AVALIAÇÃO DA INATIVAÇÃO DE ENDÓSPOROS DE GEOBACILLUS

STEAROTHERMOPHILUS NO TRATAMENTO PRÉVIO DE RESÍDUOS DE

SERVIÇOS DE SAÚDE POR AUTOCLAVAGEM À 121°C

Amanda Borges Ribeiro de Oliveira (*), Taís Maria Bauab, Valdir Schalch
* Núcleo de Estudo e Pesquisa em Resíduos Sólidos (Neper) do Departamento de Hidráulica e Saneamento, Escola de
Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo (EESC/USP). E-mail: [email protected]

RESUMO
Resíduos de Serviços de Saúde (RSS), ainda que tratados e dispostos em aterros sanitários, podem ser causas de impactos
ambientais por apresentarem algum indicador de periculosidade. Segundo a Resolução da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (Anvisa) RDC nº 222/2018, para as tecnologias de tratamento desses resíduos é necessário que se atinja pelo
menos o Nível III de inativação microbiana. Perante a ausência de informações na literatura que comprovassem a
esterilização de RSS durante o tratamento à temperatura de 121°C prévio a destinação final (intraestabelecimento),
definiu-se o objetivo do trabalho para otimização do processo. Esta pesquisa foi desenvolvida com base na proposta
metodológica de Oliveira (2017) estruturada para avaliar o tratamento de RSS por autoclavagem. Para os testes foram
utilizados endósporos de Geobacillus stearothermophilus como bioindicadores e instalados cinco termopares na autoclave
para aferição da temperatura dentro de todo o espaço da câmara. O RSS foi sintetizado diante das caracterizações como
composição gravimétrica, distribuição granulométrica, densidade específica aparente, massa específica aparente e teor de
umidade. Realizou-se ensaios à 121°C observando a fração de inativação em dois tempos de exposição, 50 e 60 minutos.
Inoculou-se 106 endósporos nas amostras e a recuperação foi feita com filtração após a lavagem dos resíduos, sendo
realizada a técnica de “pour plate” para contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). O mesmo procedimento
foi feito com a amostra retirada da autoclave. As frações de 76% e 92% de inativação para as situações de 50 e 60 minutos
respectivamente, representaram a ineficiência do tratamento nessa temperatura e pressão absoluta de 1,3 kgf/cm². O
resultado dessas frações foi obtido através da relação do número de micro-organismos recuperados considerados como
inoculados e o número de micro-organismos sobreviventes ao tratamento. Com os resultados alcançados foi possível
concluir que à 121°C os resíduos não são esterilizados. As frações de inativação encontradas na presente pesquisa não
foram satisfatórias nas condições mais utilizadas para esterilização de materiais e de resíduos submetidos a tratamento
prévio em estabelecimentos de saúde.

PALAVRAS-CHAVE: Resíduos de Serviços de Saúde, autoclavagem, tratamento prévio, esterilização,

estabelecimentos de saúde.

ABSTRACT
Healthcare waste, even when treated and disposed of in landfills, can be causes of environmental impacts because they
show some hazard indicator. According to Resolution of the National Health Surveillance Agency of Brazil (Anvisa)
RDC nº 222/2018, for healthcare waste treatment technologies, it is necessary to achieve at least Level III of microbial
inactivation. Towards the absence of information in the literature to prove the sterilization of healthcare waste during
prior treatment to final destination (within the health facility) at a temperature of 121°C, the objective of this research
was defined to optimize the process. This research was developed based on the methodological approach of Oliveira
(2017) structured to evaluate the treatment of healthcare waste by autoclaving. For the tests, endospores of Geobacillus
stearothermophilus were used as bioindicators and five thermocouples were installed in the autoclave for temperature
measurement throughout the chamber space. The healthcare waste was synthesized by characterizations such as
gravimetric composition, granulometric distribution, apparent specific density, apparent specific mass and moisture
content. Tests were performed at 121°C observing the inactivation fraction in two exposure times, 50 and 60 minutes.
The concentration of 106 endospores were inoculated in the samples and the recovery was done with filtration after
washing the waste, and the "pour plate" technique was used to count the colony forming units. The same procedure was
done with the sample removed from the autoclave. The inactivation fractions of 76% and 92% for situations of 50 and 60
minutes respectively, represented the inefficiency of the treatment at this temperature and an absolute pressure of 1.3
kgf/cm². A outcome obtained by the ratio of the number of recovered microorganisms considered as inoculated and the
number of microorganisms surviving the treatment. With the results achieved it was possible to conclude that at 121°C
the waste are not sterilized. The inactivation fractions found in the current study were not satisfactory in the most used
conditions for sterilizing materials and waste that are subjected to prior treatment in health facilities.

KEY WORDS: Healthcare waste, autoclaving, prior treatment, sterilization, health facilities.

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INTRODUÇÃO
Os Resíduos de Serviços de Saúde (RSS), quando caracterizado como perigoso, devem receber tratamento segundo a
Resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) RDC nº 222/2018. Esse tratamento consiste na aplicação
de processo que modifique as características físicas, químicas ou biológicas dos resíduos, reduzindo ou eliminando o risco
de dano ao meio ambiente ou à saúde pública, e pode ser prévio ao armazenamento intraestabelecimento e/ou à disposição
final em aterro sanitário, conforme Anvisa (2006).

A autoclavagem é a descontaminação com utilização de vapor em altas temperaturas e pressões. Utiliza o termo
descontaminação ao invés de esterilização por considerar que a eficiência do tratamento se dá com 99,9% de inativação
de micro-organismos, o que se opõe ao conceito de esterilização, que seria a morte de 100% dos seres vivos. Afirma que
os valores usuais de pressão são da ordem dos 3 a 3,5 bar e temperaturas de aproximadamente 135ºC, porém não esclarece
se essa temperatura é a ideal para o tratamento ou se é a máxima atingida pelo equipamento. O processo de autoclavagem
inclui ciclos de compressão e de descompressão de forma a facilitar o contato entre o vapor e os resíduos. O aquecimento
dos resíduos em autoclave acontece em regime transiente não-isotérmico, ou seja, desde o início até o fim do processo a
temperatura e pressão não se mantêm constantes. Durante o procedimento, o vapor é introduzido na autoclave e o aumento
gradual da pressão favorece o contato entre o vapor e os resíduos (Anvisa, 2006). Esse tratamento é aplicado somente a
RSS dos grupos A (somente subgrupos A1 e A2) e E, segundo a Resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(Anvisa) RDC nº 222/2018, sendo necessário que se atinja pelo menos o Nível III de inativação microbiana.

A mesma resolução pontua alguns RSS que necessitam do tratamento prévio à destinação final, ou seja, aquele que
acontece dentro da unidade de saúde geradora o qual antecede o armazenamento temporário no abrigo de resíduos, com
o intuito de evitar o risco à saúde do trabalhador. Resíduos do Subgrupo A1 como culturas e estoques de micro-
organismos, os meios de cultura e os instrumentais utilizados para transferência, inoculação ou mistura de culturas
contendo micro-organismos das classes de risco 1, 2, 3 e 4, necessitam desse tratamento prévio. Os RSS resultantes da
atenção à saúde de indivíduos ou animais com suspeita ou certeza de contaminação biológica por agentes classe de risco
4, podem ser tratados dentro ou fora da unidade geradora, assim como as bolsas de sangue e de hemocomponentes
rejeitadas por contaminação, má conservação, prazo de validade vencido e oriundas de coleta incompleta, sobras de
amostras de laboratório, recipientes e materiais contendo sangue ou líquidos corpóreos (Anvisa RDC nº 222/2018). Por
fim, alguns RSS do Subgrupo A2 contendo micro-organismos com alto risco de transmissibilidade, alto potencial de
letalidade ou com risco de contaminação ambiental, obrigatoriamente devem ser submetidos ao tratamento no local onde
foi gerado.

A Norma Técnica da Companhia Ambiental do Estado de São Paulo (Cetesb) E15.010/2011 regulamenta a avaliação da
eficiência de sistemas de tratamento térmico sem combustão de resíduos contaminados biologicamente, por meio do teste
com bioindicadores, que para os processos que utilizam calor úmido são as Geobacillus stearothermophilus. A
metodologia empregada para os testes, regulamentada através da norma P2-112/2016 da Cetesb, utiliza fitas ou tiras
contendo populações mínimas de 104 endósporos que quando colocadas em meio de cultura específico apenas alteram
sua cor na presença de micro-organismos, sendo que não há contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) após o
teste.

Em Ministério da Saúde (2010), ao analisarem a autoclavagem de bolsas de sangue, notaram que a distribuição das bolsas
dentro da autoclave e o grau de exposição direta ao calor úmido influenciaram diretamente na eficácia do tratamento.
Hossain et al. (2012) constataram que o tratamento por autoclavagem de RSS não foi efetivo no sentido de atingir o Nível
III de inativação microbiana. Utilizaram células vegetativas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e Bacillus subtilis mediante tempos de aquecimento de até
60 minutos e temperaturas do vapor na entrada no intervalo de 111°C a 131°C. Galvão (2012) utilizou RSS do Subgrupo
A1 gerados em laboratórios de microbiologia e seus resultados evidenciaram ineficiência na descontaminação dos
resíduos à 121°C na autoclave.

Contudo, não foram encontrados trabalhos científicos que comprovassem a eficiência da esterilização em nenhuma das
circunstâncias de tratamento prévio à destinação final de RSS, ou tratamento prévio à disposição em aterro sanitário, e
até mesmo na esterilização de materiais e equipamentos utilizados nos serviços de saúde à temperatura de 121°C.

Com isso, nesta pesquisa, foram realizados ensaios para descobrir se a condição de 121ºC seria favorável à inativação dos
endósporos, já que é padronizada em hospitais, laboratórios de análises clínicas, laboratórios de ensino e pesquisa,
consultórios odontológicos e outros estabelecimentos como temperatura ideal para esterilização de materiais e tratamento

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prévio de RSS. Destaca-se, que segundo o Ministério da Saúde (2010), bolsas de sangue devem ser esterilizadas a 121°C
e tempo de exposição de 50 minutos.

Uma vez comprovada a resistência de micro-organismos em amostras de RSS típico submetidos à autoclavagem, a
proposição do presente estudo consistiu em avaliar tecnicamente a inativação de endósporos de Geobacillus
stearothermophilus em RSS, sob as condições operacionais de tratamento prévio de RSS semelhantes a equipamentos em
escala real. Apesar de ser a tecnologia mais utilizada para tratamento de resíduos infectantes, o processo de tratamento
por autoclave pode ser otimizado nas unidades de saúde, para atender maiores eficiências na inativação microbiana,
eliminando o risco à saúde e contaminação ambiental.

OBJETIVOS
Avaliar tecnicamente a eficiência do processo de tratamento de Resíduos de Serviços de Saúde (RSS) por autoclave para
que a inativação microbiana seja atingida mediante a condição de temperatura de 121°C, temperatura pré-estabelecida
como ideal para esterilização de materiais em estabelecimentos de saúde e desinfecção de resíduos como forma de
tratamento prévio à destinação final.

 Objetivos Específicos
Analisar previamente estudos realizados com inativação microbiana à 121ºC e quantificar os níveis de inativação
microbiana no tratamento por autoclave, em função da condição operacional nessa temperatura e nos tempos de exposição
de 50 e 60 minutos.

METODOLOGIA
Esta pesquisa foi desenvolvida com base na proposta metodológica de Oliveira (2017) estruturada para avaliar o
tratamento extraestabelecimento de RSS por autoclavagem, tendo como referência normativa a Anvisa RDC nº 306/2004,
vigente naquele momento (revogada por Anvisa RDC nº 222/2018). O objeto de estudo foi a inativação de endósporos de
Geobacillus stearothermophilus em RSS, bioindicadores estabelecidos por regulamentações da Anvisa e Cetesb para
avaliação de tratamento térmico sem combustão. Os RSS estudados para composição das amostras, foram os pertencentes
aos subgrupos A1, A2 e A4, pois os subgrupos A3 e A5 devem receber outras formas de tratamento ou destinação final,
segundo a Anvisa RDC nº 306/2004.

 Caracterização dos resíduos e preparação do material para os ensaios

A primeira etapa constituiu em determinar a composição gravimétrica e granulométrica dos RSS, para síntese das
amostras. Para isso, usou-se a gravimetria e granulometria encontrada por Oliveira et al. (2010). A síntese foi feita com
resíduos classificados, conforme a Norma Brasileira Aprovada pela Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT)
NBR 10004/2004, como Classe II, não-perigosos, procurando-se alcançar características mais próximas dos RSS gerados
em estabelecimentos de saúde, e triturados, como no tratamento externo por autoclave, para garantia de melhor
desinfecção devido ao aumento da superfície de contato, e menor área de ocupação em aterro sanitário quando
depositados. Em seguida, após amostragem por quarteamento (ABNT NBR 10007/2004), todo o resíduo foi transferido
para os sacos, autoclavados por 60 minutos a 121°C e 2,0 kgf/cm2 e secos em estufa a 35°C por 24 horas.

Através da densidade específica aparente, que foi de 26,90 g/L, foi verificada a massa específica aparente para
determinação do volume de material que seria utilizado em cada ensaio.

Para que não houvesse estrapolação na bandeja de alumínio utilizada e consequente perda de material e micro-organismos,
determinou-se que o ideal seria a ocupação de 1/3 em todos os testes, aproximados 125,53 g. Para cada teste foram
utilizadas duas amostras que eram novamente autoclavadas após serem armazenadas em sacos para autoclave, cortados e
lacrados por uma seladora. Não sendo necessária a secagem após essa esterilização a 121°C, o material estava pronto para
os ensaios. Preparou-se a solução salina a 0,9% com água destilada para lavagem de cada amostra e diluição dos
endósporos, que foi armazenada em fracos de vidro com tampa rosqueável, e autoclavou a 121°C. O meio de cultura Agar
Triptona de Soja (TSA) também era preparado com água destilada, armazenado nos frascos, autoclavados a 121°C e
mantidos em Banho Maria. Utilizou-se 20 mL de Agar para cada placa de Petri. Do caldo de Triptona de Soja (TSB)
utilizou-se 1 mL para lavagem de cada membrana e plaqueamento, repetiu-se o método de preparo e esterilização do
Agar, porém manteve-se em temperatura ambiente até o uso.

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Foram instalados cinco termopares na autoclave para aferição da temperatura dentro de todo o espaço da câmara, e
enumerados com etiquetas para identificação. A Figura 1 a) exibe a ocupação de 1/3 do volume total da autoclave e a
localização dos termopares instalados, e a b) é referente as instalações dos equipamentos.

Figura 1: a) Volume de 1/3 de ocupação da câmara da autoclave e posicionamento dos termopares; b)

Equipamentos devidamente instalados para os testes com autoclavagem. Fonte: Autores.

Os termopares 1, 2, 3, 4 e 5 foram conectados em um indicador de temperatura digital, que transferia os dados durante
cada autoclavagem para o computador. Este foi configurado para registrar a temperatura a cada minuto. Os dados
coletados eram exportados e assim elaborados os gráficos.

 Fração volumétrica ocupada da câmara de autoclavagem

Para analisar a influência da fração volumétrica da massa de resíduos ocupada na autoclave (capacidade total de 14 L) foram
feitos dois testes: o primeiro com 2/3 de ocupação, volume anteriormente definido de 250,99 g, e o segundo com 1/3, 125,53 g.

 Diluição, plaqueamento e inoculação dos endósporos

Para diluir a suspensão de G. stearothermophilus, concentração 108, utilizou-se a seguinte fórmula:

C1 x V1 = C2 x V2 equação (1);
sendo: C1 a concentração inicial, 108 endósporos/mL; C2 a concentração a ser utilizada, 106 endósporos/mL; V2 o volume
a ser utilizado, que foi sempre 1 mL de solução salina. Seriam necessários um volume (V1) de 10 µL de suspensão a 108
diluídos em 990 µL de solução salina para inoculação. Após 24 horas de incubação a 57°C, as bactérias viáveis presentes
na amostra formaram colônias, conforme Norma Técnica da Cetesb L5.201/2006. Calculado o número de endósporos por
mL, multiplicou-se o volume semeado (1 mL) pelo número de UFC. Dentro da cabina de segurança inoculava-se 1 mL
da suspensão diluída de 106 endósporos diretamente nas amostras estéreis de resíduo de forma espalhada e agitava-se
lentamente.

 Os testes de autoclavagem e a recuperação dos endósporos

Os testes para a determinação da fração de inativação de endósporos de G. stearothermophilus consistiram em realizar 2
ensaios com autoclavagem de RSS para observar através de gráficos o resultado dessa fração sob a temperatura de 121°C,
pressão absoluta 1,3 kgf/cm2 e tempos de exposição de 50 e 60 min.

Para cada um dos ensaios tinham-se dois testes. O primeiro era o controle, o qual a amostra não receberia o tratamento.
O segundo, o autoclavado, que seria analisado qualitativamente e quantitativamente quanto a sobrevivência dos micro-
organismos. Do controle obtinha-se o N0; considera-se número de micro-organismos inoculados o recuperado de cada
teste controle. No autoclavado obtinha-se o N, número de sobreviventes ao tratamento. A fração de inativação seguiu
baseada na Lei de Arrhenius com integração numérica feita pelo método de Simpson e critério de mínimos quadrados
(LEVENSPIEL, 1999):
(N0 -N)
x(%)= N0
.100 equação (2).

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Na recuperação dos endósporos foi adicionado 1 L de solução salina a 0,9% estéril dentro do saco, seguido de leve
agitação para enxágue do material, e era perfurado e todo o líquido coletado em frasco estéril. O sistema de filtração era
acionado pela bomba de vácuo e os micro-organismos presentes na solução eram retidos em membrana que era retirada
cuidadosamente com uma pinça estéril e colocada dentro de um tubo “Falcon”. A Figura 2 ilustra os materiais utilizados
nessa etapa.

Figura 2: Materiais e sistema de filtração utilizados na recuperação dos endósporos. Fonte: Autores.

Com 1 mL de TSB era feita a lavagem da membrana dentro do tubo e o líquido semeado em placa de Petri juntamente
com 20 mL de TSA. Após 24 horas de incubação da placa a 57°C era feita a contagem das UFC por “pour plate”. A
segunda amostra era retirada da autoclave e imediatamente colocada dentro da cabina e o processo acima descrito era
igualmente repetido.

RESULTADOS
 Outras pesquisas desenvolvidas com inativação microbiana à 121°C
Em Hossain et al. (2012), constataram que com o aumento do tempo e da temperatura o número de micro-organismos
patógenos diminui, porém, a autoclavagem de RSS não foi efetiva no sentido de atingir o Nível III de inativação
microbiana recomendado por Anvisa RDC nº 222/2018. As condições ótimas experimentais para o grau de inativação das
células vegetativas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes e Bacillus subtilis eram de 121°C durante 15 minutos para as bactérias gram-negativas, e de
121°C a 131°C, durante 60 e 30 minutos para as gram-positivas. O “recrescimento” foi constatado em células vegetativas,
sendo que seria mais favorecida a observação em endósporos.

Com isso, nesta pesquisa, foram realizados ensaios para descobrir se a condição de temperatura de 121ºC seria favorável
à inativação dos endósporos, já que é padronizada em hospitais, laboratórios de análises clínicas, laboratórios de ensino
e pesquisa, consultórios odontológicos e outros estabelecimentos a temperatura ideal para esterilização de materiais e
tratamento prévio de RSS a temperatura de 121°C, apesar de não terem sido encontrados trabalhos científicos que
comprovem a eficiência da esterilização nessa circunstância. Destaca-se, que segundo o Ministério da Saúde (2010),
bolsas de sangue são esterilizadas a 121°C e tempo de exposição de 50 minutos. Após testes com inativação microbiana
em bolsas de sangue, afirmou que os endósporos de G. stearothermophilus são mais resistentes ao calor úmido de um
ciclo de inativação do que os vírus da Hepatite B.

Galvão (2012) utilizou RSS do Subgrupo A1 gerados em laboratórios de microbiologia. Não realizou contagem de micro-
organismos sobreviventes ao processo de tratamento, apenas indicador biológico de presença ou ausência de endósporos
de G. stearothermophilus. Os resultados evidenciaram ineficiência na descontaminação dos resíduos à 121°C na
autoclave. Não foram detalhadas condições de tempo de exposição pelo autor.

 Resultados e avaliação das frações de inativação

Esperava-se que a fração ocupada dos resíduos na autoclave poderia ser um fator de influência no tratamento e que se
houvesse variação de temperatura poderia ter região que não alcançasse a inativação desejada. Contudo, foram feitos

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testes com 1/3 e 2/3 de ocupação para observação de ocorrências na variação de temperatura entre os termopares com
relação ao preenchimento do espaço da câmara. Contatou-se pequenas variações quando comparado um termopar com
outro, de até 3°C, mais essas não foram influenciadas nem pela presença ou ausência de resíduo dentro do equipamento
(foram feitos testes com o equipamento vazio). O Gráfico 1 apresenta os testes feitos sob 121°C e tempos de exposição
de 50 e 60 min.

Gráfico 1: Variação do tempo de exposição na temperatura de 121°C nos dois testes realizados. Fonte: Autores.

Para cada condição de exposição atingida dentro da câmara da autoclave, determinaram-se as frações de inativação
microbiana conforme a equação 2. A Tabela 1 descreve as condições, a relação do número de micro-organismos
inoculados perante os sobreviventes, resultando na fração de inativação.

Tabela 1. Fração de inativação alcançada para cada condição estabelecida. Fonte: Autores.
Temperatura Tempo de exposição Pressão máxima Ninoculados (N0) Nfinal (N) Fração de
(°C) (min) atingida (kgf/cm²) inativação (%)
121 50 1,3 2,32 x 105 5,50 x 104 76,29
121 60 1,3 6,16 x 105 4,20 x 104 92,47

O tempo de exposição refere-se ao tempo de contato que a amostra ficou exposta apenas à temperatura máxima. As
frações de 76 e 92% de inativação para essas situações representou a ineficiência do tratamento nessa temperatura e
pressão absoluta de 1,3 kgf/cm² (atingida pelo equipamento utilizado neste estudo).

CONCLUSÕES
O objetivo de autoclavar o resíduo a 121°C foi para verificar se a fração de inativação seria satisfatória nas condições
mais utilizadas para esterilização de materiais e RSS do Subgrupo A1 em estabelecimentos de saúde. Por isso os testes
foram feitos apenas com tempos de contato maiores (50 e 60 minutos).

As frações de inativação para as situações estudadas representaram a ineficiência do tratamento. Não foram encontrados
trabalhos científicos que comprovem a eficiência da esterilização nessa circunstância, apesar do Ministério da Saúde
(2010) preconizar essa condição (121°C à 50 minutos) como ideal para esterilização de bolsas de sangue. Em Hossain et
al. (2012) as bactérias voltaram a se reproduzir após autoclavagem e suposta inativação. Ressalta-se que G.
stearothermophilus é gram-positiva e a presente pesquisa trabalhou com endósporos, que são mais resistentes. Acredita-
se que para cada contaminante têm-se a condição específica favorável à inativação.

Com os resultados alcançados nessa pesquisa, foi possível concluir que nessa temperatura os resíduos não são esterilizados
e também não atingem o Nível III de inativação (99,99%) preconizado por legislação como ideal para desinfecção de
RSS. As frações de inativação encontradas não foram satisfatórias nas condições mais utilizadas para esterilização de
materiais e de resíduos submetidos a tratamento prévio em estabelecimentos de saúde.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Saúde e dá outras providências. Brasília, DF.
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Dezembro de 2004 DOU de 10/12/2004. Dispõe sobre o Regulamento Técnico para o gerenciamento de resíduos de
serviços de saúde. Brasília, DF.
3. ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Ministério do Meio Ambiente e Ministério da Saúde. Manual
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Rio de Janeiro: ABNT, 2004. 71 p.
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