M 3 anos Trato urinário Urina
VA27 8.64.4 Laboratório Privado Cão SRD M NI NI “Swab”
PCB: Pelo Curto Brasileiro; SRD: Sem Raça Definida; F: Fêmea; M: Macho; NI: Não informado
71
ANEXO B – Alinhamento das sequências (BioEdit versão 7.2) do gene spa amplificado através
dos iniciadores descritos por Moodley e colaboradores (2009). Em destaque encontram-se as
sequências de repetições de 30 pb que determinam o tipo de spa.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C11 1 AAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCAAGTGTAAGTAAAGATATCCTTGTTGAAGCTAAAAAGTTAAATGACAGCCAAGCAAAACCTGATTA
C33 1 ........................................................................................................................
C55 1 ........................................................................................................................
C56 1 ........................................................................................................................
C57 1 ........................................................................................................................
C85 1 ........................................................................................................................
C86 1 ........................................................................................................................
C111 1 ........................................................................................................................
C128 1 ........................................................................................................................
C156 1 ........................................................................................................................
S231 1 ...TC.T........G........................................................................................................
VA1 1 ........................................................................................................................
VA15 1 ........................................................................................................................
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C11 121 CAGTGAAGCGCAACAAAATGCATTTTATGAAATTTTACACCTTCCAAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCGAGTGTAAGTAGTGATATTCT

C33 121 ........................................................................................................................
C55 121 ........................................................................................................................
C56 121 ........................................................................................................................
C57 121 ........................................................................................................................
C85 121 ........................................................................................................................
C86 121 ........................................................................................................................
C111 121 ........................................................................................................................
C128 121 ........................................................................................................................
C156 121 ........................................................................................................................
S231 121 ........................................................................................................................
VA1 121 ........................................................................................................................
VA15 121 ........................................................................................................................
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C11 241 TGCTGAAGCTAAGAAATTAAATGACAGCCAAGCGCCTAAAGAAGACAACAACGTAAAAGACAATAATTCAGGTGAAAACAAAGCTGAAGACAAAGGCAACAAAGAAAACAAAGCTGAAGA

C33 241 ........................................................................................................................
C55 241 ........................................................................................................................
C56 241 ........................................................................................................................
C57 241 ........................................................................................................................
C85 241 ........................................................................................................................
C86 241 ........................................................................................................................
C111 241 ........................................................................................................................
C128 241 ........................................................................................................................
C156 241 ........................................................................................................................
S231 241 ........................................................................................................................
VA1 241 ........................................................................................................................
VA15 241 ........................................................................................................................
370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C11 361 TAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGATAAAGCTAAAGA

C33 361 ........................................................................................................................
C55 361 ........................................................................................................................
C56 361 ........................................................................................................................
C57 361 ........................................................................................................................
C85 361 ........................................................................................................................
C86 361 ........................................................................................................................
C111 361 ........................................................................................................................
C128 361 ........................................................................................................................
C156 361 ........................................................................................................................
S231 361 ........................................................................................................................
VA1 361 ........................................................................................................................
VA15 361 ........................................................................................................................
490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C11 481 CAAAGACAACAAAGAAGGCAAAGCTGCAGACAAAGGTATGGACAAAGCGAAAGATGCAATGCATGTCGTTCAACCTGGTGAAACAGTAGAAAAAATTGCTAAAGCTAATAACACAACTGT

C33 481 ........................................................................................................................
C55 481 ........................................................................................................................
C56 481 ........................................................................................................................
C57 481 ........................................................................................................................
C85 481 ........................................................................................................................
C86 481 ........................................................................................................................
C111 481 ........................................................................................................................
C128 481 ........................................................................................................................
C156 481 ........................................................................................................................
S231 481 ........................................................................................................................
VA1 481 ........................................................................................................................
VA15 481 ........................................................................................................................
610 620 630 640

....|....|....|....|....|....|....|....|....|.
C11 601 AGAACAAATCGCTAAAGATAATCATTTAGAAGATAAAAACATGATT

C33 601 ..............................................
C55 601 ..............................................
C56 601 ..............................................
C57 601 ..............................................
C85 601 ..............................................
C86 601 ..............................................
C111 601 ..............................................
C128 601 ..............................................
C156 601 ..............................................
Legenda: Em destaque a sequência de repetições para o spa tipo 02.
72
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C27 1 AACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCGAGTGTAAGTAGTGATATTCTTGCTGAAGCTAAGAAATTAAATGACAGCCAAGCGCCTAAAGAAGAC
C81 1 ........................................................................................................................
MO22A 1 ........................................................................................................................
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C27 121 AACAACGTAAAAGACAATAATTCAGGTGAAAACAAAGCTGAAGACAAAGGCAACAAAGAAAACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAA

C81 121 ........................................................................................................................
MO22A 121 ........................................................................................................................
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C27 241 GACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAA

C81 241 ........................................................................................................................
MO22A 241 ........................................................................................................................
370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C27 361 GATAAAGCTAAAGACAAAGACAACAAAGAAGGCAAAGCTGCAGACAAAGGTATGGACAAAGCGAAAGATGCAATGCATGTCGTTCAACCTGGTGAAACAGTAGAAAAAATTGCTAAAGCT

C81 361 ........................................................................................................................
MO22A 361 ........................................................................................................................
490 500 510 520 530 540 550

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....
C27 481 AATAACACAACTGTAGAACAAATCGCTAAAGATAATCATTTAGAAGATAAAAACATGATTTTACCAGGTCAAAA

C81 481 ..........................................................................
MO22A 481 ..........................................................................
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C46 1 TTACCAAATCTTACTGAAGAGCAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCAAGTGTAAGTAAAGATATCCTTGTTGAAGCTAAAAAGTTAAATGACAGCCAAGCAAAACCT
130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C46 121 GATTACAATGAAGCGCAACAAAATGCATTTTATGAAATTTTACACCTTCCAAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCGAGTGTAAGTAGTGAT
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C46 241 ATTCTTGCTGAAGCTAAGAAATTAAACGACAGCCAAGCGCCTAAAGAAGACAACAACGTAAAAGACAATAATTCAGGTGAAAACAAAGCTGAAGACAAAGGCAACAAAGAAAACAAAGCT
370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C46 361 GAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCT

v
490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
C46 481 GAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGATAAAGCTAAAGACAAAGACAACAAAGAAGGCAAAGCTGCAGACAAAGGTATGGACAAAGCGAAAGATGCAATGCATGTCGTTCAACCTGGTGAAACA
610 620 630

v 640 650 660 670 680 690
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.
C46 601 GTAGAAAAAATTGCTAAAGCTAATAACACAACTGTAGAACAAATCGCTAAAGATAATCATTTAGAAGATAAAAACATGATTTTACCAGGTCAAAAA
73
10 20 10 30 20 40 30 50 40 60 50 70 60 80 70 90 80 100 90 100
. . . . | . . . . | . . . . | .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || .. .. .. .. || . . . . | . . . . | . . . . |
VA27SPA_1142761.seq 1 ACCAAATCTTACTGAAGAGCAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCAAGTGTAAGTAAAGATATCCTTGTTGAAGCTAAAAAGTTAAAT
VA27SPA_1142761.seq 1 ACCAAATCTTACTGAAGAGCAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCAAGTGTAAGTAAAGATATCCTTGTTGAAGCTAAAAAGTTAAAT
110 120 10
110 130 20
120 140 30
130 150 40
140 160 50
150 170 60
160 180 70
170 190 80
180 200 90
190 100
200
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VA27SPA_1142761.seq 101 GACAGCCAAGCAAAACCTGATTACAGTGAAGCGCAACAAAATGCATTTTATGAAATTTTACACCTTCCAAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCA

VA27SPA_1142761.seq 1
101 ACCAAATCTTACTGAAGAGCAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCAAGTGTAAGTAAAGATATCCTTGTTGAAGCTAAAAAGTTAAAT
GACAGCCAAGCAAAACCTGATTACAGTGAAGCGCAACAAAATGCATTTTATGAAATTTTACACCTTCCAAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCA
210 220 10
110
210 230 20
120
220 240 30
130
230 250 40
140
240 260 50
150
250 270 60
160
260 280 70
170
270 290 80
180
280 300 90
190
290 100
200
300
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VA27SPA_1142761.seq
VA27SPA_1142761.seq 1
201 TCCAAAGCCTTAAAGACGATCCAAGTGTAAGTAAAGATATCCTTGTTGAAGCTAAAAAGTTAAATGACAGCCAAGCAAAACCTGATTACAGTGAAGCGCA
101 GACAGCCAAGCAAAACCTGATTACAGTGAAGCGCAACAAAATGCATTTTATGAAATTTTACACCTTCCAAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCA
TCCAAAGCCTTAAAGACGATCCAAGTGTAAGTAAAGATATCCTTGTTGAAGCTAAAAAGTTAAATGACAGCCAAGCAAAACCTGATTACAGTGAAGCGCA
310 320 110

210
310
10 330 120
220
320
20 340 130
230
330
30 350 140
240
340
40 360 150
250
350
50 370 160
260
360
60 380 170
270
370
70 390 180
280
380
80 400 190
290
390
90 200
300
400
100
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VA27SPA_1142761.seq
VA27SPA_1142761.seq 101
301 ACAAAATGCATTTTATGAAATTTTACACCTTCCAAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCGAGTGTAAGTAGT
410 420 210

310
10
410
110 430 220
320
20
420
120 440 230
330
30
430
130 450 240
340
40
440
140 460 250
350
50
450
150 470 260
360
60
460
160 480 270
370
70
470
170 490 280
380
80
480
180 500 290
390
90
490
190 300
400
100
500
200
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VA27SPA_1142761.seq
VA27SPA_1142761.seq 201
401 GATATTCTTGCTGAAGCTAAGAAATTAAATGACAGCCAAGCGCCTAAAGAAGACAACAACGTAAAAGACAATAATTCAGGTGAAAACAAAGCTGAAGACA
v
510 520 310
10
410
110
510
210 530 320
20
420
120
520
220 540 330
30
430
130
530
230 550 340
40
440
140
540
240 560 350
50
450
150
550
250 570 360
60
460
160
560
260 580 370
70
470
170
570
270 590 380
80
480
180
580
280 600 390
90
490
190
590
290 400
100
500
200
600
300
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VA27SPA_1142761.seq
VA27SPA_1142761.seq 301
1
401
101
501 AAGGCAACAAAGAAAACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAA
GATATTCTTGCTGAAGCTAAGAAATTAAATGACAGCCAAGCGCCTAAAGAAGACAACAACGTAAAAGACAATAATTCAGGTGAAAACAAAGCTGAAGACA
AAGGCAACAAAGAAAACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAAAGAAGACAAAGCTGAAGATAAAGGCAGCAA
v
610 620 410
110
510
210
610
10
310 630 420
120
520
220
620
20
320 640 430
130
530
230
630
30
330 650 440
140
540
240
640
40
340 660 450
150
550
250
650
50
350 670 460
160
560
260
660
60
360 680 470
170
570
270
670
70
370 690 480
180
580
280
680
80
380 700 490
190
590
290
690
90
390 500
200
600
300
700
100
400
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VA27SPA_1142761.seq
VA27SPA_1142761.seq 401
101
201
1
601 AGAAGATAAAGCTAAAGACAAAGACAACAAAGAAGGCAAAGCTGCAGACAAAGGTATGGACAAAGCGAAAGATGCAATGCATGTCGTTCAACCTGGTGAA
AGAAGATAAAGCTAAAGACAAAGACAACAAAGAAGGCAAAGCTGCAGACAAAGGTATGGACAAAGCGAAAGATGCAATGCATGTCGTTCAACCTGGTGAA
ACAAAATGCATTTTATGAAATTTTACACCTTCCAAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGTTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCGAGTGTAAGTAGT
v
710 720 10
510
210
610
310
710
110
410 730 20
520
220
620
320
720
120
420 740 30
530
230
630
330
730
130
430 750 40
540
240
640
340
740
140
440 760 50
550
250
650
350
750
150
450 770 60
560
260
660
360
760
160
460 780 70
570
270
670
370
770
170
470 790 80
580
280
680
380
780
180
480 90
590
290
690
390
790
190
490 100
600
300
700
400
200
500
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UFRRJ

OCORRÊNCIA, RESISTÊNCIA, VIRULÊNCIA E DIVERSIDADE

Cássia Couto da Motta

OCORRÊNCIA, RESISTÊNCIA, VIRULÊNCIA E DIVERSIDADE

CÁSSIA COUTO DA MOTTA

Sob a orientação da Professora

Tese submetida como requisito parcial

Cássia Couto da Motta ingressou no curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal

MOTTA, Cássia Couto da. Ocorrência, resistência, virulência e diversidade genética de

No Brasil, a prevalência de Staphylococcus pseudintermedius meticilina-resistentes como causa de

In Brazil, the prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) as a

AMH Ágar Müeller-Hinton

Tabela 1. Isolamento de Staphylococcus pseudintermedius por sítio de infecção 27

Staphylococcus pseudintermedius é comumente presente na pele e mucosas de cães e é o

Bactérias do gênero Staphylococcus, pertencente à família Staphylococcaceae, são cocos

2.1.2 Staphylococcus pseudintermedius

Staphylococcus pseudintermedius foi primeiramente descrito como S. intermedius por

2.2 Identificação de Staphylococcus pseudintermedius

Historicamente, membros do gênero Staphylococcus eram classificados e diferenciados

2.3 Patogenicidade e potencial zoonótico

Staphylococcus pseudintermedius é comensal da pele e mucosas de cães saudáveis,

2.4 Fatores de virulência

Microrganismos patogênicos desenvolvem uma série de estratégias de sobrevivência para

2.5 Staphylococcus pseudintermedius meticilina-resistentes (MRSP) e multirresistência

A relevância de S. pseudintermedius sp. como patógeno em diversos quadros infecciosos

2.6 Tipagem molecular de cepas MRSP

A tipagem molecular de microrganismos tem o papel principal de avaliar as relações

O PFGE é reconhecidamente um dos métodos mais discriminatórios para tipagem

2.6.2 Tipagem do gene spa

Diferentemente da técnica de PFGE, um protocolo específico de tipagem através do gene

2.6.3. Tipagem da Sequência Multilocus (“Multilocus Sequence Typing” – MLST)

A fim de superar a insuficiência na portabilidade das abordagens tradicionais, o método

2.6.4 Tipagem do cassete cromossômico mec (SCCmec)

Avaliar o perfil de virulência, resistência antimicrobiana e diversidade de cepas de

3.2. Objetivos específicos

• Avaliar, fenotipicamente, a formação de biofilme e detectar genes de virulência associados

Os isolados de S. pseudintermedius estudados foram obtidos a partir de 169 amostras

4.1.1 Isolamento e identificação presuntiva de Staphylococcus coagulase-positivos

As amostras clínicas foram submetidas à rotina de identificação que consistiu no isolamento

4.1.2 Prova do hidróxido de potássio (KOH) 3% e prova da catalase

A prova do hidróxido de potássio foi efetuada através da adição de um fragmento da colônia

4.1.4 Prova de suscetibilidade à bacitracina e à polimixina

4.1.5 Prova de Voges-Proskauer e fermentação de manose e maltose

Os isolados de ECP foram bioquimicamente identificados através das provas de Voges-

Quadro 1. Resultados esperados na identificação fenotípica das espécies de ECP

4.2 Identificação molecular de Staphylococcus pseudintermedius

Os isolados foram reativados em ágar Tripticase de Soja (TSA – BD Difco™) e

4.2.1 Liberação do DNA bacteriano por lise térmica

4.2.2 Identificação pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerase Chain

A caracterização genotípica foi realizada pela amplificação utilizando iniciadores específicos

Quadro 2. Iniciadores e ciclos empregados para identificação genotípica

4.2.3 Identificação proteômica por MALDI-TOF MS

A identificação proteômica pela técnica do Tempo de Vôo de Ionização/Desorção por Laser

Quadro 3. Interpretação dos escores resultantes da avaliação proteômica por MALDI-TOF MS

4.4. Detecção de genes de virulência

A técnica de PCR foi realiazada utilizando os iniciadores descritos no Quadro 4, para a

Foram utilizadas as seguintes concentrações de reagentes: Tampão 1 X (Thermo Fischer

Quadro 4. Iniciadores e ciclos empregados para a amplificação dos genes de virulência