Document 46328 1

Diversidade
Microbiana da
Amazônia
Editores:
Oliveira, L.A.; Fernandes, O.C.; Jesus, M.A.;
Bentes, J.L.S.; Andrade, S.L.; Souza, A.Q.L.; Santos, C
Copyright © 2016, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
PRESIDENTE DA REPÚBLICA
Michel Temer
MINISTRO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, INOVAÇÕES E COMUNICAÇÕES

Gilberto Kassab
DIRETOR DO INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

Luiz Renato de França
EDITORA INPA
Editor: Mario Cohn-Haft. Produção editorial: Rodrigo Verçosa, Shirley Ribeiro Cavalcante,
Tito Fernandes. Bolsistas: Brenda Costa, Lucas Souza, Natália Nakashima, Paulo Maciel e
Sabrina Trindade.
FICHA CATALOGRÁFICA
D618 Diversidade microbiana da Amazônia /Editor L. A. Oliveira... [et.al.].--

Manaus: Editora INPA, 2016.
436.: il. color.
ISBN 978-85-211-0159-8
1. Microbiologia - Amazônia. 2. Diversidade. I. Oliveira, L. A..
CDD 576.9811
Editora do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

Av. André Araújo, 2936 – Caixa Postal 2223
Cep : 69067-375 Manaus – AM, Brasil
Fax : 55 (92) 3642-3438 Tel: 55 (92) 3643-3223
www.inpa.gov.br e-mail: [email protected]
APRESENTAÇÃO
O CDMicro - Congresso sobre Diversidade Microbiana da Amazônia – vem se consolidando ao

longo dos anos, tornando-se um referencial regional com alcance nacional e internacional na divul-
gação da microbiota amazônica.
Para que as informações apresentadas no Congresso tenham um maior alcance de divulgação, op-
tou-se, a partir do 5° Congresso realizado no final de 2014, para a elaboração de um livro, dando a
oportunidade aos autores dos trabalhos apresentados durante o evento, para transformarem suas
apresentações em capítulos do livro. Para isso, foi solicitado aos autores interessados na conversão,
para ampliarem o número de páginas e adotando-se um padrão geral de qualidade e de redação.
Esse livro é o resultado da compilação elaborada e autorizada pelos autores que se interessaram em
publicar seus trabalhos apresentados no 5° CDMicro na forma de capítulos.
A Comissão Organizadora
SUMÁRIO
Alimentos
Fazio M.L.S., Sartori N., Geromel M.R. Ação antibacteriana de ervas aromáticas........................... 1 - 6
Fazio M.L.S., Costa A.F., Almeida V.S., Geromel M.R. Qualidade microbiológica de sucos de frutas
Naturais comercializados na região de Catanduva – SP.................................................................. 7 - 13
Teixeira N.S., Galúcio V.A., Ferreira Neta A.P., Nunes A.S., Sales-Campos C. Análise físico-
química e microbiológica de resíduos de maracujá (Passiflora sp.) coletados no município de
Parintins - Amazonas.......................................................................................................................... 14 - 20
Ambiental
Bastos V.I.S., Jesus M.A., Santos Borel J.F. Some hydnoid (Basidiomycetes) mushrooms of the
Brazilian Amazon................................................................................................................................ 21 - 34
Bezerra AFM, Vasconcelos HS, Neto JFN, Sousa HM, Araújo LS, Oliveira FM, Zanotto SP, Andrade
LH, Barroso HS. Bioprospecção de fungos filamentosos isolados dos sedimentos do rio Negro para
aplicação em reações de biorremediação enantiosseletiva de cetonas................................... 35 - 40
Brito L.L., Menezes N.C., Minelli-Oliveira C., Oliveira L.A. Biodegradação de petróleo por
isolados de rizóbios provenientes de solos amazônicos............................................................... 41 - 46
Carvalho R.S., Nascimento C.C. Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff & Maubbl.
(Sphaeropsidales, Sphaeroidaceae) associada à espécie florestal Scleronema micranthum
((Ducke) Ducke, Bombacaeae) (Cardeiro) da Amazônia............................................................ 47 - 57
Cortez A.C.A., Souza J.V.B, Rocha L.C., Silva T.K.S., Sanches M.A., Freire A.K.L., Zelski S.E. Fungos
presentes em um ambiente lêntico do Município de Iranduba – Região Amazônica................. 58 - 62
Costa J. S., Atroch, E.M.A.C., Nagao, E.O. Estudos da atividade de fungicidas para o
controle do crescimento de Trichoderma sp em meio de cultura de micropropagação de
plantas................................................................................................................................................. 63 - 68
Costa T.P., Menezes N.C., Oliveira L.A. Crescimento de rizobactérias em meio de cultura
usando o mesocarpo do babaçu (Orbignya phalerata Mart) como fonte de carbono para fins
biotecnológicos................................................................................................................................. 69 - 74
Couceiro D.M., Jesus M.A. Macrofungos Agaricomycetes (Basidiomycota) não poróides da

região amazônica incorporada à Coleção de Fungos Lignocelulolíticos/INPA..................... 75 - 81
Demosthenes L.C.R., Bentes J.L.S. Respostas enzimáticas de defesa à murcha bacteriana.........82 - 87
Fernandes K.R.P., Bittencourt O.S.T., Teixeira A.F., Souza A.Q.L., Nunomura R.C.S.
Isolamento e caracterização de fungos endofíticos de Myristicaceae com potencial de atividade
antioxidante........................................................................................................................................ 88 - 93
Fonseca M.D.P., Costa C.L.S.O., Souza A.Q.L., Gibertoni T.B., Souza A.D.L., Rodrigues
M.O., Pereira J.O., Azevedo J.L. Diversidade de macrofungos da família Polyporaceae
(Basidiomycotina) no Estado do Amazonas.............................................................................. 94 - 99
Gama A.M., Silva M.S., Moraes A.B., Carvalho N.O., Nonato L.S., Spira B., Mota A.J.,
Yamane T. Isolamento de bactérias da Região Amazônica, como modelo para a recuperação de
fosfato............................................................................................................................................... 100 - 105
Gasparotto L., Pereira J.C.R. Fitopatógenos habitantes do solo na Amazônia......................... 106 - 113
Gonzaga A. D., Souza A.Q.L., Pereira J.O. Isolamento, purificação, identificação e conservação
de microrganismos associados ao jardim de fungos simbióticos das formigas cortadeiras Atta
sexdens............................................................................................................................................ 114 - 119
Lima H.D.S., Jesus M.A, Oliveira D.A.S. Avaliação da viabilidade de culturas de Paecilomyces
preservadas em óleo mineral na Coleção de Culturas de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do INPA......................................................................................................... 120 - 127
Lima J.M.S., Pereira J.O., Costa Neto P.Q., Batista I.H., Santos J.C., Araújo S.P., Pantoja
M.C., Azevedo J.L. Avaliação de fungos endofíticos e epifíticos com potencial para
produção de biossurfactantes, isolados de macrófitas aquáticas do rio Negro em Manaus,
Amazonas...................................................................................................................................... 128 - 138
Malheiros C.H., Stieven A.C.. Santos J.O., Almeida L.S., Campos D.T.S., Oliveira L.A.
Indicadores microbiológicos em diferentes sistemas de manejo do solo na Amazônia
Meridional...................................................................................................................................... 139 - 146
Marinho M. P. S., Souza, R.D.N.S., Santos, J.C., Lima, J.M.S., Pereira, J.O., Batista I. H., Ferreira
F.S. Bactérias endofíticas com potencial de degradar hidrocarbonetos, isoladas a partir de
macrófitas aquáticas, coletadas em áreas portuárias de Manaus - AM.................... 147 - 155
Menezes N.C., Oliveira L.A. Tolerância de rizóbios à acidez e ao alumínio......... 156 - 161
Moraes J.C.F.B., Rolim L.N., Sales-Campos C. Avaliação produtiva de cogumelos comestíveis

desenvolvidos pela técnica Jun-Cao........................................................................................ 162 - 168
Nogueira J.C., Maki C.S., Martins M.K. Fungos endofíticos associados à pimenta murupi (Capsicum
chinense): Isolamento, caracterização morfológica e atividade antimicrobiana........... 169 - 178
Oliveira D.A.S., Jesus M.A. Identificação e conservação de culturas Penicillium de interesse

Agrossilvicultural......................................................................................................................... 179 - 184
Oliveira F.R.; Oliveira L.A. Micro-organismos de solos amazônicos com habilidade em

degradar gasolina obtida da Refinaria de Manaus (REMAN).................................... 185 - 191
Oliveira M.R., Gama A.M., Katak R., Matos E., Terenius O., Marinotti O., Tadei, W.P., Souza
A.Q.L. Espécies de bactérias associadas a larvas de Anopheles darlingi Root, 1926, em seu
ambiente aquático........................................................................................................................ 192 - 198
Peixoto J.V.O., Minelli-Oliveira C., Brito L.L., Oliveira L A. Atividades celulolíticas, proteolíticas
e ureolíticas de rizóbios provenientes de solos amazônicos.............................................. 199 - 205
Rocha E.M., Katak R.M., Oliveira M.R., Gama A.M., Souza A.Q.L., Tadei W.P. Caracterização
morfológica de bactérias isoladas do habitat de larvas de Anopheles darlingi Root. 1926 do
município de Coari, AM........................................................................................................... 206 - 211
Santos J.C., Lima J.M.S., Telles Y.V., Araújo S.P., Costa Neto P.Q., Mota A.J.; Peixoto J.C.C., Batista
I.H., Pereira J.O. Caracterização da microbiota da rizosfera resistentes ao agrotóxico carbendazim
em culturas de coentro na Comunidade Nova Esperança em Manaus/AM........................ 212 - 220
Silva S.R.S, Silva A.S., Santiago P.A.L., Souza A.D.L., Polikarpov I., Martinez J.L., Souza, A.Q.L.
Avaliação das enzimas CMcase e xilanase de três fungos endofíticos da Amazônia, em três resíduos
agrícolas em duas diferentes condições de cultivo....................................................................... 221 - 226
Souza R.D.N., Batista I.H., Ferreira F. S., Santos J.C., Marinho, M.P.S., Araújo, S.P., Lima J.M.S.,
Pereira J.O. Atividade enzimática em fungos endofíticos isolados seletivamente de Eichhornia
crassipes coletada em área portuária de Manaus – AM.............................................................. 227 - 233
Básica
Castro C.S.P. Coleções de Microrganismos da Embrapa: De Requisitos Corporativos da Qualidade à
Acreditação..................................................................................................................................... 234 - 240
Couto F.A., Santos C., Dias E.S., Lima N., Batista L.R. Uso de marcadores fenotípicos e
bioquímicos para caracterização de isolados de Aspergillus seção Flavi............................ 241 - 250
Demosthenes L.C.R., Bentes J.L.S., Costa Neto P.Q. Variabilidade genética de Ralstonia
solanacearum utilizando marcadores AFLP............................................................................. 251 - 256
Fonseca T.R.B., Palheta R.A., Souza B.C., Marinho N.M.V., Ebinuma V.C.S., Teixeira M.F.S. Análise
de variáveis que influenciam a produção de biomassa de actinomicetos.............................. 257 - 263
Lobo I.K.C., Almeida, L.B., Souza Á., Sousa N. R., Silva G.F. Identificação molecular de fungos
filamentosos isolados dos sintomas de superbrotamento em guaranazeiro........................ 264 - 273
Marinho N.M.V., Fonseca T.R.B., Palheta R.A., Souza B.C., Ebinuma V.C.S., Teixeira M.F.S.
Variáveis que influenciam a produção de biomassa de actinomicetos................................... 274 - 280
Matos K.S., Hanada R.E., Silva G.F. Diagnóstico molecular por PCR-RFLP e gene LYS2 para identificação
de Fusarium decemcellulare........................................................................................................ 281 - 288
Oliveira L.A., Cortez A.C.A., Souza J.V.B.. Avaliação de metodologias de preservação para manutenção
de microrganismos do Filo Ascomycota e leveduras do gênero Candida pertencentes à Coleção de
Microrganismos de Interesse Médico do INPA........................................................................ 289 - 294
Oliveira L.A., Cortez A.C.A., Souza J.V.B. Identificação de espécies do gênero Candida mantidas na
Coleção de Microrganismos de Interesse Médico do INPA.................................................. 295 - 300
Queiroz C.Á., Silva A.F., Cruz J.C., Silva G.F., Sousa N.R., Matos K.S., Hanada R.E. Caracterização de
Fusarium decemcellulare isolado de guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis) por meio de ERIC-
PCR....................................................................................................................................... ......... 301 - 309
Silva M.S., Gama A.M., Moraes A.B., Nonato L.S., Carvalho N.O., Spira B., Yamane T., Mota J.
Minipreparação de múltiplas amostras para extração de DNA total bacteriano em microplacas
de 96 poços.................................................................................................................................. 310 - 315
Siqueira V.K.S., Matos K.S., Hanada R.E., Gualberto G.F., Silva G.F. Primers específicos para a
determinação de MAT-1 em Fusarium decemcellulare........................................................ 316 - 321
Industrial
Araújo C.O.M., Silva L.M., Lima A.K.S., Torres D.R., Silva J.C., Fernandes O.C.C. Produção
de proteases por Aspergillus spp estocados na Coleção de Fungos da Amazônia - CFAM do
Instituto Leônidas e Maria Deane............................................................................................ 322 - 329
Lima A.K.O., Taube Júnior P.S. Bactérias lácticas e sua importância na indústria de alimentos e
saúde: Uma revisão..................................................................................................................... 330 - 335
Lima A.K.S., Torres D.R., Fernandes O.C.C., Silva J.C., Mendes L., Araújo C.P.M. Enzimas
extracelulares de Aspergillus e Penicillium conservados na Coleção de Fungos da Amazônia-
CFAM............................................................................................................................................. 336 - 341
Maciel M.J.M., Farias J.A., Silva I.R., Souza F.R.F., Procópio R.E.L. Produção de etanol a partir
de meio de cultura hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar............................................. 342 - 348
Martim S.R., Silva T.A., Teixeira L.S., Cruz-Filho R.F., Fonseca T.R.B., Marinho N.M.V.,
Santos-Ebinuma V., Teixeira M.F.S. Produção e extração de proteases por fermentação
extrativa.......................................................................................................................................... 349 - 354
Martim S.R., Silva L.S.C., Machado A.R.G., Teixeira R.A., Santos-Ebinuma V.C., Cruz-Filho
R.F., Teixeira M.F.S. Extração líquido-líquido de proteases de Pleurotus albidus (DPUA 1692)
empregando sistema de duas fases aquosas (peg-fosfato)................................................ 355 - 360
Silva L.S.C., Machado A.R.G., Martim S., Teixeira R.A., Cruz Filho R.F., Teixeira M.F.S.
Comparação entre processos de fermentação na produção de enzimas por cogumelos
comestíveis.............................................................................................................................. 361 - 365
Souza R.A.T.; Fonseca, T.R.B., Silva L.S.C., Teixeira M.F.S. Atividade proteolítica dos extratos
aquosos de biocompósitos formulados com cogumelos comestíveis utilizando como matriz
casca de abacaxi........................................................................................................................ 366 - 371
Verçosa J.V.M., Neiva M., Carmo E.J., Asfolfi Filho S. Clonagem e expressão do um inibidor de
fosfolipase A.............................................................................................................................. 372 - 381
Médica
Banhos E.F., Souza A.Q.L., Lima G.A., Souza A.F., Souza A.D.L. Avaliação da atividade
anticandida de extratos de fungos do gênero Pestalotiopsis spp. isolados de ambientes
amazônicos................................................................................................................................... 382 - 387
Brelaz E.C.D.O., Teixeira N.S., Galúcio V.C.A., Nunes A.S., Sales-Campos C.

Pesquisa de endoparasitas em bovinos abatidos no matadouro municipal de Parintins,
Amazonas..................................................................................................................................... 388 - 395
Couto F.M.M., Andrade S.L., Buonafina M.D.S., Leal A.F.G., Magalhães O.M.C., Vasconcelos
F.M.T.S., Santos F.A.G., Neves R.P. Candidemia em Unidades de Terapia Intensiva: Diagnóstico
e avaliação da capacidade de aderência e formação de biofilme................................. 396 - 402
Cunha G.S., Pimenta L.A., Oliveira A.D., Pio C.H.S., Andrade S.L. Fatores de risco para o
desenvolvimento de fungemia em pacientes de Unidade de Terapia Intensiva em hospital terciário
de Manaus................................................................................................................................... 403 - 408
Jensen B.B., Comandolli-Wyrepkowski C.D., Santos P.A., Barros A.M.C., Soares F.V., Pinheiro
F.G., Domingos P.R.C., Naiff M.F., Franco A.M.R. Avaliação das formulações contendo
extrato metanólico de Libidibia ferrea contra infecção causada por Leishmania (Leishmania)
amazonensis................................................................................................................................... 409 - 416
Matsuda J.S., Wanke B., Assumpção I.A., Balieiro A.A.S., Santos C.S.S., R.C.S., Muniz M.M.,
D.R., Martinez-Espinosa F.E., Souza J.V.B. Aspergilose pulmonar em pacientes de tuberculose
pulmonar com baciloscopia negativa. Manaus, Amazonas............................................... 417 - 426
Melo E.D., Tibery Espir T., Guerreiro T.S.B., Figueira L., Naiff M., Costa A.G., Malheiro
A., Franco AMR. Perfil de citocinas TH1 e TH2 em pacientes com Leishmania (Viannia)
guyanensis no Norte do Brasil............................................................................................ 427 - 436
Oliveira, L.A.; Fernandes, O.C.; Jesus, M.A.; Bentes, J.L.S.;
Andrade, S.L.; Souza, A.Q.L.; Santos, C.
Diversidade Microbiana da Amazônia 2015. Editora INPA.
Ação antibacteriana de ervas aromáticas
Fazio M.L.S1., Sartori N.1, Geromel M.R.1
1
Instituto Municipal de Ensino Superior - IMES Catanduva | 17 – 35312200 Avenida Daniel
Dalto s/n – Caixa Postal: 86 - 15.800-970 - Catanduva-SP. Emails: [email protected],
[email protected], [email protected]
Resumo
Diversas espécies vegetais têm sido usadas pelas características antimicrobianas, através
de compostos sintetizados pelo metabolismo secundário da planta, como é o caso dos
compostos fenólicos. Estes apresentam ação inespecífica sobre micro-organismos,
rompendo a parede celular bacteriana, inibindo os sistemas enzimáticos para a formação
da mesma. Considerando os aspectos mencionados o objetivo do presente trabalho foi
avaliar a atividade antibacteriana de algumas ervas aromáticas empregando-se o método
de difusão em gel de ágar. Os extratos que apresentaram ação antimicrobiana
significativa (halos iguais ou superiores a 10 mm) foram utilizados em testes posteriores
para verificar até qual diluição (10-2, 10-3 e 10-4) a atividade estava presente. Verificou-
se que a atividade antibacteriana dos extratos aquosos de hortelã e manjerona foram
superiores; e a ação antimicrobiana foi constatada apenas para a primeira diluição.
Concluiu-se que a hortelã e manjerona apresentaram maior eficácia sobre as bactérias
testadas.
Palavras-chave: antibacteriana, ervas aromáticas, hortelã, manjerona
Introdução
Muitas vezes oriundos de regiões banhadas pelos oceanos Índico e Pacífico,

chegando à casa de Imperadores e famílias modestas, os condimentos vegetais foram
1
adquirindo importância, tornando-se indispensáveis à vida destes povos, seja por
ligação em rituais, por sua utilização como temperos de alimentos ou mesmo em
medicina. As ervas são utilizadas desde os tempos mais antigos, fazendo parte da
cultura de seu país. Cada cidade, região, país, dependem das culturas e dos costumes,
tendo assim hábitos diferentes. Uma cultura pode caracterizar o alimento como forma
de saciar a fome ou como fonte de prazer e oportunidade social. A família, igreja e a
escola passam a prática da cultura de geração para geração, sendo assim cada pessoa
consome o alimento baseado no guia cultural (Medved, 1981).
As ervas possuem níveis distintos de atividade biológica sendo, porém, efetivas
contra micro-organismos em distintas concentrações. Diversas espécies vegetais têm
sido usadas pelas características antimicrobianas, através de compostos sintetizados pelo
metabolismo secundário da planta, como é o caso dos compostos fenólicos. Estes
apresentam ação inespecífica sobre micro-organismos, rompendo a parede celular
bacteriana, inibindo os sistemas enzimáticos para a formação da mesma (Nascimento et
al., 2000).
Existe um interesse particular na descoberta e emprego de novos agentes
antimicrobianos, fato ligado ao alarmante aumento de microrganismos resistentes aos
antibióticos normalmente utilizados (Souza; Lima; Narain, 2003). Considerando os
aspectos mencionados o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade
antibacteriana de algumas ervas aromáticas.
Material e Métodos
Empregou-se o método de difusão em gel de ágar. Foram utilizados extratos

aquosos de diferentes ervas aromáticas in natura. No laboratório cada amostra recebeu
uma identificação, alecrim (Rosmarinus officinalis L.), cebolinha (Allium
schoenoprasum L.), coentro (Coriandrum sativum L.), hortelã (Mentha spicata L.),
manjericão (Ocimum basilicum L.), manjerona (Origanum majorana L.) e salsa
(Petroselinum sativum Hoffm.). A seguir, assepticamente 10 g da mesma foram
colocados em um frasco de Erlenmeyer contendo 90 mL de água destilada estéril sendo
homogeneizados posteriormente e submetidos a banho em água fervente por 30
minutos. Em seguida a amostra foi filtrada em recipientes de vidro estéreis e a solução
obtida resfriada à temperatura ambiente. Os discos, de papel filtro de 6 mm de diâmetro,
2
próprios para antibiograma foram adicionados à solução, sendo a mesma mantida no
agitador por 30 minutos.
Os microrganismos, Bacillus cereus, Bacillus subtilis (ATCC 6633), Salmonella
typhimurium (ATCC 14028), Salmonella enteritidis e Staphylococcus aureus (ATCC
22923), previamente semeados em Caldo Nutriente e incubados a 35°C por 24 horas,
foram semeados na superfície de placas de Petri contendo Ágar Nutriente. As análises
foram realizadas em duplicata. Na seqüência, discos de antibiograma saturados com a
solução foram colocados no centro de cada placa; sendo as mesmas incubadas a 35°C
por 24 e 48 horas. Após este período foi possível observar e medir o halo de inibição.
Halos iguais ou superiores a 10 mm foram considerados significativos de atividade
antimicrobiana, conforme Hoffmann et al. (1999). Os extratos aquosos que
apresentaram atividade antibacteriana significativa foram novamente testados com as
diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4, para verificar até qual diluição a ação antibacteriana era
observada.
Resultados e Discussão
Os resultados obtidos em 48 horas (Tabela 1) demonstraram que a ação

antibacteriana do extrato aquoso de hortelã (Mentha spicata L.) e o de manjerona
(Origanum majorana L.) apresentaram atividade antimicrobiana significativa, sendo tal
desempenho observado com relação às bactérias S. Enteritidis e S. Typhimurium,
respectivamente. Observou-se o halo de inibição de 10 mm do extrato aquoso de
manjerona sobre S. Typhimurium; resultado superior (20 mm) foi observado por outros
pesquisadores ao testarem o óleo essencial da mesma erva (Ernandes e Garcia-Cruz,
2008). De acordo com o trabalho apresentado por Busatta et al. (2008), o principal
componente do óleo essencial de manjerona é o terpeneno_4_ol (30,41%).
O potencial antimicrobiano da hortelã sobre outros micro-organismos
(Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas fluorescens) também foi observado em
pesquisa realizada por Tyagi e Malik (2011). Em trabalho realizado por Chauhan et al.
(2009), verificou-se que o principal componente do óleo essencial de hortelã é o
“Carvone”, variando entre 49,62% e 76,65%, sendo tais substâncias, provavelmente,
responsáveis pela ação antimicrobiana observada. A partir dos resultados apresentados
na Tabela 2 verificou-se que a atividade antimicrobiana não foi significativa para
diluições 10-2, 10-3 e 10-4 (halo menor que 10 mm).
3
Conclusão
Os estratos aquosos hortelã e manjerona apresentaram maior eficácia sobre as
bactérias testadas.
Referências
Busatta C. et al (2008) Application of Origanum majorana L. essential oil as an

antimicrobial agent in sausage. Food Microbiology: 207-211.
Chauhan MK et al (2009) Chemical composition of essential oils in Mentha spicata L.

accession [ IIIM(J)26] from North-West Himalayan region, India. Industrial Crops and
Products29: 654-656.
Ernandes FMPG, Garcia-Cruz CH (2008) Atividade Antimicrobiana de Extrato de

algumas plantas comumente consumidas no Brasil. Higiene Alimentar22.
Hoffmann FL, Souza SJF, Garcia-Cruz CH, Vinturim TM, Dutra AL (1999)
Determinação da atividade antimicrobiana “in vitro” de quatro óleos essenciais de
condimentos e especiarias. Boletim CEPPA7: 11-20.
Medved E (1981) The world of food. Ed. Ginn and Company, Lexington.
Nascimento GGF et al. (2000). Antibacterial activity of plant extracts and

phytichemicals on antibiotic-resistant bacteria. Braz. J. Microbiol. 31:1-15.
Souza EL, Lima EO, Narain N (2003) Especiarias: uma alternativa para o controle de
qualidade sanitárias e de vida útil de alimentos, frente às novas perspectivas da indústria
alimentícias. Revista Higiene Alimentar17: 38-42.
Tyagi AK, Malik A (2011) Antimicrobial potential and chemical composition of

Mentha piperita oil in liquid and vapour phase against food spoiling microorganisms.
Food Control22: 1707-1714.
4
Tabela 1 - Determinação da atividade antibacteriana de extratos aquosos de alecrim,
cebolinha, coentro, hortelã, manjericão, manjerona e salsa, impregnados em discos de
papel filtro de 6 mm de diâmetro; incubação a 35 °C / 24 horas; expressa como halo de
inibição em mm.
Ervas Alecrim Cebolinha Coentro Horte Manjer Manjeri Salsa
aromáti (Rosmari (Allium (Coriand lã ona cão (Petro
cas/ nus schoenopra rum (Ment (Origan Ocimum se-
Micro- officinali sum L.) sativum ha um basilicu linum
organis s L.) L.) spicat majoran m L.) sativu
mos a L.) a L.) m
Hoff
m.)
B. cereus - - - 6 8 - -
B. - - - - - - -
subtilis
S. aureus - - - 6 - - -
S. 6 8 - 10 - 8 8
enteritidi
s
S. 5 8 - 5 10 9 9
typhimur
ium
Após 48 horas os resultados não apresentaram alterações.
Tabela 2 - Determinação da atividade antibacteriana de extratos aquosos de hortelã e

manjerona sobre Salmonella Enteritidis e Salmonella typhimurium, respectivamente;
impregnados em discos de papel filtro de 6 mm de diâmetro; incubação a 35 °C / 24
horas; expressa como halo de inibição em mm.
5
Hortelã Manjerona
Ervas aromáticas / (Mentha spicata L.) (Origanum majorana L.)
Microorganismos
10-1 10-2 10-3 10-4 10-1 10-2 10-3 10-4
Salmonella 10 7 6 -
enteritidis
Salmonella 10 6 -
typhimurium 6
Após 48 horas os resultados se mantiveram.
6
Oliveira, L.A.; Fernandes, O.C.; Jesus, M.A.;Bentes, J.L.S.;
Qualidade Microbiológica de Sucos de Frutas Naturais

Comercializados na Região de Catanduva – SP
FazioM.L.S.1, Costa A.F.1, Almeida V.S.1, Geromel M.R.1
1
Instituto Municipal de Ensino Superior - IMES Catanduva | 17 – 35312200 Avenida Daniel
Dalto s/n – Caixa Postal: 86 - CEP 15.800-970 Catanduva-SP - Emails: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
Na vida atribulada que vivemos atualmente os hábitos alimentares da sociedade têm
sofrido grandes mudanças. Hoje em dia, devido ao fato de ambos os pais trabalharem, é
muito comum as crianças frequentarem desde muito cedo, creches ou escolas de
educação infantil em tempo integral. Neste contexto, pais e filhos são obrigados a
tomarem duas ou mais refeições fora de casa. Apesar das opções não serem
recomendadas como saudáveis, há sempre a possibilidade de acompanhar com sucos
naturais, trocando as calorias de um refrigerante pelas propriedades nutricionais da
bebida natural extraída das frutas. O objetivo do estudo foi avaliar a qualidade
higiênico-sanitária e microbiológica de sucos in natura sabores abacaxi, acerola, goiaba,
laranja, limão, maracujá, melancia, melão, morango e tamarindo comercializados na
região de Catanduva-SP. As análises microbiológicas consistiram na investigação da
presença de Salmonella spp. e Número Mais Provável de coliformes totais e
termotolerantes. Os resultados revelaram que todas as amostras estavam de acordo com
o padrão federal vigente, sendo, portanto classificadas como produtos em condições
sanitárias satisfatórias e, por conseguinte produtos próprios para o consumo humano.
Palavras-chave: qualidade microbiológica, suco in natura
7
Introdução
Na vida atribulada que vivemos atualmente os hábitos alimentares da sociedade

têm sofrido grandes mudanças. Hoje em dia, devido ao fato de ambos os pais
trabalharem, é muito comum as crianças frequentarem desde muito cedo, creches ou
escolas de educação infantil em tempo integral. Neste contexto, pais e filhos são
obrigados a tomarem duas ou mais refeições fora de casa. Apesar das opções não serem
recomendadas como saudáveis, há sempre a possibilidade de acompanhar com sucos
naturais, trocando as calorias de um refrigerante pelas propriedades nutricionais da
bebida natural extraída das frutas (Canesqui e Garcia, 2005).
Os sucos de frutas são consumidos e apreciados em todo o mundo, não só pelo
seu sabor, mas, também, por serem fontes naturais de carboidratos, carotenóides,
vitaminas, minerais e outros componentes importantes (Pinheiro et al., 2006). Porém, a
manipulação inadequada dos produtos e utensílios no preparo dos sucos, acarreta na
contaminação do alimento, tornando-o impróprio para consumo. De acordo com o
mencionado, esta pesquisa apresentou como objetivo avaliar a qualidade microbiológica
de sucos naturais comercializados na região de Catanduva-SP, por meio de métodos
reconhecidos mundialmente.
Material e Métodos
Foram adquiridas e analisadas dez diferentes amostras de sucos naturais prontos
para o consumo, sendo estes de diferentes frutas (abacaxi, acerola, goiaba, laranja,
limão, maracujá, melancia, melão, morango e tamarindo). As mesmas foram
transportadas ao Laboratório Multidisciplinar do Instituto Municipal de Ensino Superior
de Catanduva e estocadas sob refrigeração (Silva et al., 2010). Cada amostra recebeu
um número de identificação e assepticamente, 10 ml da mesma foram colocadas em um
Erlenmeyer contendo 90 ml de água destilada estéril, sendo homogeneizados
posteriormente (diluição 10-1). A partir desta foram realizadas as demais diluições
decimais seriadas até 10-3 utilizando-se o mesmo diluente. As três diluições obtidas
foram usadas, conforme necessárias, nas análises subsequentes (Silva et al., 2010). As
amostras foram submetidas às seguintes análises: Determinação do Número Mais
Provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes e, pesquisa de Escherichia coli e
Salmonella spp.
8
Determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais
Foram inoculados volumes de 1 ml das diluições 10-1 a 10-3 em três séries de
tubos, contendo 9 ml de Caldo Lauril Sulfato (CLS) com tubo de Durhan invertido, e
incubados a 35o C durante 24-28 horas para teste presuntivo e, considerados positivos os
que apresentaram gás no interior do tubo de Durhan.
Para o teste confirmativo, com o auxílio de uma alça de platina, foi inoculada
uma alçada dos tubos positivos de CLS pata tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile
2% (VB), incubados às mesmas condições anteriores, sendo a positividade verificada
também para os que apresentam gás, e determinado o NMP/g de coliformes totais com o
auxílio da tabela do NMP (Silva et al., 2010).
Determinação do NMP de coliformes termotolerantes

A partir dos tubos de CLS positivos, inóculos foram transferidos por meio de
alçadas para tubos contendo Caldo Escherichia coli (EC), com tubo de Durhan
invertido, sendo incubados a 44, 50 C durante 24 horas. O cálculo do NMP/g de
coliformes termotolerantes foi determinado utilizando-se a tabela do NMP (Silva et al.,
2010).
Pesquisa de E. coli
A partir dos tubos contendo caldo EC, usados na quantificação de coliformes
fecais que apresentam turvação, com ou sem gás no interior do tubo de Durhan, foram
semeadas placas de Petri contendo Ágar Levine Eosina Azul de Metileno (L-EMB)
para o isolamento de E. coli, sendo incubadas a 35o C durante 24 horas.
Colônias típicas, pequenas, com centro negro e bordas claras, brilho verde-
metálico à luz refletida, bem como as atípicas, foram confirmadas por coloração de
Gram (bastonetes Gram-negativos). Posteriormente, foram repicadas em tubos contendo
Ágar Padrão para Contagem (PCA) inclinado, sendo incubadas às mesmas condições.
Após este período, procedeu-se à identificação por meio de testes bioquímicos:

Indol, Vermelho de Metila (VM), Voges-Proskauer (VP) e Citrato (IMVIC), com
incubação por 35o C durante 48 horas, exceto para Citrato, incubado por 96 horas.
Para a prova de indol foram pipetados 5 ml de Caldo Triptona 1%, sendo na

leitura adicionadas de duas a quatro gotas do reagente de Kovacs. No teste de vermelho
9
de metila foi pipetado 1 ml da cultura, adicionando-se cinco gotas de solução de
vermelho de metila.
Para a prova de Voges-Proskauer foram pipetados 5 ml da cultura, sendo

adicionados 0,6 ml de solução α-naftol e 0,2 ml de hidróxido de potásio a 40%.
Posteriormente foi verificado o desenvolvimento característico, citrato (-); VP (-); indol
(+/-) (Silva et al., 2010).
Pesquisa de Salmonella spp.

Em 225 ml de Caldo Lactosado (CL) foram homogeneizados, respectivamente
25 ml de cada amostra. Após a incubação a 35o C por 24 horas, 1 ml de cada cultivo foi
transferido para tubos de ensaio contendo 10 ml de Caldo Rappaport-Vassiliadis
Modificado (RV), incubados a 35º C. Após 24 horas foram feitas semeaduras em placas
de Petri contendo Salmonella Shigella Ágar (SSA) e Ágar Verde Brilhante (BG),
incubados às mesmas condições.
As colônias suspeitas em SSA, pequenas, cremes, com ou sem centro negro, e

em BG, pequenas e avermelhadas, bem como as atípicas, foram transferidas com o
auxílio de uma alça de platina para tubos de ensaio contendo Ágar Tríplice Açúcar
Ferro (TSI) e Ágar Lisina Ferro (LIA), incubados às mesmas condições e,
posteriormente, submetidas a teste sorológico a partir dos tubos com características
bioquímicas compatíveis e não compatíveis. Para este, duas gotas de solução salina
0,85% estéril foram colocadas nas extremidades de uma lâmina. Uma alçada do micro-
organismo típico ou atípico foi transferida para cada extremidade e homogeneizada com
a solução salina, sendo acrescentada uma gota do soro somático polivalente anti-
Salmonella sobre uma das gotas.
A leitura foi realizada após dois minutos de movimentos de inclinação e rotação

da lâmina. A ausência de aglutinação das misturas classifica a reação como negativa e a
positividade é constatada pela aglutinação da gota com o anti-soro (Silva et al., 2010).
Nenhuma amostra apresentou coliformes totais e termotolerantes, o que é

considerado um fator favorável, visto que, de acordo com o estudo de Correa Neto e
10
Faria (1999) sobre sucos as temperaturas em torno de 90°C, normalmente empregadas
no tratamento térmico para a preservação do suco, podem não ser suficientes para
inativar fungos termorresistentes. No entanto, temperaturas mais elevadas afetam as
características físico químicas dos sucos e, portanto, o controle da deterioração por
fungos termorresistentes baseia-se fundamentalmente na adoção de práticas higiênico-
sanitárias adequadas, visando diminuir a possibilidade de contaminação das matérias-
primas.
Tabela 1. Apresentação dos resultados obtidos após diferentes análises microbiológicas.

Amostras Coliformes Coliformes Escherichia Salmonella spp
Totais Termotolerantes coli
(-/+)
(NMP/mL) (NMP/mL) (confirmativo)
Abacaxi <3 <3 Negativo -
Acerola <3 <3 Negativo -
Goiaba <3 <3 Negativo -
Laranja <3 <3 Negativo -
Limão <3 <3 Negativo -
Maracujá <3 <3 Negativo -
Melancia <3 <3 Negativo -
Melão <3 <3 Negativo -
Morango <3 <3 Negativo -
Tamarindo <3 <3 Negativo -
Padrão Federal 102 Ausência em 25
(BRASIL, 2001) mL
Caso houvesse a presença dos mesmos seria um fator preocupante, pois os

microorganismos indicadores são grupos ou espécies que, quando presentes em um
alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação fecal, sobre
a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial de um alimento,
além de poder indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento,
produção ou armazenamento. (Garcia et al., 2012).
Com relação à Salmonella spp. Observou-se uma situação semelhante, obtendo-

se 100% de amostras com resultado negativo. O que difere da pesquisa realizada por
11
Garcia et al. (2012) em Juazeiro do Norte-CE, também com sucos “in natura”, quando
afirma que no tocante aos testes de Salmonella, verificou-se presença deste
microrganismo em 100% das amostras analisadas, estando em desacordo com o
especificado pela legislação brasileira que estabelece ausência em 25 mL.
A presença de Salmonella nas amostras analisadas constitui-se de riscos a saúde

do consumidor. Ações para o controle de qualidade dos sucos de frutas in natura
comercializados no mercado ambulante da cidade de Juazeiro do Norte-CE tornam-se
necessárias, dentre as quais se destacam o treinamento do pessoal envolvido na
produção dos sucos e monitoramento das condições dos manipuladores. (Garcia et al.,
2012).
Conclusão
De acordo com as avaliações realizadas e com base na legislação verificou-se

que 100% das amostras encontravam-se em acordo com o padrão federal vigente para
coliformes termotolerantes e Salmonella spp., podendo ser classificadas como “produtos
em condições sanitárias satisfatórias” e, portanto “produtos próprios para o consumo
humano.
Referências
BRASIL, Ministério da Saúde. RDC nº12, de 2 de janeiro de 2001. Regulamento

técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos. Diário Oficial [da República
Federativa do Brasil], Brasília, DF, 20 dez. 2001. Seção 1.
Canesqui AM, Garcia RWD (2005) Antropologia e Nutrição: um diálogo possível.

Fiocruz, Rio de Janeiro.
Correa Neto RS, Faria JA (1999) Fatores que influem na qualidade do suco de laranja.
http://www.educadores.diaadia.pr.gov.br/arquivos/File/2010/veiculos_de_comunicacao/
CTA/VOL19N1/CTA19N1_24.PDF
Garcia R, Santos D, Oliveira EN, Josino AS, Mori E (2012) Qualidade microbiológica
de sucos in natura comercializados na cidade de Juazeiro do Norte-CE. Revista
Brasileira de Tecnologia Agroindustrial.
12
Pinheiro AM, Fernandes AE, Prado G, Sousa PH, Maia GA (2006) Avaliação química,
físico-química e microbiológica de sucos de frutas integrais: abacaxi, caju e maracujá.
Scielo. http://www.scielo.br/pdf/cta/v26n1/28856.pdf
Silva N, Junqueira VCA, Silveira NFA, Taniwaki MH, Santos RFS, Gomes RAR
(2010) Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. Varela, São
Paulo.
13
Análise físico-química e microbiológica de resíduos de maracujá (Passiflora

sp.) coletados no município de Parintins - Amazonas
Teixeira N.S.1, Galúcio V.A.1, Ferreira Neta A.P.1, Nunes A.S.1 e Sales-Campos C.2
1
Universidade Federal do Amazonas – UFAM
2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA,
Emails: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected] [email protected]
Resumo
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e é líder na produção de frutas

tropicais. No entanto, o processamento dessas frutas gera um grande volume de resíduos
resultando em problemas econômicos e sérios danos ao meio ambiente. O município de
Parintins é uma área produtora de frutos amazônicos, consumidos em larga escala pela
população em geral e na merenda escolar com distribuição local pela agricultura familiar,
gerando grande quantidade de resíduos no processamento artesanal das frutas. Com o objetivo
de pesquisar a viabilidade do aproveitamento destes resíduos para a produção de alimentos
que possam ser incorporados na alimentação humana e animal, realizou-se análises físico-
químicas que demonstraram que muitas características das frutas in natura são semelhantes
em resíduos e análises microbiológicas evidenciaram a necessidades de controles rígidos
quanto às condições higiênico-sanitárias de resíduos que se pretende aproveitar para geração
de produto de valor agregado.
Palavras-Chave: aproveitamento de resíduos; frutas amazônicas; coliformes; valor

nutricional.
Introdução
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e é líder na produção de frutas

tropicais (FAO, 2013), chegando a aproximadamente 44 milhões de toneladas de frutos por
ano (IBGE, 2012). O seu mercado interno de suco de frutas tem apresentado um grande
crescimento, acompanhando a expansão da agroindústria para o processamento destas frutas.
No entanto, o grande volume de resíduos gerados pode se tornar um problema, trazendo entre
outros problemas econômicos, sérios danos ao meio ambiente. No entanto, o processamento
dessas frutas gera um grande volume de resíduos resultando em problemas econômicos e
sérios danos ao meio ambiente.
14
O município de Parintins, situado a 400 Km de Manaus – AM, é uma área produtora
de frutos amazônicos, consumidos em larga escala pela população em geral e na merenda
escolar com distribuição local pela agricultura familiar, principalmente na forma de suco,
gerando grande quantidade de resíduos no processamento artesanal das frutas.
Os principais resíduos gerados no processamento possuem em sua composição
vitaminas, minerais, fibras, compostos antioxidantes, entre outros, importantes para um bom
desempenho das funções fisiológicas. Muitos desses resíduos se perdem ou não são utilizados
adequadamente, em função do desconhecimento de suas potencialidades, valor nutritivo e
deficiências que devem ser corrigidas para sua melhor utilização. Cascas e sementes de
maracujá (Passiflora sp.), resíduos estes provenientes do processo de obtenção do suco,
atualmente, são utilizadas por produtores rurais na alimentação animal, ainda sem muita
informação técnica adequada. Como este volume representa inúmeras toneladas, agregar valor
a estes subprodutos é de interesse econômico, cientifico e tecnológico.
A casca de maracujá tem merecido destaque por ser um produto rico em pectina,
niacina, ferro, cálcio e fósforo, sendo aceita na elaboração de diversos produtos (Córdova et
al., 2005). Porém existem outras características importantes que influenciam no
aproveitamento destes resíduos, entre elas os parâmetros físico-químicos, como pH, sólidos
solúveis, umidade e matéria-seca. Além de condições sanitárias satisfatórias, facilmente
observadas através de análises microbiológicas para a pesquisa de microrganismos
patogênicos, principalmente a presença de coliformes fecais.
Surge, então, a necessidade de estudos visando o aproveitamento desses resíduos a
produção de alimentos que possam ser incorporados na alimentação humana e animal, uma
vez que as maiores quantidades de vitaminas e sais minerais de muitos alimentos se
concentram nas cascas de frutas e legumes.
Diante do exposto e do potencial biotecnológico eminente, foram avaliadas as
características físico-químicas e microbiológicas de resíduo de maracujá (casca) oriundo da
agricultura familiar do município de Parintins – AM, para o aproveitamento na indústria
alimentícia.
Material e métodos
Os resíduos foram coletados na sede da agricultura familiar de Parintins/AM, no

período de 18 a 29 de agosto de 2014, totalizando 10 kg de casca de maracujá. No preparo, os
resíduos foram levados ao Laboratório de Nutrição Animal do ICSEZ – Parintins/AM para
15
serem triturados e secos para a realização das análises descritas a seguir.
-pH: Alíquotas de 10 gramas da amostra triturada foram adicionadas em 90 mL de água
destilada, em triplicata (Skrbic e Filipcev, 2008). Cada suspensão foi submetida à agitação por
cinco minutos e, após sedimentação, realizou-se a leitura em potenciômetro digital portátil
KASVI – K390014P, previamente calibrado.
-Sólidos solúveis: Com o uso de refratômetro portátil Instrutherm RTB-300 foram medidos os
índices de refração da solução de açúcar contido nos resíduos analisados, onde 10 gramas
destes foram homogeneizados em 100 mL de água destilada e os resultados expressos em
ºBrix (Carvalho et al., 2002).
-Teor de umidade e matéria seca: Foi determinado pelo método de secagem das amostras até
peso constante, em estufa a 105°C, seguindo a metodologia descrita pelo Instituto Adolfo
Lutz (1985). A umidade foi expressa em % e a massa seca foi calculada como sendo MS%=
100 – U.
-Cinzas: Foram determinadas após completa carbonização em incineração e calcinação das
amostras em forno mufla a 550°C, obtendo-se um resíduo isento de carvão, com coloração
branca acinzentada (Instituto Adolfo Lutz, 1985), sendo os resultados expressos em %.
-Extrato Etéreo: A determinação de lipídios foi realizada a partir de extração contínua em
Aparelho tipo Soxhlet, tendo o éter de petróleo como solvente de extração, a gordura extraída
foi calculada por diferença de pesagem.
-Análise Microbiológica: Foi realizado a contagem padrão de Coliformes Totais e
Termotolerantes, através da Técnica de Tubos Múltiplos e os resultados foram dados em
Número Mais Provável (NMP) e pesquisa de Salmonella sp., sendo os resultados expressos
em Unidade Formadora de Colônia (UFC), segundo o Método da American Public Health
Association (APHA) descrito em A.O.A.C. (2012). As análises foram realizadas de acordo
com a legislação determinada pela ANVISA sobre padrões microbiológicos – RDC nº12
(BRASIL, 2001). Inicialmente, como padrão para amostras sólidas, foram realizadas duas
diluições, sendo a primeira 1:50 (10 gramas de amostra em 490 mL de água destilada) e a
segunda 1:10 (25 mL da primeira diluição em 225 mL de água peptonada a 0,1%). A partir
desta segunda diluição, considerada 10-1, foram preparadas diluições decimais sucessivas,
pela transferência de 1 mL da diluição anterior em 9 mL de diluente água peptonada a 0,1%,
até 10-3. Essas diluições foram utilizadas para a determinação dos microrganismos em meios
de cultura vertidos em tubos de ensaio com tubos de Durhan invertidos em seu interior. Sendo
utilizados os seguintes meios de cultura, Caldo Lauryl e Caldo EC para o crescimento de
coliformes totais e Escherichia coli e Caldo SC (Selenito de Cistina) para Salmonella sp.
16
Após a inoculação, os tubos foram encubados em estufa bacteriológica a 35ºC por 3 dias, a
leitura foi realizada a cada 24 horas para a observação de produção de gás e turvação do meio.
Após este período, alíquotas de 100 µL retiradas dos tubos contendo Caldo SC foram
adicionas em placas de Petri, em triplicata, contendo os meios TSI (Triple Sugar Iron Agar),
XLT4 e BVB (Agar Verde Brilhante modificado), incubadas a 35ºC por 3 dias para a
confirmação da presença de Salmonella sp. A identificação das colônias foi feita de acordo
com as características morfológicas descritas pelo fabricante de cada meio específico, baseado
na cor, aspecto e alteração do meio pelo crescimento de colônias características. Os resultados
das análises foram avaliados segundo a Instrução Normativa nº 7, de 5 de abril de 1999, da
Secretaria de Desenvolvimento Rural do Ministério da Agricultura e do Abastecimento
(Brasil, 1999), que preconiza os padrões para polpa de frutas, pois não há legislação
específica para análise de resíduos de frutas.
Resultados e discussão
Os resíduos in natura possuíam aroma característico, sendo composto apenas de casca

de maracujá. Foram realizadas análises físico-químicas destes resíduos para avaliar
características nutricionais fundamentais para o aproveitamento dos mesmos em produtos de
valor agregado para alimentação humana ou animal. Os resultados das análises físico-
químicas estão descritos na Tabela 01, sendo relevantes para avaliar características
nutricionais fundamentais para o aproveitamento dos resíduos coletados, transformando-os
em produtos de valor agregado para alimentação humana ou animal.
Tabela 01: Resultado das análises físico-químicas e nutricionais de amostras de resíduos

agroindustriais.
Sólidos Matéria Matéria Extrato
pH Solúveis Umidade Seca Mineral Etéreo
Resíduo (º BRIX) (MS) (MM) (EE)
(%) (%) (%) (%)
Maracujá
4,33 0,5 87,64 12,36 5,07 0,60
(Casca)
As análises físico-químicas realizadas demonstraram que importantes características

da fruta in natura são mantidas em outras partes como a casca, objetivo desta pesquisa. Um
exemplo, foi a acidez da fruta sendo mantida na casca que apresentou pH 4,33, sendo este um
17
fator de fundamental importância na limitação dos diferentes microrganismos capazes de se
desenvolver no alimento (Hoffmann, 2001).
A umidade é uma característica importante que interfere na coloração e sabor das
frutas (Souza et al., 2008). Quanto ao resíduo da casca do maracujá, observou-se um teor de
umidade bastante elevado de 87,64% e um teor de matéria seca de 12,36%. Estes resultados
indicam a interferência do clima da região Amazônica na umidade das frutas como um alto
valor presente também nos resíduos, fator este destacado por Abud e Naraim (2009), sendo de
grande importância, uma vez que a umidade presente no material interfere na preservação do
alimento. Este é um fator que precisa ser observado para a utilização dos resíduos,
principalmente pelo custo elevado para desidratar e a suscetibilidade para deterioração por
crescimento microbiano (Cunha et al., 2009).
Esta alta umidade foi evidenciada também pelo baixo valor de cinzas 5,07%, o que
pode estar associado a uma menor concentração dos minerais presentes nos resíduos
analisados, visto que se tratavam de resíduos brutos, em que predominam altas concentração
de água (Sousa et al., 2011).
O teor de açúcar, expresso pela percentagem de sólidos solúveis totais (SST) ou
°BRIX é variável entre os frutos (Sousa et al., 2011). O alto suprimento de água diminui a
percentagem de açúcares, encontrado em baixa concentração na casca de maracujá,
apresentando apenas 0,5 °BRIX.
As análises microbiológicas foram realizadas com intuito de verificar fatores que
pudessem alterar a qualidade dos resíduos inviabilizando seu aproveitamento. Sabe-se que
alterações microbiológicas são indesejáveis em qualquer tipo de alimento bem como a
presença de patógenos e microrganismos indicadores proveniente de más condições
higiênico-sanitárias.
Os resultados das análises microbiológicas realizadas a partir de amostras moídas
demonstraram características preocupantes, pois apesar de apresentarem resultados negativos
nos testes presuntivos com presença de coliformes inferior a 3 NMP.g–1, observou-se o
crescimento microbiano em placas contendo os meios seletivos para a identificação de
Salmonella sp. e Escherichia coli (Figura 01).
O resultado foi feito a partir do critério de presença e ausência de crescimento
microbiano, tendo em vista que não existe uma legislação específica para análise de resíduos,
mas levou-se em consideração a característica patogênica dessas bactérias. A identificação
das colônias foi feita de acordo com as características morfológicas descritas pelo fabricante
de cada meio específico, baseado na cor, aspecto e alteração do meio.
18
Figura 01: Crescimento microbiano em placa contendo meio seletivo para desenvolvimento
de colônias de Salmonella sp. e Escherichia coli.
Os resultados demonstraram a necessidade de maiores cuidados quanto às condições

higiênico-sanitárias e manuseio dos resíduos, pois mesmo não havendo uma legislação
específica, a presença de microrganismos patogênicos inviabiliza o seu aproveitamento
(Cunha et al., 2009).
O teste presuntivo não demonstrou resultado quanto ao crescimento microbiano
observado pela turvação do meio e produção de gás, porém nos testes confirmativos em tubo
e em placa com meios seletivos, observou-se a presença de colônias características,
possibilitando a identificação de crescimento de Escherichia coli e Salmonella sp. nas
amostras avaliadas.
Conclusões
Os resíduos avaliados neste estudo apresentaram características físico-químicas

próprias sobre influência do clima e solo da região onde são produzidas, além de manter
algumas características da fruta in natura.
As análises microbiológicas evidenciaram a importância de manter padrões higiênico-
sanitários para viabilizar o aproveitamento dos resíduos com qualidade. Sendo este
procedimento um grande potencial para minimizar problemas ambientais e gerar produtos de
valor agregado.
Referências
Abud, A.K.S.; Narain, N. (2009). Incorporação da farinha de resíduo do processamento de

polpa de fruta em biscoitos: uma alternativa de combate ao desperdício. Braz. J. Food
Technol., 12(4):257-265.
19
AOAC. Association of Official Analytical Chemists (2012). Official methods of analysis of
AOAC international. 19. ed. Maryland: AOAC.
Brasil. (2001). Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n. 12, de 02 de

janeiro de 2001. Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos.
Disponível em: www.anvisa.gov.br/e-legis.
Brasil (1999). MAPA. IN nº 12/99, de 13/09/99. Padrões de Identidade e Qualidade para

Polpas de Frutas. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 13 set. 1999,
Seção I, p 72.
Carvalho H.H., Jomg E.V., Bello R.M. (2002). Alimentos: Métodos físicos e químicos de
análises. 1 ed. Porto Alegre: Universidade/UFRGS. 180p.
Córdova K.V., Winter C.M.G., Neto G.K. (2005). Características físico-químicas da casca do
maracujá amarelo (Passiflora edulis Flavicarpa Degener) obtida por secagem. Boletim do
Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, Curitiba, 23(2):221-230.
Cunha M.G.G., Oliveira E.R., Alcântara, M.D.B. (2009). Conservação e utilização do resíduo
de abacaxi na alimentação 1de ovinos no Curimataú Ocidental da Paraíba. Tecnol. & Ciên.
Agropec., João Pessoa, 3(3):55-62.
FAO, Produção brasileira de frutas 2013. Disponível em: <http://faostat.fao.org/>Acesso em

03 de abril de 2014.
Hoffmann F.L. (2001). Fatores limitantes à proliferação de microorganismos em alimentos.

Brasil Alimentos, 9:23-30.
IAL. Instituto Adolfo Lutz (1985). Métodos Químicos para Análise de Alimentos. 3 ed. São
Paulo.
IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (2012). Levantamento sistemático da

produção agrícola. Rio de Janeiro: IBGE. Disponível em: <http://www.sidra.ibge.gov.br>.
Acesso em: 15/11/2013.
Skrbic B., Filipcev B. (2008). Nutricional and sensory evaluation of wheat breads
supplemented with oleic-rich sunflower seed. Food Chemistry, 108(1):119-129.
Sousa M.S.B.; Vieira L.M., Lima A. (2011). Caracterização nutricional e compostos

antioxidantes em resíduos de polpas de frutas tropicais. Ciênc. agrotec., Lavras, 35(3):554-
559.
Souza M.W.S., Ferreira T.B.O., Vieira I.F.R. (2008). Composição centesimal e propriedades
funcionais tecnológicas da farinha da casca do maracujá. Alim. Nutr., Araraquara, 19(1):33-
36.
20
Some hydnoid (Basidiomycetes) mushrooms of the Brazilian Amazon
Bastos VIS1, Jesus MA1,2; Santos Borel JF1

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, AM. E-mail:
[email protected], [email protected];
Abstract
The general characters of this fungal group are the presence of odontioid
hymenium, hymenophore, and pileate or resupinate. Generally, the hydnoid species are
ectomycorrhizal, as they are important functional components of forest ecosystems. In
some cultures (e.g. Hydnum repandum) it holds nutritional importance. The objective is
to report the occurrence of hydnoid mushrooms for the Amazon Rainforest. The
collections were made in the following sites: Adolpho Ducke Forest Reserve, Tropical
Silviculture Experimental Station, Uatumã Biological Reserve in the State of
Amazonas, and Viruá National Park located in the State of Roraima. Besides the
aforementioned sites few collections were made in the urban area of Manaus. All the
specimens are deposited in the Herbarium of the National Institute of Amazon
Research–INPA. A total of 21 specimens of Amazon hydnoid mushrooms were
identified: Climacodon sp (1), Dentipellis sp (1), Hydnodon thelephorum (11),
Pseudohydnum gelatinosum (1), Stecchericium hydneum (1), S. seriatum (2), S.
ochraceum (1), Trechispora gillesii (2), Trechispora sp. (1). Due to the economic and
ecological importance of these macrofungi, the study contributed to the expansion of
knowledge about hydnoid diversity in the Amazon region. Comments and illustrations
are given for most of the species.
Key words: Ectomycorrhizal fungi, Northern Brazil, South America, Taxonomy
Introduction
The hydnoid fungi are characterized by their pileate basidiomes, usually stiptate,
centrally attached. Colors range from white to yellow, and orange to brown. The
“teeth”, or “spines”, reach up to 3 mm. The hyphal system varies from monomitic to
dimitic, consisting of generative and skeletal hyphae. The generative hyphae are thin-
walled, branched, contain septa, and clamp connections. The skeletal hyphae are mostly
thick-walled, and branched with septae. Basidiospores are hyaline, being globose or
subglobose to ellipsoid, with a smooth or verrucose surface (Chevall., 1826).
21
Many hydnoid fungi are wood-inhabiting species, but some of them are believed
to be ectomycorrhizas, forming mutually beneficial relationships with the roots of living
trees and other plants, (e.g., species of Hydnellum P. Karst.). Most of the basidiomes
typically occur on the ground, or in leaf litter in woodland (Dai, 2010).
Some species (e.g. Hydnum repandum L.) are well known edible fungi and are
commercially collected and marketed in Europe and France. It is often referred to as
"pied de mouton" in France (Roberts and Evans, 2011). In North America, the related
H. umbilicatum Peck is also known to have a sweet flavor and commercially collected,
sometimes under the name "sweet tooth".
Stipitate hydnoid fungi have been shown to be particularly sensitive to nitrogen

deposition as an indicator of eutrophication (Vesterholt et al., 2000; Arnolds, 2003).
Others (e.g. Steccherinum ochraceum) have gone through several studies about its
biotechnological potential for the pulping industry (Chernykh et al., 2008).
Therefore, the main objective of this present contribution is to report the

occurrence of hydnoid fungi for the Amazon Rainforest and, thereby, show this fungi
group's potential to develop future biotechnological studies in northern Brazil.
Materials and Methods
This study represents a few materials collected during the last 18 years by Dra.
Maria Aparecida de Jesus and collaborators as a part of ongoing projects to search for
biodiversity in the Amazon rainforest “Biodiversity Research Program– PPBio” (INPA/
MCTI) and a sustainable forest management project in the Brazilian Amazon “Amazon
woods” (INCT–MCTI/ FAPEAM). The collections were made in the per quadrant
sampling effort methodology (RAPELD), using a grid of 30 (250 × 40 m) lots same as
the ones employed by (PPBio/MCTI/INPA).
Characters of the collection sites
Adolpho Ducke Forest Reserve (2°59'38.5"S 59°55'05.8"W) with collections

performed in January 2006. The forest reserve is surrounded by the urban area of
Manaus, Amazonas, which is composed of a typical Amazon Rainforest. Average
temperature in Manaus is 26.0°C/ 78.8°F (maximum 39.0°C/ 102.2°F and minimum
19.0°C/ 66.2°F). The vegetation has uniform canopy with an average height of 32
22
meters. The topography consists of plateaus crossed by streams. The soils are composed
of argillaceous oxisols, and are sandier with increasing inclination and decreasing
altitude, see (Oliveira et al., 2008).
The Tropical Silviculture Experimental Station is located 60 km from the city of

Manaus (2°35'21"S 60°06'55"W). The collections were performed during 2014. The
vegetation corresponds to the dense upland forest, with floristic composition of high
trees up to 12–15 meters tall, and 7–12 meter tall small trees and shrubs. The soil is
composed of very oxisol acidic, clayey soil, with high aluminum content. The climate is
equatorial, with abundant rainfall and well distributed all year round. There is a short
dry season, where the lowest rainfall (August) gets less than 100 mm, and a rainy
season with monthly precipitation exceeding 290 mm (Jardim and Hosokawa, 1986).
Uatumã Biological Reserve is located in the municipality of São Sebastião do

Uatumã, in the State of Amazonas (1º27'10.03"S 59º20'28.601"W) with collections
performed in 2009. The reserve holds a large variety of environments composed mostly
of rainforest, with trees reaching up to 50 meters. The soil is rocky, with high
concentration of nutrients. It is also very hilly and has two distinct habitats, the high and
dry plateaus and the humid lowlands with many streams. The vegetation type of the
open areas is composed of vines, bamboo, or grasses. Other formations are the open and
closed white sand forests, very dense covered of shrubs and climbing plants (Zuquim et
al., 2008).
Viruá National Park is located in the municipality of Caracaraí, in the State of

Roraima (1°38'57.4"N 61°08'51.7"W) with collections made between 2008/09. The
vegetation is an extensive mosaic of complex, seasonally flooded, forested and not
forested systems (Mendonça 2011). The climate is equatorial (hot and humid), with a
short dry season, and higher rainfall in autumn. In its southern part, the area comprises a
wide and nearly flat surface, with predominately sandy, poorly drained soils and lots of
ponds. In its northern part, there are residual hills. Along the west extension, bounded
by the Branco River, there is occurrence of alluvial flood plains, which is also observed
in the southern portion (Rossetti et al., 2012).
Additionally, few collections were performed in 2015 in the urban area of Manaus
by collaborators during a project of fungi associated with trees and shrubs in public
roads.
23
Macro- and microscopic examinations
The hydnoid specimens were analyzed according to standard techniques as

described by (Martin, 1934) used light microscopy, samples were mounted in 5%
potassium hydroxide (KOH), Melzer’s reagent (IKI), and 0.1% Cotton Blue (CB) in
60% lactic acid to determine cyanophily. All the specimens were deposited at the
Herbarium of the National Institute of Amazon Research (INPA). Substrates were not
identified properly due to their high stage of rotting. IH indicates the herbarium
collection number.
Results and Discussion
A total of 21 specimens of Amazon hydnoid mushrooms were identified in the

Brazilian Amazon. Substrate preference and collection sites are shown below (Table 1).
Table 1. Occurrence of hydnoid fungi in the Brazilian Amazon

Taxa Family Substrate Collection Total
site
Climacodon sp 1 Phanerochaetaceae Ft PARNA 1
Dentipellis sp 1 Hericiaceae Fb ZFII 1
Hydnodon thelephorum (Lév.) Banker Hydnodontaceae Rt, Ft ZFII, RDS 11
Pseudohydnum gelatinosum (Scop.) P. Exidiaceae Ft INPA 1
Karst.
Steccherinum hydneum Rick: Maas Geest. Phanerochaetaceae Lt UB 1
Steccherinum seriatum (Lloyd) Maas Geest. Phanerochaetaceae Ft ZFII 2
Steccherinum ochraceum (Pers. ex J.F. Phanerochaetaceae Fb ZFII 1
Gmel.) Gray
Trechispora gillesii (Maas Geest.) Liberta Hydnodontaceae Rt, Lt RFAD, UB 2
Trechispora sp 1 Hydnodontaceae Lt RFAD 1
Total 21
Substrate: Fb. fallen tree branch, Ft. fallen tree trunk, Lt. live tree, Rt. root. Collection
sites: PARNA. Viruá National Park, RDS. Uatumã Forest Reserve, RFAD. Adolpho
Ducke forest reserve, INPA. National Institute of Amazon Research, UB. Urban area,
ZFII. Tropical Silviculture Experimental Station.
Among the studied species, the largest number of specimens is H. thelephorum

most likely due to the high sampling effort performed in ZF II, which compared to the
others, possibly shows that the number of species in the Amazon is low, demonstrating
the need for a greater sampling effort. Likewise, most of the species studied were
24
described on soil corroborating with (Cifuentes et al., 2005) who reported these species
in the tropical and subtropical forests.
In Regards to S. ochraceum, its potential lignocellulolytic has been heavily

studied and some different forms of laccase with unusual properties have been isolated
from its culture (Chernykh, et al., 2008).
Taxonomy
Hydnodon thelephorum Fig. 1–2
Description: Basidiome piliate, about 2–6 cm (wide), pale orange to orange

brown, surface smooth to rimose at center, margin curved downward, imbricate.
Hymenophore tuberculate with cylindrical spines, 0.5 to 1 mm (long), smaller and
scattered toward margin, orange-brown to cream colored. Stipe, 2–3.5 × 3–5 cm, central
portion subcylindrical to flattened, covered with short yellowish to cream colored
spines, surface longitudinally rugose. Hyphal system monomitic, thin walled generative
hyphae, 1.5–3 μm (wide), frequently simple clamped and scanty inflated. Cystidia
absent. Basidia subclavate, 19(–25)–30 × 4.5–7.5 μm, sterigmata 2–5 μm (long),
hyaline, with basal clamps. Basidiospores ellipsoid to subglobose, 4–5 × 2.5–5 μm,
verrucose, in KOH 5% ornamentation cyanophilic.
25
Figure 1–2. H. thelephorum in different perspectives. A–B. Aspect of the fresh piliate basidiome on the substrate, C.
Dry hymenophore, D. Hymenophore tuberculate with cylindrical spines. bs. Basidiospores, bd. Basidia clavate with
basal clamps, hs. Hyphal system (generative hyphae). Bar 100 µm (2); 1mm (D); 10 mm (A, B, C).
Known distribution: This species was previously described for the Amazon region
by (Bononi, 1981). Also known to be restricted to the Neotropic zone (Cifuentes et al.,
2005).
Material examined: Brazil, Amazonas, Manaus, Tropical Silviculture

Experimental Station, on soil/root or fallen tree trunk, 23 Apr. 2014, 11 Apr. 2013, 12
Apr. 2013, 23 Apr. 2014, 12 Apr. 2013, 23 Apr. 2014, 24 Apr. 2014, 23 Apr. 2014, 24
Apr. 2014, VIS Bastos and MA Jesus (IH 8.217, 8.261, 8.412, 8.746, 10.526, 10.527,
10.528, 10.529, 10.530); Uatumã Biological Reserve, on a tree root, 26 May 2009, MA
Jesus (IH 5285).
Remarks: H. thelephorum is distinguished among the stipitate hydnoid fungi

because of the pale orange to red color, gelatinous basidiome, and the basidiospores
26
with cyanophilic warts. (Coker and Beers, 1951). The specimens described here were
mostly found on soil close to tree roots, corroborating with (Bononi, 1981; Cifuentes et
al., 2005; Sobestiansky, 2005).
Pseudohydnum gelatinosum Fig. 3–4
Description: Basidiome spatulate to fan-shaped; pileus 3–4 × 2-5 cm, upper

surface smooth, white to greyish-white when fresh, pale grey to somewhat dark brown
when dry; odontioid hymenophore surface, provided with dense pale grey to light
brown conic spines, 2–12 × 1-2 mm, with 3–6 spines per centimetre. Cystidia absent.
Probasidia globose, 45–50 × 3–7.5 µm, divided into four cells by longitudinal septa,
with 2–4 cylindrical sterigmata 3–5 × 1.5–2 µm. Basidiospores subglobose to ellipsoid,
6–7(–7.5)–8 × 4.2–5 µm, hyaline, smooth, inamiloides and indextrinoides.
Figure 3. Macro and microstructures. A. Aspect of the dry piliate basidiome, B. Dry odontioid hymenophore. bs.
Basidiospores, pb. Protobasidia, hs. Hyphal system (generative hyphae). Bar 100 µm (4); 1mm (B); 5 cm (A).
Known distribution: It is distributed worldwide (Kirk et al., 2008). In Brazil, it is

reported to the State of Pará (Bononi, 1981).
Material examined: Brazil, Amazonas, Manaus, National Institute of Amazon

Research, on a fallen tree trunk, 05 Mar 2015, MA Jesus (IH 10.051).
Remarks: This species is characterized by its hydnoid hymenophore and

gelatinous consistency (Lowy, 1971).
Steccherinum hydneum Fig. 5–6
27
Description: Basidiome annual, effused reflexed, usually 5–8 × 2–4 cm, when
dries easily separable from substrate; odontioid hymenophore, dense spines, brownish
to cream colored, subulate, flattened, straight to somewhat flexuous, 2–3 mm (long).
Hyphal system dimitic; generative hyphae with clamps, thin-walled; skeletal hyphae
thick-walled, 1.5–5 µm (wide), branched, somewhat interwoven. Cystidia clavate,
heavily encrusted, 25–35 × 3.5–5 µm, thick-walled, no basal clamps. Basidia clavate,
15–20 × 4.5–5 µm, with basal clamps, usually with 2–4 sterigmata. Basidiospores
subglobose, 5–(5.5)–6 × 3–(3.5–) 4.5 µm, hyaline, thin-walled, smooth, uninucleate.
Figure 5–6. Macro and microstructures. A. Aspect of the annual basidiome, B–C. hymenophore odontioid with dense
spines. bs. Basidiospores, bd. Basidia clavate, cs. Cystidia encrusted, hs. Hyphal system (generative hyphae and
skeletal hyphae). Bar 10 µm (6); 1mm (B, C); 5 cm (A).
Known distribution: Brazil, in the State of São Paulo (Bononi 1976; Bononi et al.,
1981).
Material examined: Brazil, Amazonas, Manaus, Urban area, on a live tree, 06 Mar
2015, MA Jesus (IH 9.987).
Remarks: The species is very similar to S. ochraceum, reported by (Bononi, 1976)

by the color of the basidiomes and shape. However, S. hydneum has larger
basidiospores, and its context is thin and homogeneous whereas the context of S.
ochraceum is thick and duplex.
Stecchericium seriatum Fig. 7–8
28
Description: Basidiome imbricate to effused-reflexed with flabelliform pileus, flat
or convex 15–50 × 10–30 mm, ranging from light yellow to reddish orange when fresh,
whitish to cream-colored when dry, usually in association with algae. Hymenial surface
tuberculate with cylindrical spines 3 mm (long). Hyphal system monomitic; generative
hyphae bearing clamp connections; skeletal hyphae thick-walled 1.5–2 μm. Cystidia
abundant, cylindrical to fusiform, 30–40 × 10 μm, thick-walled, rarely with
encrustation. Basidia clavate, hyaline 8–15 × 3–5 μm, with 2–4 stigmata, up to 1.5 μm.
Basidiospores ellipsoid to globose, 2–6 (wide), non-cyanophilous, amyloid.
Figure 7–8. Macro and microstructures. A. Aspect of the dry effused-reflexed basidiome, B. hymenophore odontioid
with dense spines. bs. Basidiospores, bd. Basidia clavate, cs. Cylindrical cystidia, hs. Hyphal system (generative
hyphae and skeletal hyphae). Bar 10 µm (8); 1mm (B); 10 mm (A).
Known distribution: According to (Kirk et al., 2008), the species is widespread in

the tropics. It is reported in the State of Santa Catarina, Brazil by (Drechsler-Santos et
al., 2008) and for the Amazon region by (Bononi, 1981).

Experimental Station, on dead tree trunks, 23 Apr. and 23 Dec. 2014, MA Jesus (IH
8.548, 10.531).
Remarks: S. seriatum can be easily confused as S. ochraceum by macro-characters

in the field. However, microscopically, S. seriatum is strongly amyloid, has finely
verrucose basidiospores, and tubular, thick-walled gloeocystidia. In contrast, S.
ochraceum has non-amyloid, smooth, ellipsoid basidiospores, and apically encrusted
skeletocystidia.
Steccherinum ochraceum Fig. 9–10
29
Description: Basidiome ressupinate, odontioid, adnate to effused-reflexed, fibrillar
velutina margin, ranging from light yellow to reddish orange when fresh, whitish to
cream colored when dry; odontioid surface with abundant fimbriate, bleached teeth,
about 1 mm (long). Hyphal system dimitic, generative hyphae 2.5–3 µm (wide),
hyaline, thin-walled, fibulate, septate, very branched; subiculum hyphae, about 3–4 µm
(wide). Thick walls are observed on some simple septa. Lamprocystidia cylindrical, 35–
50 × 6–7 μm, obtuse apex, protruding from the hymenium, some without encrustation.
Basidia tubular to suburniform, 18–20 × 4.5–5 μm, hyaline, with 2–4 sterigmata, about
2 μm (long). Basidiospore ellipsoid, 4–4.5 × 2–3 μm, hyaline, thin walled, smooth,
inamiloides.
Figure 9-10. Macro and microstructures. A. Aspect of the dry effused-reflexed basidiome, B. Hymenophore
odontioid with dense spines. bs. Basidiospores, bd. Basidia subuniform, c. Cystidia, hs. Hyphal system (generative
hyphae and skeletal hyphae), lp. Lamprocystidia. Bar 10 µm (10); 1mm (B); 10 cm (A).
Known distribution: Distributed worldwide (Jülich and Stalpers, 1980).

Experimental Station, on a fallen tree branch, 12 Apr. 2013, VIS Bastos (IH 10.513)
Remarks: S. ochraceum seems to be morphologically similar to S. tenuispinum

Spirin, Zmitr. & Malysheva differing from it by being shorter up to 2 mm (long) and
densely arranged (5–7 per mm) pale ochraceous spines.
Trechispora gillesii Fig. 11–12
30
Description: Basidiomes piliate 1.5–2 × 1 cm, whitish to cream colored, with
brown edges when fresh, dark orange to brownish when dried. Stipe ochraceous, up to
1.2–1.5 cm. Hymenophore tuberculate with cylindrical spines, 0.5–1 mm (long), near
stipe, smaller and scattered toward margin, cream colored. Hyphal system monomitic;
hyphae fibulate and inflated close to the septa. Cystidia absent. Basidia hyaline, clavate,
15–20 × 5.5–6 µm. Basidiospore hyaline, subglobose, 5–6.6 × 4.5–6 µm, verrucose,
non-amyloid.
Figure 11–12. Macro and microstructures. A. Aspect of the dry piliate basidiome, B–C. hymenophore tuberculate
with cylindrical spines. bs. Basidiospores, bd. Basidia clavate, hs. Hyphal system, hyphae with clamp connections.
Bar 5 µm (12); 1mm (B, C); 10 cm (A).
Known distribution: Little is known about T. gillesii, previously reported only in

Central Africa. This is the first report of T. gillesii in the Brazilian Amazon.
Material examined: Brazil, Amazonas, São Sebastião do Uatumã, Uatumã

Biological Reserve, on soil, 27 May 2009, MA Jesus (IH 5.534); Amazonas, Manaus,
Adolpho Ducke Forest Reserve, on a live tree, 27 Jan. 2006, MA Jesus (IH 3.078).
Remarks: T. gillesii has a particular stipitate-pileate basidiome and has large

basidiospores, being one of the few species of the genera with these characters (Julich,
1976).
Conclusion
Due to the economic and ecological importance of these macrofungi, the study
contributed to the expansion of knowledge about hydnoid’s fungal diversity in the
Amazon region. However, a lot of them still remain unknown in the Amazon rain forest.
31
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the Brazilian government for funding

collections and research by National Council for Scientific and Technological
Development (CNPq). The Brazilian Program for Biodiversity Research (PPBio/
INPA/MCTI). The sustainable forest management project in the Brazilian Amazon,
Amazon wood (INCT-MCTI) and the National Institute for Amazonian Research
(INPA) by infrastructure.
References
Arnolds E (2003). De stekelzwammen en pruikzwammen van Nederland en België..

Coolia 46: 1–96.
Bononi VLR (1976). Basidiomicetos hidnoides da micota brasileira. (Tese), doutorado

em Ciências na área de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo,
314 p.
Bononi VLR (1981). Alguns Basidiomicetos hidnóides da região Amazônica. Rickia. 9:

17–30.
Chernykh A, Myasoedova N, Kolomytseva M, Ferraroni M, Briganti F, Scozzafava A,

Golovleva L (2008). Laccase isoforms with unusual properties from the basidiomycete
Steccherinum ochraceum strain 1833. J. Appl. Microbiol., 105: 2065–2075.
Chevallier FF (1826). Flore Générale des Environs de Paris. 1: 1–674.
Cifuentes J, Patiño-Conde V, Villegas M, García-Sandoval R, Valenzuela R (2005).

First record of Hydnodon thelephorus from Belize, Dominican Republic, Mexico, with
new data on its morphology and distribution. Mycotaxon 91: 27–34.
Coker WC, Beers AH (1951). The stipitate Hydnums of the eastern United States.
University of North Carolina Press, Chapel Hill, NC. 211 p.
Dai YC (2011). A revised checklist of corticioid and hydnoid fungi in China for 2010.
Mycoscience 52: 69–79.
32
Drechsler-Santos ER, Groposo C, Loguercio-Leite C (2008). Additions to the
knowledge of lignocellulolytic Basidiomycetes (Fungi) in forests from Santa Catarina
State, Brazil. Mycotaxon 103: 197–200.
Jardim FCS, Hosokawa RT (1986). Estrutura da floresta equatorial Úmida da Estação

Experimental de Silvicultura Tropical do INPA. Acta Amazonica, 16/17 (Único): 411–
508.
Julich W (1976). Studies in resupinate Basidiomycetes – IV. In Persoonia 8: 431-442.
Jülich W, Stalpers A (1980). The resupinate non–poroid Aphyllophorales of the

temperate northern hemisphere. Verhande–lingen der Koninklijke Nederlandse
Akademie van Wetenschappen 74: 1–335.
Kirk PM, Canhão PF, Minter DW, Stalpers JA (2008). Dicionário da Fungi (10th ed.).
Wallingford, UK: CAB International. 340 p.
Lowy B (1971). Tremellales. Flora Neotropica 6: 153 p.
Martin GW (1934). Three new Heterobasidiomycetes. Mycologia 26: 261–265.
Mendonça BAF (2011). Campinaranas amazônicas. Pedogênese e relações solo-

vegetação. 110p. (Dissertação) Mestrado em solos e nutrição de Plantas. Universidade
Federal de Viçosa, Viçosa
Oliveira ML, Baccaro FB, Braga-Neto R, Magnusson WE (2008). Reserva Ducke: A

biodiversidade amazônica através de uma grade. Manaus : Áttema Design Editorial, 168
p.
Roberts P, Evans S (2011). The Book of Fungi. University of Chicago Press, Chicago,
Illinois, 471 p.
Rossetti DF, Zani H, Cohen MLC, Cremon EH (2012). A Late Pleistocene-Holocene

wetland megefan in the Brazilian Amazonia. Journal of Sedimentary Geology 282:
276–293.
Sobestiansky G (2005). Contribution to a macromycete survey of the states of Rio

Grande do Sul and Santa Catarina in Brazil. Brazilian Archieves of Biology and
Technology 48 (3): 437–457.
33
Vesterholt J, Asman WAH, Christensen M (2000). Nitrogen deposition and decline of
fungi on poor and sandy soils. Svampe 42: 53–60.
Whittaker RH (1969). New concepts of Kingdoms of organisms. Sci ence 163: 150–
160.
Zuquim G, Costa FRC, Prado J, Tuomisto H (2008). Guia de identificação das

samambaias e licófitas da REBIO Uatumã, Amazônia Central. Manaus: Áttema Design
Editorial, 321 p.
34
Bioprospecção de fungos filamentosos isolados dos sedimentos do rio

Negro para aplicação em reações de biorremediação enantiosseletiva
de cetonas
Bezerra AFM1, Vasconcelos HS2; Neto JFN1, Sousa HML1, Araújo LS3, Oliveira FM1,
Zanotto SP4, Andrade LH3, Barroso HS1.
1
Universidade do Estado do Amazonas, Manaus-AM. 2 Centro Universitário do Norte
Laureate, Manaus-AM. 3. Universidade de São Paulo, Instituto de Química, São Paulo-SP,
Brasil. 4 Universidade Federal do Amazonas, Manaus-AM.
E-mails: [email protected]; [email protected],
[email protected], [email protected]; [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected],
[email protected]
Resumo
A busca por novos biocatalisadores é um dos atuais interesses das indústrias
biotecnológica e farmacêutica. As enzimas de origem microbiana se apresentam como
excelentes catalisadores devido a capacidade de sintetizar intermediários químicos
biologicamente ativos. Alguns destes são bastante difundidos na produção de fármacos,
como os alcoóis enantiomericamente puros. Sua síntese pode ser realizada utilizando
fungos em reações de biorredução assimétrica de cetonas. Diante da vasta diversidade
microbiana presente na região amazônica e a necessidade de investigações nesta área,
este trabalho teve como objetivo realizar a bioprospecção de fungos filamentosos
isolados dos sedimentos do rio Negro, a fim de avaliar o potencial em reações de
biorredução enantiosseletiva de cetonas. A atividade enzimática de 91 fungos
filamentosos foi avaliada. Neste quesito, nove destacaram-se ao obter excelentes
resultados, com taxas de conversão maiores que 80% e excesso enantiomérico
superiores a 99% no processo de biorredução das cetonas aromáticas: 4-
cloroacetofenona e 4-metilacetofenona. O fungo, cujo código de identificação é SED
41, apresentou atividade enzimática capaz de biorreduzir a 4-cloroacetofenona ao (R)-1-
(4-clorofenil)etanol, obtendo uma conversão >99% e excesso enantiomérico >99% para
o enantiômero-R . O isolado SED 108 converteu 60% da 4-metilacetofenona ao (S)-1-
(4-metilfenil)etanol com excesso enantiomérico de 81% (S). Estes resultados
35
demonstram o potencial dos fungos filamentosos isolados na bacia amazônica em
reações de biorredução enantiosseletiva dos derivados da acetofenona e a versatilidade
na produção tanto do enatiômero S como o R.
Palavras-chave: Biocatálise, micro-organismos, biorredução, alcoóis quirais.
Introdução
Os alcoóis enantiomericamente puros são amplamente utilizados como
intermediários químicos em diversas áreas, principalmente, nas indústrias farmacêutica,
agroquímica e biotecnológica (Patel, 2014). A produção biotecnológica de compostos
químicos por biocatálise possui vantagens em relação à química sintética pois diminuem
o impacto ambiental e gastos energéticos devido as condições reacionais brandas (Xu,
2013). Isto está relacionado com a utilização das enzimas produzidas pelos micro-
organismos como catalisadores reacionais. Esta abordagem tem sido visada pois
apresenta elevada enantiosseletividade e por ser benéfica ao meio ambiente. A
biorredução assimétrica de cetonas para obtenção de alcoóis quirais pode ser realizada
com células íntegras de micro-organismos ou com enzima oxirredutase isolada (Soni e
Banerjee, 2006).
As reações com células íntegras de micro-organismos representam uma
alternativa mais acessível, uma vez que seu sistema possui os caminhos metabólicos
para regeneração de cofatores como o NAD+ e NAD(P)H (Ni e Xu, 2012). Além disso,
o cofator das oxirredutases, o NAD+ ou NAD(P)H, confere elevada enantiosseletividade
ao inserir quiralidade à molécula alvo, sendo uma boa estratégia para a produção de
alcoóis opticamente ativos, possibilitando alcançar o rendimento teórico de quase 100%
e enantiossetividade de 99%. (Soni e Banerjee, 2006)
A produção de enzimas de origem fúngica é um processo bastante estudado,
mas poucos são os relatos a respeito da utilização destes micro-organismos, isolados da
região amazônica, em processos biotecnológicos. Diante da crescente necessidade de
busca por novos biocatalisadores, a biodiversidade fúngica da região amazônica é
extremamente promissora para a pesquisa do seu potencial de aplicação em processos
biocatáliticos. Assim, este trabalho tem como objetivo principal verificar o potencial de
fungos filamentosos isolados dos sedimentos do rio Negro/Amazônia, para produção de
enzimas redutases para realizar reações de redução de dois derivados da acetofenona de
forma enantiosseletiva.
36
Material e Métodos
A avaliação da atividade enzimática dos fungos realizou-se de acordo com o
procedimento descrito por Araújo (2011). Conforme as seguintes etapas:
Reativação. Os fungos estão preservados pelo Método de Castellani e foram
reativados utilizando o meio de cultura Ágar Sabouraud Dextrose. Os cultivos foram
incubados a 28 ºC por 7 dias.
Pré-inóculo. O inóculo do fungo foi adicionado a um erlenmeyer de 50 mL
contendo 20 mL de meio de cultura (MCFE7) e incubados a 28 ºC sob agitação orbital,
160 rpm por quatro dias.
Inóculo/Reação. Neste ensaio, foram utilizadas microplacas (24 poços). Após
quatro dias, foram adicionados, em cada poço da microplaca, 2 mL de pré-inóculo e 40
μL das soluções das cetonas 4-metilacetofenona e 4-cloroacetofenona (5 mmol/L). As
microplacas foram mantidas em agitador orbital por 3 dias nas mesmas condições
citadas anteriormente.
Extração. Após 3 dias, foi adicionado éter etílico (2 mL) a cada poço da
microplaca e extraída a mistura reacional (fase aquosa) sendo transferida para um tubo
Falcon e centrifugada (1 min, 6000 rpm) para separação de fases.
Análise. As amostras foram analisadas por cromatografia gasosa e coluna com
fase estacionária quiral. O excesso enantiomérico dos compostos foram determinados
por comparação cromatográfica com amostras dos (R,S)-alcóois sintetizados
quimicamente, fornecidos pelo Laboratório de Química Fina e Biocatálise da
Universidade do Estado de São Paulo - USP, e das cetonas. O excesso enantiomérico
(ee) foi definido como a razão de [S]-[R]/[S]+[R]X100%, em que [R] e [S] são as
concentrações dos enantiômeros (R) e (S), respectivamente.
As soluções padrões dos alcoóis: (R,S)-1-(4-metilfenil)etanol e (R,S)-1-(4-
clorofenil)etanol; e das cetonas: 4-cloroacetofenona e 4-metilacetofenona foram
preparados numa concentração de 5 mmol/L. Para isto, diluiu-se 0,25 mmol dos
substratos em 1 mL de dimetilformamida (DMF) para os alcoóis; e etanol para as
cetonas.
Meio de Cultura MCFE7 = (pH 5,6) = KH2PO4 (0,1 %; 1,0 g/L), MgSO4.7H2O
(0,04%; 0,4 g/L), NH4Cl (0,04 %; 0,4 g/L), Dextrose (0,025 %; 0,25 g/L), Peptona
(0,025 %; 0,25 g/L).
37
A atividade enzimática de 91 isolados fúngicos foi avaliada através da
biorredução de 4-cloroacetofenona e 4-metilacetofenona aos seus respectivos alcoóis.
Os resultados mais relevantes foram dos seguintes isolados: SED 35, SED 64, SED 89,
SED 4, SED 132, SED 05, SED 10, SED 123 e SED 75 (Tabela 1).
Tabela 1. Biorredução de 4-cloroacetofenona (Cl) e 4-metilacetofenona (Me).
Reação Fungos Filamentosos Substrato Conversão (%) eea (%)

1 Me 28 44(R)
SED 35
2 Cl 87 >99 (R)
3 Me - -
SED 64
4 Cl 77 >99(R)
5 Me 79 >99 (R)
SED 89
6 Cl 52 79(R)
7 Me 84 97(R)
SED 41
8 Cl >99 >99(R)
9 Me 44 74(R)
SED 132
10 Cl 94 93 (R)
11 Me 69 94 (R)
SED 05
12 Cl 95 91 (R)
13 Me 63 85 (S)
SED 10
14 Cl 86 78 (S)
15 Me 53 35 (R)
SED 123
16 Cl 89 95 (R)
17 Me 75 64 (S)
SED 75
18 Cl - -
a
Condições reacionais: 5 mmol/L dos substratos 1 e 2 em 2 mL de meio de cultura, 160 rpm, 28 °C, 72h.
A configuração absoluta foi determinada por comparação com dados da literatura. ee.: excesso
enantiomérico.
38
Os valores de conversão variaram entre 28% a 84% quando o substituinte R da
acetofenona era o grupo metila (Me) e de 52% a >99% quando o substituinte era o cloro
(Cl). Nas reações 2, 8, 10, 12, 14 e 16 com o substrato clorado as conversões foram
excelentes (>80) e com elevado excesso enantiomérico (ee) (>90%) nas reações 2, 4, 8,
10, 12 e 16. Por outro lado, nas reações com o grupo substituinte Me apenas na reação 7
ocorreu conversão acima de 80% e nas reações 5, 7 e 11 obteve-se ee >90%.
Dentre os nove isolados fúngicos, sete reduziram as cetonas para produzir o
enantiômero-R e apenas dois foram enantiosseletivos para sintetizar o enantiômero-S. O
SED 10 converteu 63% do 4-metilacetofenona com e.e. 85% para o (S)-1-(4-
metilfenil)etanol e o 4-cloroacetofenona ao (S)-1-(4-clorofenil)etanol (conversão 86% e
excesso enantiomérico 78%); o SED 75 reduziu 75% de 4-metilacetofenona em (S)-1-
(4-metilfenil)etanol com ee 85%.
O isolado SED 41 apresentou o melhor resultado na avaliação enzimática, pois
catalisou 4-metilacetofenona e 4-cloroacetofenona com elevadas conversões (83% e
>99%, respectivamente) e e.e. para o enantiômero-R (97% e >99%, respectivamente).
Os melhores resultados foram obtidos nas reações onde o substrato era uma
cetona com o substituinte cloro (Cl) em seu anel aromático. Assim, as enzimas
redutases produzidas pelos isolados fúngicos, SED 35, SED 41, SED 132, SED 05, SED
10 e SED 123 tiveram maior afinidade com a cetona clorada. Isto pode ser explicado
pelo fato do cloro ser um grupo substituinte retirador de elétrons, o que facilita a reação
de redução. O isolado SED 64 demonstrou-se específico para reduzir a cetona com
substituinte cloro, convertendo 77% da cetona ao enantiômero (R) do álcool com
elevado e.e. (>99%), mas não reduziu a cetona substituída pelo grupo Me. Por outro
lado, o isolado SED 75 foi específico para a redução da cetona com substituinte Me,
convertendo 75% da cetona a álcool com excesso enantiomérico 64% para o
enantiômero (S).
A maioria dos isolados fúngicos apresentaram enzimas oxidorredutase com
preferência pela formação do enantiômero-R do álcool. Já o SED 10 e o SED 75
produziram oxidorredutases diferentes dos demais, que tiveram preferência na síntese
do enantiômero-S.
39
O isolado fúngico SED 41 apresentou ótimos resultados como biorredutor
enantiosseletivo, reduzindo tanto a 4-cloroacetofenona como a 4-metilacetofenona com
altas taxas de conversão e excesso enantiomérico para o enantiômero-R.
Conclusões
Este trabalho obteve resultados que demonstram o potencial biotecnológico das
enzimas produzidas pelos isolados de fungos filamentosos de sedimentos de rio Negro,
pois, sintetizaram com sucesso alcoóis quirais enantiomericamente puros a partir das
reações de biorredução da 4-cloroacetofenona e 4-metilacetofenona, além da
versatilidade na produção tanto do enatiômero-S como o enantiômero-R.
Destacou-se o isolado fúngico SED 41 como um biocatalisador promissor em
reações de biorredução de cetonas para a obtenção de alcoóis quirais
enantiomericamente puros.
Referências
Araújo LS, Kagohara E, Garcia TP, Pellizari VH, Andrade LH (2011) Screening of
Microorganisms Producing Cold-Active Oxidoreductases to Be Applied in
Enantioselective Alcohol Oxidation. An Antarctic Survey. Mar Drugs9: 889-905.
Ni Y, Xu JH. (2012) Biocatalytic ketone reduction: A green and efficient access to
enantiopure alcohols. Biotechnology Advances30: 1279–1288.
Patel PK, Singh S, Kumar A, Sandhyavali MS, Priyadarshini SR, Yadav IK (2014)
Microbial reduction of ketones and its derivatives. Ind J of Research in Pharm and
Biotechnology2: 1020-1029.
Soni P, Banejjer UC (2006) Enantioselective reduction of acetophenone and its
derivatives with a new yeast isolate Candida tropicalis PBR-2 MTCC 5158.
Biotechnology Journal1: 80-85.
Xu G, Yu H, Xu J (2013) Facile access to chiral alcohols with pharmaceutical relevance
using a ketoreductase newly mined from Pichia guilliermondii. Chin J Chem31: 349-
354.
40
Biodegradação de petróleo por isolados de rizóbios provenientes de solos

amazônicos.
Brito L.L.1, Menezes N.C.2, Minelli-Oliveira C.1, Oliveira L.A.3
1
PG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas –, 2 Mestre em Agricultura no Trópico
Úmido, INPA, 3 Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Emails:
[email protected]
Resumo
O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos e outros compostos. A
contaminação ambiental por estas substâncias causa grande impacto ecológico. Para a
descontaminação dos locais contaminados, a biorremediação utiliza micro-organismos, o
que requer mecanismos para estimular e desenvolver a atividade microbiana na degradação
de compostos de petróleo. Esse trabalho teve como objetivo, testar isolados de rizóbios na
degradação de compostos do petróleo. Foi utilizado o método de riscagem em placas de
Petri, tendo o petróleo como fonte de carbono. Dos 120 rizóbios, 93 mostraram capacidade
de usar o petróleo como fonte de carbono, apresentando bom crescimento até os 15 dias de
avaliação. Desses, 36 mostraram elevada habilidade de degradar o petróleo com seis dias
de crescimento. Os melhores apresentaram crescimentos elevados após 24 horas usando o
petróleo (INPA R629, INPA R634, INPA R656, INPA R664, INPA R667, INPA R672 e
INPA R674). Esses resultados demonstram que os rizóbios podem tornar-se uma
alternativa viável e segura para a biorremediação de solos contaminados com petróleo.
Palavras-chave: Metabolismo microbiano, Ecologia microbiana, Biotecnologia,

Amazônia
Introdução
A Biorremediação é um processo de simples manutenção, aplicável em grandes
áreas e de baixo custo, que usa micro-organismos ou suas enzimas para destoxificar
contaminantes no solo ou outros ambientes. É a transformação do contaminante em formas
41
que não oferecem riscos ambientais (Duarte, 2012). Os acidentes e vazamentos com
produtos oleosos, principalmente derivados de petróleo, afetam vários meios ambientes,
tanto aquáticos como nos solos. Para a remediação destas áreas, vários processos podem
ser utilizados, mas os biológicos são os mais usados devido ao custo e à eficiência, quando
comparados a processos físico-químicos (Reginatto et al., 2011). A legislação brasileira
exige que áreas contaminadas sejam remediadas para minimizar a interferência ambiental e
restaurar os ecossistemas. Para isto, são necessários o diagnóstico, a análise e o
monitoramento do impacto e medidas remediadoras (CETESB, 2010). Os micro-
organismos são considerados biodegradadores eficientes por sua abundância, diversidade,
versatilidade catabólica e anabólica, e capacidade de adaptação a condições ambientais
adversas (Moraes e Tornisielo, 2009). Para que ocorra a degradação biológica de
compostos orgânicos, como os derivados do petróleo, precisam ser estabelecidas condições
ambientais favoráveis (concentração de nutrientes, umidade, pH, temperatura e aeração),
além do conhecimento sobre a concentração e o tipo de óleo contaminante, a densidade
populacional e o potencial de degradação dos micro-organismos. Os rizóbios fazem parte
da população microbiana do solo e seu estudo pode conduzir à descoberta de estirpes para
uso na biorremediação de ambientes contaminados com compostos de petróleo, visto que
são adaptadas ao ambiente local, e podem mostrar maior eficiência e tolerância às
condições de estresse. Portanto, este trabalho testou a capacidade de isolados de rizóbios
em degradar petróleo para serem utilizados no processo de biorremediação de solos
contaminados com petróleo.
Material e métodos
O trabalho foi realizado no Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Micro-

organismos da Amazônia (LEBMAM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
(INPA), utilizando-se 120 isolados de rizóbios adquiridos através da coleta de nódulos de
leguminosas, seguidos de isolamento e purificação, segundo método descrito por
Somasegaran e Hoben (1985). As bactérias isoladas foram enumeradas como INPA R546 a
INPA R677. Para avaliar a capacidade de degradação de petróleo e seus derivados e o
crescimento bacteriano, foi utilizado um método de riscagem proposto por Oliveira e
Magalhães (1999) modificado, realizado em placas de Petri contendo meio de cultura
YMA (yeast manitol agar), onde foram utilizados 0,1 mL de petróleo como fonte de
carbono ao invés de manitol. Como controle foi usado o manitol ao invés do petróleo. Esse
42
teste foi realizado em quatro repetições. As avaliações foram feitas a cada três dias, por um
período de 15 dias, no qual as bactérias foram mantidas em laboratório a uma temperatura
de 23 – 28 ºC. De acordo com o desenvolvimento das colônias nas quatro zonas da placa,
foram dados valores para o crescimento para cada isolado, segundo Oliveira e Magalhães
(1999). Com base no crescimento em placas de Petri, os isolados foram classificados como
pouco (1,00 à 2,00), moderado (2,06 à 3,00) ou elevado crescimento (3,06 à 4,00) usando o
petróleo como fonte de carbono (biodegradação). Para fins de seleção, foram escolhidos os
isolados que apresentaram nota mínima de 3,06 ao sexto dia de teste.
Resultados
A figura 1 monstra o crescimento dos 120 isolados de rizóbios com as fontes de
carbono manitol (M) e petróleo (P) no período de 15 dias de avaliação. Não houve
diferença entre as duas fontes de carbono quando se analisa os percentuais (68% e 69%)
para os isolados que apresentaram crescimentos elevados no meio com manitol e petróleo
respectivamente. As diferenças dos usos dessas duas fontes de carbono apareceram entre
os isolados que apresentaram pouco ou moderado crescimento. No meio com manitol, 11%
mostraram crescimento moderado e 21%, baixo crescimento, enquanto que no meio com
petróleo, esses percentuais foram respectivamente de 23% e 8%. Alguns microrganismos
já apresentavam notas 3,06 ou acima desta após 24 horas de incubação com a fonte de
carbono petróleo (INPA R629, INPA R634, INPA R656, INPA R664, INPA R667, INPA
R672 e INPA R674) mostrando-se assim, superiores a todos os outros quanto à habilidade
de degradar o petróleo. Outros foram adquirindo elevados crescimentos (notas acima de
3,0) após alguns dias. Com base nesses resultados, foram identificadas 36 bactérias com
performances superiores, que atingiram notas elevadas (3,06 a 4,00) até o sexto dia de
crescimento e foram utilizados em testes posteriores, demonstrando com isso, que são
potenciais degradadores de hidrocarbonetos. Os demais isolados que apresentaram notas de
crescimentos elevados e moderados após o sexto dia podem ser utilizados formando
consórcios em futuros testes de biodegradação de petróleo ou de suas frações, pois até o
150 dia apresentaram crescimentos elevados usando o petróleo para crescerem. Isso mostra
que os isolados de rizóbios testados utilizaram o petróleo para seus crescimentos,
tornando-se necessário novos testes para verificar o potencial de degradação de cada
rizóbio utilizado.
43
A B
Figura 1 – Crescimento de rizóbios usando manitol ou petróleo como fontes de carbono.
Discussão
Apesar de não haver grande diferença nos testes com manitol e petróleo com
relação ao crescimento elevado (68% e 69% dos isolados), observou-se que os percentuais
de rizóbios com crescimentos moderados foram o dobro no meio com petróleo (23%, em
comparação aos 11% com manitol), resultando em um percentual bem menor daqueles que
tiveram pouco crescimento nesse meio (21% em manitol e 8% em petróleo). Esses dados
demonstram que os rizóbios testados nesse trabalho usaram o petróleo com mais eficiência
do que o manitol para seus crescimentos. Para demonstrar o potencial dos rizóbios na
biodegradação de petróleo, vários trabalhos vêm sendo realizados.Yang e Lee (2008)
testaram consórcios de rizóbios na tentativa de degradar 4-clorofenol e afirmaram que
quanto maior a concentração dessa substância menor foi a biomassa das colônias de
consórcios. Xiong et al., (2011) realizaram testes para mensurar os efeitos da temperatura
sobre a degradação de petróleo por comunidades microbianas, concluindo que a
temperatura influencia na composição das comunidades microbianas do solo. Ahmad et al.,
(1997) isolaram e caracterizaram várias linhagens de Rhizobium meliloti em áreas
contaminadas com hidrocarbonetos aromáticos e cloroaromáticos, sendo os primeiros a
registrarem isolados de Rhizobium meliloti com potencial para degradação de
hidrocarbonetos. Isso mostra que os isolados utilizados se adaptaram à fonte de carbono
petróleo, tornando-se necessário novos testes para verificar o potencial de degradação de
cada rizóbio utilizado.
44
Conclusões
Dos 120 isolados de rizóbios, 93 apresentaram capacidade de degradar o petróleo
no meio.
Trinta e seis isolados mostraram essa habilidade elevada já com seis dias de
crescimento.
Os isolados INPA R629, INPA R634, INPA R656, INPA R664, INPA R667, INPA
R672 e INPA R674 mostraram-se como os melhores, por apresentarem crescimentos
elevados após 24 horas usando o petróleo.
Referências bibliográficas
Ahmad D, Mehmannavaz R, Damaj M (1997) Isolation and Characterization of Symbiotic

N2-Fixing Rhizobium meliloti from Soils Contaminated with Aromatic and Chloroaromatic
Hydrocarbons: PAHs and PCBs. International Biodeterioration & Biodegradation,
39(I):33-43.
CETESB (2010). Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. [on line].

Brasil,Disponível em:<http://www.cetesb.sp.gov.br> Acesso em: 13 jan. 2010.
Duarte, WM (2012) Identificação de Actinomicetos Isolados de Solo Impactado com

Resíduos Petroquímicos e Seleção de Potenciais Degradadores de Misturas de Diesel e de
Biodiesel. Porto Alegre, Brasil. (M.Sc Dissertação. Universidade Federal do Rio Grande
do Sul. UFRGS).
Moraes BE, Tornisielo TMS (2009). Biodegradation of Oil Refinery Residues Using
Mixed- Culture of Microorganisms Isolated from a Landfarming. Brazilian archives of
Biology and technology, 52(6):1571-1578.
Oliveira LA, Magalhães HP (1999) Quantitative evaluation of acidity tolerance of root

nodule bacteria. Revista de Microbiologia 30:203–208.
Reginatto C, Colla M.L., Thomé A. (2011). Biorremediação de Resíduos Oleosos em Solos

Revista CIATEC – UFP, 3(2):19-31.
45
Somasegaran P, Hoben HJ (1985) Methods in legume-Rhizobium technology. NifTAL
Project and MIRCEN, Hawaii, 365p.
Xiong Y, Wang H, Hao X, Sun Y (2011) Effects of temperature on oil-degrading microbial

communities and the biodegradation of petroleum. 5ª Conferência Internacional sobre
Bioinformática e Engenharia Biomédica (iCBBE). Wuhan, China.
Yang CF, Lee CM (2008) Enrichment, isolation, and characterization of 4-chlorophenol-

degrading bacterium Rhizobium sp. 4-CP-20. Biodegradation, Taiwan, 19:329–336.
46
Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff & Maubbl. (Sphaeropsidales,

Sphaeroidaceae) associada à espécie florestal Scleronema micranthum
((Ducke) Ducke, Bombacaeae) (Cardeiro) da Amazônia
Carvalho R S1, Nascimento CC1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coordenação de Tecnologia e Inovação COTI- E-

1
mail: [email protected].
Resumo
Realizou-se este trabalho da prevalência de Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff &

Maubbl., manchador de madeira, associado a espécie florestal da Amazônia Scleronema
micranthum (Ducke) Ducke durante 12 meses. Foram utilizadas cinco árvores e dos fustes
foram cortados 30 discos de 30 cm. Os mesmos foram distribuídos, aleatoriamente, sobre o
solo da floresta da Estação Experimental de Silvicultura Tropical-ZF-2, do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia, INPA. Neste ambiente, os discos ficaram expostos a
biodeterioração e a cada dois meses procedia-se a remoção de cinco discos do solo e todos
foram transportados para o Laboratório de Patologia da Madeira COTI/INPA. Para o
isolamento L. theobromae foram utilizados fragmentos retirados do alburno dos discos, foi
feito a assepsia dos fragmentos, sendo que três foram colocados sobre o meio de cultura
extrato de malte-agar. As placas de Petri foram e mantidos em incubadora a 27 0C. As
colônias desenvolvidas durante o período de incubação foram observadas e o isolado puro
foi preservado em tubo de ensaio em baixa temperatura. A identificação foi feita por meio
de observações macroscópicas da colônia e microscópica das estruturas vegetativas e
reprodutivas. Em todas as coletas, com exceção da segunda, a prevalência de L.
theobromae associado a S. micrantum foi confirmada. A maior prevalência foi observada
na primeira, quarta e sexta coleta, todas com cinco isolados.
Palavras-Chave: Madeira, S. micranthum, fungos manchadores, Lasiodiplodia theobromae
Introdução
A espécie florestal da Amazônia Scleronema micranthum (Ducke) Ducke, conhecida

como Cardeiro, pertence à família Bombacaceae. É uma árvore de porte médio a grande é
comumente encontrado no Estado do Amazonas principalmente nos arredores de Manaus e
no Baixo Rio Negro (Loureiro et al., 1979; Loureiro e Silva 1968). A sua madeira apresenta
fácil trabalhabilidade, tendo potencial na confecção de móveis, tabuados, lâminados,
faqueados decorativos, compensados e na construção civil e naval (Freitas et al., 1992). Em
47
ensaios acelerados de laboratório, o Cardeiro foi considerado resistente aos fungos
apodrecedores Pycnoporus sanguineus (Linnaeus : Fr.) Murril e Polyporus fumosus Pers :
Fr. (Paes et al., 2007) e, moderadamente resistente, a Lenzites trabea (Pers.: Fr.)
(INPA/CPPF 1991). As toras de S. micranthum foram cortadas e os discos foram deixados
na floresta, e após 12 meses não foi encontrado ataque de fungos no cerne, e o alburno
demonstrou ser pouco resistente (INPA/CPPF 1991). Sabe-se que a madeira dessa essência
florestal representa o principal produto florestal, considerado um material orgânico
complexo e sua composição anatômica e química que pode nutrir espécies de fungos e
outros microrganismos (Dix e Webster 1995).
Os primeiros fungos que colonizam as árvores recém-abatidas são os manchadores de

madeira e emboloradores, devido a grande quantidade de substâncias de reserva e a elevada
umidade. Alguns fungos manchadores podem em estágio avançado de ataque provocar
podridão mole (Cavalcante 1982). De acordo com Oliveira (2005) e Silva (2004), L.
theobromae é um dos principais fungos relatados causando manchas em madeira nas
regiões tropicais e subtropicais.
Na Amazônia Brasileira, há registro de L. theobromae ocorrendo em 12 doze espécies

florestais oriundas de quatro indústrias madeireiras de Manaus-Amazonas (Hanada et al.,
(2003). Na Amazônia Peruana, Segura (1970) relata o ataque de L theobromae, causando
mancha azul em amostras de 27 espécies de madeira.
Diante do exposto, o estudo teve como objetivo isolar e avaliar a prevalência do

fungo manchador L. theobromae de amostras da madeira de S. micranthum, expostas ao
ambiente florestal por doze meses.
Material e Métodos
Local do Experimento
O experimento de campo foi realizado na área da Estação Experimental de

Silvicultura Tropical-ZF-2, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia-INPA,
localizado no km 60 da BR 174 (Manaus- Boa Vista). Segundo RADAM (1978) e Bastos et
48
al., (1986) a área em estudo apresenta o terreno suavemente ondulado, o clima de acordo
com a classificação de Koppen, é do tipo Am. A temperatura média anual do mês mais frio
é sempre acima de 18 ºC. A umidade relativa é muito alta e a média anual varia de 84% a
90%. A precipitação pluviométrica é maior nos meses de dezembro a maio e a media anual
é de 2097 mm. A vegetação da área é influenciada pela Bacia do rio Negro, por possuir
florestas heterogêneas, a altura das árvores varia de 30 a 40 metros.
Neste trabalho foram utilizadas cinco árvores de S. micranthum, de cada árvore foram
seccionados, aleatoriamente, seis discos (amostras) de 30 cm de comprimento, totalizando
30 discos. Os discos foram identificados com placas de alumínio e posteriormente
expostos, no solo da floresta, eqüidistante a 50 cm, à biodeterioração por um período de 12
meses conforme pode ser visualizado (Figura 1).
Foto: Souza de Abreu L.
Figura 1. Local da disposição dos discos no solo da floresta.
Isolamento e identificação dos fungos
Durante o período de exposição dos discos na floresta, a cada dois meses, seis discos
foram removidos aleatoriamente, os quais foram transportados para o Laboratório de
Patologia COTI/INPA. De cada disco foram retirados fragmentos de aproximadamente 10 a
20 mm2, estes foram submetidos à assepsia, sendo imersos durante um minuto em
hipoclorito de sódio a 5 % , álcool 70 % e lavados com água destilada estéril duas vezes.
Em seguida foram colocados em papel de filtro estéril para retirar o excesso de água
(Dhingra e Sinclair 1995). Posteriormente, seis fragmentos foram transferidos de forma
eqüidistante em duas placas de Petri, sendo três em cada placa contendo meio de cultura
extrato de malte-agar com antibiótico cloranfenicol. Em seguida, as placas foram colocadas
49
em incubadora a 27 ºC, no escuro até a obtenção da colônia de L. theobromae. Às culturas
puras foram armazenadas na Coleção de Culturas de Microorgamismos de Interesse
Agroflorestal do INPA.
Para confirmação da identificação taxonômica, foi feita observações macroscópicas

da colônia como o crescimento, aspecto micelial, coloração e forma. Para tanto foram
retirados discos de micélio de 5 mm de diâmetro e transferidos para o centro das placas de
Petri, contendo meio de cultura. Para cada isolado foi preparadas três placas de Petri
(repetições). Em seguida, as placas foram mantidas em incubadoras a 27 ºC sob foto
período de 12 h ou até a formação de picnídios e picnidiosporos, as placas foram
observadas, diariamente sob microscópio estereoscópico (Lupa). A partir da formação das
estruturas reprodutivas foram preparadas lâminas semipermanentes coradas com lactofenol
ou azul de algodão e observadas sob microscópio de luz (óptico).
Os picnídios formado, foram colocados sobre a lâmina contendo corante. A estrutura

foi partida com um bisturi e uma lamínula foi colocada sobre a mesma. Em seguida, os
picnídios foram esmagados, cuidadosamente, fazendo uma pressão leve sobre a lamínula.
com o cabo do estilete. Desta forma, tanto os picnídios e picnidiosporos foram possíveis de
serem visualizados e medidos. As descrições das colônias e das estruturas reprodutivas e
vegetativas do fungo foram comparadas com as descritas em literaturas especializadas:
Barnett e Hunter (1998); Sutton (1980) e Dugan (2006).
Foram obtidos 20 isolados de L. theobromae de 30 discos de S micranthum, referente

ao somatório de seis coletas por cada árvore. Este fungo foi isolado desde a primeira coleta
com exceção a segunda. A prevalência foi registrada na primeira, quarta e sexta coleta com
cinco isolados em cada uma destas (Figura 2).
O fato de ter encontrado maior número de isolados na primeira, quarta e sexta coleta,
pode estar relacionado ao próprio ambiente onde os discos ficaram expostos na floresta, sob
sol, chuva e a sombra da floresta, que ofereceram condições climáticas propícias ao
desenvolvimento dos mesmos. Segundo Sales-Campos et al., (2000), a temperatura e a
50
umidade elevada da região Amazônica, favorecem a incidência de fungos. Este fungo além
de ocorrer em madeira pode ser encontrado no solo e plantas (Mohali e Encinas, 2001;
Santos et al., 2001; Mesquita et al., 2006; Segura,1970).
4,5
3,5
Número de isolados
2,5
1,5
0,5
0
1º 2º 3º 4º 5º 6º
Coletas
Figura 2. Número de isolados de L. theobromae obtidos em toras de S. micranthum

expostas em ambiente florestal em doze meses.
Identificação da espécie L. theobromae
As colônias de L. theobromae apresentaram crescimento rápido, com 10 dias o

micélio havia tomado toda a superfície do meio de cultura das placas, formado por micélio
aéreo aveludado a cotonoso de coloração inicialmente branca e conforme o envelhecimento
cinza a preto. O reverso da colônia apresentou coloração preto escura. Não foram
observados quaisquer tipos de pigmentação, setores ou zonação. Houve produção de
picnídios após 25 dias de incubação a 27 0C, sob fotoperíodo de 12 h. Também, há
gotículas de exsudatos transparentes sobre os picnidios. Os picnídios são escuros, globosos
e ostiolados. Células conidiogênicas holoblásticas, cilindricas, hialinas e lisas. Os
picnídiósporos ou conídios na fase imatura foram inicialmente hialinos, globosos,
crespados (granuloso), enquanto que, na fase madura apresentaram coloração marrom claro
a escuro, elipsoidais a ovóides, 21-29 µm x 7-17 µm e tornaram-se bicelular, com septo
51
transversal. Estas características são semelhantes a descritas por Sutton (1980) e Barnett e
Hunter (1998).
Conforme analise dos dados da freqüência da ocorrência de L. theobromae nos discos

foi observado logo na primeira coleta, pois o fungo ataca a árvore assim que é derrubada,
podendo prolongar o ataque durante a secagem do tronco, e inclusive, penetrar nos tecidos
da madeira corroborando com as observações feitas por Scheffer (1973); Oliveira et al.,
(1986); Mesquita et al., (2006). Ainda de acordo com estes autores, este fungo utiliza como
fonte de nutrientes, o amido e açucares presentes no lúmen das células de reservas das
madeiras, mas pode eventualmente se nutrir de outros constituintes ao adentrar a parede
celular na fase avançada de ataque. Por se utilizar materiais de reservas da madeira, em
geral, este fungo restringe seu ataque ao alburno, ficando o cerne praticamente intacto.
Todos os isolados de L. theobromae foram obtidos a partir de amostras que apresentavam
coloração azul (blue stain). Segundo Scheffer (1973); Cavalcante (1982); Oliveira et al.,
(1986), fungos que causam manchas na região do alburno da madeira, geralmente
apresentam hifas pigmentadas, características de L. theobromae, ou secretam substâncias
coloridas produzidas por eles. Os autores afirmam, ainda, que estes fungos podem causar
manchas profundas na região do alburno, restringir o seu uso e consequentemente
comprometendo com o valor comercial da madeira.
Neste contexto, as manchas de L. theobromae em madeiras tem sido objeto de

estudos por partes de vários pesquisadores em diversas regiões. Na África, L. theobromae
tem sido relatado como o principal causador de mancha azul de madeiras úmidas
(Fougerousse 1958); no Peru, o fungo foi isolado em mais de 27 espécies florestais cujas
amostras apresentavam mancha azul (Segura 1970) e na Venezuela o fungo tem causado
sérios danos nas espécies Pinus caribea var. hondurensis, Ceiba pentandra, Acacia
mangium, Eucalyptus urophylla (Mohali e Encinas 2001, Mohali et. al., 2007). Na
Amazônia Brasileira, L. theobromae ocorre em várias espécies florestais da região
amazônica. No estado do Amazonas, estudos de Mendonça e Jesus (1999) relatam que dos
269 fungos da Coleção de Cultura de Micro organismos de Interesse Agrossilvicultural do
INPA.L. theobromae, foi isolado de sete espécies florestais, oriundas de quatro indústrias
madeireiras Ceiba pentandra (L.) Gaerth, Carapa guianensis Aubl., Erisma calcaratum
52
(Link) Warm., Hevea brasiliensis Müll. Arg., Hura creptans L., Schefflera morototoni
(Aubl.) Lecne & Planch, Virola sirinamensis (Rol.) Warb. e em Manaus o L. theobromae
ocorreu em 12 doze espécies florestais oriundas de quatro indústrias madeireiras (Hanada et
al., 2003). Estes foram os primeiros estudos que abordaram a colonização L. theobromae
associado à espécie florestal ao longo do ano em condições naturais de floresta.
Além de L. theobromae ser um fungo sapróbio é considerado o principal responsável

por manchas e bolores em madeira das regiões tropicais e subtropicais e pode colonizar em
serrapilheira, sobre plantas, associado a insetos dentre outros segundo Grandi (1998), e
Mohali et al., (2005), cita que é um patógeno comum, difundido de árvores lenhosas
tropicais, causando ferrugem em broto e doenças em árvores e arbustos e mancha azul em
madeira. Também, o fungo ocorre em culturas da gravioleira, ateira, sapotizeiro e cajueiro e
outras. Pereira et al., (2006); Viana et al., (2003) relatam que L. theobromae é considerado
um patógeno fraco, mas nos últimos anos, é responsável por doenças em inúmeras fruteitas
tropicais, onde se incluem as famílias Anacardiaceae e Anonaceae, causando perdas
significativas de produção, notadamente no nordeste brasileiro.
A ocorrência desse fungo em diversos ambientes e hospedeiros comprova a eficiente

capacidade de adaptação e o grau de evolução conforme a sua exigência fisiológica. Por
outro lado, o fungo apresenta características morfológicas e genéticas semelhantes entre os
isolados obtidos de diferentes substratos. Medeiros-Galvão (2008), estudando diversos
isolados de L. theobromae, de diferentes hospedeiros e substratos, inclusive obtidos de
madeira, por meios de caracterização moleculares, não observou diferenças entre eles.
Também neste trabalho não foram observadas diferenças morfológicos significativas entre
os isolados, confirmando, desta forma, que o fungo em estudo se trata da mesma espécie,
apesar das diferentes procedências de isolamentos, hospedeiros e substratos.
Conclusão
O fungo L. theobromae foi isolado do alburno de S. micranthum exposto em

ambiente florestal, sendo que na primeira, quarta e sexta coleta, obteve-se maior numero de
isolados da madeira.
53
Referências
Barnett HL, Hunter BB (1998). Illustrated genera of imperfect fungi. 4thed. The American
Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota. 218p.
Bastos TX, Rocha EJP, Rolim PAM, Diniz TDAS, Santo ECR, Nobre RAA; Cutrim RMS,
Mendon’car LD. (1986). Climate of Brazilian Amazon region for a agricultural purpose a
state-of-the-art.1 In.: Proceeding of the 1º Symposium of the Humid Tropics held in Belém,
Pará. Vol. 1. Climate and Soil. EMBRAPA-CPATU. Documento 36: 19-36.
Cavalcante MS (1982). Deterioração Biológica e Preservação de Madeiras. IPT. Instituto de

Pesquisas do Estado de São Paulo. Divisão de Madeiras, Pesquisas e Desenvolvimento. São
Paulo. 41.
Dhingra OD Sinclair JB (1995). Basic plant pathology methods. 2. ed. Boca Raton.: CRC
Press, 434.
Dix NJ, Webster J (1995). Fungal Ecology.Chapman & Hall.London. 549.
Dugan FM. (2006) The identification of fungi. An illustrated Introduction with keys,
Glossary, and Guide to Literature.The American Phytopathological Society. Minnesota.
U.S.A. 175.
Fourgerousse M (1958). Les alteration fungiques dês bois frais em Afrique Tropicale et
plus particulierment de l’llomba et du limba. Bois et Forest te Tropiques, 60: 41-56.
Freitas JÁ, Vasconcelos JF, Silva NB, Loureiro AA (1992). Madeiras da Amazônia que
apresentam raios largos. Acta Amazônica 22 (1): 61-91.
Grandi RAP (1998). Taxonomia de Deuteromicetos. In: Bononi, V.L.R., Coord.

Zigomicetos, Basidiomicetos e Deuteromicetos “Noções básicas de taxonomia e aplicações
biotecnologica”. Instituto de Botânica, Secretaria de Estado do Meio Ambiente, São Paulo,
184.
54
Hanada RE, Sales-Campos C, Abreu RLS, Pfenning L (2003). Fungos emboloradores e
manchadores de madeira em toras estocadas em indústrias madeireiras do município de
Manaus, Amazonas, Brasil. Acta Amazonica 33 (3): 483-488.
INPA/CPPF (1991. Catalogo de Madeiras da Amazônia: Características Tecnológicas. Área

da Hidrelétrica de Balbina. Manaus, Amazonas. 163.
Loureiro AA, Silva MF, Alencar JC. (1979). Essências madeireiras da Amazônia v. 2.
CNPq/INPA/ SUFRAMA. Manaus. 230p.
Loureiro AA, Silva MF (1968). Catálogo das Madeiras da Amazônia. SUDAM. Belém, 1:
125-131.
Medeiros-Galvão RS (2008). Diversidade de linhagens de Botryosphaeria rhodina

produtoras de jasmonatos, Manaus, Brasil 198p. (Tese de Doutorado Universidade Federal
do Amazonas – UFAM).
Mendonça ACA, Jesus MA (1999). Ocorrência de fungos manchadores e de bolor em

madeiras Amazônicas. V Congresso e Exposição Internacional sobre Florestas-FOREST`
99. Centro de Convenções de Curitiba. Curitiba- Paraná- Brasil.
Mesquita JB, Lima JT, Trugilho PF (2006). Micobiota associada à madeira serrada de
Eucalyptusgrandis Hill ex Maiden durante a secagem ao ar livre. Ciência Florestal, Santa
Maria 16 (1): 45-50.
Mohali S, Encinas O. (2001) .Association of Diplodiamuticola with blue stain of Caribbean

Pine in Venezuela.For.Path 31: 187-189.
Mohali S, Encinas O (2001). Association of Diplodia muticola with blue stain of Caribbean
Pine in Venezuela.For.Path 31: 187-189.
Mohali S, Burgess TI, Wingfield MJ (2005). Diversity and host association of the tropical
tree endophyteLasiodiplodiatheobromae revealed using simple sequence repeat markers.
Forest Pathology 35: 385–96.
55
Mohali SR, Slippers B, Wingfield MJ, Michael J (2007). Identification of
Botryosphaeriaceae from Eucalyptus, Acacia and Pinus in Venezuela. Fungal Diversity 25:
103-125.
Oliveira AMF, Leis AT, Oliveira ES, Lopes GAC, Oliveira LCS, Canedo MD, Milano S
(1986). Agentes destruidores da Madeira. In: Oliveira, E.S. (Ed). Manual de Preservação de
Madeiras. IPT, São Paulo, 1. 99-278.
Oliveira ML, Luz, EDMN (2005). Identificação e manejo das principais doenças do
cacaueiro no Brasil. Ilhéus. CEPLC/CEPEC/SEFIT. 132.
Paes JB, Melo RR, Lima CR (2007). Resistência natural de sete madeiras a fungos e cupins
xilófagos em condições de Laboratório. Cerne, Lavras. 13(2): 160-169.
Pereira AL, Silva, GS, Ribeiro VQ (2006). Caracterização Fisiológica, Cultural e

Patogênica de Diferentes Isolados de Lasiodiplodia theobromae. São Luiz–Maranhão.
Fitopatologia Brasileira 31(6): 572-578.
Punithalingam, E (1976). Botryodiplodia theobromae. C.M.I. – Descriptions of pathogenic

fungi and bactéria. N. 519.
RADAM (1978). Programa de Integração Nacional. Levantamento de Recursos Naturais.

V-18 (Manaus)–RADAM (projeto) DNPM, Ministério de Minas e Energia. 620.
Sales-Campos C, Abreu RLS, Vvianez BF (2000). Indústrias Madeireiras de Manaus,

Amazonas, Brasil. Acta Amazônica 30(2): 319-331.
Santos FEM, Sobrosa RC, Costa IFD, Corder MPM (2001). Detecção de Fungos
Patogênicos em Sementes de Acácia-Negra (Acácia mearnsii De Wild). Ciência Florestal,
Santa Maria 11(1): 13-20.
Scheffer TC (1973). Microbiological degradation and the causal organism. In: Nicholas,
D.D. (Ed.) Wood deterioration and its prevention by preservative treatments. Syracuse
University Press, Syracuse 11. 31-106.
56
Segura CB (1970). Mancha azul de algumas madeiras tropicales Peruanas. Revista
Florestal del Peru 4(1-2): 25-30.
Silva SC, Silva MFGF; Filho ER, Souza A, Muller MW (2004). Identificação de fungos
isolados de Khayaivoresnis(Meliaceae). XXVI Reunião Anual sobre Evolução Sistemática
e Ecológica Micromoleculares. Instituto de Química. Universidade Federal Fluminense.
Sutton, BC (1980). The Coelomycetes: fungi imperfecti with pycnidia acervuli and
stromata. Kew: Commonwealth Mycological Institute. 696p.
Viana FMP, Freire FCO, Cardoso JE, Vidal JC (2003). Principais Doenças do
Maracujazeiro na Região Nordeste e seu Controle. Fortaleza-CE. Embrapa Agroindústria
Tropical. (Embrapa Agroindústria Tropical, Comunicado Técnico, 86) 11p.
57
Fungos presentes em um ambiente lêntico do Município de Iranduba –

Região Amazônica
Cortez A.C.A1, Souza J.V.B2, Rocha L.C2, Silva T.K.S2, Sanches M.A.3, Freire A.K.L4,
Zelski S.E.5
1
Programa de pós-graduação da Bionorte –UFAM, 2 Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, 3Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas- UFAM, 4 Programa de
Pós-graduação em Medicina tropical- FMT, 5 Uiversity of Illinois
E mail: [email protected]
Resumo
Os fungos são importantes decompositores de madeira e detritos herbáceos
presentes em ambientes aquáticos. Mesmo sabendo desta importância ecológica, não
existem investigações descrevendo a diversidade de fungos presentes nos ambientes
aquáticos da Amazônia. O objetivo da presente pesquisa foi investigar a biodiversidade
de fungos decompositores de madeira submersa em um lago do município de Iranduba-
Região Amazônica. Foram realizadas 4 coletas de fragmentos de madeira submersa
presentes em um lago do município de Iranduba-AM-Brasil. Duas dessas foram
realizadas na estação chuvosa e duas na estação não-chuvosa. Os fragmentos de madeira
foram incubados e durante 6 meses, os fungos que se desenvolveram foram
identificados/isolados. Observou-se 259 indivíduos pertenceram a 25 taxa do Filo
Ascomycota, sendo 15 Ascomycetes e 10 Fungos anamorfos. Nos meses chuvosos
foram observados 23 espécies e nos meses não chuvosos foram 14 espécies. Maior
diversidade e menor equitabilidade foi observada no período chuvoso. Os fungos mais
frequentes pertencem a classe dos Sordariomycetes.
Palavras-chave: biodiversidade, fungos de água doce, região Amazônica.
Introdução
Os fungos são importantes decompositores de madeira e detritos herbáceos

presentes em ambientes aquáticos. Os ecossistemas aquáticos são classificados em
marinhos, onde temos os oceanos, os estuários, os recifes de corais e os manguezais; e
ecossistemas continentais que são divididos em três classes: a) lóticos constituído
pelos rios, riachos, córregos e aquíferos subterrâneos; b) lênticos constituído pelos lagos
e as lagoas e c) os híbridos (Jones and Pang, 2012; Nunes et al., 2013). Quanto aos
ecossistemas continentais, a Amazônia é uma das mais importantes coleções de
58
ambientes aquáticos. Localiza-se no Norte do Brasil, América do Sul, na qual encontra-
se a maior floresta tropical e bacia de água doce do mundo (Avila-Cabadilla et al.,
2009).
Os fungos presentes nos ambiente aquáticos podem ser classificados como
residentes que reproduzem-se e são apenas encontrados nos ambientes aquáticos; e
transeuntes que são aqueles carreados para esse ambiente. Os fungos presentes nos
ambientes aquáticos pertencem aos filos Chytridiomycota, Ascomycota e
Basidiomycota (Shearer et al., 2007). Os Ascomycetes presentes nos ambiente
aquáticos são sapróbios, colonizam e decompõem os substratos submersos, sendo
importantes na cadeia alimentar como fonte de alimento para os invertebrados (Simonis
et al., 2008). As classes mais encontradas nos ambientes de água doce são
Leotiomycetes, Dothideomycetes e Sordariomycetes (Shearer et al., 2007). Mesmo
sabendo-se desta importância ecológica, não existem investigações descrevendo a
diversidade de fungos presentes nos ambientes aquáticos da Amazônia. O objetivo da
presente pesquisa é investigar a biodiversidade de fungos decompositores de madeira
submersa em um lago do município de Iranduba-Região Amazônica.
Material e Métodos
Foram realizadas 4 coletas de fragmentos de madeira submersa (n=30/coleta)

presentes em um lago conhecido como “Parque das Águas San Raphael”, localizado no
Km 25 da estrada Manuel Urbano (AM 070), coordenadas de 3°16'35"S e 60°26'87"W
pertencente ao município de Iranduba-AM-Brasil. Esse lago foi formado na década de
70 pelo represamento do “Igarapé da Cachoeira Grande”. Possui aproximadamente
65.000 m2, forma oval e profundidade de 0,8 a 2 m. A estação chuvosa ocorre nos
meses de dezembro a maio e a não chuvosa de junho a novembro (Ferreira et al., 2005).
Duas coletas foram realizadas na estação chuvosa (março/2013 e fevereiro/2014) e duas
na estação não-chuvosa (agosto e novembro/2013). Devido à ausência de estudos
prévios de caracterização da água, o presente trabalho realizou a investigação de
algumas variáveis físico-químicas da água, incluindo: temperatura, potencial
hidrogeniônico (pH), condutividade elétrica, transparência, concentração de oxigênio e
potencial de saturação.
Os fragmentos de madeira foram incubados em câmaras úmidas e as amostras
foram dimensionadas quanto ao seu comprimento e diâmetro e incubadas à temperatura
59
ambiente e a cada 7 dias durante 6 meses. Os fungos que se desenvolveram foram
transferidas para lâminas de microscopia contendo água destilada e identificados, os
Ascomycetes é realizada com base na morfologia do ascomata, hematecium, ascos e
ascósporos; os fungos mitospóricos estão sendo identificados investigando os tipos de
conidiogêneses e conídios. Para o isolamento, tranferiu-se as estruturas fúngicas para a
superfície de Ágar Água Antibiótico e as colônias desenvolvidas foram transferidas para
o meio de cultura Ágar PYG (Raja et al., 2009; Zelski et al., 2011)
Resultados
Na caracterização da água os resultados encontrados para a temperatura foi a

mínima de 27,9 C e a máxima de 30,0 °C, com valor médio de 28,5 C. As
concentrações de pH variaram de 4,2 a 4,8 com valor médio de 4,4. A condutividade
elétrica mínima foi de 7,5 µS/cm e a máxima de 8,5µS/cm, com valor médio 8,0µS/cm.
As concentrações de oxigênio variaram de 5,19 mg/L a 5,71 mg/L, com valor médio de
oxigênio dissolvido de 5,41mg/L. O potencial de saturação foi de 54,8 a 67,8, com valor
médio 63. A transparência permaneceu inalterada em todas as coletas. O comprimento
das amostras variou entre 6-22 cm (média de 12,66 cm) e o diâmetro entre 4 e 15 cm
(média de 8,67 cm). Até o presente momento nas 120 amostras de madeira que foram
coletadas, duas na estação chuvosa (março/2013 e fevereiro/2014) e duas na estação
não-chuvosa (agosto e novembro/2013), nas quais observou-se 259 indivíduos que
pertencem a 25 taxa do Filo Ascomycota, sendo 15 Ascomycetes e 10 fungos
anamorfos. Nos meses chuvosos, foram observados 125 fungos contidos em 23
espécies, sendo 13 Ascomycetes e 10 fungos anamorfos. Os índices de diversidade (H’)
e equitabilidade (E) foram 2,6514 e 0,616255, respectivamente. Nos meses não
chuvosos, ocorrem 134 espécimes distribuídas em 14 espécies, sendo 12 Ascomycetes
e 2 fungos anamorfos. Os índices de diversidade (H’) e equitabilidade (E) foram 2,2084
e 0,650082, respectivamente. Quanto avaliadas ambas estações, o índice de similaridade
de Sorenson foi de 0,6486. Os fungos mais frequentes pertencem a classe dos
Sordariomycetes seguido pelos fungos anarmorfos.
Discussão
60
A falta de conhecimento sobre os fungos encontrados nas águas da região
Amazônica foi o que motivou este estudo, logo, este é apenas o começo desta
investigação, pois, coleções futuras são necessárias para podermos descrever os fungos
presentes neste ambiente, assim como a sua importância para o ecossistema da região,
onde, os mesmos são considerados a base da cadeia alimentar, principalmente nas águas
pretas que compõem a rede hidrográfica da bacia Amazônica. Os resultados das águas
analisadas apresentaram características físico-químicas similares a de outros ambientes
lênticos de águas pretas da região Amazônica e não apresentaram diferenças quanto a
sazonalidade (Pinto et al., 2009).
Os dados encontrados diferem dos ambientes lacustres da China, onde a

temperatura mínima foi de 11C e a máxima foi de18 C, assim como o pH, onde o
mínimo foi de 6,9 e o máximo de 8,6 (Luo et al., 2004). Os resultados de diversidade
encontrados são similares com os descritos por Luo et al. (2004) em ambientes lacustre
na China, onde os fungos mais frequentes foram os Ascomycetes (56) e os Fungos
anamorfos (46), não ocorrendo diferença significativa entre as coletas. No entanto, Hu
et al. (2010), também descreveram que em ambiente lacustre na Tailândia, o fungo
mais frequente é Ascomycetes entre os 7 taxa encontrados,. Mesmo que os taxa dos
fungos anamorfos (16 taxa) seja os mais predominantes,os índices foram similares ao
presente estudo, diferindo apenas quanto ao índice de similaridade que e menor (0,12),
comparado ao obtido neste estudo (0,64), ambos estudos demonstram que a diversidade
de cada ambiente é alto, mesmo para o ambiente lêntico que é considerado pobre
quando comparado com o ambiente lótico, sendo os resultados similares ao de
diversidade de fungos presentes em ambientes aquáticos na região Amazônica.
Conclusões
Nas 120 amostras de madeira coletadas foram isolados 259 indivíduos

pertencentes a 25 taxa do Filo Ascomycota, sendo 15 Ascomycetes e 10 fungos
anamorfos.
A maior diversidade e menor equitabilidade foi observada no período chuvoso.

Quanto avaliadas ambas estações, o índice de similaridade de Sorenson é 0,6486.
61
Os fungos mais frequentes pertencem a classe dos Sordariomycetes, seguido
pelos fungos anamorfos. As águas analisadas apresentaram características físico-
químicas similares a de outros ambientes lênticos da região Amazônica.
Referências
Avila-Cabadilla LD, Stoner KE, Henry M, Añorve MYA (2009) Composition, structure
and diversity of phyllostomid bat assemblages in different successional stages of a
tropical dry forest. Forest Ecology and Management 258:986–996. doi:
10.1016/j.foreco.2008.12.011
Ferreira SJF, Luizão FJ, Dallarosa RLG Precipitação interna e interceptação da chuva
em floresta de terra firme submetida à extração seletiva de madeira na Amazônia
Central . 1. 35:55–62.
Hu D, Cai L, Chen H, et al (2010) Fungal diversity on submerged wood in a tropical

stream and an artificial lake. Biodiversity and Conservation 19:3799–3808. doi:
10.1007/s10531-010-9927-5
Jones EBG, Pang K-L (2012) Tropical aquatic fungi. Biodiversity and Conservation
21:2403–2423. doi: 10.1007/s10531-011-0198-6
Luo J, Yin J, Cai L, et al (2004) Freshwater fungi in Lake Dianchi , a heavily polluted
lake in Yunnan, China. Fungal Diversity 16:93–112.
Nunes MV, Ferreira MJ, Reginato R (2013) Estudo das diferenças das variáveis
abióticas de um riacho de pequena ordem e de uma represa. Fórum Ambiental 9:351–
359.
Pinto AGN, Silva MSR, Pascoaloto D, Santos HMC (2009) Efeitos da contribuição
antrópica sobre as águas do rio negro, na cidade de Manaus, estado do Amazonas.
Caminhos de Geografia 10:26–32.
Raja HA, Schmit JP, Shearer CA (2009) Latitudinal, habitat and substrate distribution
patterns of freshwater ascomycetes in the Florida Peninsula. Biodiversity and
Conservation 18:419–455. doi: 10.1007/s10531-008-9500-7
Shearer CA, Descals E, Kohlmeyer B, et al (2007) Fungal biodiversity in aquatic

habitats. Biodiversity and Conservation 16:49–67. doi: 10.1007/s10531-006-9120-z
Simonis JL, Raja HA, Shearer CA (2008) Extracellular enzymes and soft rot decay :
Are ascomycetes important degraders in fresh water? Fungal Diversity 31:135–146.
Zelski SE, Raja HA, Miller AN, Shearer CA (2011) Longicollum biappendiculatum
gen. et sp. nov., a new freshwater ascomycete from the Neotropics. Mycosphere 5:539–
545.
62
Estudos da atividade de fungicidas para o controle do crescimento de

Trichoderma sp em meio de cultura de micropropagação de plantas
Costa, J. S.1, Atroch, E.M.A.C.1, Nagao, E.O.1
1
Universidade Federal do Amazonas, UFAM, Av. Gal. Rodrigo Otávio 3000 Coroado Manaus AM.
E-mail: [email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
Com o objetivo de avaliar a eficiência de alguns fungicidas na inibição de

Trichoderma sp. testes in vitro foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais do ICB/UFAM. Os fungicidas utilizados foram: Amistar, Cuprogarb, Manzate,
Priori. Os tratamentos foram compostos pela adição ao meio de MS dois fungicidas na
concentração de 0,1gL-1. A adição dos fungicidas foi realizada em duas condições, antes e
depois da autoclavagem do meio. A eficiência dos fungicidas foi verificada através da
aferição perpendicular dos diâmetros das colônias em milímetros, obtendo-se a média geral
por tratamento, e pela determinação da porcentagem de inibição do crescimento (PIC) dos
tratamentos em relação à testemunha, utilizando-se a fórmula: PIC = (diâmetro da testemunha
– diâmetro do tratamento x 100) / diâmetro da testemunha. A maior inibição do crescimento
dos inóculos de Trichoderma sp. ocorreu nos tratamentos com o fungicida sistêmico
Amistar® autoclavado e não autoclavado onde o percentual de inibição foi de 8,69a e 6,25a.
Os fungicidas Cuprogarb, Manzate, Priori apresentaram baixa eficiência no controle do
patógeno, evidenciando que o isolado em estudo é tolerante a estes produtos.
Palavras-chave: Metabolismo microbiano, controle de doenças, resistência a fungicidas.
Introdução
Indispensáveis na relação planta-hospedeiro, muitos microrganismos representam a

possibilidade das plantas ampliarem mecanismos de defesa e utilização dos recursos do
ambiente, a exemplo da importância de micorrizas e bactérias fixadoras de nitrogênio.
Entretanto, na cultura in vitro de plantas, os microrganismos geram o primeiro gargalo no
63
estabelecimento de microcultivos, sendo que a contaminação poderá ocorrer em diferentes
fases dos procedimentos necessários à introdução de plantas in vitro, desde as condições de
manutenção das plantas matrizes, que serão fontes de explantes, até a manipulação para
introduzi-los no meio de cultura. Assim, existem várias fontes de contaminação em todo o
processo que inclui o material vegetal, os instrumentos de trabalho, o ambiente laboratorial e
o trabalho dos técnicos (García, 2003). Além disso, muitos microrganismos se desenvolvem
endofiticamente sem representarem risco para as plantas na natureza, mas podem vir a
desenvolver-se na condição de microcultivo constituindo-se em contaminantes.
Desta forma, é fundamental associar boas práticas de manipulação ao emprego de

substâncias antimicrobianas que possam garantir o sucesso da assepsia. Para tal utilizam-se
agentes bactericidas e fungicidas, de amplo espectro, para o controle da contaminação. Este
cenário põe em destaque a eficiência de fungicidas e/ou bactericidas empregados, e suas
formas de uso nos protocolos de assepsia.
Muitos fatores influenciam o sucesso da descontaminação, como a origem do material,

se cultivado em condições fitossanitárias adequadas e suas características morfológicas, como
por exemplo, a presença de pelos na epiderme que dificultem os processos de limpeza e
descontaminação (Hussain, 2012). Nota-se também, em boa parte dos casos, que os fungos,
tais como Penicillium spp. Trichoderma spp. Lasiodiplodia spp. Xylaria spp são
contaminantes importantes. Assim, os protocolos de assepsia buscam combinar técnicas e
substâncias que possam funcionar tanto na planta matriz, em condição de viveiro, como nos
procedimentos em laboratório para limpeza dos microrganismos epifíticos e controle dos
endofíticos do explante. Quando tais métodos mostram-se ineficientes, existe a alternativa de
adicionar as substâncias descontaminantes ao meio de cultura. Contudo, a adição segura
desses compostos depende da estabilidade perante autoclavagem e da eficiência no controle
do crescimento dos organismos em questão. Ademais tal procedimento só deverá ser aplicado
quando esgotadas as possibilidades de promover a assepsia antes da inoculação do explante,
uma vez que fungicidas e bactericidas podem influenciar no desenvolvimento das plantas in
vitro, sendo escassos os estudos que tratem da segurança destas substâncias associadas à
micropropagação de plantas, conforme verificado por Msogoya et al (2012) em trabalho que
objetivou o controle do crescimento de bactérias e fungos no cultivo in vitro de banana, pela
adição de antibióticos e antifúngicos no meio de cultura.
64
Assim buscou-se avaliar a eficiência dos fungicidas dos grupos químicos azoxistrobina
(sistêmicos), ditiocarbamato e oxicloreto de cobre (ambos fungicidas de contato), adicionados
antes e após autoclavagem, ao meio de cultura de MS (1962), sobre o crescimento in vitro de
Trichoderma sp, com vistas a incluir substâncias fungicidas nos meios para micropropagação
em ensaios futuros.
Material e Métodos
O efeito de diferentes fungicidas no controle do Trichoderma sp foi analisado por
meio de testes in vitro, realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do
ICB/UFAM.
Os inóculos do fungo foram obtidos a partir da contaminação de gemas in vitro de
curauá (Ananas erectifolius L.B. Smith). Em seguida, repicados para placas de Petri com
meio constituído pelos sais de MS (Murashige e Skoog, 1962), empregado na
micropropagação de plantas, suplementado com 30 g L-1 de sacarose e 8 g L-1 de agar, e pH
ajustado para 5,8.
Os tratamentos foram compostos pela adição ao meio de MS de dois fungicidas do
grupo azoxistrobina (sistêmicos); e ditiocarbamato e oxicloreto de cobre (de contato), em
concentração de 0,1gL-1. A adição dos fungicidas foi realizada em duas condições, antes e
depois da autoclavagem do meio. Após a homogeneização foram vertidos em placas de Petri
de 15 cm. Com o meio solidificado, cada placa recebeu quatro discos de micélio de 07 mm
de Trichoderma sp. As condições de crescimento foram as da micropropagação, em sala de
crescimento com temperatura de 29±2 оC por sete dias, sendo as placas protegidas da luz.
Como testemunha foram utilizadas placas de Petri contendo meio de MS sem fungicida.
A eficiência dos fungicidas foi verificada através da aferição perpendicular dos
diâmetros das colônias em milímetros, obtendo-se a média geral por tratamento, e pela
determinação da porcentagem de inibição do crescimento (PIC) dos tratamentos em relação à
testemunha, utilizando-se a fórmula: PIC = (diâmetro da testemunha – diâmetro do tratamento
x 100) / diâmetro da testemunha.
A mensuração do crescimento micelial radial foi realizada a cada 24 horas, durante seis
dias.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e
duas repetições por tratamento com quatro inóculos por placa.
Resultados
65
Os fungicidas apresentaram efeitos diferenciados sobre o crescimento dos inóculos,
conforme detectado pela análise de variância (p≤0,01). A maior inibição do crescimento
ocorreu nos tratamentos com o fungicida sistêmico Amistar®, principalmente quando não
autoclavado (Tabela 1). Os tratamentos referentes a adição dos fungicidas de contato dos
grupos de ditiocarbamato autoclavado e oxicloreto de cobre, nas duas condições de
autoclavagem, não resultaram em nenhum controle do crescimento do fungo.
.
Tabela 1. Média dos efeitos dos tratamentos sobre o crescimento dos inóculos
Tratamento Crescimento
Ditiocarbamato não autoclavado 40.0 a
Priori® autoclavado (sistêmico) 29.7 b
Priori® não autoclavado 27.6 bc
Amistar® autoclavado (sistêmico) 24.7 cd
Amistar® não autoclavado 22.1 d
1
Médias seguidas pelas mesmas letras, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A porcentagem da inibição do crescimento (PIC) apresentou resultados diferenciados

em resposta aos tratamentos, de acordo com a análise de variância (p≤0,01). Confirmou-se a
maior atividade do fungicida Amistar®, autoclavado ou não, na inibição do crescimento dos
inóculos de Trichoderma sp. Notou-se que em alguns tratamentos, a presença do fungicida
estimulou o crescimento do fungo (PIC negativo), em lugar de inibição, e que tal condição
favoreceu quando o fungicida não foi autoclavado (Tabela 2).
Tabela 2. Média dos efeitos dos tratamentos sobre a porcentagem de inibição do

crescimento (PIC) em relação à testemunha (n=40)
Tratamento PIC
Ditiocarbamato não autoclavado -65,52c
Priori® autoclavado -14,01b
Priori® não autoclavado -24,11 ab
Amistar® autoclavado 8,69a
Amistar® não autoclavado 6,25a
1
Médias seguidas pelas mesmas letras, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
66
Discussão
A frequência da contaminação por fungos resultou em procedimentos que inclui a

aplicação de substâncias fungicidas em alguma fase da micropropropagação, constituindo
parte da assepsia. Os fungicidas podem ser empregados desde os cuidados com a planta
matriz e/ou procedimentos de limpeza antes da inoculação (Barrueto Cid e Zimmerann,
2006), e até no próprio meio de cultura (Londe et al., 2007). De forma semelhante ao
verificado neste trabalho com Trichoderma sp (Quadro 1), Tavares e Souza (2005) relataram
alta eficiência de fungicida do grupo da Azoxistrobina, quando adicionados ao meio BDA,
para o controle do crescimento de Colletotrichum gloeosporioides. Também a adição do
fungicida Benomyl ao meio de MS, resultou em maior controle da contaminação por fungos
na micropropagação de Anacardium humile (LONDE et al., 2007). Utilizando vários tipos de
fungicidas no meio de MS para o estabelecimento in vitro de gemas laterais de mangueira,
Andrade et al. (2008) verificaram que a presença de fungicida Tebuconazole resultou em
maior controle da contaminação, enquanto que o meio com Mancozebe, também do grupo
ditiocarbamato, de forma semelhante ao desempenho desta substância aqui observado
(Quadros 1 e 2), apresentou os maiores índices de contaminação dos explantes, embora este
fungicida tenha demonstrado bom desempenho em experimentos de campo. Tal situação se
explica pela condição nutritiva do meio de MS que, rico em nutrientes minerais, e adicionado
de uma fonte de carbono, sem dúvida favorece o crescimento de microrganismos, os quais são
mais facilmente controlados quando a planta é cultivada no campo ou viveiro.
A inclusão de substância antibiótica ao meio de cultura precisa ser otimizada para

garantir a eficiência. Neste sentido, o procedimento de autoclavagem pode causar alterações
na eficácia dessas substâncias, como sugere os resultados aqui verificados para os fungicidas
Amistar® e Priori® quando não autoclavados (Quadros 1 e 2). Outro aspecto é que a decisão
de adicionar substâncias que inibem o crescimento de microrganismos in vitro, juntamente
com o explante, precisa também considerar a verificação de efeitos prejudiciais ao
desenvolvimento das plantas durante o microcultivo e no período de aclimatização.
Conclusões
O fungicida Amistar®, autoclavado, apresenta maior eficiência para o controle de

Trichoderma sp no meio de cultura de MS.
67
- A eficiência dos fungicidas foi alterada durante o processo de autoclavagem.
Referências
Andrade SEM, Oliveira WC, Reis Júnior FB, Charchar MJ, Faleiro, FG, Metha A, Texeira
JB, Peixoto JR (2008) Controle do crescimento e identificação de microrganismos
contaminates visando à micropropagação de gemas laterais de mangueira. Boletim de
Pesquisa e Desenvolvimento, n. 217. Embrapa Cerrados.
Barrueto LP, Zimmermann MJA (2006) Contaminação in vitro de plantas. Boletim de

Pesquisa e Desenvolvimento, Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 20
p.
García PC, Rivero RM, Ruiz JM, Romero L (2003) The role of fungicides in the physiology
of higher plants: implications for defense responses. The Botanical Review, 69:162–172.
Hussain A, Qarshi IA, Nazir H, Ullah I (2012) Recent Advances in Plant in vitro Culture.
Chapter 1: Plant Tissue Culture: Current Status and Opportunities. Disponível em:
http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/40180.pdf Acesso em: 20/8/2014.
Londe LN, Sousa CS, Vieira CU, Bonetti AM, Kerr WE (2007) Efeito do Benomyl e
identificação de fitopatógenos em meio MS para controle da contaminação na
micropropagação de Anacardium humile (Anacardiaceae). Bioscience Journal, Uberlândia,
23(3):94-100.
Msogoya T, Kanyagha H, Mutigitu J, Kulebelwa M, Mamiro D (2012) Identification and

management of microbial contaminants of banana in vitro cultures. Journal of Applied
Biosciences, 55:3987– 3994.
Murashige T, Skoog FA (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, 15:473-497.
Tavares GM, Souza PE (2005) Efeito de fungicidas no controle in vitro de Colletotrichum

gloeosporioides, agente etiológico da antracnose do mamoeiro (Carica papaya L.). Ciência e
Agrotecnologia, Lavras, 29(1):52-59.
68
Crescimento de rizobactérias em meio de cultura usando o

mesocarpo do babaçu (Orbignya phalerata Mart) como fonte de
carbono para fins biotecnológicos
Costa T.P.1, Menezes N.C.2, Oliveira L.A.1

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Tecnóloga em Petróleo e Gás, Mestre em
2
Agricultura no Trópico Úmido. Emails: [email protected],

Resumo
O Brasil é o maior produtor, consumidor e exportador de etanol, usando quase que
exclusivamente, a cana-de-açúcar. Na sua entressafra as usinas estão procurando usar
espécies que contêm amido, para que possam produzir álcool o ano inteiro. Na
Amazônia, onde o babaçu (Orbignya phalerata Mart) tem ocorrência espontânea em
suas matas, essa palmeira pode ser uma alternativa econômica e socialmente viável para
essa finalidade, devido ao alto teor de amido no mesocarpo de seus frutos. Micro-
organismos podem ser usados para a conversão dos componentes do mesocarpo,
convertendo-o em produtos de valor econômico, como o etanol. Portanto, este trabalho
teve como objetivo, selecionar rizobactérias capazes de utilizar o mesocarpo do babaçu
como fonte de carbono para fins biotecnológicos. Para isso foram testadas 40
rizobactérias em meio YMA, no qual se substituiu o manitol pela farinha do babaçu,
verificando a capacidade desses micro-organismos em degradá-la, avaliando seu
crescimento. Os resultados mostraram que 23 atingiram notas acima de 3,0 até o décimo
quinto dia de crescimento, indicando que usam eficientemente, a farinha do babaçu para
seus crescimentos. Dessas, 17 mostraram altas capacidades de degradar a farinha já no
terceiro dia de crescimento (notas acima de 3,0), indicando serem as melhores para
futuros testes visando a obtenção de produtos biotecnológicos de valores econômicos,
usando a farinha do babaçu como fonte de crescimento. Elas foram identificadas como
INPA R178, R234, R236, R262, R266, R268, R276, R277, R278, R279, R285, R288,
R296 e R298.
Palavras-chave: Metabolismo microbiano, farinha de babaçu, microbiota amazônica.
69
Introdução
O Brasil é o maior produtor, consumidor e exportador de etanol, com a sua
produção atingindo 28,6 bilhões de litros em 2014 (Estadão, 2015). Devido a isto, há
uma necessidade maior em investimentos em pesquisas a fim de encontrar outras
biomassas potenciais para a produção deste bioproduto (Lima, 1975; Bermann, 2008).
Diversas são as fontes propícias para a sua produção, entre elas, encontra-se o
babaçu, cuja farinha do mesocarpo apresenta cerca de 50-70% de amido (Peixoto, 1973;
Zuniga et al., 2013). Para que ocorra a conversão deste composto em etanol é necessário
que este seja hidrolisado e desta forma convertido em açúcares, podendo ser por
hidrólise ácida ou enzimática, ambas com a mesma finalidade de reduzi-lo a
monossacarídeos (Collares, 2011). Para isso são necessárias enzimas de interesse
econômico, como amilases, que já foram encontradas em isolados de rizobactérias, tais
como as do gênero Rhizobium (Oliveira et al., 2006, 2007).
O babaçu (Orbignya phalerata Mart.) é um tipo de palmeira que frutifica
durante todo o ano e seu fruto é utilizado para diversos fins, como na fabricação de
farinha e óleo comestível, produção de carvão e, etanol a partir do seu mesocarpo. É
nativo da zona de transição entre o cerrado e as florestas abertas do sul da Amazônia
com grandes extensões (cerca de 17 milhões de hectares) (Holanda, 2004; Clement,
2005). É uma palmeira bastante atrativa no setor energético de sustentabilidade, por
apresentar várias características favoráveis em relação à produção de biocombustível.
Portanto, este trabalho teve como objetivo, selecionar rizobactérias capazes de usar o
mesocarpo do babaçu como fonte de carbono para fins biotecnológicos.
Material e Métodos
Foram obtidos 40 isolados de rizobactérias da coleção bacteriana do Laboratório
de Ecologia e Biotecnologia de Micro-organismos da Amazônia, do Instituto Nacional
de Pesquisas da Amazônia (LEBMAM/INPA). Estes isolados foram testados em meio
YMA (Extrato de levedura, manitol e ágar), no qual se substituiu o manitol pela farinha
do babaçu. A matéria-prima utilizada foi a farinha do mesocarpo do babaçu, proveniente
do Município de Rio Preto da Eva/AM. Para a avaliação do teste de crescimento, os
isolados foram estriados em placas de Petri contendo o meio anteriormente citado e
avaliados por um período de 15 dias. Para cada isolado foram realizadas quatro
repetições, usando as notas de 1,00 (sem crescimento visível na zona 1) a 4,00 (máximo
crescimento na zona 4) (Figura 1), segundo o método de Oliveira e Magalhães (1999),
70
podendo ser atribuídas notas intermediárias, subdivididas em 0,25, ou seja, 1,00, 1,25,
1,50, 1,75, 2,00 e etc., até 4,00 (Figura 1), aumentando assim a precisão do método. As
avaliações foram realizadas a cada três dias, num total de quinze dias, sendo
considerados de baixo crescimento, os isolados que apresentaram valores de 1,00 a
2,00, crescimento mediano os com notas entre 2,06 a 3,00 e, crescimentos elevados, os
com valores de 3,06 a 4,00.
Figura 1. Ilustração do método de estriagem proposto por Oliveira e Magalhães (1999).
Sob as condições testadas em laboratório a uma temperatura média de 27°C, a maioria
dos isolados apresentou crescimento mediano ou elevado (Tabela 1). Os resultados
mostraram que 23 atingiram notas acima de 3,0 até o décimo quinto dia de crescimento,
indicando que usam eficientemente, a farinha do babaçu para seus crescimentos. Dessas,
17 mostraram altas capacidades de degradar a farinha já no terceiro dia de crescimento
(notas acima de 3,0), indicando serem as melhores para futuros testes visando a
obtenção de produtos biotecnológicos de valores econômicos, usando a farinha do
babaçu como fonte de crescimento. Elas foram identificadas como INPA R178, R234,
R236, R262, R266, R268, R276, R277, R278, R279, R285, R288, R296 e R298.
Segundo Oliveira e Magalhães (1999), as bactérias que crescem mais rapidamente no
meio de cultura, atingindo as notas máximas já nos primeiros dias de crescimento, são
as mais promissoras, pois conseguem usar os componentes do meio com mais
eficiência.
71
Tabela 1- Crescimento de rizobatérias em meio de cultura contendo farinha de babaçu.
Média dos isolados (dias)

Isolados 3 6 9 12 15
INPA_R001 1.00 1.25 1.25 1.25 1.25
INPA_R020 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
INPA_R028 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25
INPA_R178 3.07 3.20 3.80 4.00 4.00
INPA_R233 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
INPA_R234 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R236 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R260 1.20 1.80 4.00 4.00 4.00
INPA_R261 1.20 2.20 3.70 3.70 3.70
INPA_R262 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R263 1.20 2.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R264 1.15 1.50 1.70 1.70 1.70
INPA_R265 1.50 3.70 4.00 4.00 4.00
INPA_R266 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R267 1.15 1.50 2.00 2.00 2.00
INPA_R268 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R270 1.25 1.50 1.50 1.50 1.50
INPA_R272 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25
INPA_R273 1.15 1.25 1.50 1.50 1.50
INPA_R274 1.25 1.50 2.00 2.00 2.00
INPA_R275 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15
INPA_R276 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R277 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R278 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R279 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R280 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
INPA_R282 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R284 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R285 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R287 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
INPA_R288 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R289 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
INPA_R290 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
INPA_R291 1.50 2.75 3.00 4.00 4.00
INPA_R292 3.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R294 2.25 2.75 2.75 2.75 2.75
INPA_R295 1.15 1.75 1.75 1.75 1.75
INPA_R296 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R297 2.06 4.00 4.00 4.00 4.00
INPA_R298 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
72
A figura 2 mostra uma rizobactéria crescendo em uma placa de petri contendo farinha
de babaçu em substituição ao manitol e usando os demais componentes do meio YMA
segundo Vincent (1970). Observa-se que essa rizobactéria mostra um crescimento
elevado, com a zona 4 quase totalmente preenchida com crescimento, pela qual, usando
os critérios estabelecidos por Oliveira e Magalhães (1999), apresenta nota 3,75.
Figura 2. Rizobactéria crescendo em meio de cultura contendo farinha de babaçu e

mostrando nota 3,75.
Conclusões
A maioria das 40 rizobactérias testadas em meio de cultura contendo farinha de babaçu
apresentou crescimento mediano ou elevado.
As 17 rizobatérias que mostraram crescimentos elevados já no terceiro dia foram as
identificadas por INPA R178, R234, R236, R262, R266, R268, R276, R277, R278,
R279, R285, R288, R296 e R298.
Essas rizobactérias mostraram potencial para serem usadas em estudos futuros visando
transformar a farinha do babaçu em bioprodutos de valor econômico desejável.
Referências
Bermann, C. (2008). Crise ambiental e as energias renováveis. Cienc. Cult. 60(3):20-29.
73
Clement C.R., Lheras P.E., Van Leeuwen L.J. (2005). O potencial das palmeiras
tropicais no Brasil: Acertos e fracassos das últimas décadas. Agrociências, 9(1-2):67-
71.
Collares, M.R. (2011). Otimização do processo de hidrólise da mandioca “In natura”,

com o uso de enzimas Amilolíticas e Pectinolíticas. Dissertação de Mestrado,
Universidade Federal de Santa Maria- Programa de Pós Graduação em Engenharia de
Processos, Rio Grande do Sul.
Estadão. 2015. Produção de etanol no Brasil atinge recorde de 28,6 bi de litros em 2014.
http://economia.estadao.com.br/noticias/geral,producao-de-etanol-no-brasil-atinge-
recorde-de-28-6-bi-de-litros-em-2014,1696115.
Holanda A. (2004). Biodiesel e inclusão social. Brasília: Câmara dos Deputados,

Coordenação de Publicações – Série Cadernos de altos estudos; n.1. pg. 13-57.
Lima U.A. (1975). Produção do Etanol. Tecnologia das Fermentações. São Paulo,
Edgard Bücher. .pg.48-68.
Oliveira L.A., Magalhães H.P. (1999). Quantitative evaluation of acidity tolerance of

root nodule bacteria. Revista de Microbiologia, 30:203-208.
Oliveira, AN; Oliveira, LA; Andrade, JS. 2006. Enzimas hidrolíticas extracelulares de
isolados de rizóbia nativos da Amazônia Central, Amazonas, Brasil. Ciênc. Tecnol.
Aliment. , Campinas, 26(4): 853-860.
Oliveira, AN, Oliveira, LA, Andrade, JS. (2007). Produção de amilase por rizóbios,
usando farinha de pupunha como substrato. Ciênc. Tecnol. Aliment., 27: 61-66.
Peixoto, A.R. (1973). Plantas Oleaginosas Arbóreas. Biblioteca Rural. Ed. Nobel S.A.
In: Teixeira, M.A. Biomassa de babaçu no Brasil. Departamento de Energia – FEM –
São Paulo: Unicamp.
Zuniga A.D.G., Fronza P., Silveira M.R., Moura J.S., Edwin Elard Garcia Rojas E.E.G.
(2013). Hidrolise ácida da farinha do mesocarpo do coco babaçu visando a obtenção de
bioetanol. Enciclopédia Biosfera. Centro Científico Conhecer - Goiânia, 9(17):3549-
3555,
74
Macrofungos Agaricomycetes (Basidiomycota) não poróides da região

Amazônica incorporada à Coleção de Fungos Lignocelulolíticos/INPA
Couceiro, DM1; Jesus MA1
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Manaus –AM. E-mail:
Resumo
Os macrofungos não poróides, abriga espécies de fungos raramente estudadas. O

objetivo deste estudo é identificar o acervo de macrofungos não poróides depositados na
Coleção de Fungos Lignocelulolíticos/INPA. Os fungos são provenientes da Estação
Ecológica de Maracá e Parque Nacional do Viruá, ambos localizados no Estado de
Roraima e Reserva Biológica do Uatumã e, Campus do Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia/INPA e da Estação Experimental de Sivilcultura Tropical- ZF2/INPA e
Área Urbana de Manaus, todos localizados no Estado do Amazonas. Os espécimes dos
macrofungos não poróides foram identificadas e distribuídas em 5 famílias, 7 gêneros e
9 espécies: Aquascypha hydrophora, Caripia montagnei, Cotylidia aurantiaca,
Cymatoderma caperatum, C. elegans, Inflatostereum glabrum, Stereopsis hiscens var.
macrospora, Stereum hirsutum e S. ostrea. C. aurantiaca e I. glabrum são de primeira
ocorrência para o Estado de Roraima. O estudo possibilitou conhecimento de espécies
Agaricomycetes não poróides da região Amazônica, contribuindo com a ocorrência e
distribuição em áreas florestais de ambos Estados Amazonas e Roraima.
Palavras-chaves: Amazônia, Micobiota, Não poróide, Podridão branca.
Introdução
Reid em 1965 propôs uma nova família para fungos não poróides
(Aphyllophorales) (Talbot, 1973). Nesta proposta, as espécies de Stereaceae descritas
por Tabolt (1973) foram incluídas, de modo que os representantes dos macrofungos
(Podoscyphaceae) foram classificados como polifiléticos (Reid, 1965). No entanto
atualmente, estes fungos estão distribuídos em Meruliaceae, Omphalotaceae,
Phanerochaetaceae, Rickenellaceae e Stereaceae (GBIF, 2016; Mycobank, 2016).
Essas famílias abrigam algumas espécies de macrofungos raramente estudadas,

das quais a maioria só ocorre na Amazônia. Esses macrofungos são caracterizados por
75
basidiomas espatulados, infundibuliformes, pseudoinfundibuliformes ou merismatóides
e estipe esteroide, e as características microscópicas possui sistema hifal monomítico,
dimítico ou trimítico, presença de cistídias e gleocistídios, os basidiósporos podem ser
lisos, globosos, subglobosos a elípticos (Reid, 1995).
Os macrofungos não poróides desse grupo estão distribuídos com

predominâncias em zonas tropicais ou subtropicais (Reid, 1965), sendo relatados para a
região Amazônica com ocorrência em diversos substratos lignocelulolíticos tais como:
galhos, troncos de árvores em pé ou caído (Teixeira, 1995). Portanto são fungos
lignocelulolíticos, causadores de podridão branca, resultante da degradação da lignina,
celulose e hemicelulose do substrato, deixando o mesmo com a coloração esbranquiçada
(Gilbertson, 1980).
O estudo teve por objetivo identificar o acervo de macrofungos não poróides

depositado na Coleção de Fungos Lignocelulolíticos do INPA, visando obter
informações importantes sobre as espécies com potencial fitopatogênico, além de
contribuir com incremento do valor científico das coleções do Herbário do INPA.
Material e Métodos
As exsicatas dos macrofungos não poróides estão depositadas na Coleção de

Fungos Lignocelulolíticos do INPA. Os macrofungos são provenientes das seguintes
áreas: Estação Ecológica de Maracá (EEM), município de Amajari e Alto Alegre,
Parque Nacional do Viruá (PNV), município de Caracaraí, Estado de Roraima, Reserva
Biológica do Uatumã (RBU), município de Presidente Figueiredo, Campus do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA (CI) Manaus, Estação Experimental de
Sivilcultura Tropical- ZF2/INPA e área urbana de Manaus, todos localizados no Estado
do Amazonas. A identificação do acervo foi baseada nos caracteres macroscópicos, tais
como: a forma do basidiocarpo, cor e modo de fixação do macrofungo no substrato, e na
microscópica: esporos, tipos de hifa, presença ou ausência de cistídios e gleocistídios
(Reid 1995). As reações de amilóide e inamilóides das hifas e dos esporos foram
evidenciadas com aplicação dos reagentes de Melzer e KOH 3% e as gloecistídio com
Vermelho Congo de acordo com (Ryvarden e Johansen, 1980).
76
Na classificação das espécies foram usados às chaves de classificação com
descrições elaboradas por Lentz (1955), Reid (1965), Dennis (1970), Demoulin (1985);
Ryvarden e Hjortstam (1987), Jung (1987), Gilbertoni (2004), Figueiredo (2008) e os
sites que disponibilizam a descrição das espécies Mycobank,
(http://www.mycobank.org) e Index Fungorum (www.indexfungorum.org). Todas as
exsicatas identificadas serão incorporadas ao Herbário do Instituto Nacionais de
Pesquisas da Amazônia (INPA).
Um total de 23 exsicatas de macrofungos não poróides está incorporado na

Coleção de Fungos Lignocelulolíticos do INPA, e está distribuído de acordo com a nova
classificação em 5 famílias, 7 gêneros e 9 espécies (Tabela 1).
Dentre as espécies, S. hirsutum apresentou o maior número de espécimes (7)

coletados na área de fragmento florestal do Campus do INPA em período úmido, o qual
pode ser favorável para o seu desenvolvimento como saprófita ou parasítico. Seguido de
C. aurantiaca e I. glabrum ambos com (3), o que provavelmente deve-se aos diferentes
tratamentos silviculturais na Estação Experimental de Silvicultura Tropical - ZF2/INPA
que pode ter contribuído para desenvolvimento das espécies.
Tabela 1. Relação de espécies de macrofungos não poróides coletadas em vários

substratos em diferentes áreas da região Amazônica.
Áreas da Região Amazônica Nº de
Táxon Substrato
EEM PNV RBU ZF2 CI MAO espécimes
Meruliaceae
Aquascypha hydrophora (Berk.) D. A. Reid TC - - 1 - - - 1
Cymatoderma caperatum (Berk. & Mont.)
G - - - - - 1 1
D.A. Reid
TC - - - 1 - - 1
C. elegans Jungh.
RT - - - - 1 - 1
Stereopsis hiscens var. macrospora D. A.
BT - - - 1 1 - 2
Reid
Omphalotaceae
Caripia montagnei (Berk.) Kuntze G - - - 2 - - 2
Phanerochaetaceae
Inflatostereum glabrum (Lév.) D. A. Reid AM - 1 - 2 - - 3
77
Rickenellaceae
Cotylidia aurantiaca (Pat.) A.L. Welden TC - 3 - - - - 3
Stereaceae
AV - - - - 1 - 1
AM - - - - 1 - 1
Stereum hirsutum (Willd.) Pers.
TC - - - - 4 - 4
TS 1 - - - - - 1
S. ostrea (Blume & T. Nees) Fr. BT - - - 2 - - 2
Total 1 4 1 8 8 1 23
Legenda: Local EEM = Estação Ecológica de Maracá; PVN = Parque Nacional do Viruá;
RBU = Reserva Biológica do Uatumã; ZF2 = Estação Experimental de Silvicultura Tropical –
ZF2; CI = Campus do INPA; MAO = Área Urbana de Manaus. Substrato: AM = Árvore
morta; AV = Árvore viva; BT = Base de tronco; G = Galho; RT= Raiz de tronco; TC = Tronco
caído; TS = Tronco suspenso.
Comparando a distribuição das espécies de macrofungos não poróides com a

de outras regiões do Brasil, verifica-se que há um número maior de gênero e espécies,
ambos relatados por Dennis (1970); Reid (1965); Gilbertoni (2004) e Jung (1987) para a
região Amazônica.
Descrição das espécies:
Aquascypha hydrophora (Berk.) D.A. Reid – Esporóforo estipitado (1.2–2.0 cm),

pseudoinfundibuliforme para infundibuliforme, hifa trimítica com septo e ansa,
basidiósporo globoso para subgloboso (3 × 3.1–3.5 µm). Distribuição: Registro na
América do Norte e parte do Sul, principalmente para o rio Negro-AM (Reid, 1965).
Caripia montagnei (Berk.) Kuntze – Basidioma estipitado (0.8–10 mm), hifa

monomítica com ansas, basídia clavada (24–25 × 6 µm), gleocistídia presente e
basidiósporo elipsóide (5.4–6 × 2.8–3.2 µm). Distribuição: Rregistros na América do
Norte e Sul em zonas tropicais (Ginns, 2011).
Cotylidia aurantiaca (Pat.) A.L. Welden – Esporóforo estipitado (0.9 mm – 1 cm)

infundibuliforme para espatulado, hifa dimítica com septo e ansas, basídia clavada (29–
32 × 5 µm) e basidiósporo elíptico (5–6 × 3.8–4 µm). Distribuição: Registros na
América Tropical, Argentina: Província de Missiones, Bolívia: Província de Nor-Yugas
e Brasil: Amazonas, Juruá e Rio de janeiro (Reid, 1965).
78
Cymatoderma caperatum (Berk. & Mont.) D.A. Reid – Esporóforo estipe central (5
cm), flabelado, encontrado em semente, hifa dimítica com ansas, basídia clavada (48–50
× 5–6 µm) e basidiósporos elíptico para subgloboso (6.8–7.2 × 5–5.8 µm). Distribuição:
Registros em todos os continentes da América (Reid, 1965).
Cymatoderma elegans Jungh. – Esporóforo estipitado para espatulado (3–4.5 cm), hifa
dimítica com ansas, basídia clavada (24–25 × 5.8–6 µm) e basidiósporo elíptico (5.8–
6.2 × 3.5–4 µm). Distribuição: Registros em zonas tropicais da África do Sul e Ásia
(Reid, 1965).
Inflatostereum glabrum (Lév.) D.A. Reid – Esporóforo estipe central (0.5 mm – 1 cm),
hifa dimítica com septo e ansas, basídia clavada (20–22 × 3 µm) e basidiósporo
elipsoide (3–4 × 2.5 µm). Distribuição: Registros na América do Sul, Brasil: Trombetas,
Rio Aripecurú, Pará, Rio madeira. Ásia: Borneo, Ilha de Ceylon e Malásia (Reid, 1965).
Stereopsis hiscens var. macrospora D.A. Reid – Esporóforo espatulado para

frambelado, hifas dimítica com septo e ansas, basídias clavada (24–25 × 5 µm) e
basidiósporo elíptico (6.3–8 × 6–6.2 µm). Distribuição: Registros no Brasil: Manaus
(Reid, 1965).
Stereum hirsutum (Willd.) Pers. – Esporoforo piliado, hifa monomítica septo e ansas,
presença de pseudocistídia e gleocistídia, basídia clavada (23–25 × 5 µm) e
basidiósporo cilíndrico para elipsoide (7.2–7.5 × 2.8–3 µm). Distribuição: Registros em
zonas pantropical do mundo (Jungh, 1987).
Stereum ostrea (Blume & T. Nees) Fr. – Esporóforo piliado, hifa dimitica, basídia
clavada (28–30 × 5–6 µm), presença de pseudocistídia, basidiósporo cilíndrico para
elipsoide (5.2–6.4 × 2.8–4 µm). Distribuição: Registros na Europa, Ásia e América
(Jungh, 1987).
Conclusões
O estudo sobre fungos não poroides mostra oito espécies de Agaricomycetes não
poróides na região Amazônica, distribuídos em 18 espécimes no Estado do Amazonas,
sendo oito encontrados no Campus do INPA e Estação Experimental de Sivilcultura
Tropical- ZF2/INPA, ambas as áreas de maior ocorrência deste grupo de macrofungos, e
79
um na Reserva Biologica do Uatumã, enquanto que cinco foram encontrados no Estado
de Roraima, quatro no Parque Nacional do Viruá e um na Estação Ecológica de Maracá.
Todas as espécies de macrofungos não poroides são geralmente associadas a

zonas tropicais, embora sejam pouco estudadas no Brasil e no mundo. Dentre as
espécies, C. aurantiaca e I. glabrum são primeiro registros no Estado de Roraima.
Referências
Demoulin V (1985). Stereum fasciatum (Schw.) Fr. and S. lobatum (kunze : Fr.) Fr.
Two distinct species. Mycotaxon 13: 207-217.
Dennis RWG (1970) Fungus of Venezuela and Adjacent Countries. Kew Bulletin
Additional Series II. Her Majesty’s Stationery Office, London, 531p.
Figuêreido VR (2008). Estudos de Fungos Aphllophorales no sul da Bahia. Ilhéus-

Bahia, Brasil, 122p. (Dissertação), Mestrado em Produção Vegetal, Universidade
Estadual de Santa Cruz – UESC.
GBIF (2016) Global Biodiversity Information Facility: Backbone Taxonomy.

Disponível em: http://www.gbif.org/. Acessado em 10 de janeiro de 2016.
Gilbertoni TB. (2004) Aphyllophorales (Basidiomycotina) em Áreas de Mata Atlântica

do Nordeste Brasileiro. Recife-Pernambuco, Brasil, 277p. (Tese). Doutorado em
Biológia de Fungos, Universidade Federal do Pernambuco - UFPE).
Gilbertson RL (1980) Wood-rooting fungi of North America. 1a ed. Mycologia 72: 49

p.
Ginns J (2011) Caripia montagnei (Basidiomycota: Tricholomataceae s. l.) in

southeastern United States. North American Fungi 6:(5), 1-5.
Index Fungorum (2016) Disponivel em: http://www.indexfungorum.org/ . Acessado em

10 de janeiro de 2016.
80
Jung HS (1987) Wood-rotting Aphyllophorales of the southern Applachian spruce-fir
forest. Berlin, Stuttgart. Bibliotheca Mycologica. 255p.
Lentz PL (1955) Stereum and Allied Genera of Fungi in the Upper Missippi Valley.
Washington, D. C. Agriculture Monograph 24, 79p.
Mycobank Fungal Databases, Nomenclature & Species Banks. 2016. Disponível em:
http://www.mycobank.org/.
Mycobank. Fungal Databases Nomenclature and Species Banks. 2014.

http://www.mycobank.org/.
Reid DA (1965). A monograph of the stipitate stereoid fungi. Beihefte zur. Nova
Hedwigia 15: 388p.
Ryvarden L, Johansen I. 1980. A Preliminary Polypore Flora of East Africa. Fungiflora,

Oslo. 636.
Ryvarden L, Hjortstam K (1987) Stereum magellanicum sp. nov. from tierra del fuego.
Transactions of the British Mycological Society 89:(1), 114-116.
Talbot PHB (1973). Aphyllophorales I: General characteristics. Thelephoroid and

cupuloid families. In: Ainsworth, G. C, Sparrow, F. K. & Sussman, A. The fungi. An
advanced treatise. Vol. IV, Academic Press, Nova York. 327-349.
Teixeira AR (1995) Método para o estudo das hifas do carpóforo de fungos

políporaceos. São Paulo, Instituto de Botânica. 20p.
81
Respostas enzimáticas de defesa à murcha bacteriana.
Demosthenes L.C.R.1, Bentes J.L.S 2.
1
.Universidade Federal do Amazonas, UFAM
E-mail: [email protected], [email protected].
Resumo
A murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum é a principal doença
bacteriana de Solanáceas no Amazonas. Este trabalho teve como objetivo avaliar a
atividade de enzimas relacionadas com respostas de defesa em acessos de Capsicum
spp. previamente avaliados como fontes de resistência à doença. Foi avaliada a
atividade de polifenoloxidase (PPO), peroxidase (POX) e fenilalanina amônia liase
(FAL) em 12 acessos de Capsicum sp. nos períodos de 0, 24, 48, 72 e 96 horas após a
inoculação. A atividade enzimática variou conforme o nível de resistência dos acessos
avaliados e foi maior nas primeiras horas após a inoculação decrescendo após 72 horas.
A resistência dos acessos foi associada com a maior atividade da PPO e FAL, sendo o
acesso LA 01 o que apresentou a maior atividade destas enzimas dentre os acessos
avaliados, indicando que estas enzimas compõem o mecanismo de defesa bioquímico
em plantas de Capsicum.
Palavras-chave: murcha bacteriana, atividade enzimática, resistência.
Introdução
A murcha bacteriana causada pela bactéria Ralstonia solanacearum é uma
doença que ataca muitas espécies de plantas, dentre elas as solanáceas compreendem
uma importante cultura agrícola muito suscetível, representando um problema para os
produtores (Lopes e Boiteux, 2004). Na Região Norte as condições favoráveis de
elevada temperatura e umidade, contribuem para a ocorrência da doença que pode se
espalhar rapidamente e comprometer a produção em larga escala. A utilização de áreas
contaminadas com o patógeno, práticas culturais errôneas como a rotação com espécies
hospedeiras do patógeno, manejo incorreto da irrigação, ausência de uma cultivar
resistente e a variabilidade do patógeno dificultam a implementação de medidas que
sejam eficientes no controle da doença.
82
A interação entre patógeno e hospedeiro induz algumas mudanças no
metabolismo das células e dependendo do patógeno, rotas de sinalização específicas das
plantas são ativadas e levam à expressão de respostas de defesa como a resposta
hipersensitiva (HR), produção de espécies reativas de oxigênio, acúmulo de
fitoalexinas, a síntese de proteínas PR, atividades das enzimas, tais como fenilalanina
amônia liase (FAL), peroxidase (POX), polifenoloxidase (PPO), lipoxigenase (LOX)
entre outras (Silva et al., 2010).
O aumento da atividade de enzimas como a POX, PPO e FAL relacionadas com
fontes de resistência já foi demonstrada em vários patossistemas. Araújo e Stadinik (2011)
avaliando a atividade de enzimas em plântulas de macieira resistente e suscetível a mancha
foliar causada por Colletotrichum gloesporioides observaram o aumento da atividade da
POX associado à resposta da cultivar resistente. O objetivo deste trabalho foi investigar a
atividade enzimática de PPO, FAL e POX como resposta dos componentes de defesa em
acessos de Capsicum com diferentes níveis de resistência.
Material e Métodos
Os ensaios foram conduzidos em casa de vegetação em Manaus. Os acessos
foram semeados em mistura de terriço e substrato comercial Bioplant® na proporção de
3:1. Para a inoculação foi utilizado o isolado IRAND10 considerado o mais agressivo
em ensaio preliminar de agressividade. A inoculação foi realizada aos 30 dias de idade
após o ferimento das raízes, através da introdução de um bisturi próximo ao colo da
planta e vertendo-se 10 mL da suspensão de inóculo por planta. As avaliações foram
feitas aos quatro, oito, 12, 16, 20 e 24 dias após a inoculação (DAI) em função da
incidência e do desenvolvimento de sintomas da doença. A avaliação dos sintomas foi
visual através de uma escala de notas variando de 0 a 5 (Winstead e Kelman, 1952), O
delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco repetições. O
controle consistiu de dez plantas inoculadas com água destilada esterilizada. Os dados
foram submetidos ao teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade utilizando o
programa estatístico SAEG versão 9.0.
Para a atividade enzimática relacionada à defesa foram coletadas três folhas por
planta aos 0, 24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação, então embaladas em papel
alumínio, identificadas, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e levadas ao
laboratório para pesar e serem armazenadas à - 20 °C para os ensaios posteriores. Para a
83
determinação do teor de proteínas totais e atividade das enzimas PPO, FAL e POX,
amostras de 0,1 g de tecido foliar foram maceradas na presença de nitrogênio líquido até
a obtenção de um pó fino que foi homogeneizado em tampão acetato de sódio, coletado
em microtubos e centrifugados a 20.000G durante 30 minutos a 4 °C em centrífuga. O
sobrenadante foi recolhido em novos microtubos e estocado a - 20 °C para as
determinações enzimáticas. O teor de proteínas foi quantificadas segundo Bradford
(1976), a atividade de FAL foi determinada segundo Umesha (2006), a atividade da
PPO e POX conforme Kar e Mishra (1976).
Considerando o progresso da murcha bacteriana de acordo com os valores área
abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) os acessos AC NT e BC 05 foram
considerados resistentes apresentando menores valores, os acessos LA 01 e BC 01
moderadamente suscetíveis, os demais acessos foram considerados suscetíveis e os
acessos BC 06 e LA 02, com maiores valores de AACPD foram considerados altamente
suscetíveis.
A atividade de proteínas apresentou aumento inicial seguido pelo declínio alguns
dias após a inoculação (d.a.i). Nos cinco dias de coleta de amostras, somente os acessos
mais suscetíveis, como CD, BC 06 e LA 02 já apresentavam sintomas visíveis. Mesmo
não sendo detectadas diferenças nos sintomas entre os acessos, um aumento gradual no
teor de proteínas totais foi detectado a partir do 2º d.a.i..
Também foi verificada a mudança no padrão de atividade das enzimas FAL e PPO,
atividade da PPO foi significativamente maior nas plantas inoculadas do que no
tratamento controle, até o segundo d.a.i, quando atingiu seu máxima atividade. A
atividade da enzima FAL apresentou comportamento semelhante aumentando sua
atividade logo após a inoculação com o patógeno, alcançando o máximo no segundo
d.a.i. e reduzindo nos dias seguintes. A atividade de FAL foi 47% maior no acesso LA
01 quando comparada com o acesso suscetível BC 12. Houve diferença quanto na
dinâmica da POX durante o período de coleta para os acessos mais resistentes quando
comparado ao acesso suscetível e ao tratamento controle. Enquanto no acesso com
maior nível de resistência (LA 01) a atividade da POX apresenta um aumento mais
rápido, no acesso susceptível (CD) esta mobilização é mais lenta. No tratamento
84
controle o aumento embora gradual apresenta-se num ritmo bem mais lento. As enzimas
fenilalanina amônia liase (FAL), polifenoloxidase (PPO) e peroxidade apresentaram
maior atividade no acesso moderadamente resistente LA 01.
A diferença quanto à resposta de resistência apresentada por diferentes estirpes de
R.solanacearum em Capsicum também já foi identificada por Lopes & Boiteux (2004)
em estudo em Brasília, DF, onde avaliaram 23 acessos de Capsicum de vários países
considerados como resistentes à murcha bacteriana, e por Demosthenes e Bentes (2011)
também encontraram variados níveis de resistência entre acessos de Capsicum
inoculados com um isolado da biovar 1 e conseguiram identificar três acessos
resistentes (20, 30 e 17). Fatores ambientais como aumento na temperatura ambiente,
tipo de solo, manejo da irrigação também são fatores que podem contribuir para
manifestação da resistência diferenciada.
Em relação à atividade enzimática associada a respostas de defesa o resultado está
de acordo com os obtidos por Araujo e Stadnik (2011) que também detectaram aumento
no teor de proteínas totais em plântulas de macieira resistentes e suscetíveis inoculadas
com Colletotrichum gloesporioides nas primeiras horas após a inoculação com o
patógeno, indicando como a planta lança mão de suas reservas enzimáticas na tentativa
de controlar a invasão do patógeno.
As enzimas FAL e PPO podem estar atuando na defesa das pimenteiras quando
infectado por R.solanacearum, uma vez que dinâmica de aumento de atividade da FAL
e PPO logo nos primeiro e segundo dia após a inoculação sugere que a planta esteja
mobilizando suas respostas de defesa para conter a invasão e concorda com estudo de
Ngadze et al.. (2011) que ao estudarem o papel de diversas enzimas na resistência de
tubérculos de batata contra Pectobacterium atropsepticum também identificaram o
aumento dessas duas enzimas.
Os resultados encontrados neste estudo estáão de acordo com os de Vanitha et al.
(2009) que avaliaram o papel das ezimas PAL e PFO em tomateiro resistente e
suscetível e conseguiram identificar que a maior atividade destas enzimas, nas cultivares
resistentes, ocorreu as 12 e 15 horas após a inoculação com R. Solanacearum enquanto
nas cultivares suscetíveis a atividade ocorreu mais tardiamente, indicando que estas
duas enzimas tem papel importante na defesa do tomateiro à murcha bacteriana.
85
A resistência também pode ser mediada pelo peróxido de hidrogênio, que é
frequentemente associada com a atividade de peroxidades (POX). Houve diferença
quanto na dinâmica da POX durante o período de coleta para os acessos mais resistentes
quando comparado ao acesso suscetível e ao tratamento controle. Enquanto no acesso
com maior nível de resistência (LA 01) a atividade da POX apresenta um aumento mais
rápido, no acesso susceptível (CD) esta mobilização é mais lenta. No tratamento
controle o aumento embora gradual apresenta-se num ritmo bem mais lento. Esta
dinâmica pode ser entendida como a capacidade em mobilizar mais rapidamente seus
mecanismos de defesa bioquímicos na tentativa da planta barrar a colonização por
R.solanacearum. Neste estudo a atividade de POX foi menor quando comparada a
atividade da PAL, mas mesmo assim ela pode estar associada a outros mecanismos de
resistência atuando em acessos de Capsicum. Andrade et al., (2013) que também
avaliou a atividade de POX, PFO, GLU e LOX em resposta ao ataque de Pseudomonas
syringae pv. tomato em cultivares de tomateiro pulverizadas com ácido jasmônico,
etefon e Bion e constataram dinâmica semelhante, onde puderam correlacionar o
aumento na atividade das enzimas POX, PFO e LOX com a maior resistência
apresentada pelo tomateiro. Neste estudo a atividades dessas enzimas foi maior entre o
sexto e nono dias após a inoculação.
Conclusão
O aumento da atividade das enzimas FAL e PPO durante a infecção por R.
solanacearum nos acessos avaliados indica que estas duas enzimas atuam nos
componentes de defesa bioquímicos em Capsicum.
Referências
Andrade CCL, Resende RS, Rodrigues FA, Silveira PR, Rios JA, Oliveira J R, Mariano
RLR (2013) Indutores de resitência no controle da pinta bacteriana do tomateiro e na
atividade de enzimas de defesa, Tropical Plant Pathology 38: 28-34.
Araújo L, Stadinik M (2011) Processo infeccioso e atividade de enzimas em plântulas

de macieira de genótipo resistente ou suscetível à mancha foliar de Glomerella causada
por Colletotrichum gloesporioides. Tropical Plant Pathology 36: 241-248.
86
Bradford MMA (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical
Biochemistry 72: 248-254.
Demosthenes LCR, Bentes JLS (2011) Fontes de resistência à murcha bacteriana em

germoplasma de Capsicum spp. Acta Amazonica 41: 251-256.
Kar M, Mishra D (1976) Catalase, peroxidase and polyphenoloxidase activities during

rice leaf senescence, Plant Physiology 57: 315-319.
Lopes CA, Boiteux LS (2004) Biovar-specific and broad-spectrum sources of resistance

to bacterial wilt (Ralstonia solanacearum) in Capsicum, Crop Breeding and Applied
Biotechnology 4: 350-355.
Ngadze E, Icishahayo D, Coutinho DD, Van der Waals JE (2011) The role of
polyphenol oxidase, peroxidase, phenylalanine ammonia lyase, chlorogenic acid and
total soluble phenols in the resistance of potatoes to soft rot, Plant disease 96: 186-189.
Silva FAC, Santos RC, Azevedo Neto A, Granja MMC, Souza CCF, Melo Filho PA
(2010) Descritores bioquímicos em cultivares de algodoeiro em resposta a inoculação
com Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, Tropical Plant Pathology 35: 114-
118.
Umesha, S. (2006) Phenylalanine ammonia lyase activity in tomato seedlings and its
relationship to bacterial canker disease resistance. Phytoparasitica 34: 68-71.
Vanitha SC, Niranjana SR, Umesha S (2009) Role of Phenylalanine ammonia lyase and
polyphenol oxidase in host resistance to bacterial wilt of tomato. Journal of
Phytopathology 157: 552-557.
Winstead NN, Kelman A (1952) Inoculation techniques for evaluating resistance to

Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 42: 628-634.
87
Isolamento e caracterização de fungos endofíticos de Myristicaceae

com potencial de atividade antioxidante
Fernandes KRP1, Bittencourt PST2; Teixeira AF1, Souza AQL 2; Nunomura RCS2
Universidade do Estado do Amazonas – UEA, Manaus, AM, 2Universidade Federal do

1
Amazonas – UFAM. E-mail: [email protected]
Resumo
A pesquisa dos fungos endofíticos, principalmente os presentes em espécies tropicais, é

um campo promissor na descoberta de novos produtos fármacos. Não havendo estudos a
respeito da microbiota endofítica de Virola venosa a pesquisa em questão contribuiu
para a sociedade com novas informações a respeito desta espécie. Este trabalho tem
como objetivo principal avaliar o potencial antioxidante de fungos endofíticos isolados
de Virola venosa e dos extratos vegetais da hospedeira. Também foram realizados o
isolamento e identificação de fungos endofíticos de várias partes de V. venosa. Nos
ensaios de atividade antioxidante foram obtidos resultados representativos nos extratos
brutos de caule e folha, utilizando o radical livre DPPH, sendo que o extrato bruto do
caule apresentou IC50 igual a 55,9 µg/mL, e no ensaio de fenólicos totais a amostra
apresentou maior concentração de fenólicos (224,39 µg/mL) mostrando a relação
existente entre esta classe de substâncias e a atividade antioxidante.
Palavra chave: fungos endofíticos, Virola venosa, atividade antioxidante
Introdução
A Família Myristicaceae é amplamente distribuída nas regiões tropicais e

subtropicais. Caracterizada, principalmente, por ser árvores medianas, e árvores de
dossel. Constituída por cerca de 8 gêneros e 400 espécies, as Myristicaceas nas
Américas são representadas por cinco gêneros endêmicos, com aproximadamente 93
espécies. Virola é um dos gêneros mais amplamente disperso (Rodrigues, 1980).
Acredita-se que a maioria dos metabólitos secundários cumpre função de defesa
da planta contra predadores e patógenos, atuando como agentes alelopáticos, sendo que
os metabólitos são liberados para exercer efeitos sobre outras plantas e de atrair os
polinizadores.
Os metabólitos secundários considerados importantes para o ser humano são os
terpenóides, alcalóides, compostos nitrogenados derivados dos fenilpropanóides e os
88
compostos fenólicos, considerando que estas classes funcionam como reguladores de
rotas biossintéticas específicas e outras como reguladores pleitrópicos (Teixeira, 2007).
As plantas produzem substâncias de interesse econômico, provenientes de seu
metabolismo, mas contêm também, fungos que produzem substâncias importantes,
principalmente os decompositores dos componentes primários da madeira.
Pertencentes ao reino Fungi, os fungos são seres eucariotos, podendo ser
haplóides, diplóides ou poliplóides; são altamente eficientes na degradação de uma
ampla variedade de substratos (Minami, 2003).
Dentre os fungos, são considerados endofíticos aqueles que habitam o interior
dos tecidos vegetais sem causar mal ao hospedeiro, não desenvolvem estruturas
externas, excluindo as bactérias nodulantes e fungos micorrízicos” e que podem ser
cultiváveis ou não (Azevedo e Araújo, 2006).
Material e Método
Diferentes partes do material vegetal (galhos, folhas e caule) de V. venosa foram
coletadas na região urbana de Manaus no campus da Universidade Federal do
Amazonas – UFAM. Foram obtidos extratos hexânicos, de acetato de etila e
metanólicos através de extração a frio, e foram realizados o isolamento e caracterização
de fungos endofíticos.
Após a desinfecção, o material vegetal foi inoculado em placas de petri,
contendo meio de cultivo BDA. A partir da contagem das colônias purificadas foi
obtida a diversidade de fungos, determinando-se, agrupamentos de acordo com suas
características morfológicas.
A obtenção dos metabólitos ocorreu através da seleção de 20% dos morfotipos
de cada grupo morfológico, do qual foram inoculados em meio líquido BDL, e em
seguida foram incubados em shaker, com agitação 120 rpm por 15 dias em 28°C. Os
sobrenadantes foram direcionados a extração em coluna SPE C18, e com o micélio foi
realizada a extração com metanol após 72h (Souza et al., 2004)
A atividade antioxidante dos extratos foram avaliados com base na captura de
radicais livres de DPPH. Inicialmente 200 µL de uma solução metanólica de DPPH 100
mM foram misturadas com 20 µL de extrato (ou padrão). Após mistura, permaneceram
durante 30 minutos encubados na ausência de luz (Moein et al., 2007). O ensaio foi
realizado em um leitor de microplacas ELX 800 no comprimento de onda de 490 nm.
89
O ensaio de fenólicos totais foi realizado adicionando 0,750 mL de solução folin
ciacateau 2N (10x diluída) em 100 µL da amostra de extrato (1mg/mL) ou padrão, após
5 minutos encubados, 0,750 mL de bicarbonato de sódio 60g/L é adicionado a mistura,
depois de 90 minutos de encubação a leitura foi realizada em espectrofotômetro de
UV/Vis à 725 nm. A curva analítica foi obtida utilizando o ácido gálico nas
concentrações de 0.5, 0.25, 0.125, 0.625, 0.03125 mg/mL. Os resultados foram
expressos em µg/mL equivalentes de ácido gálico (Velioglo et al., 1998).
Resultados
Com a extração a frio, obteve-se o total de doze extratos vegetais brutos de
galhos verdes e maduros, folhas e caule, em hexano, acetato de etila e metanol. Foram
isolados 122 fungos endofíticos, porém apenas 105 foram agrupados e identificados
morfologicamente, gerando 16 grupos distintos (Tabela 1).
Tabela 1. Grupos dos prováveis gêneros de fungos
Grupos Número de Características morfológicas Provável gênero

isolados
G1 62 Caracteristica de Ascomycetes Phomopsis
G2 20 Característica de mitospóricos Colletotrichum
G3 10 Coloração preta como de ascos Ascomycetes Preto
G4 1 Coloração castanha, micélio rasteiro
G5 1 Fungos mitospórico, coloração marrom
G6 1 Caracteristica de Ascomycetes Ascomiceto Estomático
G7 1 Caracteristica de Ascomycetes
G8 1 Caracteristica de Ascomycetes Xylaria
G9 1 Coloração cinza, micélio cotonoso
G10 1 Coloração esverdeada, Micélio cotonoso
G11 1 Coloração branca
G12 1 Característica de Ascomycetes de coloração Ascomycetes
branca
G13 1 Levedura de coloração bege Levedura
G14 1 Levedura de coloração Rosa Levedura
G15 1 Levedura de coloração cinza Levedura
G16 1 Fungo colorido, Metabólito rosa
Após a obtenção dos metabólitos e extração destes em fase reversa C18 e do

micélio em extração com metanol, e doze extratos vegetais brutos, totalizando sessenta
e oito extratos, os quais foram submetidos ao teste de atividade antioxidante.
Através da AA%, pode-se perceber que para os sessenta e oito extratos testados,
apenas três apresentaram uma relevante atividade antioxidante, sendo estes os extratos
90
vegetais brutos, de folhas em metanol, caule em metanol e em acetato de etila. Os
valores do AA% destas amostras constam na Tabela 2. E os valores de IC50 para os três
selecionados e para o padrão, quercetina estão listados na Tabela 3.
A amostra do extrato bruto do caule em acetato de etila apresentou menor IC 50

seguido das folhas e caule em metanol sendo 55.9, 75.1 e 75,15(µg/mL)
respectivamente. Quanto menor o IC50 maior é o potencial antioxidante da amostra.
Tabela 2- Capacidade de captura de radicais livres (AA%) dos extratos vegetais brutos
da V.venosa.
Atividade Antioxidante
Amostra Concentração AA%
1mg/ml 84,2
Caule MeOH
0,1mg/ml 72,1
0,01mg/ml 32,0
1mg/ml 87,1
Folhas MeOH
0,1mg/ml 50,4
0,01mg/ml 30,5
1mg/ml 88,22
Caule AcOEt
0,1mg/ml 53,1
0,01mg/ml 30,3
Tabela 3- Valores de IC50 dos extratos brutos de V. Venosa
IC50
Amostra (µg/mL)
Quercetina 14,77
Caule (AcOEt) 55,9
Folhas (MeOH) 75,1
Caule (MeOH) 75,15
Apesar do resultado promissor, as amostras dos extratos brutos apresentaram

potencial antioxidante quatro vezes menores que o padrão utilizado, quercetina (IC50 =
14,77 µg/mL). Os extratos com potencial antioxidante também apresentaram uma
91
grande quantidade de fenólicos, principalmente, no extrato bruto de caule obtido em
acetato de etila (224,39 µg/mL). Já nos extratos que não apresentaram atividade
antioxidante no ensaio de DPPH não foram encontrados valores significativos
equivalentes de ácido gálico, o que confirma a relação entre baixos valores de fenólicos
totais e o baixo potencial antioxidante.
Discussão
Os extratos de V.venosa é fonte de fungos endofíticos, essa espécie vegetal

mostrou-se hospedeira de um número total considerável de endófitos, levando em
consideração que muitas espécies de fungos não são cultiváveis e, portanto, o
isolamento expressa a frequência de fungos endofíticos cultiváveis e não o total de
fungos endofíticos presente na planta.
A ausência de microrganismos epifíticos ou contaminantes na contra prova de
desinfecção superficial, corroboram com os resultados obtidos no isolamento. Sendo
que o número significativo de endófitos encontrados em galhos, 50,82% pode estar
relacionado tanto com o modo que o endofítico penetra na planta, por transmissão
vertical ou horizontal, quanto com a existência de condições favoráveis à permanência
ou crescimento do fungo em tecidos específicos.
É importante também lembrar que a etapa de desinfecção superficial deve ser
específica para cada espécie vegetal e cada parte da planta, tendo em vista as diferenças
entre os tecidos de cada planta. Vale ressaltar que a diversidade dos fungos identificados
e seus prováveis gêneros, caracterizaram estes endófitos para com esta hospedeira.
Os resultados dos testes de atividade antioxidante mostraram que os extratos de
micélio extração em metanol e dos sobrenadantes em extração com C18, não
apresentaram nenhuma atividade significativa comparadas com o padrão, o que
possivelmente que estes fungos não metabolizam substâncias com potencial
antioxidante.
Enquanto que nos extratos que apresentaram atividade antioxidante pode-se
observar a relação entre atividade antioxidante e compostos fenólicos, a amostra do
caule apresentou o maior IC50 (µg/mL) e maior quantidade de fenólicos (µg/mL).
Conclusões
92
Mediante aos resultados apresentados foi possível compreender que a espécie
Virola venosa é uma ótima hospedeira de fungos endofíticos, apresentando ampla
diversidade.
Com relação ao teste atividade antioxidantes no qual os extratos dos isolados
fúngicos foram testados, estes demonstraram uma baixa capacidade de sequestrar
radicais livres, ou seja, nenhum dos extratos se destacou em relação à presença de
compostos com atividade antioxidante.
Visto que os extratos promissores de atividade antioxidantes foram os extratos
os obtidos com solventes de alta e média polaridade que podem ter promovido a
extração de compostos fenólicos, sendo assim podemos relacionar que a atividade
antioxidante destes extratos está intimamente ligada aos compostos fenólicos contidos
nestes extratos.
Referências
Azevedo JL, Araujo WL (2006). Diversity and applications of endophytic fungi isolated
from tropical plants. In: GANGULI BN DESMUCKH SK. Fungi. Multifacetated
Microbes. New Dehli: Anamaya Publication, p.189-207.
Minami PS (2003) Micologia: métodos laboratoriais de diagnóstico de micoses.

Barueri: Editora Manole, 199p.
Moein, S, Farzami B, Khaghani S, Moein MR (2007). Antioxidant properties and

protective effect on cell cytotoxicity of Salvia mirzayani. Pharm Biol, 46:458–463,
Rodrigues WA 1980. Revisão Taxonômica das Espécies de Virola Aublet

(Myristicacea) do Brasil, Acta Amazonica, ano 10, n.1.
Souza AQL, Souza ADL (2004). O. Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

isolados de plantas tóxicas da Amazônia: Palicourea longiflora (Aublet.) Rich e
Strychnos cogens Bentham. Acta Amazonica, 34(2):185-195.
Teixeira AF (2007). Metabólitos secundários de frutos da Virola molissima (Poepp. ex.

A. DC) Warb.: Neolignanas e Atividade Antifúngica. 2007. 156p. (Tese) Doutorado em
química orgânica, USP. São Paulo.
Velioglo YS, Mazza G, Gao L (1998). Antioxidant activity and total phenolics in
selected fruits, vegetables, and grain products. J. Agric. Food. Chem., 46:4113 - 4117.
93
Diversidade de Macrofungos da Família Polyporaceae

(Basidiomycotina) no Estado do Amazonas
Fonseca MDP1; Oliveira Costa CLS2, Souza AQL2, Gibertoni TB2, Souza ADL2,
Rodrigues MO3, Pereira, JO2; Azevedo JL4.
1
Universidade do Federal do Amazonas-UFAM Programa de Pós-Graduação em
Biodiversidade e Biotecnologia da Rede Bionorte, 2 Universidade Federal de Pernambuco-
UFPE, 3 Universidade do Estado do Amazonas-UEA,4 Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz, ESALQ,
E-mail:[email protected], [email protected]; [email protected],
Resumo
Investigação sobre a biodiversidade são de suma importância para a utilização

racional dos recursos naturais, principalmente em regiões mega-diversas, como a
Amazônia. O estudo da diversidade de macrofungos da família Polyporaceae
(Basidiomycotina) é importante para contribuir com o conhecimento sobre a diversidade
destes no Estado do Amazonas e apresentar novos registros para a região, além de
poderem ser usados como matéria prima para diferentes setores da sociedade, como
alimentos, farmacêuticos, químico e outros. As áreas de coleta dos fungos se atem ao
Estado do Amazonas. Foram realizadas coletas em área de floresta nos municípios de
Autazes, Anamã, Careiro da várzea, Coari, Barcelos, Borba, Novo Aripuanã, Nova
Olinda do Norte, Manaus, Manicoré, Parintins e Presidente Figueiredo. A coleta e
preservação dos espécimes seguiram as recomendações técnicas de Fidalgo e Bononi
(1989) e Souza (2004). Foram identificados 83 fungos da família Polyporaceae
distribuídos em 11 gêneros e 15 espécies. Esta pesquisa ampliou o conhecimento sobre
a distribuição de destes macrofungos, fornecendo dados suplementares sobre sua
classificação geográfica na Amazônia brasileira.
Palavras-chave: Polyporaceae, diversidade, taxonomia, Amazonas.
Introdução
O conhecimento sobre a biodiversidade amazônica ainda é restrito devido às
constantes alterações ambientais, falta de investimento financeiro e falta de recursos
humanos qualificados para efetuarem as coletas, o que contribui para baixa produção
científica desta área do conhecimento. Existe neste contexto a necessidade de aumentar
o conhecimento da micobiota endogena do Amazonas, tornando-se assim,
imprescindível para avaliar a diversidade fúngica desta região. Segundo Moore e Frazer
94
(2002), houve uma queda de identificações entre as décadas de 1980 e 2000,
provavelmente porque a taxonomia clássica (morfologica) deixou de ser interessante,
aliada a popularidade de outras áreas, a formação de profissionais em taxonomia
clássica diminuiu. Muitas espécies da família Polyporaceae podem, nesse caso, ser
extintas na região Amazônica mesmo antes de serem descritas.
A família Polyporaceae pertence a ordem Polyporales, classe Agaricomycetes e
filo Basidiomycota são popularmente conhecidos como cogumelos, orelha de pau ou
urupê (Kirk, 2008; Hibbett et al., 2007, 2014). Os Agaricomycetes compreendem todos
os fungos do filo Basidiomycota que formam basidiomas, com himênio definido
(Hibbett et al., 2007). Dentre os Basidiomycota, os Agaricomycetes representam
fundamental importância na decomposição e reciclagem da matéria orgânica também
podendo ainda ser fitopatógenos (Stalpers e Loerakker, 1982). Crescem em madeira
morta, mas também em solo e folhedo degradando restos animais e vegetais, inclusive
da micota (Donk, 1964). Além da importância biológica, os Agaricomycetes têm
recebido especial atenção nas duas últimas décadas, devido ao seu potencial de
aplicabilidade no tratamento de contaminantes ambientais como biorremediadores do
solo e pela produção de antibióticos (Schmit e Mueller, 2007).
Algumas espécies da família Polyporaceae são comestíveis como por exemplo
Lentinus (Ishikawa, 2012). Existem mais de 200 gêneros de Agaricomycetes
(Basidiomycotina) utilizados pelo homem por suas propriedades proteicas (Boa, 2004).
Material e Métodos
Foram realizadas 12 coletas dos macrofungos no período de janeiro a março de
2013 e janeiro a maio de 2014, em área de floresta nos municípios de Autazes, Anamã,
Careiro da várzea, Coari, Barcelos, Borba, Manaus, Manicoré, Novo Aripuanã, Nova
Olinda do Norte, Parintins e Presidente Figueiredo.As coletas e preservações dos
espécimes seguiram as recomendações técnicas de Fidalgo e Bononi (1989) e Souza e
col., (2004). Posteriormente, os materiais foram levados ao laboratório de genética da
Universidade do Estado do Amazonas-UEA e secos em estufa, com temperatura
aproximada de 60 °C por 72 a 120 horas.
As identificações taxonômicas morfológicas foram realizadas no departamento
de micologia da Universidade Federal de Pernambuco-UFPE e na Universidade do
Estado do Amazonas-UEA. As análises microscópicasforam realizadas através de cortes
dos exemplares à mão livre, em microscópio estereoscópico, com o auxílio de uma
95
lâmina de aço inoxidável para observação das micro-estruturas. Estes cortes contendo as
superfícies abhimeniais e contexto, foram colocados entre lâmina e lamínula com o
reagente de Melzer para a observação da reação amilóide (azulada) ou dextrinóide
(avermelhada) e, solução aquosa de hidróxido de potássio 3% para observação da
reação xantocróica (negra) (Singer, 1951). As lâminas assim montadas permitiram a
observação do sistema hifal (mono, di ou trimítico), da disposição das hifas no contexto,
de elementos estéreis (cistídios, setas), de basídios e de basidiósporos.
Resultados
Neste trabalho foram encontrados representantes de outras famílias mas, esse
estudo se atem a família Polyporaceae. Com as coletas realizadas em 12 municípios do
Estado do Amazonas foi possível identificar 83 espécimes de macrofungos pertencentes
a família Polyporaceae da ordem Polyporales distribuídos em 11 gêneros e 14 espécies
(Tabela 1). Com o estudo da distribuição geográfica das espécies encontradas, baseada
em literatura, mostrar-se que as espécies Coriolopsis polyzona (Pers.) Ryv. 1972;
Datronia brunneoleuca (Berk.) Ryvarden 1988; Grammothele subargentea (Speg.)
Rajchenb.1983; Earliella scabrosa (Pers.) Gilb. e Ryv. 1985; Hexagonia hirta (P.
Beauv.) Fr. 1838, representam novas ocorrências para o Estado do Amazonas.
Tabela 1 Gêneros e espécies representantes da família Polyporaceae coletados em 12

municípios do Estado do Amazonas e novas ocorrências.
Ocorrência
Família /Espécie na Novo registro na Amazônia Literatura
Amazônia
Coriolopsis floccosa (Jungh.) Ryv. AC, AM,
Anamã; Manaus BR 174;
MT, AP, RO, Ryvarden e Johansen
1972 Manicoré; Novo Aripuanã
RR (1980)
Autazes; Borba, Coari;
Coriolopsis polyzona (Pers.) Ryvarden Manaus, Manicoé, Nova
RO, RR
1972 Olinda do Norte, Novo
Aripuanã;
Coriolopsis byrsina (Lloyd) Ryvarden Nogueira-Melo et al.
AM, RO, RR Manaus, BR174
2012 (2012)
Datronia brunneoleuca (Berk.) Manaus-RDS; Nova Olinda do

Norte; Manicoré
Ryvarden 1988
Dichomitus cavernulosus (Berk.) AM, RO,

Manaus-Tarumã Masuka e Ryvarden
RR, PA
Masuka e Ryvarden 1999 (1999)
Anamã; Autazes; Borba;
Earliella scabrosa (Pers.) Gilb. e Manaus BR 174; Coari;
MT, PA, RR,
Manicoré; Nova Olinda do Ryvarden eJohansen
Ryvarden 1985 RO
Norte; Novo Aripuanã; (1980)
Parintins
Bononi (1992),
Favolus brasiliensis (Fr.) Fr. 1830 AC, AM,
Borba, Coari, Manaus; Sotãoet al. (1997,
PA, RO
2002b), Sotão et al.
96
(2008), Capelari e
Maziero (1988)
Fomes fasciatus (Sw.) Cooke 1885 AC, AM, Sotãoet al. 2008);
Presidente Figueiredo
MT, PA, RO Jesus (1996)
Grammothele subargentea (Speg.) RR Borba Drechsler-Santos,

Rajchenb. 1983 R.E. et al., (2008)
Hexagonia hirta (P. Beauv.) Fr. 1838 Abrahão, M.C. et al.,
Manaus
(2009)
Anamã; Autazes; Borba;
Lentinus crinitus Lloyd 1920 AM, AP, Manaus BR 174; Coari; Bononi, V.L.R. et al.,
PA,RO Manicoré; Novo Aripuanã; (2008), Meijer, A.A.,
Parintins (2008)
Trametes modesta (Kunzeex Fr.) AC, AM, Borba; Manaus; Novo Abrahão, M.C. et al.,
Ryvarden 1972 PA, RO, RR Aripuanã. (2009)
Trametes ochroflava Cooke 1880 AC, AM, Manaus; Presidente
RO, RR, PA Figueiredo, Ryvarden (1988)
(Bononi 1992);
Batista et al. (1966),
Trametes polyzona (Pers.) Justo 2011 AC, AM,
Coari. Silva & Minter
AM, PA,
(1995), Sotão et al.
(2008)
Trichaptum byssogenum (Jungh.) AC, AM, Autazes; Manaus; Coari; Novo Gugliotta, A.M. et al.,
Ryvarden 1972 PA, RO, RR Aripuanã. (2010)
*** Novas Ocorrências na Amazônia
Vários espécimes encontram-se em estudo e estão sendo revisados, os quais

inclusive podem representar novas espécies e ocorrências para o estado e para o Brasil,
que apresenta-se bastante diverso nas áreas deste estudo.
Discussão
A família Polyporaceae apresentou maior número de gêneros e espécies. O
maior número de espécies observado em Polyporaceae já era esperado, já que essa
família está entre as que apresentam maior diversidade específica entre os fungos
poliporóides (Alexopoulos et al., 1996). Esses resultados corroboram com estudos sobre
fungos macroscópicos no Brasil e no Estado do Amazonas. Para a Amazônia e
Amazonas Gomes-Silva e Gibertoni (2009a, 2009b) divulgaram uma lista dos fungos
Agaricomycetes, com 216 espécies para a ordem Polyporales, divulgando o maior
número de espécies 146, de famílias 07 e de gêneros 61. Para Rondônia Capelari e
Maziero (1988) fazem referência a 28 espécies de fungos Agaricomycetes poroídes. No
Amapá, Sotão et. al., (1991) divulgaram uma relação de 33 espécies de Basidiomicetos,
sendo 20 táxons de Agaricomycetes poróides, a família Polyporaceae apresentou maior
número de representantes.
97
De acordo com Soarese et. al., (2014), dados recentes, ainda para o Estado do
Amapá, apresentaram registro com 637 espécimes de fungos polyporoides identificados,
representantes de 97 espécies, 36 gêneros e oito famílias das ordens Hymenochaetales
(Hymenochaetaceae e Schizoporaceae), Polyporales (Fomitopsidaceae,
Ganodermataceae, Meripilacea, e a família com o maior número de representantes
também foi Polyporaceae, com 19 gêneros e 52 espécies, acompanhada por
Hymenochaetaceae e Ganodermataceae. Amauroderma Murril foi o gênero com o maior
número de espécies, seguido por Perenniporia Murril e Polyporus, P. Micheli (oito). Já
as espécies que apresentaram maior densidade foram Ganoderma tornatum (Pers.) Bres.
(48), Polyporus dictyopus Mont. (45), P. leprieurii Mont. (37) e Lenzites elegans
(Spreng.) Pat. (34).
Conclusão
Para ampliar o conhecimento sobre a riqueza e distribuição das espécies da
Familia Polyporaceae no bioma Amazônia, sugere-se a continuidade de coletas no
Estado do Amazonas.
Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM pela
concessão da bolsa de estudos. Ao departamento de Micologia da Universidade de
Pernambuco -UFPE. Ao apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico – CNPq, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES), que viabilizaram a realização desse trabalho.
Referências
Alexopoulos CJ, Mims CW, Blackwell M (1996) Introductory Mycology. 4 th ed.,

John Wiley and Sons, Inc., Nova York, 868p.
Capelari M, Maziero, R (1988) Fungos macroscópicos do estado de Rondônia,

região dos rios Jaru e Ji-Paraná. Hoehnea, 15:28-36.
Donk MA (1964) A conspectus of the families of Aphyllophorales. Persoonia 3:

199-324.
Fidalgo O, Bononi VL (1989) Guia de coleta, preservação e herborização de

material botânico. Instituto de Botânica: São Paulo, (Manual n° 4).
98
Gomes-Silva e Gibertoni (2009a) Revisão do Herbário URM. Novas ocorrências de
Aphyllophorales para a Amazônia brasileira. Revista Brasileira de Botânica.
32(3):587-596.
Gomes-Silva AL, Gibertoni TB (2009b) Checklist of the aphyllophoraceous fungi

(Agaricomycetes) of the Brazilian Amazonia. Mycotaxon, v. 108, p. 319–322.
Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE,
Huhndorf S, James T, Kirk PM, Lücking R, Thorsten-Lumbsch H, Lutzoni F,
Matheny P B, Mclaughlin DJ, Powell MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW,
Stalpers JA, Vilgalys R, Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL,
Castlebury LA, Crous PW, Dai Y C, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C,
Hawksworth D L, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde KD, Ironside JE,
Kõljalg U, Kurtzman CP, Larsson KH, Lichtwardt R, Longcore J, Miadlikowska J,
Miller A, Moncalvo JM, Mozley-Standridge S, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V,
Rogers JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schüßler A, Sugiyama J, Thorn, RG,
Tibell L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiss M, White MM, Winka
K, Yao Y J, Zhang N (2007) A higher level phylogenetic classification of the Fungi.
Mycological Research, 111(5):509–547.
Hibbett DS, Bauer R, Binder M, Giachini A J, Hosaka K Justo A, Larsson E,

Larsson KH, Lawrey JD, Miettinen O, Nagy LG, Nilsson RH, Weiss M, Thorn RG
(2014) Systematics and Evolution, The Mycota VII Part A. D.J. McLaughlin and
J.W. Spatafora (Eds.). Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2nd Edition
Ishikawa N K, Vargas-Isla R, Chaves RS, Cabral TS (2012) Macrofungos da

Amazônia: Importância e Potencialidades. Ciência &Ambiente, v. 44, p. 129-139.
Moore D , Frazer L (2002) Essential Fungal Genetics. New York: Springer.
Schmit JP, Mueller GM (2007) An estimate of lower limit of global fungal diversity.
Biodivers. Conserv. 16: 99-111.
Sotão HMP, Bononi VLR, Figueiredo T S (1991) Basidiomycetes de manguezais da

Ilha de Maracá, Amapá, Brasil. Boletim do Museu Paraense Emílio Goeldi, (série
botânica), 7(1):109-114.
Souza AQ L, Souza ADL, Astolfi-Filho S, Pinheiro MLB, Sarquis MIM, Pereira JO

(2004) Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas
da Amazônia: Palicourealongiflora (Aubl.) Rich e Strychnoscogens Bentham. Acta
Amazônica. 34(2):.
Stalpers JA, Loerakker WM (1982) Canadian Journal of Botany. Laetisaria and

Limonomyces species (Corticiaceae) causing pink diseases in turf grasses. v.60.
537p.
99
Isolamento de bactérias da Região Amazônica, como modelo para a

recuperação de fosfato
Gama, A.M1, Silva, M.S2, Moraes, A.B2, Carvalho, N.O2, Nonato, L.S2, Spira, B3, Mota,
A.J2, Yamane, T1
1
Universidade do Estado do Amazonas UEA, Manaus-AM, 2 Universidade Federal do Amazonas-
UFAM, Manaus-AM), 3 - Universidade de São Paulo - USP, São Paulo-SP.
E-mail: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected],
Resumo
O fósforo é um elemento essencial para a vida de todos os seres vivos, o que

tornaria a vida inviável em sua eventual escassez. Seu principal uso está na forma de
fertilizantes para a agricultura, devido à pobreza dos solos desse nutriente. Por ser um
elemento finito e insubstituível, sua exploração constante, tem levado a depleção e escassez
de suas reservas naturais. Os micro-organismos desempenham um papel fundamental no
processo de reciclagem do fósforo, visto que, necessitam incorporar este elemento do meio
ambiente, na forma de íon fosfato, além de, no processo de decomposição, reciclar o fosfato
orgânico disponibilizando-o para as plantas na forma inorgânica, fechando assim o ciclo do
fósforo. Em vista desse papel, a finalidade deste estudo é buscar bactérias capazes de
realizar uma biorremediação e a reciclagem de fosfato do ambiente. Possibilitando uma
melhor compreensão dos mecanismos e da genética subjacente à captação de fosfato. As
colônias foram selecionadas morfologicamente pela fenotipagem e isoladas pela técnica de
esgotamento de alça em estrias. Após sua purificação, foram preservadas em solução de
caldo rico contendo 20% glicerol e estocadas a -20 °C. A hipótese a ser testada é que nesses
isolados possam existir um sistema eficiente de captação e assimilação de fosfato.
Palavras chaves: Rio Negro, Rio Solimões, fósforo, bactérias.
Introdução
O fósforo é um elemento químico obtido a partir do um mineral “finito e

insubstituível” e essencial para a vida. Menos de 1% do total de fósforo existente no planeta
está na forma disponível para as plantas, sendo assim, o seu principal uso é na forma de
100
fertilizantes. Assim sendo, o cenário é de extração contínua das reservas naturais para
atender a demanda da agricultura no mundo todo (LOBATO, 1982). As colheitas sucessivas
retiram o fosfato do solo, além de outros nutrientes, e a consequência imediata é que com o
crescimento populacional, a taxa de depleção de reservas de fósforo já está em ritmo
acelerado. Portanto, o risco de esgotamento das reservas naturais é real, e já há algumas
décadas uma possível crise do fósforo vem sendo discutida (ABELSON, 1999).
Visto que todos os seres vivos, inclusive os fagos e vírus, carregam material genético
(DNA/RNA) com fósforo no esqueleto de suas moléculas, uma eventual escassez desse
nutriente tornaria a vida inviável, pois não há nenhum substituto conhecido para este
elemento (Saenger, 1984; Machado e Nome, 1999).
Na natureza, as plantas e animais perecem e os micro-organismos degradam
moléculas complexas ao nível de estruturas químicas simples que são então reutilizadas
para o crescimento de outras plantas e animais, constituindo um ciclo fechado e contínuo.
Se esse ciclo se mantivesse de forma contínua, o risco de uma crise real seria mínimo,
entretanto, parte do fósforo que vai para o solo, acaba sendo levado para rios e destes para o
mar, se deposita no fundo oceânico de profundezas abissais o que inviabiliza sua extração e
aumenta muito o tempo para a reciclagem natural (Wanner, 1996).
Dessa forma, entendemos que é importante estudar medidas viáveis para retornar o
fósforo para o ciclo e concebendo que os micro-organismos exercem um papel fundamental
na reciclagem de fósforo, é conditio sinequa non que se estude a diversidade microbiana de
rios da região Amazônica, principalmente aqueles onde existe uma quantidade relativa
inferior desse nutriente, quando comparada com outros ambientes. A hipótese a ser testada
é que nesses possa existir um sistema eficiente de captação e assimilação de fosfato
(Morohoshi et al. 2002; Almeida e Spira, 2014).
Material e Métodos
Como não existem precedentes para esse tipo de abordagem, na região amazônica,
usamos como modelo de estudo os dois rios de nossa região, Rio Aracá e Rio Solimões. É
sabido que esses dois macroambientes são bastante diferentes em várias propriedades
físico-químicas e nutricionais, o que de certa forma irá colaborar para se testar a hipótese de
101
mecanismos de seleção agindo sobre um sistema mais eficiente para a recuperação do
fosfato pelos micro-organismos.
Foram coletadas amostras de água de dois locais do estado do Amazonas, (1) Rio
Solimões nas proximidades do Município de Manacapuru (três pontos de coleta); e (2) Rio
Aracá, um importante afluente do Rio Negro (quatro pontos de coletas: na Serra do Aracá,
na o encontro entre o rio Aracá e o Rio Pretinho, numa posição intermediária entre a
nascente e o Rio Negro, e por fim, no encontro com o Rio Negro). As indicações das
localidades são relativas porque não foi possível a utilização de GPS para o
georeferenciamento.
As amostras do Rio Solimões foram coletadas em garrafas estéreis de 1 L e
transportada em caixas térmicas com gelo, até o laboratório. Para cada amostra, diluições
sucessivas com 0,9% solução salina (0.9 g NaCl para 100 mL de água destilada,
esterilizada a 121 °C por 20 min) foram realizadas até se obter a diluição de 10-5.50 µL de
cada diluição foram semeados nos meios de cultura, TSA-antibiótico (Agar Triptona de
Soja + 50 µg.mL fluconazol,), LB-antibiótico (Agar Lisine-broth + 50 µg.mLfluconazol) e
CT-antibiótico (Cetrimide Ágar + 50 µg.mLfluconazol) e incubadas a 35 °C durante 24-48
h. Para as amostras do Rio Negro foram feitos diferenciações com pH (5.0, 6.0 e 7.0) e
temperaturas (18, 28 e 35 °C ) e incubadas durante 24-48 h. Após o crescimento das
colônias, estas foram selecionadas morfologicamente pela fenotipagem e isoladas pela
técnica de esgotamento de alça em estrias. Após sua purificação, foram preservadas em
solução de caldo rico contendo 20% glicerol e estocadas a -20 °C.
Resultados
Foram selecionados morfologicamente 151 isolados do Rio Solimões e 100 isolados

para o Rio Negro, conforme a tabela 1. O meio CT não foi semeado para as águas do Rio
Negro, pois no teste anterior (Rio Solimões) esse não foi seletivo para Pseudomonas sp.
que era a intenção inicial utilizando este meio de cultura.
Tabela 1- Bactérias isoladas

Local
102
Rio Solimões Rio Negro
Meios de cultura LB TSA CT LB TSA
Número de isolados 69 21 61 38 62
Com o intuito de favorecer espécies que pudessem estar sendo inibidas por
competição ou substâncias antagônicas provindas de outras espécies presentes na amostra,
variou-se a condição de cultivo quanto a temperatura e pH para a amostragem do Rio
Negro. O número absoluto de isolados estão contido na tabela 2.
Tabela 2 - Isolados do Rio Negro por diferentes temperatura e pH

Meio LB Meio TSA
Temperatura pH Número de Isolados Temperatura pH Número de Isolados
o
C o
C
5,0 7 5,0 7
18 6,0 112 18 6,0 61
7,0 107 7,0 185
5,0 10 5,0 207
28 6,0 120 28 6,0 215
7,0 113 7,0 219
5,0 222 5,0 222
35 6,0 248 35 6,0 228
7,0 136 7,0 225
Devido à grande dificuldade em identificar micro-organismos, inicialmente foi feita

a identificação pela metodologia molecular e a partir dos resultados, escolher alguns
isolados de cada espécie e realizar os testes morfológicos e bioquímicos. Pelo aspecto
macroscópio das colônias como tamanho médio, margens, elevação, consistência, brilho,
coloração, entre outros, foi possível agrupar os isolados, destacando-se maior diversidade
de cores entre os isolados do rio Aracá com colônias brancas, amarelas, vermelhas, roxas,
rósea e bege. Ainda, 7 isolados apresentam características morfológicas semelhantes as de
Crhomobacterium violaceum, uma proteobacteria que vive no solo e nos rios das regiões
tropicais, inclusive no Rio Negro. Os isolados do Rio Solimões são de predominância com
colônias brancas e beges.
103
Discussão
Os resultados apresentados são preliminares, provenientes de coleta única o que

inviabiliza um tratamento estatístico. Entretanto, a diversidade podem indicar uma
diversidade genética, e reforçar a expectativa de encontrar sistemas eficientes na captação
do fosfato. O Rio Negro é o modelo de estudo, pois suas águas são levemente ácidas e de
baixa condutividade elétrica, resultado da pobreza em elementos alcalinos, alcalinos
terrosos e nutrientes, como o fósforo livre, nitrito e nitrato. A concentração de Pi não
ultrapassa 30 µM (PROJETO BRASIL DAS ÁGUAS, 2003), logo, as bactérias adaptadas a
este ambiente devem ter um sistema de incorporação de Pi muito eficiente, digno de ser
investigado. A escolha de coletar também em seu tributário deve se que outros trabalhos
realizados no laboratório utilizaram este rio como modelo de estudo.
Entre os integrantes da microbiota do Rio Negro, destaca-se Chromobacterium

violaceum, uma bactéria de vida livre, encontrada em solos e rios de ecossistemas tropicais
e subtropicas (BRAZILIAN NATIONAL GENOME PROJECT CONSORTIUM, 2003).
Identificam-se no genoma de C. violaceum, os principais genes de um sistema conhecido de
captação de fosfato, o regulon PHO (phoB, phoR, operon pst e phoA). O regulon é
caracterizado por um grupo de genes e operons expressos em resposta a um mesmo fator ou
estímulo e controlados por uma mesma proteína regulatória. Em relação ao fosfato, os
genes são induzidos em condições de limitação de Pi (concentração de Pi externo< 4 µM),
e são regulados pelo sistema de dois componentes PhoR/PhoB (SPIRA, 2010). Entretanto, a
funcionalidade dos genes e a sua regulação em C. violaceum ainda não foram estudados.
Considerando a finalidade de estudar sistemas eficientes de reciclagem do fósforo e a
existência do regulon PHO no genoma de C. violaceum, os isolados com as características
sugestivas para essa espécie seguirão para estudos subsequentes sobre o funcionamento
desse regulon e a eficiência da captação e assimilação de fósforo.
Conclusões
Dentre os diversos isolados, sete podem apresentar possível potencial para estudos
subsequentes sobre o sistema de captação de fósforo, tendo em visto que estes isolados
104
apresentam características morfológicas sugestivas para C. violaceum uma bactéria com o
regulon PHO em seu genoma.
Futuros estudos devem ser realizados para visando a identificação dos isolados, e
verificar a existência do regulon PHO em seus genomas, assim como avaliar a cinética de
incorporação de fósforo, bem como o mecanismo de funcionamento do regulon PHO.
Referências
Abelson PH (1999) A potential phosphate crisis. Science, Washington, DC 283:2015.
Almeida LG, Ortiz JH, Schneider, RP.; Spira, B (2015) phoU Inactivation in Pseudomonas
aeruginosa enhances accumulation of ppGpp and polyphosphate. AppI Environ Microbiol,
n. 9, v. 81, p. 3006-3015.
Brazilian National Genome Project consortium (2003) The complete genome sequence of
Chromobacterium violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial adaptability.
Proc. Natl. Acad.Sci. USA, Washington, DC, 100:11660-11655.
Lobato AJ (1982) Adubação fosfatada em solos da Região Centro-Oeste. In: OLIVEIRA,

A J. Adubação Fosfatada no Brasil. Brasília: Ed. EMBRAPA-DID, p. 201-289.
Machado VG, Nome F (1999) Energy-Rich Phosphate Compounds. Quim. Nova , 22, 351.
Morohoshi T. et al (2002) Accumalation of inorganic polyphosphate in phoU mutants of

Escherichia coli and Synechocystis sp. Strain PC6803. Applied an environmental
Microbiology, Am. Soc. Microbiol, 68:4107.
Projeto Petrobras Ambiental. Projeto Brasil das Águas, 2003-2004. Disponível em:
www.brasildasaguas.com.br
Saenger W (1984) Principles of Nucleic Acid Structure, Springer: New York.
Spira B, Ferenci T (2008) Alkaline phosphatase as a reporter of sS levels

and rpoS polymorphisms in different E. coli strain. Arch. Microbial, Heidelberg, 189:43-
47.
Spira B. et al (2010) Alternative promoters in the pst operon of E. coli. Mol. Genetics and
Genomics, Sweden, 284:489-498.
Wanner BL (1996) Phosphorus assimilation and control of the phosphate regulon in:
Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology, 1:1357-1381.
105
Fitopatógenos habitantes do solo na Amazônia
Gasparotto L1, Pereira J.C.R.1
1
Embrapa Amazônia Ocidental,. Emails: [email protected]; jose.rezende-
[email protected]
Introdução
Na região Amazônica predomina o clima quente e úmido, extremamente favorável
aos fitopatógenos. Dentre estes, se destacam os patógenos habitantes do solo, responsáveis
por perdas significativas da produção, que, ao se estabelecerem numa área, inviabilizam
novos plantios da cultura afetada. São patógenos facultativos, ou seja, infectam a planta
hospedeira ou crescem sobre matéria orgânica, de acordo com as circunstâncias; polífagos,
atacando várias espécies de plantas, de famílias distintas e produzem estruturas de
resistência que lhes assegura a sobrevivência por longos períodos quando as condições
edafoclimáticas são adversas.
A maioria desses patógenos infecta o sistema radicular causando murcha vascular
ou podridões; porém alguns afetam a parte área da planta, como o Thanatephorus
cucumeris e o Sclerotium coffeicola, causadores de manchas foliares, e Aspergillus flavus e
A. parasiticus, indutores da podridão das amêndoas da castanheira-do-brasil. Uma vez
estabelecidos na área, o controle químico da maioria destes é impraticável. O plantio de
cultivares resistentes, a exclusão e adoção de práticas culturais que reduzam o inóculo e
favoreçam a atividade microbiana são medidas recomendadas para o controle de patógenos
habitantes do solo. A seguir são descritos alguns patógenos habitantes do solo, dentre
dezenas, que se destacam com os mais importantes na agricultura amazônica
106
Ralstonia solanacearum, raça 2
A bactéria, agente causal do moko da bananeira, causa até 100% de perdas na
produção. Em plantas jovens causa má-formação foliar, necrose e murcha da vela, seguidos
de amarelecimento das folhas baixeiras.
Em plantas adultas, induz o amarelecimento das folhas basais e murcha das folhas
mais jovens. Na parte interna do pseudocaule, há escurecimento vascular não localizado, de
coloração pardo-avermelhada intensa, atingindo inclusive a região central; no rizoma, além
do escurecimento vascular na região central, ocorre também na região de conexão rizoma
principal com o rizoma das brotações. No engaço pode ocorrer escurecimento vascular, na
forma de pontos avermelhados; nos frutos, além do amarelecimento precoce, há
escurecimento da polpa, seguido de podridão seca.
Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Fungo causador do mal-do-panamá da bananeira. Quando afeta cultivares
altamente suscetíveis como Maçã, provoca 100% de perdas na produção. Na Amazônia, a
doença prevalece em solos de ecossistema de terra firme. Sobrevive no solo por várias
décadas e é disseminado pelo contato dos sistemas radiculares de plantas sadias com
esporos liberados por plantas doentes e, em muitas áreas, o uso de mudas contaminadas,
pela água de irrigação, de drenagem, de inundação, assim como pelo homem, por animais e
equipamentos.
As plantas infectadas pelo fungo exibem externamente amarelecimento
progressivo das folhas mais velhas para as mais novas. Posteriormente, as folhas murcham,
secam e se quebram junto ao pseudocaule. Em consequência ficam pendentes, o que
confere à planta a aparência de um guarda-chuva fechado. É possível notar, próximo ao
solo, rachaduras das bainhas, cuja extensão varia com a área afetada no rizoma.
Internamente, observa-se a formação de um anel escuro em torno do cilindro central do
pseudocaule.
Thanatephorus cucumeris
107
Patógeno polífago que afeta centenas de espécies de plantas, causando diversas
doenças, como a mela do feijoeiro, a queima da saia do repolho e alface e a mancha
areolada da seringueira, mogno africano e citros.
A mela ou murcha da teia micélica do feijoeiro manifesta-se, inicialmente, como
manchas encharcadas nas folhas, circundadas por uma área marrom-escura, seguida de
intensa produção de um entrelaçado de micélio que atinge as folhas adjacentes, hastes,
flores e vagens, causando-lhes a morte. Há produção abundante de escleródios sobre os
tecidos mortos, constituindo em focos secundários de infecção ou permanecem no solo
como inóculo primário.
A mancha areolada da seringueira é caracterizada por lesões foliares que acarretam
o desfolhamento das plantas. As lesões, inicialmente, são aquosas e apresentam exsudação
de látex na superfície abaxial do folíolo. Cerca de dois a três dias após, a lesão apresenta
aspecto seco, com tonalidade castanha, e circundada por longo halo clorótico e amarelado.
Quando os folíolos atingem a maturação, as manchas são grandes, constituídas por faixas
largas, helicoidais, descontínuas e marrom-escuras ou marrom-claras. Em condições de
elevada umidade, na superfície abaxial das folhas, sobre as manchas se desenvolve um
manto micelial esbranquiçado.
Sclerotium coffeicola
Apesar de habitante do solo, o patógeno afeta a parte aérea de várias espécies,
como a gravioleira, o mogno africano e o cafeeiro, causando desfolhamento.
Os sintomas apresentam-se como manchas necróticas circulares de coloração
castanha e bordos escuros distribuídas no limbo foliar, medindo 0,5 cm a 1,0 cm de
diâmetro. Nas manchas da face inferior das folhas, geralmente, desenvolve-se micélio
branco-dendrídico e nas folhas caídas também há produção de escleródios. Outra
característica de S. coffeicola, somente observada na mancha da face abaxial é a produção
de estruturas semelhantes à agulhas brancas, como se fossem espículas, vista
macroscopicamente. Essa estrutura é constituída de hifas paralelas hialinas com até 0,2 mm
de diâmetro e 1 a 4 mm de comprimento.
Phytophthora drechsleri
108
O fungo causa podridão mole de raízes de mandioca. Inicialmente ocorre murcha
da parte aérea, seguida de secamento descendente dos ramos e queda das folhas.
Arrancando-se a planta, a maioria das raízes encontra-se podre. As raízes parcialmente
apodrecidas exsudam um líquido de odor fétido.
Phytophthora palmivora
Agente causal da podridão-do-estipe da pupunheira, que induz perdas de até 30%
das mudas enviveiradas e plantas adultas.
Os sintomas caracterizam-se pelo amarelecimento da primeira e da segunda folha
aberta e da folha bandeira ou vela (folha não aberta). Em seguida, pode ocorrer o
amarelecimento e a seca das demais folhas, podendo provocar a morte da planta-mãe e, às
vezes, dos perfilhos e de toda a touceira. Ao se realizar cortes longitudinais e transversais
no estipe da pupunheira, observa-se o escurecimento dos tecidos internos e uma podridão
generalizada.
Aspergillus flavus e A. parasiticus

Esses fungos se desenvolvem sobre os ouriços da castanheira-do-brasil quando o
período entre a queda dos frutos e a coleta é grande e,ou quando as condições de
armazenamento dos ouriços ou das castanhas são inadequadas, favorecendo a proliferação
desses patógenos habitantes naturais do solo, em função da umidade excessiva.
Os patógenos colonizam as castanhas e contaminam os lotes com a produção de
aflatoxinas. Aflatoxinas são micotoxinas, com ação carcinogênica, produzidas
principalmente pelo fungo A. flavus, em sementes e castanhas, tóxicas para os seres
humanos e animais.
As castanhas contaminadas por fungos do gênero Aspergillus apresentam as
superfícies externa e interna da casca recobertas parcial ou totalmente por estruturas
(micélio e conídios) do patógeno, de coloração esbranquiçada, creme ou amarelada. O
fungo esporula no interior da castanha e coloniza os tecidos causando o apodrecimento da
amêndoa, que apresenta coloração esbranquiçada, esverdeada ou amarelada, não podendo,
nesse caso, serem usadas na alimentação humana e/ou animal. A coloração escura, no
interior das castanhas, também indica a presença dos patógenos.
109
Após a queda dos ouriços, a coleta destes deve ser feita durante a safra, com
pequenos intervalos entre uma coleta e outra, procurando evitar que fiquem em contato com
o solo por longos períodos; pois os patógenos são habitantes do solo e,ou decompositores
de restos vegetais.
Lasiodiplodia theobromae
Patógeno polífago, oportunista que penetra no interior dos tecidos da planta
através de ferimentos e rachaduras da casca causadas por agentes físicos ou biológicos.
Em seringueira, os sintomas são observados em mudas enxertadas e em plantas
novas e adultas, sempre que se apresentem debilitadas ou sofram algum dano, como
ferimentos causados por tratos culturais, queimaduras devidas à elevação ou ao
abaixamento excessivo de temperatura e lesões produzidas por outros parasitas.
Nas mudas, observa-se um enegrecimento do caule, que começa na região do colo
ou acima deste, de 4 cm a 10 cm; a lesão desenvolve-se até abranger toda a circunferência
da haste. A área afetada se contrai e seca, formando uma zona bem delimitada, que se
destaca do verde normal dos tecidos sadios. Posteriormente, há morte da muda.
Em mudas enxertadas, a podridão geralmente inicia-se na região do enxerto,
causando o apodrecimento de enxertos e estacas.
Nas plantas adultas, os sintomas iniciam-se pelo amarelecimento dos ramos mais
jovens. O secamento progride no sentido da extremidade para a base da copa, apodrecendo
a casca, atingindo o tronco e causando rapidamente a morte de grande porção da copa.
Quando afeta o caule, os sintomas manifestam-se, inicialmente, na região de soldaduras do
enxerto e progride no sentido ascendente, formando o desenho de um V invertido. A casca
apresenta um apodrecimento de cor escura, que se destaca facilmente, ocorre anelamento e,
consequentemente, a morte das partes acima do local afetado.
Ganoderma philippii, Rigidoporus lignosus e Phellinus noxius

São patógenos causadores de podridões das raízes de plantas arbóreas, dentre estas a
seringueira. Esses agentes formam carpóforos do tipo orelha-de-pau, em troncos, galhos
grossos e raízes, em estádio avançado de apodrecimento de árvores da mata anterior ao
seringal, especialmente nas épocas de maior umidade.
110
As rizomorfas de G. philippii são vermelhas, com os bordos brancos, que escurecem
quando envelhecem, mas tornam-se vermelhas quando umedecidas. Rigidoporus lignosus
produz rizomorfas brancas, aderidas à superfície da casca da raiz, apresentam crescimento
rápido e podem propagar-se por longas distâncias no solo, na ausência de qualquer
substrato lenhoso. Phellinus noxius não produz rizomorfas típicas, mas forma uma manta
micelial envolvendo as raízes. Estas apresentam desenvolvimento lento, são de cor escura,
mucilaginosas e incrustadas com terra e pequenos pedaços de casca.
Nas plantas afetadas, inicialmente, há amarelecimento parcial da copa da árvore,
que se generaliza com o passar do tempo. A planta morre repentinamente, apresentando
folíolos secos presos aos ramos, por algumas semanas. Em solos pouco profundos, onde as
raízes pivotantes são pouco desenvolvidas, as seringueiras podem tombar em virtude do
apodrecimento das raízes laterais, sem apresentar sintomas de amarelecimento da copa. Isso
pode ocorrer mesmo quando o fungo afeta a raiz pivotante, causando o seu apodrecimento
e, consequentemente, o tombamento da árvore. Examinando-se o sistema radicular,
constatam-se raízes apodrecidas e rizomorfas ou camada micelial do patógeno.
Meloidogyne exigua, M. incognita e M. javanica

Fitonematoides que afetam várias espécies de plantas. Meloidogyne exigua
associado ao sistema radicular da seringueira, causa severos danos em seringais com quatro
a doze anos de idade, situados na região geoeconômica de Rondonópolis, MT.
As plantas atacadas apresentam morte progressiva, secamento do painel e alta
incidência de L. theobromae. O nematoide induz a formação de galhas com até 8 mm de
diâmetro em profusão nas radicelas. Em cortes histológicos das raízes infectadas observa-se
que a arquia da raiz, tipicamente tetrarca em sua estrutura primária, fica completamente
alterada. No interior de uma galha, observam-se até doze adultos (fêmeas) completamente
imersos no córtex radicular. Apenas a parte anterior do corpo ultrapassa periciclo, com o
conjunto de células gigantes formadas no cilindro central. O xilema, em torno das células
gigantes, fica completamente alterado e os elementos do vaso curtos, deformados e
dispostos num aglomerado de forma irregular, provavelmente reduzindo a eficiência das
raízes na absorção de água.
111
Plantas afetadas por M. incognita e M. javanica apresentam o sistema radicular com
galhas de aspecto necrosado e amarelado, tanto nas radicelas principais como nas laterais,
com poucas massas de ovos externas. Pobre desenvolvimento radicular e segmentos
necrosados. Morte descendente de ramos, descortiçamento e ataque intenso de fungos
oportunistas, como L. theobromae.
Radopholus similis
Bananeiras afetadas pelo nematoide R. similis apresentam crescimento reduzido,
amarelecimento das folhas, seca prematura, má-formação de cachos, refletindo em baixa
produção e reduzindo a longevidade dos plantios. Sua disseminação é altamente
dependente do homem, seja por meio de mudas contaminadas, deslocamento de
equipamentos de áreas contaminadas para áreas livres de nematoides, ou por meio da
irrigação e/ou água das chuvas.
Os danos causados pelo fitonematoide podem ser confundidos ou agravados com
outros problemas de ordem fisiológica, como estresse hídrico, deficiência nutricional,
principalmente deficiência de fósforo, ou pela ocorrência de pragas e doenças de origem
virótica, bacteriana ou fúngica, devido à redução da capacidade de absorver água e
nutrientes, pelo sistema radicular. A sustentação da planta é também bastante
comprometida.
Referências bibliográficas
Cardoso JE, Luz EDMN (1981) Avanços na pesquisa sobre a mela do feijoeiro no estado
do Acre. Rio Branco: EMBRAPA.UEPAE/Rio Branco. 29p. (EMBRAPA.UEPAE/Rio
Branco. Boletim de Pesquisa, 1).
Duarte MLR (1999) Doenças de plantas no trópico úmido brasileiro. I Plantas industriais.
Embrapa Amazônia Oriental, Belém, PA.
Gasparotto L, Bentes, JLS, Pereira JCR (2014) Doenças de espécies florestais arbóreas,
nativas e exóticas na Amazônia. Embrapa Informação Tecnológica, Brasília, DF.
Gasparotto L, Pereira JCR (2012). Doenças da seringueira no Brasil. 2. ed. rev. e atual.
Embrapa Informação Tecnológica, Brasília, DF.
112
Gasparotto L, Pereira JCR. (2010). A cultura da bananeira na região Norte do Brasil.
Embrapa Informação Tecnológica, Brasília, DF.
Poltronieri LS, Albuquerque FC, Trindade DR, Duarte MLR, Benchimol RL (2001)
Podridão mole das raízes de mandioca. In: Luz EDMN, Santos AF, Matsuoka K, Bezerra
JL (eds). Doenças causadas por Phytophthora no Brasil. Livraria e Editora Rural,
Campinas, SP, 433-454.
Poltronieri LS, Trindade DR (2002) Manejo integrado das principais pragas e doenças de
cultivos amazônicos. Embrapa Amazônia Oriental, Belém, PA.
113
Isolamento, purificação, identificação e conservação de microrganismos

associados ao jardim de fungos simbióticos das formigas cortadeiras Atta
sexdens
Gonzaga A. D1, A. Q. L. Souza1; Pereira J O1
1
Universidade Federal do Amazonas – UFAM , Manaus, AM
E:mail:[email protected], [email protected]; [email protected]
Resumo
Algumas formigas tornaram-se dependentes do cultivo de fungos como alimento e

desenvolveram uma sociedade de cooperação com tarefas divididas, que os tornam
ecologicamente muito importantes. Esta dependência de fungos ocorre em formigas
(Formicidae) no monofilético grupo formado por formigas da tribo Attini (Myrmicinae:
Formicidae: Hymenoptera), dependentes obrigatórias dos fungos que cultivam para alimento
e nas formigas Megalomyrmex silvestrii (Myrmicinae, tribo Solenopsidini), que são parasitas
sociais de formigas da tribo Attini e que consomem os fungos cultivados por atíneos
hospedeiros. Esta pesquisa teve como objetivo isolar, purificar, identificar e conservar de
microrganismos associados ao jardim de fungos simbióticos das formigas cortadeiras Atta
sexdens. Foram isolados seis microrganismos, representados por fungos filamentosos
mitospóricos (Trichoderma sp., Aspergillus sp.), basidiomiceto (Leucoagaricus
gongylophorus) Leveduras e Bactérias gram negativas e positivas, que cresceram mesmo na
presença de antibióticos. Os resultados do sequenciamento de DNA indicaram a presença de:
Leucoagaricus gongylophorus; Bionectria ochroleuca; Aspergillus flavus; Trichoderma
longibrachiatum; Fusarium solani e Leveduras como os microrganismos associados às
formigas. Todos os microrganismos isolados e identificados foram preservados para estudos
posteriores em ensaios de antagonismo. Recomendamos a continuação dos estudos, pois
outros microrganismos podem ser associados a estas formigas cortadeiras, incluindo aqueles
de importância biotecnológica.
Palavras-chave: Leucoagaricus gongylophorus, Bionectria ochroleuca, Aspergillus
flavus, Trichoderma longibrachiatum, Fusarium solani
114
Introdução
Poucos animais apresentam capacidade de cultivar seu próprio alimento. Algumas

linhagens de insetos, entre elas, formigas, cupins e besouros, há aproximadamente 50-60
milhões de anos desenvolveram a capacidade de cultivar fungos para alimento. Alguns destes
insetos tornaram-se dependentes do cultivo para alimento e desenvolvem uma sociedade de
cooperação com tarefas divididas, que os tornam ecologicamente muito importantes (Mueller
e Geraldo, 2002).
Esta dependência de fungos como principal fonte de alimento ocorreu duas vezes em
formigas (Formicidae) no monofilético grupo formado por formigas da tribo Attini
(Myrmicinae: Formicidae: Hymenoptera) que são dependentes obrigatórias dos fungos que
cultivam para alimento e nas formigas Megalomyrmex silvestrii (Myrmicinae, tribo
Solenopsidini), que são parasitas sociais de formigas da tribo Attini e que consomem os
fungos cultivados por atíneos hospedeiros (Adams et al., 2000).
As formigas fornecem aos fungos substratos predominantemente de origem vegetal.
As formigas das espécies dos gêneros Acromyrmex e Atta cortam folhas frescas e têm
recebido atenção especial dos pesquisadores devido aos danos causados a plantas silvestres e
cultivadas (Currie et al., 2003).
Fungos e formigas se beneficiam com a relação simbiótica; os fungos são utilizados
na dieta das formigas que, por sua vez, fornecem aos fungos substratos para crescimento e
proteção contra parasitas e competidores (Currie e Stuart, 2001). Portanto, esta pesquisa teve
como objetivo verificar o isolamento, purificação, identificação e conservação de
microrganismos associados ao jardim de fungos simbióticos das formigas cortadeiras Atta
sexdens.
Material e Métodos
Treze colônias da espécie Atta sexdens, foram coletados no município de Manaus,
AM e transportados para o Laboratório LABGEMMA da Universidade Federal do
Amazonas, UFAM. Os ninhos foram acomodados em recipientes de plástico transparente,
recebendo água, alimento e outros cuidados.
Para o isolamento, fragmentos dos jardins (esponjas) foram imersas em água destilada
autoclavada por um minuto, etanol 70% por um minuto, hipoclorito de sódio (NaOCl) 3% por
um minuto, novamente lavados em etanol 70% por 30 segundos e por último em água
destilada esterilizada. Após esse processo de assepsia foram retirados fragmentos do fungo
simbionte e transferidos para placas de Petri contendo diferentes meios de cultura (BDA e
115
Pagnocca). Também foi isolado o fungo diretamente do formigueiro, transferindo-se
pequenos fragmentos das esponjas para placa de Petri. As placas de cultivo foram transferidas
para estufa tipo B.O.D (Biological Oxygen Demand) a 26oC.
Todos os fungos isolados do formigueiro foram submetidos aos procedimentos de
cultivos a fim de se obter uma nova colônia a partir de um único esporo. Para tal, utilizou-se a
técnica de diluição seriada seguida de plaqueamento de acordo com o protocolo de Azevedo e
Costa (1973).
Os isolados utilizados no presente trabalho foram conservados por meio de 3
processos: (1) método segundo Castellani (1939); (2) método do glicerol a 15%, onde a
solução de esporos foi armazenada e conservada a -20oC e (3) método dos tubos de ensaio
com meio inclinado coberto por óleo mineral.
A extração de DNA dos fungos foi realizada conforme o protocolo utilizado por
SOUZA (2006). A PCR foi realizada a partir dos “primers” descritos por WHITE et al.
(1990) para a região ITS-1 do rDNA. O produto da PCR foi conferido por eletroforese em gel
de agarose 1,5%, corado com gel blue green e visualizado sob luz ultravioleta.
A partir do jardim de fungos associados às formigas cortadeiras, foram isolados seis
microrganismos, representados por fungos filamentosos mitospóricos (Trichoderma sp.,
Aspergillus sp.), basidiomiceto (Leucoagaricus gongylophorus) Leveduras e Bactérias gram
negativas e positivas, que cresceram mesmo na presença de antibióticos.
Posteriormente estes fungos foram identificados com auxílio de ferramentas
moleculares para a confirmação da espécie. Os resultados do seqüenciamento de DNA
indicaram a presença de: Leucoagaricus gongylophorus; Bionectria ochroleuca; Aspergillus
flavus; Trichoderma longibrachiatum; Fusarium solani e Leveduras como os
microrganismos associados às formigas. Todos os microrganismos isolados e identificados
foram preservados para estudos posteriores em ensaios de antagonismo.
A associação simbiótica entre as formigas que foram objetos deste estudo, juntamente
com os fungos por elas cultivados é considerada uma das razões de seu sucesso ecológico na
natureza. Aparentemente o desafio continua.
Uma das razões dos poucos estudos realizados com fungos de Attini é a sua difícil
identificação. Os estudos realizados até o momento indicam ser basidiomicetos os cultivares
de todos os gêneros de Attini (Weber, 1969), porém há dificuldades na definição do táxon
116
destes fungos, devido ao fato de, na maioria dos casos, apenas desenvolvem hifas estéreis,
seja no ninho ou em culturas isoladas de laboratório, dificultando a taxonomia tradicional
deste grupo, que é baseada na morfologia do basidioma, estrutura de reprodução destes
fungos e que é indispensável na identificação até nível de espécie.
Os resultados encontrados nesta pesquisa confirmam a presença de fungos
predominantes nos ninhos de Atta sexdens e descreve a presença de outros microrganismos
que vivem em associação simbiótica com essas formigas cortadeiras.
Wheeler (1907), Weber (1969) descreveram também estes mesmos microrganismos
fazendo parte dos jardins de fungos associados às formigas cortadeiras. A literatura registra
ainda a presença de Leucoagaricus weberi; Escovopsis weberi (Muchovej et al., 1991) e
Escovopsis aspergilloides e Actinomicetos da família Pseudonocardiaceae), como sendo
também microrganismos encontrados associados a estas formigas.
Estudos bioquímicos e micromorfológicos confirmam que os fungos simbiontes de
Attini são basidiomicetos, os quais estão divididos em três grupos: G1- inclui os fungos
cultivados pelos gêneros Atta, Acromyrmex, Trachymyrmex e Sericomyrmex; único grupo que
possui gongilídeos; G2- cultivados pelas espécies morfologicamente derivadas do gênero
primitivo Apterostigma, possuem abundantes grampos de conexão e hifas aéreas
extremamente alongadas, que em algumas espécies servem como proteção aos ninhos; G3-
cultivados pelos gêneros Cyphomyrmex, Mycetosorites, Mycetophylax Mycocepurus,
Mycetarotes e Myrmecocrypta, são relativamente mais heterogêneos, com alguns exemplares
mais próximos ao grupo G1, enquanto outros estão mais relacionados a espécies de
basidiomicetos não domesticados pelas formigas (Currie et al. 2003).
Wheeler, em 1910, já previa este fato dizendo: “O estudo das Attini está apenas
começando, e o avanço neste fascinante tema será mais difícil para micologistas do que para
entomologistas (Mueller, 2002).
Em estudos moleculares realizados por Currie et al., (2003) observaram-se diferenças
até em nível taxonômico de Família entre os fungos cultivados por diferentes categorias de
Attini. MUELLER (2002) faz um relato de todas as ocorrências de basidiomas em ninhos de
formigas forrageadoras e, a partir deste trabalho pode-se inferir que, ao menos para as
espécies dos gêneros considerados mais evoluídos (Atta e Acromyrmex) há o cultivo da
mesma espécie de fungo.
Conclusões
117
A partir do jardim de fungos associados às formigas cortadeiras, foram isolados seis
microrganismos, representados por fungos filamentosos mitospóricos (Trichoderma sp.,
Aspergillus sp.), basidiomiceto (Leucoagaricus gongylophorus) Leveduras e Bactérias gram
negativas e positivas, que cresceram mesmo na presença de antibióticos.
Os resultados do sequenciamento de DNA indicaram a presença de: Leucoagaricus
gongylophorus; Bionectria ochroleuca; Aspergillus flavus; Trichoderma longibrachiatum;
Fusarium solani e Leveduras como os microrganismos associados às formigas. Todos os
microrganismos isolados e identificados foram preservados para estudos posteriores em
ensaios de antagonismo.
Recomendamos a continuação dos estudos, pois outros microrganismos podem ser
associados a estas formigas cortadeiras, incluindo aqueles de importância biotecnológica.
Referencias
Adams MD et al., (2000). The Genome Sequence of Drosophila melanogaster. Science.
287(5461):2185-2195.
Azevedo, JL, Costa SOP (1973). Exercícios práticos de genética, São Paulo: EDUSP, 288p.
Castelani A (1939). Viability of mold culture of fungi in destilled water. J. Trop. Med. Hyg.,
42:225.
Currie CR; Stuart AE. (2001). Weeding and grooming of pathogens in agriculture by ants.
Proceedings. Biological sciences The Royal Society .
Currie, CR, Bot ANM, Boomsma J J (2003) Experimental evidence of a tripartite mutualism:
bacteria protect ant fungus garden from specialized parasites. Oikos, 101: 91-102.
Mueller, UG (2002) Ant versus fungus versus mutualism: Ant-cultivar conflict and the
deconstruction of the attine ant-fungus symbiosis. American Naturalist, 160: S67-S98.
Mueller UG, Geraldo N (2002). Fungus-farming insects: Multiple origens and diverse
evolutionary histories. PNAS. 23:15247-15249.
118
Muchovej JJ, Della Lucia TM, Muchovej RM C (1991). Leucoagaricus weberi sp. nov. from
a live nest of leaf-cutting ants. Mycol. Res., 95(11):1308-1311.
Souza, AQL (2006). Potencial Genético e Químico dos endófitos de Murray paniculata L.
(Jack). (Tese) Doutorado em Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos, SP, Brasil, 128 p.
Weber JR, Greer, B, Voight E, White RR. (1969). Unusual strength properties of echinoderm
calcite related to structure. J. Ultrastruct. Res., 26: 355-366.
Wheeler WM (1907). The polymorphism of ants, with an account of some singular

abnormalities due to parasitism. Bull. Amer. Mus. Nat. Hist. 23:1-93.
White T J, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990). Amplificação e sequenciamento de genes de

fungos ribosomal RNA para filogenética. In: Innis MA, Gelfand DH, Shinsky JJ, White TJ,
editors. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, p.315-322.
119
Avaliação da viabilidade de Culturas de Paecilomyces preservadas em

Óleo Mineral na Coleção de Culturas de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do INPA
Lima H.D.S1; Jesus M.A1; Oliveira D.A.S1
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Manaus, AM. E-mail:
[email protected], [email protected],
Resumo
A Coleção de Culturas de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultura do INPA

abriga linhagens de diferentes fungos anamorfos de importância biotecnológica,
agrossilvicultural e de saúde. O gênero Paecilomyces (Moniliaceae) se destaca por ter
diversos potenciais, tais como: agroindustrial, biotecnológico e patológico. Os isolados
estão preservados nos métodos de Óleo mineral, Sílica gel e Baixa temperatura. O
presente estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade das culturas de Paecilomyces
armazenadas em Óleo mineral, visando à reativação das cepas ao mesmo tempo
verificar as vantagens e desvantagens deste método de preservação. Foi realizado um
levantamento das linhagens de Paecilomyces preservadas em Óleo mineral depositadas
no acervo citado. Com os dados devidamente organizados, foi retirado o óleo das
culturas mantidas em tubos criogênicos, com o auxilio de papel de filtro placa de Petri
com, ambos estéreis em câmara de fluxo laminar devidamente fechada, visando à
retirada total do óleo. Em seguida, dois papéis de filtros pequenos estéreis e umedecidos
em caldo glicosado foram colocados sobre na parte da colônia com possível micélio,
sob condições assépticas, visando o crescimento micelial em todo o papel de filtro. Os
papeis filtro já colonizado foram inoculado em placa de Petri com meio de cultura BDA
(Batata, Dextrose e Ágar) e levados aà estufa a 25ºC por um período até o crescimento
do fungo no meio de cultivo. As culturas contaminadas ou morfologicamente
descaracterizadas foram descartadas e outras amostras da linhagem foram reativadas até
a obtenção da cultura pura. As características morfológicas e fenotípicas do fungo foram
observadas sob esteremicroscópio. O presente estudo contribuiu para a recuperação de
todas as (94) linhagens preservadas pelo método de Óleo mineral. O método de
preservação em óleo mineral pode ser considerado eficiente na conservação de cepas de
Paeciloymces, no entanto, recomenda-se o uso de recipiente com total vedação o que
minimiza o risco de contaminação.
Palavras Chaves: Viabilidade, Óleo Mineral, Paecilomyces.
Introdução
Diante da imensa diversidade genética de microrganismos da região Amazônica,

as coleções apresentam um importante papel na preservação e manutenção das
linhagens destes microrganismos (Sola et al., 2012). Para tal, a conservação do estado
120
inicial do microrganismo é essencial para evitar mutações indesejáveis, garantindo
assim a vitalidade e quantidade das células (Paoli 2005; Okafor 2007).
Os métodos de preservação das culturas são classificados de acordo com o tempo

de conservação, são eles de curto prazo: repique continuo; médio prazo: meios líquidos
como, preservação em Óleo mineral e Água destilada e longo prazo: Liofilização e
Criopreservação (Costa e Ferreira 1991; Pires et al. 2012). O método de preservação em
óleo mineral consiste na aplicação de óleo mineral esterilizado sobre a cultura, a fim de
limitar a quantidade de oxigênio disponível, assim reduzindo o metabolismo e a taxa de
multiplicação do microrganismo (Romero 2014; Sales-Campos et al., 2015).
Na Coleção de Culturas de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural do

INPA, estão depositadas linhagens de Paecilomyces isoladas de diversas espécies
florestais de importância econômica da região amazônica, resíduos madeireiros,
produtos florestais, dentre outros substratos lignocelulolíticos avaliado em estudos de
tecnologias da madeira e biotecnologia realizados no INPA.
O gênero Paecilomyces pertence ao filo Eumycota, Classe Deuteromycetes,

Ordem Moniliales e Família Moniliaceae (Santin, 2008) suas colônias são de
crescimento rápido, variando de cor em ouro, verde-ouro, amarelo-marrom, lilás ou
castanho, mas nunca em uma cor uniforme (Samson, 1974). O gênero é de ampla
distribuição em diferentes substratos lignocelulolíticos. Paecilomyces é associado a
contaminações, pois pode provocar infecções em humanos tais como úlcera de córnea,
ceratite e endoftalmite por uso incorreto de lentes de contato ou cirurgias oculares mal
realizadas, além de serem associados a micoses oportunistas e doenças alérgicas (Chan-
Tack et al., 1999). As linhagens de Paecilomyces encontravam-se preservadas em
diferentes métodos tais como: Baixa temperatura, Óleo mineral e Sílica gel. Neste
estudo analisou-se a viabilidade das culturas armazenadas no método Óleo mineral,
visando à preservação das características biológicas de Paecilomyces, assim como as
vantagens e desvantagens da preservação destas culturas armazenadas por longo
período.
Material e Métodos
121
Inicialmente, foi realizado um levantamento das linhagens de Paecilomyces
mantidas pelo método de preservação em Óleo mineral, que se encontram depositadas
no acervo. Posteriormente as culturas foram agrupadas em ordem crescente de acordo
com a data do repique. Com os dados de cada linhagem devidamente organizados e as
culturas agrupadas, foi retirado o óleo dos tubos criogênicos, os mesmos foram
colocados invertidos em Papel de Filtro Whatman (esterilizado a 120ºC), por dois dias
em uma placa de Petri na câmara de fluxo laminar, as placas foram deixadas na câmara
devidamente fechada por um período 03 a 05 dias, visando à retirada total do óleo
conforme (Ista, 1978; EL-Aziz, 2015), os papeis de filtros encharcados foram trocados
por outros secos. Dois papeis de filtros pequenos estéreis e umedecidos em caldo
glicosado foram colocados sobre a colônia do fungo, sob condições assépticas (Figura
1a). Os tubos com os papeis foram mantidas em estufa a temperatura de 25 a 27 ºC até o
crescimento micelial em todo o papel filtro.
O papel de filtro colonizado pelo fungo foi colocado no centro de uma placa de
Petri com meio de cultura BDA, visando o crescimento micelial nas placas, as quais
foram mantidas em estufa a temperatura 25 e 27 °C por 07 dias, tempo suficiente para
formação das colônias com características macroscópicas da cultura tais como:
velocidade de crescimento (lento, relativamente lento, rápido), textura (algodonosa,
granular ou pulverulenta), topografia (umbiliforme, elevada e outras), coloração
(variando suas cores em ouro, verde-ouro, amarelo-marrom, lilás ou castanho), presença
de pigmentos (exsudado) de acordo com os critérios estabelecidos por Neufeld (1999).
Em caso de contaminação, procedeu-se o processo de descontaminação através de
repiques contínuos ate a purificação da cultura (Figura 1b). Também, no caso de perda
total da cultura, outra cepa mantida em outro método foi reativada, no sentido de se
obter maior número de culturas, e assim a preservação do acervo de Paecilomyces.
122
a b c
Fig. 1 - Metodologia utilizada para verificação da viabilidade dos espécimes de Paecilomyces
armazenados em método de preservação Óleo Mineral. a) Tubo de ensaio invertido para retirada
do óleo mineral. b) Cultura de Paecilomyces purificadas. c) Tubo de ensaio com tampão de
algodão e tubos criogênicos com inoculo de Paecilomyces.
Na coleção estão depositadas 124 linhagens de Paecilomyces preservadas nos

diferentes métodos de armazenamento. Destas, 94 estavam preservadas em Óleo
mineral.
Um total de 94 culturas foi reativado, no entanto somente 19 linhagens não

apresentavam qualquer tipo de contaminação e/ou alteração em suas características
morfológica, portanto 75 linhagens apresentaram contaminações externas de
microrganismos, tais como, bactérias, leveduras e outros fungos como Trichoderma,
Penicillium, Aspergillus, dentre outros.
Também se as culturas de Paecilomyces mantidas pelo método de Óleo mineral

entre o período de 2007 até 2014 em temperatura ambiente não apresentaram
contaminação, enquanto que a maioria das culturas preservadas entre os anos de 2000 e
2006 apresentaram contaminação.Constata-se que, a vedação dos tubos de ensaio com
tampão de algodão não é indicada, pois pode facilitar a entrada de outros
microrganismos entre os espaços do tubo e o algodão durante o período de
armazenamento. Por outro lado, as culturas preservadas em método Óleo mineral,
armazenadas em tubos criogênicos tampados com rosca entre o período de 2007 e 2014,
não apresentaram quaisquer contaminações, pois o tubo é bem vedado, o que dificulta a
entrada de microrganismos nas culturas (Figura 1c).
123
Do total de 94 culturas de Paecilomyces avaliado nesse estudo, 50 mantidas em
óleo mineral foram reativadas e outras 44 foram recuperadas de outros métodos de
preservação, de modo que todo o acervo deste gênero de fungo foi reativado e
preservado em três métodos: Óleo mineral, Sílica gel e Repicagem continua.
Os dados adquiridos corroboraram com os descritos por Sola et al. (2012) e

Dellaretti (2014), onde afirmam a eficiência do métodos de preservação em Óleo
Mineral, quando comparado as vantagens que do Repique contínuo, diferindo somente
na longevidade da preservação da cultura, por até cinco anos.
De modo que a preservação de cepas do gênero Paecilomyces, torna se

necessária considerando que apresenta diversos potenciais, tais como: biotecnológico,
agroindustrial e/ou medicinal, por ser um fungo bastante comum, podendo ser
encontrado no ar e no solo de ambientes subtropicais e/ou tropicais (Rheea, 2016). P.
variotii se destaca na coleção, pois está representada por várias linhagens, como
também, encontra-se associada a micoses oportunistas, infecção cutânea em órgãos ou
sistema do corpo humano como os tecidos moles, pulmonares, sendo o maior índice de
contaminação cutânea como sinusite, otite média, endocardite e outras (Chan-Tack et
al., 1999; Zaki et al. 2015).
Outras espécies de Paecilomyces estão associadas a doenças alérgicas, tais

como infecções relacionadas à hialohifomicoses em gatos, tartarugas, cabras e ratos de
laboratório (Mandarapu, 2015). No setor agricola, P. variotii é usado com outros fungos
para proteger as galhas de raízes de café e de tomate e associado à biodegradação do
óleo de palma, de juta, de papel, e de emulsões farmacêuticas (Samson 1974; Costa
2001). Também este fungo é usado em processos agroindustriais como proteção ao
ataque de Aphisgossypii e Myzuspersicae em galhas de pequenos arbustos da família
Leguminosae/Fabaceae, Rosaceae e Malvaceae (feijão, grão-de-bico, pessegueiros,
algodoeiro, dentre outros) (Zawadneak et al., 2015). Do ponto de vista biotecnológico, a
preservação de culturas de Paecilomyces torna-se muito importantes, assim como o
acesso das cepas viáveis para pesquisas e ensino.
124
Fig. 2 - Culturas de Paecilomyces preservadas em Óleo Mineral, sem contaminação e
contaminadas por outros microrganismos .
Fig. 3 - Porcentagem das culturas de Paecilomyces reativadas de óleo mineral e recuperadas

e as recuperadas de outros métodos.
Conclusões
O presente estudo contribuiu para a recuperação de todas as linhagens de

Paecilomyces preservadas em óleo mineral, além de constatar a eficiência do método de
preservação óleo para Paecilomyces. No entanto é de fundamental importância o uso de
recipientes adequados ao armazenamento destes fungos.
Recomenda-se a utilização de tubos criogênicos com tampa de rosca para a

manutenção das culturas, pois a vedação é melhor, dificultando a entrada de
microrganismos e reduzindo o risco de contaminação, aumenta a viabilidade cultural.
Agradecimentos
125
Ao Programa de coleções e acervos científicos do Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia (INPA), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas
(FAPEAM) e o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq).
Referências
Chan-Tack KM, Thio CL, Miller NS, Karp CL, Ho C, Merz WG (1999) Paecilomyces
lilacinus fungemia in an adult bone marrow transplant recipient. Med Mycol. 37:57-60.
Costa MJN, Campos VP, Pfenning LH, Oliveira DF (2001) Toxicidade de filtrados
fúngicos a Meloidogyne incognita. Fitopatologia Brasileira. Lavras, MG. 26:749-755.
Costa CP, Ferreira MC (1991) Preservação de microrganismos: revisão. Revista de
Microbiologia. São Paulo, SP. 22:263-268.
Dellaretti ÉM (2014) Preservação de fungos em baixas temperaturas. Sete Lagoas,
Minas Gerais, Brasil, 36p (Monografia. Universidade Federal de São João Del Rei,
Programa de Graduação do Bacharelado Interdisciplinar em Biossistemas).
EL-Aziz ABEA, Awad AAE, Zaki GH (2015) Reduction of olive oil mill waste water
phenolic compounds and COD using Paecilomyces variotii. Trends in Industrial
Biotechnology Research. 1:1-9.
ISTA - International Seed Testing Association (1978) Seed health testing. Seed Science
and Technologic.4:12.
Mandarapu SB, Mukku KK, Raju SB, Chandragiri S (2015) Bem sucedida reinserção
cateter em um caso de Paecilomyces varioti peritonite em um paciente em diálise
peritoneal ambulatorial contínua. Indian J. Nephrol. 25:177-179.
Neufeld PM (1999) Técnicas básicas de Diagnósticos. Manual de micologia médica.
Rio de Janeiro, RJ, BR. 1:65-67.
Okafor N (2007) The Preservation of the Gene Pool in Industrial Organisms: Culture
Collections. In: Modern industrial microbiology and biotechnology. Science Publishers.
8:300-315
Paoli P (2005) Biobanking in microbiology: from sample collection to epidemiology,
diagnosis and research. FEMS Microbiology Reviews, Amsterdam, 29:897-910.
Pires GCC, Aparecido CC, Finatti, D (2012) Preservação em laboratório de fungos
filamentosos por longos períodos de tempo. Instituto Biológico. 74:9-16.
Rheea YJ, Hillierbc S, Gaddad GM (2016) A new lead hydroxycarbonate produced
during transformation of lead metal by the soil fungus Paecilomyces javanicus.
Geomicrobiology Journal. 33:3-4.
Romero RS (2014) Preservação de culturas de bactérias fitopatógenicas. Material
didático, Laboratório de Bacteriologia de Plantas, Departamento de Fitopatologia,
Universidade Federal de Viçosa, 2006. Avaliado em: <http://www.ufv.br/dfp/bac
/uni11.pdf> Acesso em 18 jun. 14.
126
Sales-Campos C, Gonçalves KM, Jesus MA, Andrade MCN (2015) Avaliação de
diferentes métodos de preservação de culturas fúngicas. Ambiência Guarapuava (PR)
11:337-343.
Samson RA (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes. Studies in Mycology.
6:1-119.
Santin RCM (2008) Potencial do uso dos fungos Trichoderma spp. e Paecilomyces
lilacinus no controle de Meloidogyne inconita em Phaseolus vulgaris. Porto Alegre, Rio
Grande do Sul. (Tese) Doutorado em Fitotecnia, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul.
Sola MC, Oliveira AP, Feistel JC, Rezende CSM (2012) Manutenção de
Microrganismos: Conservação e Viabilidade. Enciclopédia Biosfera, Centro Científico
Conhecer – Goiânia. 8:14-13.
Zawadneak MAC, Pimentel IC, Robl D, Dalzoto P, Vicente V, Sosa-Gómezc DR,
Porsani M, Cuquel FL (2015) Paecilomyces niveus Stolk & Samson, (Ascomycota:
Thermoascaceae) as a pathogenof Nasonoviaribis nigri (Mosley, 1841) (Hemiptera,
Aphididae) in Brazil. Brazilian Journal Biology. 75:158-162.
127
Avaliação de fungos endofíticos e epifíticos com potencial para produção de

biossurfactantes, isolados de macrófitas aquáticas do rio Negro em Manaus,
Amazonas
Lima, JMS1, Pereira, JO2, Costa Neto PQ2, Batista IH3, Santos JC1, Araújo SP4, Pantoja, MC2,
Azevedo JL5
1
Rede Bionorte de Biodiversidade e Biotecnologia, 2 Universidade Federal do Amazonas-UFAM
3
Universidade do Estado do Amazonas - UEA. 4 Pós-Graduação em Biotecnologia/UFAM, Manaus – AM
– Brasil. 5Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”/Universidade de São Paulo, Piracicaba – SP
Resumo
Foram investigados fungos endofíticos e epifíticos isolados de macrófitas

aquáticas Eichhorniacrassipes (Mart.) Solms e Cyperus ligularis L., coletadas em águas
contaminadas com resíduos de petróleo para avaliação do potencial quanto à produção de
biossurfactantes; os mais promissores foram identificados por meio do sequenciamento da região
rDNA. Na seleção quanto à atividade biodegradadora de hidrocarbonetos o indicador utilizado
foi 2,6 indofenol (DCPIP) em meio Bushnell-Haas(BH) acrescido de petróleo. Para a atividade
biossurfactante, foram realizados os seguintes testes: Medidade emulsificação,colapso da gota,
tensão superficial. Do total de vinte isolados, doze cresceram em meio BH e petróleo; dos quais,
oito promoveram a descoloração doDCPIP. O isolado S31apresentou moderada emulsão do
diesel (1,5cm ou 52%) com redução da tensão superficialda água em51,03 mN/msendo
identificado como Phoma sp. Os outros fungos identificados foram: Rhizopus oryzae, Gibberella
moniliformis, Fusarium oxysporum, F. proliferatum, F. fujikuroie, Penicillium citreonigrum, e
apresentaram potencial para biodegradação de hidrocarbonetos. Novos estudos com o fungo
Phoma sp. tornam necessários como o cultivo em diferentes fontes de carbono com o intuito de
melhorar a produção de compostos secundários envolvidos na emulsificação e diminuição da
tensão superficial da água.
Palavras chave:Biorremediação, bioemulsificantes, Eichhornia, Cyperus, petróleo, diesel
128
Introdução
Os biossurfactantes podem ser de origem microbiana e apresentam potencial para

aplicações comerciais em diversos setores. Esses produtos são eficazes na recuperação avançada
de petróleo e em processos de biorremediação de ambientes contaminados por hidrocarbonetos.
Também possuem aplicações potenciais na agricultura, como insumos na área de cosméticos,
produtos farmacêuticos, detergentes, produtos de higiene pessoal, processamento de alimentos,
dentre outros (Cola e Costa 2003; Sourav et al., 2015). Apresentam vantagens sobre os
surfactantes de origem sintética considerando sua biodegradabilidade e por apresentar baixa
toxicidade.
Considerando-se que os biossurfactantes são produzidos por bactérias, leveduras e
fungos filamentosos,os fungos endofíticos e epifíticos também podem possuir essa característica.
Micro-organismos endofíticoss egundo Azevedo (2008) são aqueles que habitam pelo menos um
período do seu ciclo de vida, o interior de um vegetal, em oposição aos epifíticos que vivem na
superfície das plantas.
As espécies Curvularia clavata, Fusarium proliferatum e Phoma sp. isolados de
diferentes ambientes contaminados por hidrocarbonetos são as principais espécies citadas como
produtores de biossurfactantes. Quanto à biodegradação de hidrocarbonetos, Cladophialophora e
Exophiala assimilam tolueno; enquanto que Aspergillus sp. e Penicillium spp. degradam os
hidrocarbonetos alifáticos, clorofenóis, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP),
pesticidas, corantes sintéticos e 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) (Azevedo 2008; Oliveira et al., 2008;
Harms et al., 2011; Bhardwaj et al., 2015; Neoh et al., 2015). O objetivo deste trabalho foi
avaliar o potencial de fungos endofíticos e epifíticos, quanto à biodegradação de hidrocarbonetos
e produção de biossurfactantes.
Material e Métodos
Os micro-organismos foram isolados das macrófitas aquáticas Cyperusligularis L.

e Eichhorniacrassipes (Mart.) Solms coletadas próximo à saída dos efluentes da refinaria da
Petrobrás/Manaus-AM (REMAN). O cultivo foi em placas de Petri contendo meio Batata
Dextrose Ágar (BDA) (Himedia) a 28°C por nove dias e repicados para meio Bushnell-Haas
(BH)Broth (Sigma-Aldrich),acrescido de 2mL de petróleo.Após o crescimento micelialem BH
por nove dias, discos de 5mm de diâmetro foram utilizados como pré-inóculo nos testes
129
subsequentes em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 100mL de meio BH líquido, acrescido de 5
mL de petróleo,o pH foi ajustado para 5 e incubados por 14 diasa30°C.
A identificação molecular foi realizada somente para as amostras com resultado

positivo no teste indicador redox 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) e aqueles com resultado
acima de 1 cm para o índice de emulsificação. Para a extração do DNA foi utilizado o
Plant/Fungy DNA isolation kit (NorgenBiotekCorp) conforme as recomendações do fabricante.
Foram utilizados os primers ITS1 (5’ – TCC GTA GGT GAA CCT GCG G – 3’) e ITS4 (5’ –
TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’) para amplificação da região conservada em posições
específicas do 18S e 28S do gene rDNA. Os amplicons foram purificados com polietileno glicol
8000 e sequenciados em analisador genético ABI 3500xL (AppliedBiosystems®). As sequências
foram alinhadas e editadas no programa MEGA com agrupamento pelo método Neighbor-
Joining e utilizadas para identificação dos isolados comparando-se com as sequências tipo com
base nos resultados observados no BLASTn
O petróleo cru foi proveniente da Base Petrolífera de Urucu, Amazonas, Brasil e o

diesel foi adquirido em posto de gasolinade bandeira BR, previamente filtrado. As dosagens de
petróleo ou diesel foram utilizadas conforme Jaquiche-Matsuuraetal.,(2014).
Teste de Biodegradabilidade Utilizando o Indicador Redox 2,6-Diclorofenol Indofenol (DCPIP)

O teste de biodegradabilidade foi realizado pela técnica do DCPIP (Hanson etal.,
1997). O experimento foi realizado em placa de poliestireno com 96 poços, a concentração de
DCPIP foi ajustada para 0,010 g/mL. Em cada poço foram adicionados 200 µLda solução de
DCPIP, 10 µLdo petróleo de Urucu,e inóculodo fungo correspondendo a 2±3 mm de diâmetro.
As placas foram mantidas em temperatura ambiente (27±2 °C). As medidas do tempo para
descolorir o meio foram realizadas após24 e 48 horas. Como controle positivo foi utilizado
DCPIP com petróleo, e controle negativo somente o indofenol.
Meio Específico para Produção de Biossurfactantes

A produção de biossurfactante foi realizada em 50 mL de meio de cultura
constituído de MgSO4.7H2O 0,5 g/L, KH2PO4 1 g/L, NaNO3 3 g/L, extrato de levedura 1 g/L e
peptona 0,3 g/L, com pH ajustado em 5 para fungos filamentosos, modificado de Rapp e
Backhaus(1992). Como fonte de carbono foi utilizado óleo diesel ou petróleo a 1,0% v/v.
130
O cultivo microbiano foi realizado em frascos Erlenmeyer de 125 mL a 30°C em
incubadora orbital (New BrunswickScientific) com agitação constante de 150 rpm, por 20 dias.
FrascosErlenmeyer com 50 mL de meio de cultura e 1% de óleo diesel(v/v), sem o inóculo, foi
utilizado como controle. Cada micro-organismo foi cultivado em triplicata. Após o período de
incubação, os meios de cultura foram filtrados em membrana filtrante (TPP, Europe/Switzerland)
com porosidade de 0,45 mm acoplada à seringa esterilizada de 20 mL.
Teste Qualitativo do Colapso da Gota de Óleo

O teste foi realizado em placas de Petri(60 x 12 mm) com 3,5 mL do extrato
filtrado livre de células. Para realizar o teste, uma gota de petróleofoi adicionada ao extrato livre
de células, em triplicata, e observados nos tempos 0, 1, 5, 30 min, 1e72 horas. O resultado foi
considerado positivo quando houve dispersão da gota de petróleo. Como controle negativofoi
utilizado 3,5 mL do extrato, porém sem o fungo; e 3,5 mLda solução do surfactante Sódio
Dodecil Sulfato (SDS)a1M, como controle positivo.
Avaliação da Atividade de Emulsificação

O meio específico para a produção de biossurfactantes foifiltrado e avaliado
quanto à atividade de emulsificação do tipo água em óleo (A/O). O teste foi realizado em
triplicata. Adicionou-se em tubos de ensaio 3Ml dos extratos das culturas livres de células e 2
mLde diesel.Foram agitados pordois minutos em vortexa 70 rpme 24 horas em repouso. Após
esse período, a altura do petróleo emulsificado (cm) foi comparada à altura total (Cooper e
Goldenberg 1987). O índice de emulsificação foi medido segundo as convenções adotadas por
Paraszkiewiczet al.,(2001) e calculado conforme a equação (1):E24 = Índice de emulsificação
após 24 h (%), Hemulsão = Altura da emulsão, Ht = Altura total.
𝐻𝑒
Equação (1): 𝐸24 = × 100
𝐻𝑡
Avaliação da Tensão Superficial

A medida da tensão superficial é uma ferramenta comum e um método indireto
para monitorar a produção de biossurfactantes. À medida que o micro-organismo cresce, ele
sintetiza o biossurfactante e este metabólito é lançado ao caldo metabólico, reduzindo a tensão
131
superficial.A tensão superficial foi medida no tensiômetro modelo Kruss (K-6, Alemanha), pelo
método do anel (Du Noüy). As análises foram realizadas com o sobrenadante obtido após a
centrifugação da amostra bruta a 25°C.
Resultados
Oito fungos selecionados pelo crescimento no meio BH acrescido de petróleo

foram identificados por meio do sequenciamento de parte do gene rDNA. Os fragmentos do gene
rDNA contendo a região ITS1-5,8S-ITS2 apresentaram entre 531 a 562 pb. Os fungos epifíticos
S31 e S36 isolados de C. ligularis foram identificados como Phomasp.; S24 Rhizopus
oryzae;S32 F. oxysporum; S33 Gibberella moniliformis e S42 F. proliferatum. Entre os fungos
endofíticos, S42 foi identificado como F. fujikuroi e S51 Penicillium citreonigrum, ambos
provenientes de E. crassipes. O resultado das sequências mais relacionadas com as do National
Center for BiotechnologyInformation estão na (Tabela 1).
Tabela 1. Relação dos fungos endofíticos e epifíticos isolados de macrófitas do rio Negro-
Amazonas/Brasil, utilizando como referência os dados do NCBI (National Center for
Biotechnology Information)
Iso* Micro-organismos Cod. NCBI Hospedeiros Endo.* Epi.* Id.*(%)
S24 Rhizopus oryzae KJ460029.1 Cyperusligularis X 99
S31 Phomasp. KM979945.1 C. ligularis X 100

S32 Fusariumoxysporum JX406507.1 Eichhornia crassipes X 99
S33 Gibberella moniliformis EU151472.1 C. ligularis X 98

S36 Phomasp. KM246267.1 C. ligularis X 100
S42 F. proliferatum KJ020897.1 C. ligularis X 99
S46 F. fujikuroi KM369868.1 C. ligularis X 99

S51 Penicillium citreonigrum KF031329.1 E. crassipes X 97
*Iso= Isolado; Endo= Endofitico; Epi= Epifítico; Id= Identidade
Entre os oito fungos analisados apenas Phomasp. (S31), mostrou-se eficiente nos
diferentes testes realizados afim de selecionar os produtores de biossurfactantes. Os demais
isolados, embora tenham dispersado a gota de petróleo em diferentes tempos, não formaram
emulsão acima de 1 cm, conforme convenção adotada (Tabela 2).
132
Somente o Phomasp. (S31) foi selecionado para o teste de tensão superficial,pois
foi positivo no teste do colapso da gota em menor tempo e emulsificação acima de 1 cm. A
diferença entre a tensão superficial do extrato fúngico e a tensão superficial do controle foi de
2mN/m, porém em relação à água foi de 18,23 mN/m indicando possuir capacidade em romper a
tensão superficial da água.
Tabela 2. Fungos endofíticos e epifíticos isolados de macrófitas do rio Negro –

Amazonas/Brasil para produção de biossurfactantes
Índice de Tensão
Isolado Colapso da gota
emulsificação superficial
1
0 5 min 30 min 1h 72h Hu/E24
min
Phomasp. (S31) + + + + + + 1,5 cm/52 % 51,03 mN/m
Penicilliumcitreonigrum - - - + + + 0,7 cm/38 % -
Phomasp. - - ± ± ± ± 0 -
Rhizopus oryzae - - ± ± ± ± 0 -
Fusarium fujikuroi - - - - - - 0 -
F. proliferatum - + + + + + 0 -
F. oxysporum - - ± ± ± ± 0 -
Gibberella moniliformis - ± ± ± ± ± 0 -
Controle
SDS + + + + + + 100 %
BH+PS - - - - - - 0 53,03 mN/m
Água 71,26 mN/m
*SDS = Sódio Dodecil Sulfato foi usado como controle positivo e o meio BH+PS=Petróleo sem o fungo, foi usado
como controle negativo. Hu=altura emulsificada, E24 = índice de emulsificação em 24h
Discussão
O comportamento dos isolados que cresceram em meio BHcom petróleo pode ser
analisado segundo Jaques (2007); Maciel et al., (2013) e Cruz et al., (2014) onde, tanto fungos
como bactérias podem ser biodegradadores de hidrocarbonetos. Os micro-organismos que
apresentam sucesso no processo de degradação desses compostos devem produzir enzimas
capazes de utilizar as complexas moléculas do petróleo em produtos intermediários de suas rotas
metabólicas. Neste caso os fungos teriam duas rotas metabólicas uma não-lignolítica e a
lignolítica; à exemplo dos fungos Cunninghamella elegans, e o fungo Pleurotus ostreatus,
Aspergillus fumigatose C. Lunatajá estudados como degradadores de petróleo e seus derivados
(Paraszkiewicz, et al., 2001; Jaques et al.,2007; Bhatt et al., 2012).
133
Junior et al., (2012) destacaram que fungos do gênero Phomasão bons produtores de lacase,
enzima do grupo dasfenoloxidades capazes debiodegradar compostos fenólicos e
hidrocarbonetos; Carneiro (2010) corrobora com essa visão em um importante trabalho sobre
biorremediação, utilizando micro-organismos na metabolização de vários compostos tóxicos,
dentre eles o petróleo.
Harms (2011) relatou que culturas do gênero Rhizopus são potenciais
degradadores de HPAs, o que de certa forma pode explicar o aparecimento de espécies deste
gênero nos testes de seleção usando meio BH mais petróleo (Tabela 1). Balaji et al,(2015), em
trabalho realizado na Índia, citaram Aspergillus, Curvularia, Drechslera, Fusarium,
Lasiodiplodia, Mucor, Penicillium, Rhizopus eTrichoderma, isolados de solo contaminado por
petróleo. Percebe-se que a maioria dos gêneros citados, também foram encontrados no presente
trabalho (Tabela 1), indicando o potencial na produção de enzimas, que podem ser aplicado para
degradação de hidrocarbonetos de petróleo e seus derivados.
O fungo filamentosoC. Clavata citado por Neoh et al, (2014) e Neoh et al.,(2015)
como biorremediador de efluentes da indústria de palma e produtora de enzimas lignolíticas,
além de altareduçãodecompostos polifenólicos. A desintoxicaçãodo efluenteindica a adequação
de C.clavata na biorremediação de efluentes orgânicos, essse fato é importante, pois pode
direcionar futuros trabalhos utilizando fungos isolados nesta pesquisa, em processos
semelhantes.
Os fungos isolados da Amazônia assemelham-se em relação ao tempo de
oxidação do DCPIP, com o trabalho de Maciel et al, (2013), que observaram os tempos de 14 e
25 horas para os fungos que promoveram a descoloração do indofenol. Os isolados de macrófitas
promoveram descoloração em 24horas. No trabalho de Luz et al., (2011), o tempo de reação de
oxidação ao indofenol foi de 96horas. Maciel et al, (2013) destacaram que os isolados
responsáveis pela degradação: P. aurantiogriseum, P. corylophilume P. griseofulvum. Outras
espécies deste gênero isolados de macrófitas constam (Tabela 2).
Para Silva e Esposito (2004) a degradação de poluentes é realizada pelo sistema
enzimático intracelular citocromo P450 monoxigenase que transforma produtos solúveis em
água em menos tóxicos, levando ao processo de destoxificação. Provavelmente essas enzimas
estão envolvidas nesse processo. Esses autores relataram que Trichoderma e Fusarium em solos
contaminados por petróleo; F. fujikuroi e F. oxysporum foram isolados de macrófitas em
ambiente contaminado por petróleo.
134
Quanto à produção de biossurfactantes embora os fungos filamentosos tenham
crescido em meio BHcom petróleo, como única fonte de carbono, a maioria não foi capaz de
produzi-lo por meio dos testes seletivos como colapso da gota, índice de emulsificação e no teste
de tensão superficial.
Phomasp. (S31) foi o único capaz de produzir colapso da gota de petróleo em
menos de 1 min, assim como mostrou índice de emulsificação de1,5 cm ou 52%, frente
aopetróleo e ao diesel, este índice é considerado moderado, segundo Jaquiche-Matssuraet
al.,(2014); além disso produziu tensão superficial de 51,03 mN/m.
Esse fungo possui propriedade emulsificante, porém baixa capacidade de
redução da tensão superficial em relação ao controle(53,03mN/m) e maior capacidade de
redução de tensão superficial em relação a água (72,01mN/m) (Tabela 3).Talvez a baixa tensão
superficial seja devido à dificuldade de utilização do hidrocarboneto presente no óleo diesel para
a síntese de biossurfactantes (Decesaro et al.,2013). Por outro lado, é provável que pelos testes
realizados o biossurfactante presente no substrato do fungo, seja de alto peso molecular o que
explicaria de fato a baixa tensão superficial e a presença de propriedade estabilizante do óleo
diesel (Bento et al, 2008).
A emulsão formada foi do tipo A/O, sugerindo que os compostos orgânicos
presentes nesse emulsificante, possuem características hidrofílicas devido à formação da emulsão
se dar sempre entre a água e o óleo diesel ou petróleo. Esta característica é importante na
biorremediação de poluentes, pois pode auxiliar no processo de bioaumentação ou
bioestimulação, facilitando o crescimento fisiológico de outros micro-organismos no meio
contaminado com hidrocarbonetos do petróleo (Nitschke e Pastore, 2002; Deon et al.,2012;
Jackisch-Matsuuraet al., 2014). Esses autores também citaram a dificuldade de se encontrar
fungos filamentosos como bons produtores de biossurfactantese com capacidade de reduzir a
tensão superficial, fato este observado nesta pesquisa. Por outro lado, a produção de
bioemulsificante por fungos e bactérias podem ser utilizados em diversas aplicações tais como:
indústria de alimentos, indústria de fabricação de tintas, entre outras (Bezerra et al., 2012).
Herathet al. (2009) identificaram um composto lipopeptídico de estrutura cíclica a
isolado de Phoma sp, classificado como Phoma fungy, que se mostrou eficiente como
antifúngico em diversos testes realizados.Com exceção do trabalho de Herath et al., (2009), não
há citação de Phoma sp. como produtor de biossurfactante ou bioemulsificante, o que indica a
realização de estudos futuros como Phoma sp. (S31) associado a produção de biossurfactantes
135
envolvendo espécies de Phoma, principalmente no que diz respeito ao cultivo em diferentes
fontes de carbono, para que possa expressar a produção de compostos secundários envolvidos,
tanto na emulsificação como na diminuição da tensão superficial.
Conclusões
Todos os fungos identificados mostraram-se promissores na degradação do
petróleo e de diesel.
É necessário um aprofundamento em relação a produção enzimática por esses
fungos visando prospectar enzimas de interesse comercial que estejam relacionadas à
biodegradação de petróleo e seus derivados, principalmente com relação a produção de
biossurfactantes pelo Phoma sp.
Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES pelo auxílio dado à execução do projeto.
Referências
Azevedo JL. (2008) Genética de microrganismos. Goiânia, G.O.
Balaji V, Arulazhagan P, Ebenezer P (2014) Enzymatic bioremediation of polyaromatic

hydrocarbons by fungal consortia enriched from petroleum contaminated soil and oil seeds. J
Environ Biol 35: 3-9.
Bento MF, Camargo FA, Gaylarde CC (2008) Biossurfactantes. In: Melo, I.S., Azevedo, J.L.
(eds.). MicrobiologiaAmbiental. Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, Brasil, 152-184.
Bezerra MS, Holanda VCD, Amorim JA, Macedo GR, Santos ES (2012) Produção de
biotensoativo utilizando Pseudomonas aeruginosa e resíduo agroindustrial (manipueira) como
substrato. Holos 28: 14-27.
Bhardwaj G, Cameotra SS, Chopra HK (2015) Isolation and purification of a new

enamidebiosurfactant from Fusarium proliferatum using rice-bran. RSC Adv5:54783–54792.
Bhatt R, Patel K, Trivedi U (2010) Purification and properties of extracellular poly (3-
hydroxybutyrate) de polymerase produced by Aspergillus fumigatus. J Polym Environ 18: 141-
147.
Carneiro DA, Lucas PG (2010) A biorremediação como ferramenta para a descontaminação de
ambientes terrestres e aquáticos. Tecer 3:82-95.
Colla LM, Costa JV (2003) Obtenção e aplicação de biossurfactantes. Vetor 13:85-103.
136
Cooper DG, Goldenberg BG (1987) Surface-active agents from two Bacillus species. Appl
Environ Microbiol 53:224-229.
Cruz JM (2014) Biodegradation and phytotoxicity of biodiesel, diesel, and petroleum in soil.
Water Air Soil Pollut 1:225-1962.
Decesaro A, Rigon MR, Thomé A, Colla LM. (2013). Produção de biossurfactantes por
microrganismos isolados de solo contaminado com óleo diesel. Quim. Nova 36:947-954.
Deon MC, Rossi A, De Magro CD, Reinehr CO, Colla LM (2012) Bioremediation of
contaminated soil with oils residuals through bioaugmentation and natural attenuation. Semina:
Ciências Exatas e Tecnológicas33:73-82.
Hanson KG, Desai DJ, Desai AJA (1993) Rapid and simple screening technique for potential
crude oil degrading microorganisms. Biotechnology Techniques 10: 745-748.
Harms H, Schlosser DW (2011) Untapped potential: Exploiting fungi in bioremediation of

hazardous chemicals. Nat Rev Microbiol9:177-192.
Herath K, Harris G, Jayasuriya H, Zink D, Smith S, Vicente F (2009) Isolation, structure and
biological activity of phomafungin, a cyclic lipodepsipeptide from a Widespread Tropical
Phoma sp. Bioorg Med Chem 17:1361-1369.
Jackisch-MatsuuraAB, Santos LS, EberlinMN, Faria AF, Grossman MJ, Durrant LR (2014)
Production and characterization of surface-active compounds from Gordonia amicalis. Braz
Arch Biol Technol 57:138-144.
Jacques RJS, Bento FM, Antoniolli ZI, Camargo FO (2007) Biorremediação de solos
contaminados com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Ciência Rural 37:1192-1201.
Junior NL, Gern RMM, Furlan SA, Schlosseret D (2012) Laccase production by the aquatic
ascomycete Phoma sp. UHH 5-1-03 and the white rot basidiomycete Pleurotus ostreatus DSM
1833 during submerged cultivation on banana peels and enzyme applicability for the removal of
endocrine-disrupting chemicals. Appl Biochem Biotechnol 167:1144-1156.
Luz CC, Santos EA, Santos MOS, Mussy MY, Yamashita M, Bastos WR (2011) Estudos de
biodegradação de óleo diesel por consórcio microbiano coletado em Porto Velho – RO,
Amazônia. Quim Nova34:775-779.
Maciel CCS, Souza CS, Silva PA, Sousa MFVQ, Gusmão NB (2013) Cinética de degradação de
querosene de aviação por Penicillium sp. através da bioestimulação. R Brás Bioci1 1:39-42.
Moldes AB, Paradelo R, Vecino X, Cruz JM, Gudiña E, Rodrigues L, Barral MT (2013) Partial
characterization of biosurfactant from Lactobacillus pentosus and comparison with sodium
dodecylsulphate for the bioremediation of hydrocarbon contaminated soil. Bio Med Research
International3:1-6.
Mollea C, Bosco F, RuggeriB (2005) Fungal biodegradation of naphthalene: Microcosms

studies. Chemosphere 60:636-643.
137
Neoh CH, Lam CY, Lim CK, Yahya A, Ibrahim Z (2015) Utilization of agro-industrial residues
from palm oil industry for production of lignocellulolytic enzymes by Curvularia clavata. Waste
Biomass Valor 6:385–390.
Neoh CH, Lam CY, Ware AYI, Ibrahim Z (2014) Decolorization of palm oil mill effluent using
growing cultures of Curvularia clavata. Environ Sci Pollut Res Int 21:4397–4408.
Nitschke M, Pastore GM (2002) Biossurfactantes: Propriedades e aplicações. Quim Nova

25:772-776.
Oliveira SD, Lemos JLS, Barros CA, Leite SGF (2008) 0 Emprego de fungos filamentosos na
biorremediação de solos contaminados por petróleo: Estado da Arte. Série Tecnologia Ambiental
45. CETEM/MCT. Rio de Janeiro. RJ.
Paraszkiewicz K, Kanwal A, Długon´ski J (2002) Emulsifier production by steroid transforming

filamentous fungus Curvularialunata. Growth and product characterization. J Biotechnol 92:
287–294.
Paraszkiewicz K, Kanwal A, Długonski J (2002) Emulsifier production by steroidtrans forming

filamentous fungus Curvularia lunata. Growth and product characterization. J. Biotechnol
92:287–294.
Rapp, P, Backhaus S (1992) Formation of extracellular lipases byf ilamentous fungi, yeast, and
bacteria. Enzymeand Microbial Technology 14:938-943.
Silva M, Espósito E (2004) O papel dos fungos na recuperação ambiental. In: Espósito E,
Azevedo JL. (eds.) Fungos: Uma introdução à biologia, bioquímica e biotecnologia. EDUCS,
Caxias do Sul, BR, 337-375.
Sourav De, Susanta M, Ghosh A, Saha R, Saha B (2015) A reviewon natural surfactants. RSC
Adv 5:65757-65767.
138
Indicadores microbiológicos em diferentes sistemas de manejo do solo na

Amazônia Meridional
Malheiros CH1, Stieven A.C 2. Santos J.O 3, Almeida L.S 2, Campos DT S4,Oliveira LA 5
1
Universidade do Estado do Amazonas, UEA- PPG-Bionorte, 2 Universitário de Várzea Grande,
UNIVAG, Várzea Grande, MT,3Empresa Mato-Grossense de Pesquisa Assistência e Extensão Rural,
4
Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, 5Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. INPA.
Email. [email protected]
Resumo
As iLPFs são manejos que integram as atividades de agricultura, pecuária e floresta visando
diminuir a degradação ambiental e aumentar os lucros. O objetivo do presente estudo foi
avaliar os indicadores de qualidade do solo de uma área com sistemas de integração Lavoura-
Pecuária-Floresta (iLPF), em Nova Canaã do Norte-MT. A coleta das amostras de solo foi
feita em maio de 2013, onde as mesmas foram coletadas no sentido transversal às linhas das
espécies florestais (eucalipto e paricá) em sete diferentes distâncias: 0, 3, 6 e 10 m à esquerda
e direita do pé da planta. Na avaliação da qualidade do solo utilizou-se os indicadores:
Carbono da Biomassa Microbiana (CBM), Respiração Basal (RB) e o Quociente Metabólico
(qCO2). O método utilizado para a determinação do CBM foi o da fumigação e os demais
indicadores obtiveram-se a partir dos dados de CBM. Os resultados destacam os sistemas de
iLPF com uso de eucalipto frente aos sistemas com uso de paricá como planta perene, nos
indicadores CBM e qCO2. Porém, os sistemas, em geral, não apresentam diferenças
estatísticas na maioria das comparações, o que sugere a estabilidade dos mesmos. Os
resultados preliminares não sugerem benefícios ao solo com o uso de sistemas de integração
após 5 anos de instalação.
Palavras-chaves: carbono da biomassa microbiana, sustentabilidade, iLPF
Introdução
Os sistemas iLPF incorporam conceitos e práticas de uso sustentável dos recursos
naturais, máxima biodiversidade, uso conservacionista do solo e da água, além de agregar
valor aos produtos agropecuários. O emprego de sustentabilidade desses sistemas está
relacionado, entre outros fatores, aos benefícios para o solo, destacando: a melhoria da
139
qualidade química, física e biológica, estrutura, cobertura e maior armazenamento de água no
solo (Kluthcouski et al., 2003).
A biomassa microbiana do solo (BMS) compreende a parte viva da matéria orgânica, e
é considerado um indicador de qualidade do solo, uma vez que infere medidas qualitativas e
quantitativas nos processos ecológicos e nas propriedades físicas, químicas e biológicas do
solo, imediatamente após qualquer mudança do ambiente. Dessa forma, pelo fato de muitos
microrganismos utilizarem a fração disponível da matéria orgânica do solo (MOS), estes são
mais sensíveis às mudanças em sua qualidade e mudanças significativas na BMS que podem
ser detectadas muito antes que alterações na MOS possam ser percebidas, possibilitando a
adoção de medidas de correção antes que a perda da qualidade do solo seja mais severa
(Santos et al., 2005).
O reservatório de carbono microbiano é fortemente influenciado pelos sistemas de
manejo do solo, tipo e intensidade da rotação de culturas e pela incorporação de adubos
orgânicos e resíduos culturais, e os indicadores microbiológicos usados para fazer essa
avaliação são: o Carbono da Biomassa Microbiana (CBM), que afere o fluxo de energia e
transformação do C; a Respiração Basal (RB), que reflete a atividade da BMS responsável
pela degradação de compostos orgânicos; e o Quociente Metabólico (qCO2), que indica
estresse, perturbação ou estabilidade do ecossistema (Ferreira, 2006).
Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar o CBM, RB e qCO2 como
indicadores microbiológicos presentes em diferentes sistemas de manejo do solo na Amazônia
Meridional.
Material e Métodos
O presente estudo foi desenvolvido com solo da Fazenda localizada na Amazônia

Meridional, município de Nova Canaã do Norte, Mato Grosso, entre a latitude S10º33'29" e
longitude W55º57'11", sendo uma área de transição dos Biomas Cerrado e Amazônia. O solo
da propriedade é classificado como um Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico (LVAd) de
textura argilosa. O clima da região é classificado segundo Koppen como Aw, com
temperaturas médias anuais entre 4 e 40 ºC e precipitação média anual de 2.500 mm.
As amostras de solo foram coletadas em um Latossolo Vermelho Amarelo Distrófico,
na profundidade de 0-20 cm, com oito tratamentos em uma área de 5 ha para cada um deles,
sendo: T1: iLPF linha simples de; T2: iLPF linha dupla de eucalipto; T3: iLPF linha tripla de;
T4: iLPF linha simples de; T5: iLPF linha dupla de paricá; T6: iLPF linha tripla de paricá; T7:
140
área de rotação entre lavoura na safra e pasto na entre safra e T8: área de mesmo tamanho,
com mata nativa. Os sistemas de iLPF foram implantados em Dezembro de 2008 e a partir da
safra de 2011/2012 os sistemas permaneceram nas entrelinhas plantio de soja na safra, milho
na safrinha e Brachiaria ruziziensis na entressafra.
Para avaliar o Carbono da Biomassa Microbiana (CBM), Respiração Basal (RB) e o
Quociente Metabólico (qCO2) como indicadores microbiológicos utilizou-se o método de
fumigação-incubação de Jenkinson e Powlson (1976) modificado. A RB foi obtida pela
diferença da medição de carbono emanado das amostras fumigadas e não-fumigadas durante o
período de incubação. E o qCO2 foi determinado pela razão entre a RB e o CBM. Todas as
determinações foram feitas em triplicatas e os resultados expressos com base no peso de solo
seco. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do software ASSISTAT, versão
7.5, beta (Silva e Azevedo, 2002), com comparações das médias pelo Teste de Tukey a 5 %.
As concentrações do carbono da biomassa microbiana (CBM) não apresentaram
variação entre os sistemas avaliados e as distâncias do pé da planta perene (Tabela 1).
Tabela 1 - Carbono da biomassa microbiana (CBM) de um Latossolo Vermelho Amarelo

Distrófico, coletas de 0-20 cm de profundidade, para oito sistemas diferenciados de uso e
manejo do solo na Amazônia Meridional.
Distância (m)
0 3 6 10
Tratamento
-------------------------- µg C g solo -----------------------------
-1
iLPF linha simples de eucalipto 15,39 aA 18,15 aA 21,83 aA 22,31 aA

iLPF linha dupla de eucalipto 14,43 aB 24,97 aA 15,11 aB 13,12 aB
iLPF linha tripla de eucalipto 18,33 aA 24,55 aA 18,85 aA 21,31 aA
iLPF linha simples de paricá 18,76 aA 20,80 aA 16,87 aA 18,69 aA
iLPF linha dupla de paricá 19,25 aA 14,24 aA 15,41 aA 19,01 aA
iLPF linha tripla de paricá 16,84 aA 20,87 aA 21,57 aA 16,57 aA
Rotação Soja/Pasto 15,70 aA 15,70 aA 15,70 aA 15,70 aA
Mata nativa 21,82 aA 21,82 aA 21,82 aA 21,82 aA
CV% = 39,67
*As médias seguidas pela mesma letra minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não
diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade.
141
Apesar da similaridade dos sistemas, é possível observar no sistema de iLPF linha
simples de eucalipto, um incremento nas concentrações de CBM com relação a maior
distância do pé da planta perene, com valor de 15,39 μg C g solo-1 em 0 m, 18,15 μg C g solo-
1
a 3 m, 21,83 μg C g solo-1 a 6 m e 22,31 μg C g solo-1 a 10 m, entretanto, esse fato não se
observa nos demais tratamentos. Nos sistemas de rotação soja/pasto e mata nativa, observa-se
valor muito superior em áreas de mata, com 21,82 μg C g solo-1, enquanto para rotação
obteve-se 15,70 μg C g solo-1 de CBM.
Na literatura é relatado que os teores de CBM podem ser alterados durante os anos, e
diversos estudos realizados no Brasil constataram diferenças no teor de CBM entre épocas de
amostragem, principalmente em função do ciclo das plantas, da adição de resíduos vegetais,
da pluviosidade e da temperatura (Anderson e Domsch, 1993; Brandão Junior et al., 2008),
dessa forma pode-se justificar a não diferenciação dos sistemas, o que sugere a necessidade de
coletas e amostragem em diferentes períodos.
Um estudo sobre diversidade metabólica e atividade microbiana de solos sob
integração Lavoura-Pecuária, discute que a diversidade de espécies vegetais proporcionam
maiores quantidades de diferentes substratos (exsudatos liberados pelas plantas) que são
utilizados pela microbiota do solo como fonte de carbono (Chavéz et al., 2011), entretanto, os
dados do presente estudo não corroboram com os encontrados pelo autor, uma vez que áreas
de iLPF possuem maior diversidade de resíduos vegetais comparadas as áreas de rotação
soja/pasto, mas não apresentam diferenças estatísticas significativas.
As quantificações da respiração basal (RB) apresentam diferenças entre as distâncias e
entre os tratamentos avaliados (Tabela 2). Para a distância de 0 m do pé da planta perene
destaca-se a RB sob iLPF linha tripla de eucalipto, com 29,33 μg CO2 g solo-1, entretanto para
3 e 6 o sistema de iLPF composto por paricá apresenta maior RB, sendo 32,46 μg CO2 g solo-
1
em iLPF linha tripla de paricá a 3 m e 36,77 μg CO2 g solo-1 em iLPF linha simples de
paricá a 6 m. Aos 10 m não foram encontradas diferenças significativas entre os sistemas. Os
valores de RB em solo sob paricá são os maiores encontrados nesta avaliação, o que destaca
esse sistema em relação aos demais.
A taxa de respiração basal do solo está relacionada com a maior atividade biológica, a
qual é diretamente proporcional à fração de carbono lábil no solo (Tótola e Chaer, 2002), com
base neste conceito, pode se inferir que as plantas de paricá forneçam mais carbono lábil ao
solo, comparado ao eucalipto, sendo uma informação importante para tomada de decisão
quanto à espécie vegetal perene a ser incorporada no sistema de integração.
142
Uma vez que, ao comparar diferentes biomassas microbianas, quanto a sua eficiência,
Insam e Domsch (1988) consideram que a biomassa mais eficiente seria aquela que perde
menos carbono na respiração e incorpora mais à suas células. Dessa forma, a utilização de
paricá nos sistemas não é deve ser recomendada para este sistema.
De acordo com aliteratura, há uma relação inversa entre CBM e qCO2, ou seja,
maiores teores de carbono causam diminuição na atividade metabólica e aumento da biomassa
microbiana (Balota et al., 1998; Moreira e Malavolta, 2004), essa relação pode ser s
confirmada quando comparamos os sistemas de rotação soja/pasto e mata nativa. Por outro
lado, essa mesma inversão não é visível em todos os sistemas de iLPF.
Ao contrário do observado para a RB, os índices de qCO2 destacam sistemas de iLPF
com eucalipto (Tabela 3). Observa-se maior qCO2 em iLPF linha simples e dupla de eu
calipto para 0 m e 10 m, respectivamente, apresentando valores de 2,20 e 2,41 μg CO2 μg
Cmic dia-1. Para os sistemas convencionais, observa-se maior taxa de qCO2 em rotação
soja/pasto comparado a mata nativa, com 1,48 e 1,02 μg CO2 μg Cmic dia-1, respectivamente.
Tabela 2 - Respiração Basal (RB) de um Latossolo Vermelho Amarelo Distrófico, coletas de

0-20 cm de profundidade, para oito sistemas diferenciados de uso e manejo do solo na
Amazônia Meridional.
Distância ( m)
0 3 6 10
Tratamento -1
------------------------------- µg CO2 g solo --------------
---
iLPF linha simples de eucalipto 25,21 abA 24,02 bA 27,63 bA 27,76 aA
iLPF linha dupla de eucalipto 20,88 bB 29,30 abA 24,85 bAB 27,15 aAB
iLPF linha tripla de eucalipto 29,33 aA 28,45 abA 27,93 bA 27,46 aA
iLPF linha simples de paricá 24,35 abB 28,48 abB 36,77 aA 25,59 aB
iLPF linha dupla de paricá 22,96 abA 22,39 bA 24,46 bA 23,31 aA
iLPF linha tripla de paricá 25,73 abAB 32,46 aA 27,33 bAB 24,75 aB
Rotação Soja/Pasto 23,19 abA 23,19 bA 23,19 bA 23,19 aA
Mata nativa 22,16 abA 22,16 bA 22,16 bA 22,16 aA
CV% = 21,31
*As médias seguidas pela mesma letra minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem
estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade.
A relação Cmic:COT, responsáveis pelos valores obtidos de qCO2, indicam a presença

de MO muito ativa e sujeita a transformações, pois é um indicador de disponibilidade da MO
143
para os microrganismos (Sampaio et al., 2008), o que confirma que os sistemas iLPF
disponibilizam mais MO aos microrganismos, uma vez que as taxas de qCO2 são maiores.
Tabela 3 - Quociente metabólico (qCO2) de um Latossolo Vermelho Amarelo Distrófico,

coletas de 0-20 cm de profundidade, para oito sistemas diferenciados de uso e manejo do solo
na Amazônia Meridional.
Distância (m)
0 3 6 10
Tratamento
------------------------ µg CO2 µg Cmic dia-1-------------------------
-
iLPF linha simples de eucalipto 2,20 aA 1,47 aA 1,45 abA 1,50 abA
iLPF linha dupla de eucalipto 1,90 abAB 1,35 aB 1,95 abAB 2,41 aA
iLPF linha tripla de eucalipto 2,03 abA 1,33 aA 1,94 abA 1,34 abA
iLPF linha simples de paricá 1,61 abA 1,81 aA 2,36 aA 1,57 abA
iLPF linha dupla de paricá 1,46 abA 1,75 aA 1,78 abA 1,51 abA
iLPF linha tripla de paricá 1,63 abA 1,57 aA 1,43 abA 1,96 abA
Rotação Soja/Pasto 1,48 abA 1,48 aA 1,48 abA 1,48 abA
Mata nativa 1,02 bA 1,02 aA 1,02 bA 1,02 bA
CV% = 46,32
* As médias seguidas pela mesma letra minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não
diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Conclusões
Os sistemas de eucalipto destacam-se, em dois indicadores, CBM e qCO2 frente aos
sistemas com o uso de paricá.
Os resultados preliminares não sugerem benefícios ao solo com o uso de sistemas de
integração após 5 anos de manutenção do sistema.
Sugere-se maior investigação do sistema, com coletas temporais e outros indicadores
de qualidades microbiológicas do solo.
Referências
144
Anderson TH, Domsch KH (1993) The metabolic quotient for CO2 (qCO2) as a specific
activity parameter to assess the effects of environmental conditions, such as pH, on the
microbial biomass of forest soil. Soil Biol & Bioch 25:393-95.
Balota EL, Colozzi-filho A, Andrade DS, Hungria M (1998) Biomassa microbiana e sua
atividade em solos sob diferentes sistemas de preparo e sucessão de culturas. Revista
Brasileira de Ciência do Solo 22:641-649.
Brandão Junior O, Hungria M, Franchini JC, Espindola CR (2008) Comparação entre

métodos de fumigação extração e fumigação incubação para determinação do carbono da
biomassa microbiana em um latossolo. Revista Brasileira de Ciência do Solo 32:1911-1919.
Chavéz LF, Escobar LF, Anghinoni I, Carvalho PCF, Meurer EJ (2011) Diversidade
metabólica e atividade microbiana no solo em sistema de iLPF sob intensidades de pastejo.
Pes Agrop Brasileira 46:1254-61.
Ferreira AP, Cunha CLN, Wermelinger ED, Souza MB, Lenzi MF, Mesquita CM, Jorge LC
(2006) Impactos de pesticidas na atividade microbiana do solo sobre a saúde dos agricultores.
Rev Baiana de Saúde Pública 30:309-21.
Insam H, Domsch KH. (1988) Relationship between soil organic carbon and microbial
biomass on chronosequences of reelamation sites. Microbial Ecology 15:177-88.
Institudo do Homem e Meio Ambiente da Amazônia - IMAZON. 2015. Disponível em:

http://imazon.org.br/categorias-mapas/amazonia-legal/. Acessado 20 julho 2015.
Jenkinson DS, Powlson DS (1976) The effects of biocidal treatments on metabolism in soil-I.
Fumigation with chloroform. Soil Biol Bioch 8:167-77.
Kaschuck G, Adalberton O, Hungria M (2010) Three decades of soil microbial biomass

studies in Brazilian ecosystems: Lessons learned about soil quality and indications for
improving sustainability Soil Biology and Biochemistry. 42:1-13.
145
Kluthcouski J, Stone LF, Aidar H (2003) Integração Lavoura-Pecuária. Embrapa, Santo
Antônio de Goiás, GO.Moreira A, Malavolta E (2004) Dinâmica da matéria orgânica e da
biomassa microbiana em solo submetido a diferentes sistemas de manejo na Amazônia
Ocidental. Pesq. Agropecuária Brasileira 39:1103-10.
Sampaio DB, Araujo ASF, Santos VB (2008) Avaliação de indicadores biológicos de

qualidade do solo sob sistemas de cultivo convencional e orgânico de frutas. Ciência e
Agrotecnologia 32:353-59.
Santos JB, Jakelaitis A, Silva AA, Vivian R, Costa MD, Silva AF (2005) Atividade
microbiana do solo após aplicação de herbicidas em sistemas de plantio direto. Planta
Daninha 23:683-91.
Silva FASE, Azevedo CAV (2002) Versão do programa computacional Assistant para o
sistema operacional Windows. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais 4:71-78.
Tótola MRE, Chaer GM (2002) Microrganismos e processos microbiológicos como

indicadores da qualidade do solo. Tópicos em ciência do solo. Sociedade Brasileira de
Ciência do Solo: Viçosa, MG.
146
Bactérias endofíticas com potencial de degradar hidrocarbonetos, isoladas a

partir de macrófitas aquáticas, coletadas em áreas portuárias de Manaus -
AM.
Marinho, M. P. S. 1, Souza, R. D. N. S. 1, Santos, J.C. 2, Lima, J. M. S. 2, Pereira, J. O. 2 ,

Batista, I. H. 1, Ferreira, F. S. 1
1
Escola Normal Superior, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil. 2 Universidade
Federal do Amazonas, UFAM, Manaus. E-mail: [email protected]
Resumo
O problema da poluição ambiental tem caráter mundial. As áreas portuárias são locais
acometidos diariamente com diversos tipos de contaminantes. Nessas áreas encontram-se
uma variedade de Macrófitas Aquáticas. Os endofíticos são microrganismos que habitam os
tecidos internos de plantas auxiliando em seus processos metabólicos. O presente trabalho
consistiu no isolamento de bactérias endofíticas com potencial para degradação de
hidrocarbonetos de petróleo a partir de macrófitas aquáticas coletadas em duas áreas
portuárias de Manaus- AM. Foram isoladas 142 bactérias, que após purificação foram testadas
em ensaio de biodegradabilidade com indicador Redox 2,6 – Diclorofenol Indofenol (DCPIP).
As bactérias M111, M136, M113, M91, M87 e M18 apresentaram resultado positivo para o
teste de biodegradabilidade, descolorindo o meio em até 48 horas. Pelos resultados positivos
obtidos estes micro-organismos merecem mais investigações acerca de seu potencial
degradador.
Palavras Chave: Macrófitas aquáticas. Bactérias Endofíticas. Biodegradação.
Introdução
Na Amazônia há uma ampla diversidade de micro-organismos, destacando-se a
microbiota endofítica, que habitam tecidos internos das plantas (Ryan et al, 2008). Os micro-
organismos desempenham importante papel ambiental, uma vez que podem utilizar
contaminantes como fonte de energia, podendo, desempenhar a função de restauração dos
padrões ambientais (Melo e Azevedo, 1997). A partir de técnicas de degradação denominada
de biorremediação.
147
Metodologias utilizando bactérias têm revelado o grande potencial desses micro-
organismos no processo de descontaminação de áreas poluídas, apresentando um custo
relativamente baixo e resultados significativos. (Fu e Viraraghavan, 2001).
De acordo com Souza (2015), ambientes classificados como altamente e
moderadamente contaminados estão situados na costa da cidade Manaus. Dessa forma mostra
a relação da alta atividade de navegação como fonte direta de contaminação com derivados de
petróleo. Nessas áreas portuárias encontram-se uma variedade de macrófitas aquáticas, que
são vegetais que habitam desde brejos até ambientes totalmente submersos. Essas plantas
constituem-se em uma importante comunidade em ecossistemas aquáticos (Esteves, 1998).
A escolha destes vegetais neste trabalho deve-se a presença destas plantas em ambientes
contaminados e poluídos. Este aspecto trouxe o interesse em investigar a relação de micro-
organismos endofíticos dessas macrófitas com a capacidade de resistir a esses ambientes.
Nesse sentido, consideram-se as associações entre macrófitas aquáticas e micro-
organismos que possam estar contribuindo para a transformação de compostos poluentes em
moléculas com menor impacto ao ambiente. Dentro desse contexto, o presente estudo
compreende o isolamento de bactérias endofíticas com potencial para degradação de
hidrocarbonetos de petróleo, contribuindo para o conhecimento do potencial de degradação
por micro-organismos oriundos da biodiversidade amazônica.
Material e Métodos
As amostras foram coletadas em áreas portuárias, cercadas pelo Rio Negro, na cidade de
Manaus-AM, onde há um fluxo recorrente de embarcações e consequente derrame de
derivados do petróleo como óleo diesel. As áreas portuárias de realização das coletas foram:
Porto Hidroviário da Manaus Moderna localizado no Bairro Centro e Porto Marina do Davi
localizada no Bairro da Ponta Negra.
Foram coletadas folhas, caules e raízes das plantas com aparência sadia, sem sintomas
visuais de doenças ou lesões. As espécies coletadas foram a Eichornea crassipes (No Porto
Hidroviário da Manaus Moderna – Centro) e, Sauvinia auriculata e uma macrófita não
idenficada cujo nome vulgar é Gramínea aquática (Coletada no Porto Marina do Davi –
Tarumã).
Após a coleta, as amostras foram colocadas em sacos plásticos e levadas até o
laboratório de Biodegradação na Universidade Federal do Amazonas (UFAM), onde ocorreu
o isolamento dos micro-organismos. O isolamento das bactérias endofíticas foi realizado de
148
acordo com a metodologia adaptada de Pereira (1993). Inicialmente, foram cortadas com
auxílio de uma tesoura, as folhas e as raízes que foram higienizadas com água corrente com
auxílio de uma esponja nova e macia e detergente neutro; enxaguadas com água destilada e
colocadas para secar em uma bandeja forrada com papel toalha autoclavado.
Em câmara de fluxo laminar as amostras foram submetidas à desinfecção superficial em
álcool 70% por 1 minuto, hipoclorito de sódio 3% por 4 minutos, lavado em solução de álcool
70% por 30 segundos para retirar o excesso de cloro da superfície e para retirar todo o restante
das soluções, o materiais foram lavados três vezes com água destilada ou bidestilada
esterilizada. Como controle da assepsia do material isolado, a água de lavagem foi inoculada
em placas de Petri contendo os meios de cultura, com auxílio de uma alça de drigalski.
Após a desinfestação superficial, as folhas foram cortadas em fragmentos de cerca de
0,7 cm , com o auxílio de um furador, e as raízes foram cortadas em fragmentos medindo
cerca de 0,1 cm a 0,3 cm, com o auxílio de um bisturi, que foram inoculados em placas de
Petri contendo meio BH- Bushell Hass (g/L: sulfato de magnésio: 0,20, cloreto de cálcio:
0,02, fosfato monopotássico: 1,0, fosfato dipotássico: 1,0, nitrato de amônio: 1,0, cloreto
férrico: 0,05, ágar: 20,0) com fungicida e petróleo (5mL/L). Foram preparadas duas placas,
com o mesmo meio, para cada macrófita, com semeadura de 1 mL da água destilada usada
para a desinfecção como controle do isolamento. As placas foram incubadas a 28 °C sendo
visualizadas diariamente no período de 24 às 96h. Após o período de crescimento das
bactérias, as placas foram então levadas à câmara asséptica para repicagem dos isolados para
tubos de ensaio contendo o mesmo meio do isolamento. Esses tubos foram datados e
identificados em seguida guardados em recipientes plásticos à temperatura ambiente.
Após o isolamento realizou-se a purificação das bactérias por meio da técnica de
esgotamento por estrias. As bactérias foram retiradas dos tubos onde estavam armazenadas, e
dispostas em placas contendo meio NA (Nutriente Ágar), em estrias. Após 24 horas foi
retirada uma colônia de um ponto isolado da placa, sendo estriada novamente em outro tubo
de ensaio contendo NA sólido e em seguida foram acondicionadas na geladeira a 16 °C.
Para a preservação das bactérias purificadas, foi retirada uma alçada da colônia
bacteriana, sendo inseridas em tubos tipo eppendorf específicos para cada bactéria contendo
meio NA líquido. Os tubos foram mantidos a 170 rpm a 28°C durante 24 horas. Após esse
período, foi retirado 1 mililitro da colônia para ser introduzido em tubos criogênicos contendo
água destilada e glicerol a 20%. Após esse processo, os tubos foram acondicionados no
congelador a – 5 °C.
149
Foi verificado se os isolados eram capazes de degradar hidrocarbonetos de petróleo. O
teste de biodegradabilidade foi realizado usando a técnica baseada no uso do indicador redox
2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) (Hanson et al, 1993). O meio para o teste de
biodegradabilidade foi preparado com meio BH- Büshnell-Haas. Os pocinhos, das
microplacas, contendo o meio BH, foram preenchidos com uma pipeta de precisão, com 200
µL de indofenol e 10 µL de petróleo.
Cada bactéria foi introduzida, com auxílio da alça de platina, em dois pocinhos. A
primeira coluna foi utilizada como controle 1 (meio BH + indofenol + petróleo/ sem bactéria)
e a segunda como controle 2 (meio BH + indofenol + bactéria/ sem petróleo). As microplacas
foram mantidas a (28±2 ⁰ C). A mudança de tonalidade na coloração do meio em cada
inóculo foi avaliada após 24 e 48 h, para detecção de atividade biodegradadora. As bactérias
que apresentaram resultados positivos foram submetidas à coloração de GRAM e suas
características macroscópicas, cor e consistência, foram registradas.
Foram coletadas para isolamento de endofíticos três macrófitas aquáticas. Dentre essas
somente duas foram identificadas a Eichornea crassipes e a Sauvinia auriculata. A macrófita
que não foi identificada foi a Gramínea aquática.
Foram obtidas 142 bactérias endofíticas sendo 82 isolaods de Eichornnia crassipes, 14

isoaldos de Salvinia auriculata e 69isolados da gramínea aquática (Tabela 1).
Tabela 1: Bactérias endofíticas isoladas a partir de Eichornia crassipes, Sauvinia auriculata e Gramínea
aquática.
Origem Númeroendofíticas
Isolamento de bactérias de fragmentos infectados Indice
a partir das dasde colonização
Macrófitas % aquáticas
Eichornea
Eichornia crassipes
crassipes, Sauvinia auriculata e Gramínea aquática.
Folha 18 50,00%
Raiz 14 38,80%
Gramínea aquática
Folha 9 25,00%
Raiz 8 22,20%
Salvinia auriculata
Folha 2 5,50%
Raiz 5 13,80%
150
Os índices de colonização foram, respectivamente para folha e raiz, 50% e 38,8%
(Eichornea sp.), 5,5% e 13,8% (Salvinia auriculata) e 25% e 22,2% (gramínea aquática). A
maior quantidade de bactérias endofíticas isoladas foi a partir da espécie Eichornea crassipes,
sendo que, a parte da planta que mais se obteve isolado foram as folhas apresentando um
maior índice de colonização (Tabela 2).
Tabela 2: Número de isolamento de bactérias endofíticas isoladas de Eichornia crassipes, Sauvinia auriculata e
Gramínea aquática.
Parte da planta
Origem Total
Folha Raíz
Eichornea crassipes 41 41 76
Gramínea aquática 30 16 46
Salvinia auriculata 3 11 14
Total 74 68 142
A colonização das bactérias ocorreu nas folhas e nas raízes das plantas resultados esses
que corroboram aqueles obtidos por Rosenblueth e Romero (2006) que encontraram bactérias
endofíticas em diversos tecidos de plantas. As folhas das macrófitas apresentaram o maior
índice de colonização. Estes resultados divergem daqueles encontrados por Martins (2011),
pois, na maioria das plantas estudadas, nos tecidos das raízes encontram-se valores mais
elevados de endofíticos comparativamente aos tecidos das partes aéreas.
Araújo (2014) isolou 155 bactérias da macrófitas aquática Eichornia crassipes sendo
que 58 eram de origem endofítica oriunda das folhas, das raízes e das flores da planta em
local portuário com resíduo de petróleo e óleo diesel. Batista (2009) isolou 71 bactérias, sendo
29 de origem endofítica, oriundas de folhas, caules, bulbos e raízes da macrófita aquática
Eichornia crassipes coletadas em local com resíduos de petróleo.
Todos os isolados foram testados para a verificação do potencial de biodegradabilidade

de hidrocarbonetos de petróleo. A biodegradabilidade foi observada a partir da mudança da
tonalidade do meio azul a incolor (Figura 1).
151
Controle
Resultado negativo
Resultado positivo
Figura 1: Teste de biodegradabilidade. Bactérias testadas com o indicador redox 2,6-diclorofenol

indofenol (DCPIP), mostrando o resultado positivo e negativo para o teste, nos tempos de 24 a 48 horas
de incubação para confirmação de potenciais degradadores de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
com a mudança da coloração do azul para o incolor.
Dos 142 isolados, 6 bactérias apresentaram atividade de biodegradabilidade no intervalo

de 24 e 48 horas, sendo que no período de 24 horas, três bactérias (M111, M136 e M87)
promoveram a descoloração do meio e em 48 horas outras três modificaram a coloração
(M113, M91 e M18) (Tabela 3). Dentre as demais bactérias, algumas modificaram a cor do
meio em tempos maiores que 48 horas e outras não alteram essa coloração.
Tabela 3: Relação entre a biodegradação realizada pelas bactérias e o tempo.
Isolados (Cepas) Biodegradação / Tempo (horas) *X
/ Código *M 24h 48h
M 111 X
M 136 X
M 113 X
M 91 X
M 18 X
M 87 X
*X: Indica o resultado em horas da biodegradação.
Esses resultados corroboram com os descritos por Araújo (2014), que em seu estudo,
utilizando o método do indicador redox 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP), demonstrou que
152
bactérias provenientes de macrófitas aquáticas de ambientes contaminados por petróleo e seus
derivados possuem a capacidade de utilizar o petróleo como fonte de carbono. As bactérias
isoladas em seu estudo apresentaram tempo menor de descoloração demonstrando com isso a
possibilidade de selecionar micro-organismos com habilidades para degradar os
hidrocarbonetos de petróleo e derivados, a partir desse teste.
Os trabalhos de Peixoto e Vieira (2005) indicam que os testes são eficientes e rápidos
para a detecção da capacidade de biodegradação de compostos, especificamente de
hidrocarbonetos de petróleo, utilizando o redox 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) para
reações de óxido-redução.
Quanto às características macroscópicas e microscópicas das cepas testadas foi

observadas que M111 é um bacilo pequeno Gram-negativo, a cor da cultura é creme claro
com consistência cremosa; M 136 é um bacilo Gram-positivo, a cor da cultura é creme médio
com consistência cremosa; M 87 apresenta forma de coco Gram-positiva, a cor da cultura é
amarela com consistência cremosa; M113 bacilo Gram-positivo, a cor da cultura é creme
escuro tendendo ao marrom e consistência cremosa e M91 bacilo pequeno Gram-negativo, a
cor da cultura é creme médio com consistência cremosa; M18 é um bacilo Gram-negativo, a
cor da cultura é creme claro também com consistência cremosa. Estas cepas foram isoladas de
folhas e raízes de Eichornea crassipes e de Gramínea Aquática (Tabela 4).
Tabela 4: Caracterização morfológica das linhagens de endofíticos que apresentaram potencial biodegradador e
enzimático.
Cepas Planta Orgão da Forma das Característica da cultura

Gram
Hospedeira planta células
*Código M Cor Consistência
Eichornea
M 111 Raíz Bacilo Creme claro Cremosa -
crassipes
Eichornea
M 136 Raíz Bacilo Creme médio Cremosa +
crassipes
Creme escuro
Gramínea
M 113 Folha Bacilo (Tendendo ao Cremosa +
aquática
marrom)
Gramínea Bacilo
M 91 Folha Creme médio Cremosa -
aquática pequeno
Eichornea Bacilo
M 18 Raiz Creme claro Cremosa -
crassipes pequeno
Eichornea
M 87 Raiz Coco Amarelo Cremosa +
crassipes
*Código M = Mayra, 2014.
153
Conclusões
De acordo com os resultados obtidos, o isolamento de endofíticos a partir das macrófitas

coletadas pode ser considerado positivo, visto que, foi possível isolar 142 bactérias
endófiticas em meio seletivo para degradação de hidrocarbonetos de petróleo. Destacou-se
neste estudo a macrófita Eichornea crassipes, de onde foi obtido o maior número de isolados.
O teste de biodegradabilidade utilizando o Indicador Redox 2,6 – indofenol diclorofenol

DCPIP realizado, mostrou-se eficaz para a observação da capacidade de biodegradabilidade
de bactérias endofíticas. Através dele selecionou-se 6 linhagens de bactérias isoladas com
capacidade de biodegradar hidrocarbonetos em 24 e 48 horas. Estes microrganismos merecem
investigações mais detalhadas para confirmar seu poder biodegradador.
Os resultados obtidos podem proporcionar conhecimentos e informações para

aperfeiçoar técnicas e desenvolver processos biotecnológicos utilizando os microrganismos
oriundos de áreas portuárias de Manaus/AM.
Os estudos demonstram, portanto, a capacidade de micro-organismos da biodiversidade

Amazônica em realizar processos de biodegradação, contribuindo para o conhecimento da
microbiota Amazônica.
Referências Bibliográficas
Araújo SP (2014). Produção de inóculo microbiano, obtido de macrófitas aquáticas na

Amazônia, com potencial de degradação de hidrocarbonetos de petróleo. Tese de doutorado
(Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas. 158p.
Batista IH (2009). Biorremediação de ambientes aquáticos contaminados por resíduos de

petróleo: Um estudo com bactérias isoladas de Eichornia Crassipes na Amazônia. Tese de
doutorado (Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas. 184p.
Fu Y, Viraraghavan T (2001). Fungal decolorization of dye wastewaters: a review. Bioresource

Technology: v.79, p. 251 – 262.
Hanson KG, Desai DJ, Anjana J (1993). A rapid and simple screening technique for potential
crude oil degrading microorganisms. Biotechnology techniques. v. 7 n°10: 745-748.
154
Esteves FA (1998). Fundamentos de Limnologia. Ed. Interciências/FINEP. Rio de janeiro, R.
J. Cap. 20: p. 316-373.
Martins VCM (2011). Comunidade bacteriana endofítica cultivável de Halimione

portulacoides. Departamento de Biologia Universidade de Aveiro
Melo IS, Azevedo JL (1997). Microbiologia Ambiental. Jaguariúna: EMBRAPA-CNPMA.

440 p.
Peixoto RM, Vieira JDG ( 2005). Determination of the degrading potential of bacteria isolated
from an environment impacted by petroleum and derivatives using 2,6-
dichlorophenolindophenol (DCPIP). In: First Braziliam Symposium on Petroleum
Biotechnology, Natal – RN, Brasil.
Pereira JO (1993). Fungos endófitos de hospedeiros tropicais Stylosanthes guianensis e Musa

cavendeis. Piracicaba-tese de Doutorado.
Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan D e Dowling DN (2008). Bacterial endophytes: recent
developments and applications. FMES Microbiology Letters. 278: 1-9.
Rosenblueth M and Martinez-Romero E (2006). Bacterial endophytes and their interactions

with hosts. Mol. Plant Microbe Interact. 19: 827-837.
Souza HML et al (2015). Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Superficial Sediments of the

Negro River in the Amazon Region of Brazil. J. Braz. Chem. Soc., Vol. 26, No. 7, 1438-1449,
2015. Printed in Brazil.
Wetler-Tonini RMC et al (2011). Biodegradação Bacteriana de Petróleo e seus Derivados.

Rev. Virtual Quim., 2011, 3 (2), 78-87. Data de publicação na Web: 30 de junho de 2011.
155
Tolerância de rizóbios à acidez e ao alumínio
Menezes N.C.1; Oliveira L.A.2
1
Tecnóloga em Petróleo e Gás, Mestre em Agricultura no Trópico Úmido. 2 Pesquisador -
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. [email protected]
[email protected]
Resumo
A maioria dos solos amazônicos apresenta boas propriedades físicas, mas
possuem alta saturação de Al e acidez, prejudiciais ao desenvolvimento de plantas. Uma
alternativa para reduzir estes efeitos negativos é o uso de micro-organismos em
simbiose com a planta. O objetivo deste trabalho foi avaliar rizóbios capazes de tolerar a
acidez e alumínio tóxico. A metodologia consistiu em avaliar 31 isolados em meios de
cultura YMA com pH 4,5+Al (2 cmolc L-1) e pH 6,5, atribuindo notas de crescimento
que variam de 1,00 a 4,00, durante 15 dias. Os resultados mostraram que das 31
bactérias testadas, 29 apresentaram crescimento acima de 3,06 no meio controle, com
pH 6,5. Quanto à tolerância ao pH 4,5+Al, somente 9 isolados mostraram crescimento
superior a 3,06, sendo assim, tolerantes à acidez e alumínio. Esses isolados tolerantes às
condições de acidez e toxidez de Al apresentam potencial para sobreviverem nos
latossolos e argissolos da Amazônia, podendo ser usados futuramente em inoculantes
para leguminosas, caso apresentem outras características agronômicas desejáveis.
Palavras-chave: Metabolismo microbiano, Ecologia microbiana, Amazônia
Introdução
O solo é um componente ambiental complexo e suas variações, no que se refere
às propriedades físicas, químicas e biológicas, são definidoras de padrões ecológicos e
do próprio uso da terra. Na Amazônia, cerca de 70% da região é composta por duas
classes de solos, os latossolos e os argissolos (Rodrigues, 1996). Esses solos são
156
profundos, bem drenados e apresentam boas propriedades físicas, mas quimicamente
são ácidos, com baixa fertilidade natural e alta saturação com alumínio. Os níveis
tóxicos de alumínio aliados à baixa fertilidade nesses solos agem diretamente no
desenvolvimento das plantas, afetando desde a raiz, nodulação, relações hídricas,
redução da produção/produtividade e, portanto, a sustentabilidade. Apesar disso, estes
efeitos podem ser diminuídos ou neutralizados pela calagem e adubação, atuando
diretamente no solo e consequentemente aliviando os efeitos provocados pela baixa
fertilidade e toxidez de alumínio. No entanto, a obtenção destes insumos agrícolas para
o uso nos solos da Amazônia é dificultado por problemas financeiros e tecnológicos.
Assim, uma alternativa para reduzir os efeitos negativos destes solos no crescimento de
plantas é selecionar espécies ou cultivares mais tolerantes, aliado ao uso de micro-
organismos do solo, formando associações benéficas plantas-micro-organismos. Os
micro-organismos podem estabelecer relações simbióticas, como a fixação biológica de
nitrogênio, podendo atuar como “facilitadores”, tornando as plantas menos dependentes
de adubos químicos, permitindo, assim, uma economia desses insumos e ao mesmo
tempo, uma maior produtividade dos solos. Dentre esses micro-organismos estão às
bactérias nodulíferas da família Rhizobiaceae, conhecidos popularmente como rizóbios.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de tolerância à acidez e alumínio de
rizóbios isolados de nódulos de leguminosas em solos da Amazônia.
Material e Métodos
Foram testados 31 isolados de rizóbios da coleção do Laboratório de Ecologia e
Biotecnologia de Micro-organismos da Amazônia (LEBMAM), do INPA. Eles foram
isolados de nódulos de diversas leguminosas que cresciam em latossolos e argissolos da
região de Manaus. A metodologia consistiu em avaliar as bactérias em placas de Petri,
contendo meios YMA (Somasegaran e Hoben, 1985), sendo umcom pH=4,5 + 2 cmolc
Al/L+ 20mL de solução indicadora (bromocresol verde) para a avaliação de tolerância,
permitindo assim, uma concentração de Al no meio similar à encontrada nos solos da
Amazônia (Chagas Júnior et al., 2009) e, um meio com pH=6,5 +5mL de indicador
(solução alcoólica, contendo 0,5% de azul de bromotimol), como controle. O
procedimento de repicagem e avaliação para verificar a tolerância dos isolados de
rizóbios em meio com Al foi feito segundo o método de Oliveira e Magalhães (1999),
que avalia o nível de crescimento bacteriano, atribuindo-se notas de 1,0 (sem
crescimento visível) a 4,0 (máximo crescimento), subdivididas em 0,25, ou seja, 1,00,
157
1,25, 1,50, 1,75, 2,00 e etc., até 4,00, aumentando assim a precisão do método. Foram
usadas para cada cultura bacteriana, quatro repetições nos dois meios. As avaliações
foram realizadas a cada três dias, num total de quinze dias, sendo considerados sensíveis
os isolados que apresentaram valores de 1,0 a 2,0, com tolerância média 2,06 a 3,0 e,
tolerantes os que mostraram crescimentos superiores a 3,06. Os indicadores de pHs
foram usados para observar se as bactérias diminuíam ou aumentavam a acidez dos
meios depois de crescerem.
Ao se analisar os crescimentos dos 31 isolados no meio com pH 6,5 (controle),
observou-se que oito dos isolados de rizóbios mostraram crescimento elevado aos três
dias (nota acima de 3,00) após a repicagem. Aos seis dias, 26 isolados mostraram
crescimento acima de 3,06. Ao término do experimento (15 dias), 29 isolados
mostraram crescimento superior a 3,06, indicando crescimento elevado nesse meio de
cultura, permitindo assim, avaliar suas tolerâncias ou sensibilidades à acidez e presença
de Al quando essas condições foram adicionadas ao meio padrão. Os únicos isolados
que apresentaram algum problema de crescimento no meio padrão, pH 6,5 foram INPA
R578 e INPA R583.
No meio com pH 4,5 e Al, todos os isolados mostraram-se bem sensíveis aos
três dias de crescimento, apresentando valores entre 1,00 e 1,75. A partir do sexto dia de
crescimento, quatro isolados (INPA R560, INPA R582, INPA R583, INPA R588)
mostraram tolerância média (2,06-3,00) e, INPA R578 e INPA R674a cresceram acima
de 3,06, mostrando um crescimento diferenciado quando comparado com os outros
isolados testados, demonstrando maiores níveis de tolerância ao pH 4,5+Al. Aos 15 dias
foi possível selecionar 9 rizóbios: INPA R553, INPA R560, INPA R575, INPA R578,
INPA R580, INPA R583, INPA R588, INPA R615, INPA R634, INPA R674a, os quais
mostraram crescimento elevado no meio com pH 4,5+Al.
Verificou-se ainda, mudança de coloração do meio com pH 6,5, onde dos 31
rizóbios avaliados, 11 acidificaram levemente e 8 acidificaram totalmente o meio,
enquanto que, em pH 4,5+Al não houve modificação visual do pH do meio. A
visualização dessa alteração foi possível devido a utilização dos indicadores de pH.
158
1,00 - 2,00
2,06 - 3,00
3,06 - 4,00
32 pH 6,5
28
Número de Isolados
24
20
16
12
0
3° 6° 9° 12° 15°
32 pH 4,5 + Al
28
24
Número de Isolados
20
16
12
0
3° 6° 9° 12° 15°
Dias de Crescimento
Figura 1. Crescimento dos isolados de rizóbios em placas de Petri contendo

meios YMA.
Os resultados obtidos neste experimento foram diferentes dos reportados por

Hara e Oliveira (2005) e Chagas Júnior et al. (2009), onde observou-se que parte dos
isolados testados apresentaram dificuldade para crescerem em meio com pH 6,5, a partir
do terceiro e sexto dia de avaliação. Segundo Campos et al. (2010), a capacidade desses
159
isolados de sobreviverem e crescerem em pH 6,5 é de grande importância,
especialmente para estudos como associação com plantas em ambientes próximos à
alcalinidade, tendo como referencial agronômico, que solos com esse pH são os que
apresentam maiores disponibilidades de macro e micronutrientes (Malavolta, 1976). A
tolerância à acidez e alumínio, foi observado por Hara e Oliveira (2005) e Chagas
Júnior et al. (2009) analisando-se isolados de rizóbios procedentes de solos da
Amazônia, um dos motivos para estes isolados não tenham obtido um bom crescimento
é que alguns processos citoplasmáticos da bactéria sejam sensíveis a tais fatores. E o
crescimento dos isolados no meio aumentou com o tempo de exposição às condições de
estresse. Essa capacidade de tolerar o meio com pH 4,5+Al, de acordo com Graham et
al. (1994), está relacionada à habilidade de manter o pH intracelular entre 7,2 e 7,5
quando o pH externo é ácido. O tempo de crescimento dos rizóbios pode ser usado para
seleção, sendo considerados mais tolerantes em pH 4,5+Al, os isolados que
apresentarem notas acima de 3,06, em menor período de tempo. Quanto à capacidade de
acidificar o meio com pH 6,5, Chagas Júnior et al. (2009) também observaram isso
estudando outros rizóbios isolados de diferentes solos da Amazônia. Este processo de
alteração do pH ocorre devido à produção de ácidos orgânicos liberados pelas bactérias
ao crescerem no meio de cultura. Os isolados tolerantes a pH 4,5+Al apresentam-se
promissores, porém, necessitam ser testados em solos com essas características e, ainda,
em simbiose com a planta na presença desses fatores limitantes.
Conclusão
Dos 31 isolados de rizóbios testados, 29% mostraram-se tolerantes ao pH 4,5 e
presença de 2,0 cmolc de Al+3 L-1 em placas de Petri com meio YMA, indicando
potencial para serem testados em latossolos e argissolos amazônicos com essas
características químicas.
Referências
Campos LL, Martins ME, Elias Neto N, Loureiro MF (2010) Caracterização fisiológica
de rizóbios isolados de nódulos de raiz e caule de Discolobium spp. Scientia Agraria
Paranaensis, 9(3):75-84.
Chagas Júnior AF, Oliveira LA, Oliveira NA (2009) Tolerância à acidez e alumínio
tóxico por isolados de rizóbios de solos no Amazonas, Brasil. Acta Amazonica,
39(2):467 – 470.
160
Graham PH, Draeger KJ, Ferrey ML, Conray MJ, Hammer BE, Martinez E, Aarons SR,
Quintino C (1994) Acid pH tolerance in strains of Rhizobium and initial studies on the
basis for acid tolerance of Rhizobium tropici UMR 1899. Canadian Journal of
Microbiology, 40: 198-207.
Hara FAS, Oliveira LA (2005) Características fisiológicas e ecológicas de rizóbios

oriundos de solos ácidos de Iranduba, Amazonas. Pesquisa Agropecuária Brasileira,
40: 667-672.
Malavolta E (1976) Manual de química agrícola: nutrição de plantas e fertilidade do

solo. São Paulo: Agronômica Ceres.
Oliveira LA, Magalhães HP (1999) Quantitative evaluation ofacidity tolerance of root

nodule bacteria. Revista de Microbiologia, 30:203-208.
Rodrigues TE (1996) Solos da Amazônia, p.19-60. In: Alvarezv VH, Fontes LEF,
Fontes MPF (Eds.). O solo nos grandes domínios morfoclimáticos do Brasil e o
desenvolvimento sustentado. UFV/DPS/SBCS, Viçosa, MG.
Somasegaran P, Hoben JH (1985) Methods in legume-Rhizobiumtechnology. NifTAL

Project and MIRCEN, Paia, Hawaii. 367 p.
161
Avaliação produtiva de cogumelos comestíveis desenvolvidos pela

técnica Jun-Cao
Moraes JCFB1; Rolim LN2; Sales-Campos C.2

1
Graduanda Nilton Lins /Bolsista PIBIC PAIC CNPq/INPA,2Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia – INPA.
E:mail [email protected]; [email protected].
Resumo
Os cogumelos sempre foram apreciados pela humanidade por suas propriedades

nutritivas, embora em sua maioria eles possuam considerável toxicidade. Cultivo de
cogumelos comestíveis tornou-se, então, a melhor maneira de suprir o mercado sem que
haja riscos de consumir cogumelos tóxicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
resposta fisiológica de diferentes variedades de cogumelos desenvolvidas em substratos
cuja formulação baseia-se na técnica Jun-Cao. A técnica consiste na formulação, com
enriquecimento para verificar o desenvolvimento de linhagens de fungos de interesse
comercial e científico como: Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Flammulina
velutipes, Volvariela volvacea, Lentinus strigosus, Pleurotus ostreatus e Pleurotus
ostreatoroseus. O substrato Jun-Cao foi feito com umidade 70% e utilizou Capim-
elefante (Pennisetum purpureum) 60%, serragem de cajuí (Anacardium giganteum)
18%, farelo de trigo (Triticum spp.) 10%, farelo de arroz (Oryza spp.) 10%, açúcar
mascavo 1% e carbonato de cálcio 1%. A segunda formulação foi elaborada sem o
açúcar mascavo e aumentando o carbonato de cálcio para 2%. Dentre estes substratos
testados, o enriquecimento da segunda formulação apresentou melhor resposta
fisiológica para somente duas espécies (P. ostreatus e P. ostreatoroseus). O açúcar
mascavo provavelmente contribui para a colonização por bactérias e outros fungos
competidores. P. ostreatus mostrou melhor Eficiência Biológica, produtividade de
cultivo e Perda de Matéria Orgânica do que P. ostreatoroseus. Já as demais linhagens
tais como: (Lentinus strigosus, Ganoderma lucidm e Pleurotus ostreatus) se
colonizaram, mas não produziram corpos de frutificação. As outras três linhagens
(Flammulina velutipes, Volvariela volvacea e Grifola frondosa) contaminaram com
trichoderma.
Palavras Chaves: Cogumelos, Jun Cao, gênero Pleurotus
162
Introdução
Cogumelos são fungos da classe Basidiomycetes conhecidos pela civilização

desde os primórdios da sua história, devido às suas características tóxicas (gerando
acidentes por vezes fatais) ou por suas características nutritivas e medicinais, que os
tornaram importante fonte de estudos por parte de pesquisadores no mundo inteiro.
Existem cerca de 2000 espécies de cogumelos potencialmente comestíveis na natureza,
mas apenas aproximadamente 22 são intensivamente cultivadas. Principalmente em
solo ou em troncos de madeira ou em substrato de serragem (Manzi et al., 2004).
A tecnologia de cultivo de cogumelos comestíveis na região Amazônica, ainda

é pouco desenvolvida, utilizada. No entanto a região apresenta um grande potencial para
esta prática, e para tal tornam-se necessárias pesquisas, a fim de difundir o
conhecimento gerado tornando o produto cada vez mais conhecido e acessível à
população (Carvalho 2010).
“Jun-Cao” (Jun = cogumelo; Cao = gramíneas) é uma técnica de cultivo

chinesa que se tornou revolucionária para a fungicultura daquele país. Por utilizar-se de
gramíneas como substrato-base, o método possui ricas fontes para o desenvolvimento
selvagem ou para áreas plantadas. Dessa forma, é possível conciliar o cultivo de
cogumelos com a proteção do ecossistema, uma vez que não são utilizadas madeira ou
serragem (como se faz no método convencional). Além disso, o curto período de
cultivo, praticidade e facilidade de manuseio são qualidades que dão à técnica
excelentes possibilidades para análise de fungos pouco conhecidos, facilitando, por
exemplo, estudos Bioquímicos a cerca dos basidiomicetos testados (Urben et al., 2004).
Conforme mencionado na literatura diferentes composições no substrato

utilizados pelos fungos resultam em ganhos metabólicos variados, com alterações na
sua fisiologia e composição química (Ragunathan e Swamihathan 2003; Shashirekha et
al., 2005) Entretanto, Sturion e Razani (2000) relatam que os cogumelos possuem
capacidade de absorver moléculas do substrato, inclusive metais pesados o que resulta
na necessidade de cuidados quanto aos substratos utilizados.
163
O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta fisiológica de diferentes
variedades de cogumelos desenvolvidas em substratos cuja formulação baseia-se na
técnica Jun-Cao para determinar qual formulação gera melhor produtividade tanto em
nível de quantidade como qualidade nutricional.
Material e Métodos
O trabalho foi se realizado no Laboratório de Cultivo de Fungos Comestíveis

do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. As linhagens escolhidas para o estudo
foram obtidas, a partir de placas miceliadas onde todas se encontram depositadas no
banco de espécies micológicas do INPA (Manaus, Amazonas, Brasil). Ao todo, foram
utilizadas 8 linhagens: Ganoderma lucidum (CC-351), Grifola frondosa (CC-373),
Flammulina velutipes (CC-85), Volvariela volvacea (CC-94), Lentinus strigosus
(INPA-1466), Pleurotus ostreatus (INPA-1467), Pleurotus ostreatoroseus (coletado no
Estado da Amazônia) e Pleurotus ostreatoroseus (coletado na Mata Atlântica, Estado
de São Paulo).
As linhagens foram inoculadas sacos contendo 250g de sementes de trigo

previamente hidratadas e esterilizadas em autoclave (30 minutos a 121 ºC). Os sacos
inoculados foram mantidos em câmara climática a 24 ºC, UR 80% e em ausência de luz
até completa colonização. Segundo Urben et al. (2004), essa etapa é propícia para
intensificar o vigor micelial dos cogumelos. Uma vez plenamente colonizados, os sacos
foram usados como inoculo para o substrato Jun-Cao, que foi elaborado na seguinte
proporção: Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 60%, serragem de cajuí
(Anacardium giganteum) 18%, farelo de trigo (Triticum spp.) 10%, farelo de arroz
(Oryza spp.) 10%, carbonato de cálcio 2%.
Uma vez inoculado, o material foi levado à câmara climática (25 ºC, UR 80%
em ausência de luz). Após a colonização, os sacos foram transferidos para outra câmara
climática em condições abióticas diferentes (22ºC, UR 90% com fotoperíodo de 8h)
com objetivo de estimular a formação dos corpos de frutificação.
Foram avaliados tempo de colonização, formação de primórdios, quantidade de

cogumelos produzidos, eficiência biológica (EB) e perda de matéria orgânica (PMO)
164
que é a quantidade de matéria extraída do substrato ao longo do processo de cultivo
fúngico. Os dados foram analisados usando o programa Sisvar com ANOVA um fator
em teste Turkey.
O experimento foi conduzido por 90 dias. De maneira geral, a linhagem que

mais rapidamente colonizou os substratos foi P. ostreatus, com média de 21 dias. A
linhagem P. ostreatoroseus AM (variedade coletada no Amazonas) levou mais tempo
para colonizar, com média de 24 dias. Em se tratando de produção de primórdios, P.
ostreatoroseus AM mostrou-se mais eficiente, desenvolvendo-os em média cinco dias
após a completa colonização. O desenvolvimento das frutificações levou em média
quatro dias. As demais linhagens colonizaram o substrato, mas não produziram
primórdios (Tabela 1).
Tabela 1. Tempo de cultivo das linhagens pela técnica Jun-Cao.

Período (dias)
Linhagem Formação dos
Colonização Frutificação
primórdios
P. ostreatus Nativo B 21 4 3-4
P.ostreatoroseus AM 24 5 3-4
Na avaliação da produção, considerando o somatório em todos os substratos, P.

ostreatus foi a linhagem que mais se destacou no cultivo, totalizando 777,5g (peso
fresco), com média de aproximadamente 129g por quilo de substrato. Em segundo lugar
ficou P. ostreatoroseus AM, produzindo cerca de 542g de cogumelos frescos (média=
90g/Kg de substrato) (Tabela 2).
Tabela 2. Peso de cogumelos colhidos pela técnica Jun-Cao.

Linhagem Mat. fresca (g) Mat. seca (g)
P. ostreatus Nativo B 777.5 114
P. ostreatoroseus AM 542 49
165
Em relação à EB, na média obtida do substrato testado, a linhagem que mais se
destacou foi P. ostreatus (EB= 86,2%) diferindo estatisticamente, segundo o teste
Tukey, de P. ostreatoroseus AM (EB= 22,3%). No estudo da PMO, considerando a
média de todas as repetições, P. ostreatus mostrou melhor consumo dos substratos
(PMO= 62,5%), sendo diferente estatisticamente de P. ostreatoroseus AM (PMO=
53%). Em relação à concentração de proteínas, P. ostreatus e P. ostreatoroseus AM
demonstraram similaridade estatística, tendo suas concentrações com valores muito
próximos. Na avaliação das cinzas também houve similaridade (Tabela 3).
Tabela 3. Médias da Eficiência Biológica (EB) e Perda de Matéria Orgânica (PMO) em

diferentes linhagens de cogumelos desenvolvidos pela técnica Jun-Cao.
Linhagem EB (%) PMO (%)

P. ostreatus Nativo B 86,4 56,7
P. ostreatoroseus AM 46,9 66,1
Podemos observar que nesta tabela NATIVO B consumiu menos substrato, do

que o P.ostreatoroseus AM, porém sua eficiência biológica foi melhor.
Em relação à concentração de proteínas, P. ostreatus e P. ostreatoroseus AM

demonstraram similaridade, tendo suas concentrações com valores muito próximos,
com diferenças estatísticas, já fenóis houve também diferenças estatísticas. As cinzas
não houve diferença significativa (Tabela 4).
Tabela 4. Concentração de umidade e cinzas obtidas de duas linhagens de cogumelos do

gênero Pleurotus
Linhagem Proteínas (%) Fenóis (%) Cinzas (%)

P. ostreatus Nativo B 14,73 11,78 10,97
P. ostreatoroseus AM 14,20 14,14 11,24
Os resultados apresentados indicam uma produtividade relativamente elevada

em Pleurotus, quando comparados com os resultados obtidos por Ahmed et al., (2013).
No caso de P. ostreatoroseus AM, a eficiência de miceliação pode ser alterada à medida
que o fungo se aprofunda no substrato. Fatores como suplementação e dificuldade nas
trocas gasosas podem comprometer o desenvolvimento do fungo (Rossi et al., 2001).
Talvez algum destes fatores possa interferindo na ausência de crescimento das demais
166
linhagens no substrato suplementado. Ainda segundo Rossi et al., (2001), a formulação
com nutrientes, de preferência solúveis é uma alternativa promissora na estimulação do
crescimento. Neste aspecto, torna-se necessário verificar outras combinações de
materiais e insumos para determinar resultados melhores. Para Urben et al., (2004) a
umidade do substrato precisa ser observada com atenção, uma vez que as necessidades
fisiológicas variam conforme a espécie de cogumelo. Neste estudo a umidade do
substrato Jun-Cao utilizado ficou em torno de 75%.
Segundo Minotto et al. (2010) o farelo de arroz favoreceu o crescimento

micelial de diversas espécies de cogumelos, promovendo, assim, a rápida colonização
do substrato e consequentemente redução na probabilidade de contaminação.
Provavelmente o uso do farelo de arroz sem trigo poderá fornecer resultados mais
satisfatórios. Para Urben et al., (2004), o trigo confere importante fonte de nutrientes.
Faz-se, assim, necessário testá-los separadamente, comparando os resultados com
substratos onde estes insumos sejam utilizados de forma combinada.
A produção de cogumelos comestíveis por meio da técnica Jun-cao se trata de

uma tecnologia inovadora que causa menores impactos ambientais quando comparada
aos outros métodos de produção. O estudo referente de cultivo de fungos comestíveis é
um campo ainda não muito explorado com profundidade. Ainda há dúvidas quanto aos
benefícios ou prejuízos à saúde e é notório que eles tendem a ser mais estudados quanto
a melhor forma de cultivo e em quais substratos e linhagens eles evidenciam melhor
produtividade e qualidade. Através dos resultados obtidos pode-se ter base para futuros
trabalhos abordando mais profundamente a vantagem de se otimizar substratos desta
região Amazônica para cultivar fungos comestíveis.
Conclusão
Pleurotus ostreatus Nativo B e P. ostreatoroseus AM foram as linhagens que

melhor responderam. São necessários novos testes para verificar qual formulação Jun-
Cao desenvolverá melhor resposta nas linhagens de estudo citadas acima.
167
Referências
Ahmed M, Abdullah N, Ahmed KU, Bhuyan MHM (2013) Yield and nutritional
composition of oyster mushroom strains newly introduced in Bangladesh. Pesq Agropec
Bras 48: 197-202.
Carvalho SMC (2010) Cultivo e análise química e bromatológica de Pleurotus ostreatus

em resíduos de diferentes cultivares de bananeira. Manaus, Brasil, 95p. (Dissertação)
mestrado em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas
Manzi P, Marconi S, Aguzzi A, Pizzoferrato L (2004) Commercial

mushrooms:nutritional quality and cooking. Food Chem 84: 201-206.
Minotto E, Wille CN, Bernardi E, Manzoni CG, Nascimento JS (2009)

Desenvolvimento do cogumelo shiitake (Lentinula edodes) em substrato a base de
serragem suplementada com farelo de arroz. XIII CIC/XI ENPOS. 1-5.
Ragunathan R, Swaminathan K (2003) Nutritional status of Pleurotus spp. grown on

various agro-wastes. Food Chem 80: 371-375.
Rossi IH, Monteiro AC, Machado JO (2001) Desenvolvimento micelial de Lentinula

edodes como efeito da profundidade e suplementação do substrato. Pesq Agropec Bras
36 (6): 887-891.
Shashirekha MN, Rajarathnam S, Bano Z (2005) Effects of supplementing rice straw

growth substrate with cotton seeds on the analytical characteristics of the mushroom,
Pleurotus florida (Block & Tsao). Food Chem 92: 255-259.
Sturion GL, Razani MRTC (2000) Composição em minerais de cogumelos comestíveis

cultivados no Brasil - Pleurotus spp e outras espécies desidratadas. ALAN. 50: 102-108.
Urben AF, Oliveira HCB, Vieira W, Correia MJ, Uriartt AH (2004) Produção de
cogumelos por meio de tecnologia chinesa modificada. Brasília: Embrapa Recursos
Genéticos e Desenvolvimento. 110p.
168
Fungos endofíticos associados à pimenta murupi (Capsicum chinense):

Isolamento, caracterização morfológica e atividade antimicrobiana
Nogueira J.C1, Maki C.S.2 , Martins, M.K1.
1
Universidade do Estado do Amazonas-UEA, PPG em Biotecnologia e Recursos Naturais, 2
Universidade Federal do Amazonas-UFAM, Manaus, AM.
E-mail [email protected] , [email protected]
Resumo
Fungos endofíticos habitam tecidos vegetais de forma assintomática e estabelecem
uma relação considerada mutualística com seus hospedeiros. Este grupo microbiano é
reconhecido como uma valiosa fonte de metabólitos secundários com diferentes atividades
biológicas que podem ter aplicações na medicina, agricultura, biotecnologia e indústria.
Conhecendo o potencial desses micro-organismos, sugeriu-se neste trabalho, a caracterização
da comunidade de fungos endofíticos associados ao fruto da pimenta murupi (Capsicum
chinense) e a avaliação de sua capacidade em produzir metabólitos com atividade
antimicrobiana. O número total de endófitos obtidos do endocarpo foi de 133 isolados
fúngicos, com frequência total de 33,25%, sendo esses predominantes no isolamento a partir
do endocarpo. Cerca de 70% dos isolados fúngicos não produziram estruturas reprodutivas
nas condições testadas neste trabalho e, portanto, não puderam ser caracterizados em relação
às suas estruturas reprodutivas, totalizando 74 grupos morfológicos. Para outros três grupos,
foi possível analisar as características macro e micromorfológicas das colônias e sugerir a sua
identificação ao nível de gênero. Pôde-se perceber a predominância de Fusarium entre os
fungos isolados da pimenta murupi, o qual apresenta micélio cotonoso, de coloração branca a
rósea e características micromorfológicas peculiares, tais como a presença de macro e
microconídios. Foram selecionados 77 isolados fúngicos para testes de antibiose contra
micro-organismos teste: Staphylococcus aureus MRSA, Escherichia coli, Candida albicans,
C. albicans (ATCC10231), C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii.
Apenas um endófito apresentou halo de inibição contra Staphylococcus aureus resistente à
meticilina (MRSA). A partir do DNA genômico, extraído do fungo endofítico com potencial
antimicrobiano, foi possível amplificar a região ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA, a qual apresentou
169
aproximadamente 600 pb. De acordo com o banco genômico, o isolado promissor apresenta
92% de identidade com Nemania sp. Por se tratar de um índice considerado baixo, não foi
possível inferir sobre sua identificação.
Palavras-chave: Capsicum chinense, micro-organismos endofíticos, composto

antimicrobiano.
Introdução
Os micro-organismos estão presentes nos mais variados ambientes, interagindo com
diversas formas de vida. São organismos extremamente versáteis e habitam ambientes
diversificados, incluindo aqueles considerados inóspitos. Micro-organismos associados a
plantas são estudados há tempos e em diferentes níveis, formando assim um micro
ecossistema complexo, onde diferentes nichos são explorados por uma extensa variedade de
micro-organismos. Dentre esses, podemos destacar os endófitos, que são organismos
conhecidos por passar parte ou todo o ciclo de vida colonizando os tecidos vivos de uma
planta hospedeira sem, entretanto, causar sintomas aparentes de doenças (Schulz et al., 2005).
É estimado que cerca de 80% das plantas são hospedeiras de micro-organismos

(Zhang et al., 1997). A natureza dessa interação tem despertado o interesse de bioquímicos,
químicos e biólogos na tentativa de entender essas associações, que é um fascinante e amplo
campo de pesquisa, devido ao potencial que esses micro-organismos endofíticos têm em
proporcionar benefícios aos seus hospedeiros e também, devido às suas aplicações
biotecnológicas (Araújo et al., 2002). Até então, acreditava-se que os endófitos não
mantinham qualquer relação com as propriedades de interesse apresentadas pelas plantas que
os hospedavam (Radwan et al., 2004). Atualmente, mantém-se a hipótese de que genes
responsáveis pela expressão de proteínas de interesse nos micro-organismos podem ser
transferidos (via transferência horizontal) desses para seu hospedeiro, sendo que esse último
expressa as mesmas moléculas de interesse originalmente expressas pelos seus micro-
organismos associados (Araújo et al., 2010). Micro-organismos endofíticos já foram isolados
a partir de uma grande variedade de plantas (Arnold et al., 2000; Martins 2005; Rubini et al.,
2005, Wang e Dai, 2010; Siqueira et al., 2011; Bezerra et al., 2015; Freire et al., 2015).
Estima-se a ocorrência de cerca de 1,5 milhões de espécies endofíticas, sendo que deste total,
10% foram descobertas e apenas 1% examinada quanto ao seu espectro de produção de
170
metabólitos secundários (Guo et al., 2008). Assim, o estudo de bioprospecção de micro-
organismos endofíticos que produzam compostos de interesse abre perspectivas para várias
frentes de investigação, incluindo a descoberta de novos compostos antimicrobianos. Assim
como os hospedeiros estudados até hoje, as pimentas do gênero Capsicum apresentam sua
diversidade de micro-organismos endofíticos associados. Amaresan et al. (2012) isolaram de
C. annuum cerca de 87 bactérias endofíticas e dentre os isolados, foi possível identificar
gêneros como Bacillus sp., Antrobacter sp. e ainda B. subtilis. Devari et al. (2013) isolaram
da mesma espécie, um fungo endofítico identificado como Alternaria alternata, produtor da
substância capsaicina, substância responsável pela ardência das pimentas.
O gênero Capsicum compreende mais de 200 variedades, dentre as quais as espécies

mais conhecidas são C. annuum, C. baccatum, C. pubescens, C. chinense e C. frutescens
(Menichini et al., 2009; Zimmer et al., 2012). A região norte do Brasil apresenta-se como a
área de maior diversidade da pimenta murupi (Capsicum chinense), variedade largamente
utilizada como complemento a pratos típicos da região, porém além do uso culinário, esse
gênero tem reconhecidas propriedades farmacológicas, devido à presença de capsaicinóides
(Reyes-Escogido et al., 2011), um grupo de alcalóides exclusivo do gênero Capsicum.
Existem vários relatos na literatura científica que tratam da atividade antimicrobiana das
pimentas, como os trabalhos de Carvalho et al. (2010), Oliveira (2011), Kapell (2007), entre
outros. Apesar da diversidade de trabalhos com pimentas Capsicum, os estudos envolvendo a
comunidade endofítica dessas pimentas são escassos, aliado ao pouco conhecimento existente
sobre a microbiota endofítica associada à pimenta murupi, uma variedade exclusivamente
brasileira, e às características benéficas que esses micro-organismos podem apresentar. Diante
dos relatos apresentados e considerando o histórico de Capsicum associado a atividades
antimicrobianas, a proposta do presente trabalho foi estudar a microbiota endofítica associada
à pimenta murupi, no que se refere ao seu potencial na produção de compostos
antimicrobianos e à sua diversidade biológica.
Material e Métodos
Foram coletadas 20 pimentas (10 maduras e 10 imaturas) no período de novembro de 2012 a
abril de 2013, em cada um dos dois pontos da cidade de Manaus (AM): Tarumã (301’15,5”S
- 6004’36,4”W) e Zona Leste (304’50”S - 5956’00,2”W). Somente os frutos e as sementes
de pimentas murupi foram utilizados no isolamento de fungos endofíticos. As amostras foram
transportadas ao Laboratório de Genética de Micro-organismos da Universidade Federal do
171
Amazonas, onde foram realizados os procedimentos de assepsia superficial, segundo Araújo
et al. (2010): as amostras vegetais foram lavadas em água corrente com detergente neutro e,
em seguida imersas em álcool 70% (1 min), hipoclorito de sódio (2,5-3% de cloro ativo) (1
min), álcool 70% (1 min) e duas vezes em água destilada esterilizada. Após a desinfestação
superficial, foram transferidos 5 fragmentos de aproximadamente 3 mm2 para placas de Petri,
contendo ágar batata dextrose (BDA) suplementado com antibiótico tetraciclina na
concentração de 50μg/mL. As placas foram incubadas à temperatura de 28ºC por 10 dias. Para
avaliar a eficácia da desinfestação, alíquotas de 50μL da última água de lavagem foram
semeadas em placa de Petri contendo o mesmo meio de cultura e incubadas sob as mesmas
condições. A purificação dos isolados foi realizada por meio da obtenção de culturas
monospóricas a partir das colônias obtidas no isolamento. Após a obtenção dos isolados
purificados, a macromorfologia foi analisada para condições de desenvolvimento micelial
específicas: incubação em meio BDA, a 24 ºC e no escuro. Análises micromorfológicas foram
realizadas após a incubação dos isolados fúngicos em ágar água e nessas, priorizou-se a
observação de estruturas vegetativas e reprodutivas em microscópio óptico, em aumento de
400X.
Para a avaliação da atividade antimicrobiana dos filtrados dos micro-organismos
endofíticos, foi empregado o método de difusão em ágar descrito por Huang et al. (2001).
Foram utilizados Candida albicans (ATCC 10231), C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis,
C. glabrata, C. guilliermondii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, S. aureus (MRSA)
nos ensaios antimicrobianos.
O DNA do isolado com potencial antimicrobiano foi extraído e submetido à
amplificação das regiões ITS do rDNA (ITS1-5.8S-ITS2), utilizando-se os primers ITS1 (5´-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´),
descritos por White et al. (1990). As sequências de DNA foram comparadas com as
sequências de culturas depositadas no GenBank, utilizando o programa BLASTn (Basic Local
Alignment Search Tool) disponível no portal do National Center for Biotechnological
Information – NCBI.
Um total de 133 isolados de fungos filamentosos foi isolado e todos associados ao
endocarpo da pimenta murupi, com predominancia em meio Sabouraud. Considerando
especificamente os hospedeiros Capsicum, ressalta-se ainda a retenção da capsaicina à
172
placenta do fruto, visto que nenhum fungos endofíticos foi isolado das sementes, o que leva à
hipótese de que a própria placenta do fruto pode constituir em uma barreira física e química
eficiente para inibir o desenvolvimento dos fungos endofíticos, os quais foram isolados
apenas do endocarpo.
A frequência geral de isolamento foi de 33,25% para o total de fragmentos vegetais,
sendo as plantas da zona Leste de Manaus as maiores detentoras de fungos endofíticos
passíveis de isolamento, quando comparadas às plantas do Bairro Tarumã (Figura 1).
Também foi observado que no segundo isolamento, realizado em época chuvosa, houve maior
isolamento de endófitos dos tecidos vegetais analisados, especialmente os coletados na zona
Leste.
1o Isolamento (Período de seca)
Tarumã Zona Leste
2o Isolamento (Período de chuva)

Tarumã Zona Leste
Figura 1. Frequência de isolamento de fungos endofíticos em função da sua localização na planta, do

local de coleta e do meio de cultura empregados no isolamento.
173
Os dados obtidos corroboram com aqueles descritos por Rodrigues (1994) e
Suryanarayanan et al., (1998), que obtiveram maior quantidade de micro-organismos
endofíticos no período chuvoso, quando comparado ao período de seca. Uma hipótese a ser
considerada é a de que os micro-organismos, especialmente aqueles associados à rizosfera e
ao rizoplano, encontram mais facilidade de fixação, penetração e colonização da planta
através de suas raízes em épocas de solo umedecido, característica predominante do solo à
época da realização da segunda coleta.
Cerca de 70% dos isolados fúngicos não produziram estruturas reprodutivas o que
dificultou a caracterização, mesmo assim 74 grupos morfológicos foram classificados
conforme a macromorfologia apresentada em condições específicas e padronizadas. Para
aqueles fungos passíveis de identificação por meio da correlação de dados de macro e
micromorfologia, houve a predominância de Fusarium, o qual apresenta micélio cotonoso, de
coloração branca a rósea e características micromorfológicas peculiares, como a produção de
micro e macroconídios, apresentando esses últimos, a forma típica de foice septada.
Dos isolados testados para detecção de atividade antimicrobiana, apenas um
apresentou halo de inibição contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)
(Figura 2).
A B
Figura 2. Teste de detecção de atividade antimicrobiana pelo método da difusão em disco. Legenda:
(16 e 16D) disco de papel filtro embebido no filtrado do caldo de fermentação do isolado 16, um
fungo endofítico de pimenta murupi; (14, 15, 17 e 18) isolados endofíticos que não apresentaram
atividade (A) (C+) controle positivo, representado pelo antibiótico ampicilina e (C-) controle negativo,
representando apenas o meio de cultura líquido (B).
174
Análises moleculares desse isolado permitiram sua comparação com nível de
identidade de 92% a um isolado de Nemania sp. (JQ846087 1 e DQ641634 1) (Figura 3).
Baseado nos resultados moleculares, Sánchez-Ballesteros et al. (2000) especularam que o
gênero Nemania pode representar um complexo de espécies com variantes genéticas e
fenotípicas indistinguíveis por meio de ferramentas moleculares, ou seja, mesmo isolados de
espécies diferentes dentro do gênero Nemania podem apresentar homologias completas de
regiões conservadas, o que dificulta sua identificação, mesmo com a utilização de métodos
moleculares.
Figura 3. Análise de similaridade genética baseada no alinhamento de sequências ITS1-5.8S-ITS2

do rDNA do isolado 16 com acessos de maior homologia depositados no banco de dados do NCBI
Conclusão
Fungos endofíticos associados à variedade murupi de C. chinense apresentam

potencial para o controle biológico de agentes microbianos, sugerindo futuros estudos,
especialmente por se tratar de um hospedeiro adaptado ao clima amazônico e provavelmente,
constituir uma rica e promissora fonte de micro-organismos associados.
175
Referências
Amaresan N, Jayakumar V, Kumar K, Thajuddin N (2012) Isolation and characterization of
plant growth promoting endophytic bacteria and their effect on tomato (Lycopersicon
esculentum) and chilli (Capsicum annuum) seedling growth. Annual Microbiology 62:805–
810.
Araújo WL, Lima, AOS, Azevedo JL, Marcon J, Sobral JK, Lacava PT, Pizzirani-Kleiner AA
(2010) Guia Prático: isolamento e caracterização de microrganismos endofíticos. Piracicaba:
Editora CALQ, 167p.
Araujo WL, Marcon J, Macheroni W, Van Elsas JD, Van Vuurde JWL, Azevedo JL (2002)
Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in
citrus plants. Applied and Enviromental Microbiology 68: 4906-4916.
Arnold AE, Maynard Z, Gilbert GS, Coley PD, Kursar TA (2000) Are Tropical Endophytes
Fungi Hyperdiverse? Ecology Letters 3: 267-274.
Bezerra JDP, Nascimento CCF, Barbosa RN, Silva DCV, Svedese VM, Silva Nogueira EB,
Gomes BS, Paiva LM, Souza-Motta, CM (2015) Endophytic fungi from medicinal plant
Bauhinia forficata: Diversity and biotechnological potential. Brazilian Journal of
Microbiology 46(1): 49-57.
Carvalho HH, Wiest JM, Cruz FT (2010) Atividade antibacteriana in vitro de pimentas e
pimentões (Capsicum sp.) sobre quatro bactérias toxinfectivas alimentares. Revista Brasileira
Plantas Medicinais 12(1): 8-12.
Devari S, Jaglan S, Kumar M, Deshidi R, Guru S, Bhushan S, Kushwaha M, Gupta AP,

Gandhi SG, Sharma JP, Taneja SC, Vishwakarma RA, Ali Shah B (2013) Capsaicin
production by Alternaria alternata, an endophytic fungus from Capsicum annum; LC–ESI–
MS/MS analysis. Phytochemistry.
Freire KTLS, Araújo GR, Bezerra JDP, Barbosa RN, Silva DCV, Svedese VM, Paiva LM,
Souza-Motta C M (2015) Fungos endofíticos de Opuntia ficus-indica (l.) mill. (Cactaceae)
sadia e infestada por Dactylopius opuntiae (Cockerell, 1896) (Hemiptera: Dactylopiidae).
Gaia Scientia Edição Especial Cactaceae 9(2): 104-110.
Guo B, Wang Y, Sun X, Tang K (2008) Bioactive natural products from endophytes: a
review. Applied Biochemistry and Microbiology, 44: 136-142.
Huang Y, Wang J, Li G, Zheng Z, Su W (2001) Antitumor and antifungal activities in

endophytic fungi isolated from pharmaceutical plants Taxus mairei, Cephalataxus fortune and
Torreya grandis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31:163-167.
Kappel VD (2007) Avaliação das propriedades antioxidante e antimicrobiana de extrato de

Capsicum baccatum L. var. pendulum. Porto Alegre, Brasil, 74p. (Dissertação), Mestrado em
Ciências em Tecnologia de Alimento. Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS).
176
Martins MK (2005) Variabilidade genética de isolados de Fusarium spp. e estudo da interação
com a planta hospedeira. Piracicaba, Brasil, 124p. (Tese), Doutorado em Fitopatologia.
Escola Superior de Agricultura ´Luiz de Queiroz´ Universidade de São Paulo – USP)
Menichini F, Tundis R, Bonesi M, Loizzo MR, Conforti F, Statti G, Cindio B, Houghton PJ,
Menichini F (2009) The influence of fruit ripening on the phytochemical content and
biological activity of Capsicum chinense Jacq. cv Habanero. Food Chemistry 114: 553–560.
Oliveira AMC (2011) Caracterização química, avaliação da atividade antioxidante in vitro e

atividade antifúngica de pimentas do gênero Capsicum spp. Teresina, Brasil, 82p.
(Dissertação) Mestrado em alimento e nutrição. Universidade Federal do Piauí – UFPI.
Radwan T, Mohamed Z, Reis VM (2004) Efeito da inoculação de Azospirillum e

Herbaspirillum em plântulas de milho e arroz. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília
39(10): 987-994.
Reyes-Escogido ML, Gonzalez-Mondragon EG, Vazquez-Tzompantzi E (2011) Chemical and

Pharmacological Aspects of Capsaicin: Review Molecules 16:1253–1270.
Rodrigues KF (1994) The foliar fungal endophytes of the amazonian palm Euterpe oleracea.
Mycologia 3:376-385.
Rubini MR, Silva-Ribeiro RT, Pomella AWV, Maki CS, Araújo WL, Santos DR, Azevedo JL
(2005) Diversity of endophytic community of cacao (Theobroma cacao L.) and biological
control of Crinipellis perniciosa, causal agent of Witches´Brom Disease. International
Journal of Biological Sciences, 1:24-33.
Sánchez-Ballesteros J, González V, Salazar O, Acero J, Portal MA, Julián M, Rubio V, Bills

GF, Polishook J, Platas G, Mochales S, Peláez F (2000) Phylogenetic study
of Hypoxylon and related genera based on ribosomal ITS sequences. Mycologia. 92:964–977.
Schulz B, Boyle C (2005) The endophytic continuum. Mycological Research 109(06): 661-
686.
Siqueira VM, Conti R, Araújo JM, Souza-Motta CM (2011) Endophytic fungi from the
medicinal plant Lippia sidoides Cham. and their antimicrobial activity. Symbiosis 53: 89-95.
Suryanarayanan TS, Kumaresan V, Johnson JA (1998) Foliar fungal endophytes from two
species of the mangrove Rhizophora. Canadian Journal of Microbiology 44:1003-1006.
Wang Y, Dai CC (2011) Endophytes: a potencial resource for biosynthesis, biotranformation,

and biodegradation. Annals of Microbiology, 61: 207215.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to methods and
applications. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, (eds). Academic Press, New
York, USA: 315–322.
Zhang W, Wendel JF, Clark LG (1997) Molecular Phylogentics and Evolution 8:205-217.
177
Zimmer AR, Leonardi B, Miron D, Schapoval E, Oliveira JR, Gosmann G (2012) Antioxidant
and anti-inflammatory properties of Capsicum baccatum: From traditional use to scientific
approach. Journal of Ethnopharmacology 139: 228– 233.
178
Identificação e Conservação de culturas Penicillium de interesse

Agrossilvicultural
Oliveira1 D.A.S, Jesus1 M.A

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, AM. E-mail:
[email protected]; [email protected]
Resumo
Penicillium (Trichocomaceae) são fungos que possuem importante papel ecológico

como decompositor e reciclador de matéria orgânica. Algumas espécies são conhecidas
pelo seu potencial biotecnológico. Pretendeu-se identificar as linhagens de Penicillium
depositadas na Coleção de Culturas de Microrganismos de Interesse Agrossilvicultural
do INPA. Um total de (111) linhagens de Penicillium está depositados na coleção e
distribuidas em P. aculeatum Raper & Fennell, P. commune Thom, P. corylophilum
Dierckx, P. chrysogenum Thom, P. expansum Link, P. fellutanum Biourge, P.
frequentans Westling, P. glabrum (Wehmer), P.griseofulvum Dierckx, P. melinii Thom,
P. paxilli Bainer, P. raistricki Smith, P.roquefortii Thom, P. sclerotirum, P.
verruculosum Peyronel e com destaque P. citrinum, P. lividum e P. implicatum pelo
número de linhagens e os possíveis potenciais biotecnológicos. A identificação das
espécies contribui para o conhecimento da diversidade de Penicillium na região
Amazônica.
Palavras-chave: Taxonomia de fungos, Fungos amazônicos
Introdução
Penicillium pertence à família Moniliaceae, apresenta fase assexual através da

produção de frutificações telemórficas. Caracterizam-se pela formação de uma estrutura
ramificada de conídios que terminam em células conidióginas, chamadas fiálides, com
ramificações monoverticilado, biverticilado e trivercilado. As ramificações estão dividas
179
em várias microestruturas (ramos, rámulas, métula e fiálides), nas quais são produzidos
os conídios que são esféricos ou elipsoidais, unicelulares e geralmente hialino ou verde,
azul- petróleo, verde oliva ou cinza (Frisvad e Samson, 2004). O aspecto macroscópico
das colônias é circular, geralmente verdes, em algumas espécies a cor pode ser amarela,
laranja, roxo ou marrom, e a superfície da colônia, também podem apresentar uma
textura arenosa, aveludada ou mucilaginosa (Pitt, 1985).
Segundo Terrasan (2007) Penicillium apresenta grande papel ecológico como
decompositor e reciclador de matéria orgânica. Este fungo tem sido isolado como
endofítico em tecidos de várias plantas. Algumas espécies são conhecidas como
produtores diversas classes de metabólitos secundários bioativos, incluindo atividade
antiparasitária Elias (2005). Atualmente, diversas pesquisas têm mostrado seu enorme
potencial biotecnológico, podendo ser fonte de novos fármacos, de enzimas de interesse
industrial, entre outros (Pallu, 2010).
As cepas de Penicillium depositadas na Coleção de Culturas de Microrganismos de
Interesse Agrossivilcultural foram isoladas de diversas espécies florestais de importância
econômica da região amazônica, resíduos madeireiros, produtos florestais, dentre outros
substratos, lignocelulíticos que foram materiais de estudos de durabilidade natural de
madeira, tecnologia da madeira e biotecnologia, no entanto muitas linhagens ainda não se
encontravam identificadas. De modo que o estudo de taxonomia das espécies contribuiu
para o conhecimento da diversidade de Penicillium na região Amazônica.
Material e Metodos
Primeiramente, foi realizado um levantamento das linhagens de Penicillium do

acervo com o intuito de selecionar as melhores técnicas de cultivo e preservação,
identificar e conhecer a diversidade e as aplicabilidades desses fungos. As linhagens
reativadas foram mantidas a 25°C por um período de 7 à 14 dias, período em que o
micélio cresce em toda a superfície da placa de Petri. Apartir da obtenção da colônia
pura, inóculos foram produzidos para a preservação da linhagem em óleo, sílica gel e
baixa temperatura. Posteriormente, outra colônia foi obtida para estudo de taxonomia,
tendo como parâmetros: a velocidade de crescimento (lento, relativamente lento,
rápido), sendo que para fungos de crescimento mais lento a colônia foi avaliada, assim
que atingiu a metade do diamêtro da placa de Petri. Enquanto que o crescimento rápido
da colônia foi avaliado diariamente. Também, a descrição do aspecto da superfície da
180
cultura foi realizada, tendo como parâmetro o aspecto do micélio aéreo: plumoso,
ceroso, camurçado, aveludado, flocoso, lanoso e úmido (presença de exsudatos). Assim
como a coloração da colônia: verde, verde-oliva, cinzentada, amarela e outras, e
presença de anéis concêntricos, e o reverso da mesma, seguindo os paramêtros
estabelecidos por (Pitt, 1985).
A análise microscópica da colônia foi feita a partir de lâminas semipermanentes,

preparadas com lactofenol e azul de algodão, sendo que as microestruturas foram
obtidas em micro-cultivo (CYA) que consiste em repicar dois inóculos, eqüidistante na
placa de Petri e sobre cada inóculo coloca-se uma lâminula estéril pelo período de sete
dias, até que o fungo o micelial cesce sobre as lâminulas de acodr com Daumal (1995).
Também foi avaliado a presença ou ausência de microestruturas tais como micélio
vegetativo e reprodutivo e suas respectivas mensurações. As caracteristicas das culturas
foram comparados com as das espécies de Penicillium descritas em sites e.
Resultados
Um total de 111 linhagens de Penicillium está depositado na coleção, deste 95

linhagens estão identificados morfologicamente em P. aculeatum Raper & Fennell, P P.
commune Thom, P.corylophilum Dierckx, P. citrinum Thom, P.chrysogenum Thom, P.
expansum Link, P. fellutanum Biourge, P. frequentans Westling, P. glabrum (Wehmer),
P.griseofulvum Dierckx, P. implicatum Biourge, P. lividum Westlin, P. melinii Thom,
P. paxilli Bainer, P. raistricki Smith, P. roquefortii Thom, P. sclerotirum e P.
verruculosum Peyronel, e com o maior número de linhagens. Em vista que esses fungos
são representantes de maior número de linhagens de importância biotecnológica se
justifica a preservação e conservação de suas cepas em condições especifica no sentido
de manter a viabilidade cultural.
A reativação das culturas contribuiu para a obtenção de culturas puras de 111
linhagens de Penicillium, as quais estão mantidas em pelo menos 3 métodos de
conservação na Coleção.(Tabela 1.)
Os dados de reativação e identificação dos isolados indicam a necessidade de
preservação e conservação dos mesmos em todos os métodos, com o intuito e de se
evitar contaminação e perda das culturas de Penicillium, inclusive das que possuem
grande potencial bioeconômico, e assim dar continuidade na identificação das espécies
através de técnicas clássica ou moleculares, e principalmente a preservação das mesmas,
181
considerando as linhagens que podem apresentar aplicabilidades biotecnológicas, como
.Também, o estudo de taxonomia e otimização dos processos de conservação e
preservação de Penicillium viabilizou o melhor aproveitamento do na coleção, e o
conhecimento da diversidade de Penicillium fornecendo assim subsídios para futuro
estudos em bioprospeção dos metabólitos destes fungos, visando a obtenção de
bioprodutos (Canhos e Vazoller, 2004).
Tabela 1. Relação de Penicillium identificados na coleção.
Táxon Linhagem
Penicillium aculeatum Raper & Fennell 1
P. corylophilum Dierckx 1
P. chrysogenum Thom 3
P. citrinum Thom 15
P. commune Thom 3
P. expansum Link 2
P. fellutanum Biourge 2
P. frequentans Westling 1
P. glabrum(Wehmer) Westling 1
P. griseofulvum Dierckx 2
P. implicatum Biourge 7
P. lividum Westling 14
P. melinii Thom 1
P. raistricki Smith 1
P. roquefortii Thom 2
P. paxilli Bainier 2
P. sclerotirum Beyma 2
P. verruculosum Peyronel 4
Penicillium spp. 47
Total 111
182
Discussão
Muitas das espécies de Penicillium depositadas na coleção são conhecidas pelo

seu amplo potencial biotecnológico por produzirem diversos metabólitos secundários
bioativos utilizados para produção de enzimas hidrolíticas (amilases, celulases e
proteases), ácidos orgânicos (ácido cítrico e ácido glucônico) que podem possuir
aplicabilidade em diversas áreas bioeconômicas (Pallu, 2010).
Também, outras espécies de Penicilium da coleção são utilizadass no controle
de patógenos em cultivares e sementes na agricultura (Costa e Jesus 2012). P. citrinum é
antagônico a Aspergillus níger Tiegh, inclusive é usado no controle da população desse
patógeno causal de podridão vermelha no sisal (Damasceno, 2012). Na área médica, as
espécies P. lividum e P. implicatum são produtores de proteases, enzimas industriais,
aplicadas a indústria farmacêutica na produção de fármacos antibióticos da classe Beta
lactâmicos penicilina, amoxilina, bezetacil e outros antibióticos. (Silva e Lins, 2008).
Além destas de valor econômico, Penicillium roquefortii e Penicillium camembert tem
aplicabilidaes na indústria alimenticias, principalmente na produção de fermento para pão
e de diversos queijos, (Rousseau, 1984) sendo que os seus respectivos nomes roquefortii e
camembert são dados para queijos que são bastante diferentes um do outro.
A importância da preservação de culturas de Penicillium, principalmente das
linhagens conhecidos pelos seus potenciais e até mesmo aquelas desconhecidas podem
servir de fonte para futuras pesquisas em biotecnologia na região amazônica. Uma vez
que é de grande valia a manutenção de culturas de microrganismos, não somente para
fins científicos como também didáticos (Romeiro, 1996).
Conclusão
O presente estudo contribui para o conhecimento da diversidade de Penicillium
na região Amazônica, com destaque para P. citrinum, P. lividum e P. implicatum com o
maior número de linhagens com possíveis potenciais biotecnológicos.
183
Referências
Abreu MM, Tutunji LV(2003). Implantação e Manutenção das coleções de culturas de

microrganismos da UniCEUB. Universitas Ciência da Saúde. 2:236-251.
Canhos VP, Vazoller MP (2004). Coleções de culturas de microrganismos. 82-101.

Disponível em: <http://www.biota.org.br/pdf/v72cap03.pdf> Acesso em: 11 de
dezembro de 2013.
Dalmau LM (1929). Remarques surla technique mycologique. Parasitologie et Humaine

Comparée, Annales 7:536-545.
Damasceno LC. (2012). Potencial de Penicillium citrinum para controle Aspergillus

niger, agente causal da podridão vermelha do sisal, Monografia, Universidade Federal
do Rêconcavo da Bahia. 69 pp.
Elias BC(2005). Estudo químico e atividades biológicas de extratos obtidos de culturas

de Penicillium verruculosum Dierck23p., (Dissertação) Mestrado em Produtos Naturais
e Sinteticos, FCF-USP. Ribeirão Preto.
Pallu APS (2010). Potencial biotecnológico de fungos do gênero Penicillium e interação

com cana de açúcar, (Tese) Doutorado em Genetica e melhoramento de plantas,
Piracicaba. 130pp.
Pitt JI (1985). A laboratory guide to common Penicillium species. Common wealth

scientific and industrial research organization division of food research. Australia. 6pp.
Rousseau M (1984). Study of the surface flora of traditional Camembert cheese by

scanning electron microscopy Milch Wissens Chaft, 39:129–134.
Romeiro RM (2005). Bactérias patogênicas. Imprensa Universitária/ UFMG. Viçosa.

417pp.
Silva RR,Lins GD (2008). Fungos e Aplicabilidades biotecnológicas, programa de pos-

graduação em Biodiversidade Vegetal do IBT, São Paulo. 20pp.
Terrasan CRF (2007). Produção e caracterização do complexo Xilanolítico de

Penicillium janczewskii, 83pp. (Dissertação) Mestrado em Microbiológia Aplicada,,
UNESP, Rio Claro.
184
Micro-organismos de solos amazônicos com habilidade em degradar gasolina

obtida da Refinaria de Manaus (REMAN)
Oliveira F.R.1; Oliveira L.A.1
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA
E-mails: [email protected], [email protected]
Resumo
A contaminação ambiental por derivados do petróleo, como a gasolina, diesel, entre
outros, causa grande impacto ecológico e as técnicas para sua remediação têm recebido destaque
nas últimas décadas. O presente trabalho teve como objetivo testar isolados de rizobactérias com
habilidade em degradar gasolina. Foi utilizado o método de estriagem em placa, contendo meio
de cultura YMA modificado com 0,1 mL de gasolina como fonte de carbono. Em seguida foi
verificada a capacidade dos microrganismos em degradar e tolerar esse composto, avaliando seu
crescimento nas placas de Petri. Os resultados mostraram que os isolados testados são tolerantes
à presença de gasolina. Do total de 90 isolados bacterianos avaliados, 12 mostraram crescimento
máximo usando a gasolina como fonte de carbono (INPA_R561, R586, R589, R610, R614,
R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732). Os demais mostraram ser moderados ou
sensíveis ao cultivo contendo gasolina. Trata-se ainda de um trabalho inicial na busca de isolados
de Rizobactérias capazes de degradar a gasolina, visando utilizá-las no processo de
biorremediação de solos amazônicos contaminados.
Palavras-chave: Biorremediação, rizobactérias, tolerância à gasolina.
Introdução
O petróleo é um composto orgânico, formado por processos biogeoquímicos, constituído
em sua maior parte por uma mistura complexa de hidrocarbonetos. A contaminação ambiental
por esta substância e por seus derivados (gasolina, álcool, diesel, etc.) causa grande impacto
ecológico e as técnicas para sua remediação têm recebido destaque nas últimas décadas. A maior
185
parte dos compostos de petróleo é passível de biodegradação; no entanto, trata-se de um processo
lento, podendo levar décadas até a total descontaminação do ambiente.
A comercialização da gasolina tem como consequências negativas, a possibilidade de
derramamento nos solos e águas regionais. Não há ainda no Estado do Amazonas, estudos sobre
o impacto negativo da contaminação dos solos e rios por esse composto químico, bem como as
características da população microbiana tolerante e possivelmente responsável pelo processo de
biorremediação natural.
Os processos biológicos de descontaminação, enquadrados na categoria de
biorremediação, utilizam, geralmente, micro-organismos autóctones ou introduzidos com
capacidade de biodegradar parcial ou totalmente as substâncias contaminantes. A biorremediação
é uma tecnologia que utiliza micro-organismos para minimizar ou remover poluentes, assim
como os hidrocarbonetos dos compostos derivados do petróleo no ambiente sem afetar o
equilíbrio ecológico (Autry e Ellis, 1992; Desai e Banat, 1997).
Foi avaliada a capacidade de 90 isolados de rizobactérias em degradarem a gasolina
comercializada na região amazônica. Os resultados obtidos visam, portanto, indicar os micro-
organismos com maiores potenciais de degradação desse produto para serem utilizados no
processo de biorremediação de solos e/ou rios contaminados.
Material e Métodos
Os isolados de rizobactérias foram obtidos do banco de micro-organismos do LEBMAM
(Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Micro-organismos da Amazônia) no Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia /INPA. Cada isolado foi inoculado em placas de Petri
contendo meio de cultura YMA (Vincent, 1970) e incubados a 26,5º- 28º C até o crescimento das
colônias (por cerca de 3 dias) para posteriores estudos e análises com gasolina. O meio de cultivo
YMA é historicamente utilizado para o isolamento, purificação e crescimento de bactérias
indutoras de nódulos em leguminosas, genericamente denominadas de rizóbios. As bactérias
utilizadas foram isoladas dos nódulos de leguminosas coletados em diferentes localidades de
Manaus/AM e municípios circunvizinhos.
Para avaliar a capacidade de degradação da gasolina, foram testados 90 isolados de
rizobactérias por meio do método proposto por Oliveira e Magalhães (1999), realizado em placas
de Petri contendo meio de cultura YMA modificado, onde foi utilizado 0,1 mL de gasolina como
186
fonte de carbono ao invés de manitol. Como controle usou-se o meio com manitol e sem
gasolina, com todos os tratamentos realizados em quadruplicata. As avaliações foram feitas após
10 dias de crescimento à temperatura ambiente (± 26 ºC). O processo de avaliação consistiu na
atribuição de notas 1,00 (sem crescimento visível) a 4,00 (máximo crescimento). Foram também
atribuídas notas intermediárias, subdivididas em 0,25, ou seja, 1,00, 1,25, 1,50, 1,75, 2,00 até
4,00. Consideraram-se como os de melhores crescimentos, os que apresentaram notas médias
acima de 3,06.
Conforme o método proposto por Oliveira e Magalhães (1999), foi observado que todos
os isolados avaliados apresentaram crescimento no meio de cultura YMA modificado,
adicionado com 0,1 mL de gasolina (Figura 1 e Tabela 1).
Na figura 1 observa-se a nota 4 de crescimento bacteriano, identificada como bactéria
altamente tolerante ao cultivo adicionado de gasolina como fonte de carbono.
Meio Agar-Manitol Meio Agar-Gasolina
Figura 1. Crescimento máximo mostrado pela bactéria INPA_R586 cultivada em meio Agar-
Manitol e Agar-Gasolina por um período de 10 dias em temperatura ambiente.
Do total de 90 isolados bacterianos avaliados, 12 (~13%) foram bastante tolerantes e

usaram a gasolina como fonte de carbono, tendo em vista que apresentaram um crescimento alto
na presença de gasolina no meio sólido (nota acima de 3,06), sendo eles INPA_R561, R586,
R589, R610, R614, R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732. Dos demais isolados (cerca
de 90% do total), 41 mostraram crescimentos moderados (notas 2,06 - 3,00) e outros 37 foram
sensíveis (notas 1,00 - 2,00) ao cultivo contendo gasolina como fonte de carbono (Tabela 1).
187
Tabela 1 - Crescimento de rizobactérias em meio Agar-manitol (M) e Agar-gasolina (G) após 10
dias de incubação à temperatura ambiente. (Notas segundo Oliveira e Magalhães, 1999).
Isolados M G Isolados M G Isolados M G
INPA R007 1,3 1,3 INPA R571 2,0 2,0 INPA R621 3,8 3,4
188
De acordo com os dados da tabela 1, observa-se que para muitos isolados, não houve
diferença de crescimento nos dois meios utlizados (Agar-Manitol e Agar-Gasolina), sugerindo
que essas bactérias apresentam uma boa adaptação, ou seja, um crescimento satisfatório quando
utilizada a gasolina como fonte de carbono, sob as condições testadas, sendo que os melhores
isolados foram INPA_R586, R626, R652 e R732.
A gasolina é um dos principais produtos resultantes da destilação do petróleo, podendo
apresentar de 6-12 átomos de carbono em sua cadeia (Farias, 2008); trata-se de um composto
altamente complexo e que pode servir como fonte utilizável no metabolismo de determinados
micro-organismos. Esses podem ser utilizados como fontes de biorremediação, por meio do uso
de suas enzimas capazes de degradar essa substância presente em solos ou outros ambientes
contaminados.
Ecologicamente, micro-organismos degradadores de hidrocarbonetos são amplamente
distribuídos e as dificuldades encontradas para caracterizar comunidades microbianas de
ambientes impactados por esses compostos são agravadas pela grande quantidade de substratos
específicos e interações metabólicas possíveis (Wetler-Tonini et al., 2011). Tais micro-
organismos podem ser encontrados no próprio ambiente impactado, sendo na maioria das vezes,
os responsáveis pelo desaparecimento dos contaminantes e são capazes de degradar a maioria
desses compostos para suprir as suas necessidades energéticas e de crescimento, iniciando assim
o processo de biodegradação (Bernoth et al., 2000). Alguns trabalhos foram realizados utilizando
isolados de rizóbios na degradação de compostos derivados do petróleo (Lindström et al., 2003;
Poonthigpun et al., 2006; Coelho et al., 2010; Wen et al., 2011).
A grande motivação de pesquisas e estudos de biodegradação é, sem dúvida, a busca de
micro-organismos versáteis capazes de degradar, de maneira eficiente, uma grande variedade de
poluentes a baixo custo operacional, utilizando aqueles que não prejudiquem a vida existente nas
áreas contaminadas. Entre as rizobactérias de interesse, o gênero Rhizobium ou similares
apresenta características adequadas para ser utilizado num processo de biorremediação, pois
além de apresentar todas as características citadas, não são patogênicas, não prejudicando assim
o homem, a fauna e a flora existentes no meio ambiente.
Ttrata-se ainda de um trabalho inicial na busca de isolados de rizobactérias capazes de
degradar os derivados do petróleo, assim como a gasolina. Há, entretanto, necessidade de uma
busca de um maior número de isolados e testes mais aprofundados para avaliar a eficiência
189
enzimática dessas bactérias, como forma de indicar as mais aptas para serem utilizadas no
processo de biorremediação de solos amazônicos contaminados.
Conclusões
Do total de 90 isolados de rizobacterias, apenas doze mostraram-se altamente tolerantes
quando presentes no meio de cultivo Agar-Gasolina, dos demais isolados, 41 mostraram
crescimentos moderados (nota 2,06 - 3,00) e outros 37 sensíveis (1,00 - 2,00);
Doze isolados de rizobactérias (INPA_ R561, R586, R589, R610, R614, R620, R621,
R626, R630, R633, R652 e R732) mostraram crescimentos elevados usando a gasolina como
fonte de carbono e apresentam potencial para serem usadas futuramente em inoculantes visando
descontaminar solos contaminados com gasolina.
Alguns isolados mostraram pouco crescimento nos dois meios, indicando dificuldades de
usarem o manitol e a gasolina como fontes de carbono nas condições experimentais.
Referências
Autry A.R., Ellis G.M. (1992). Bioremediation: An effective remedial alternative for petroleum
hidrocarbon-contaminated soil. Environmental Progress, 11(4):318-323.
Bernoth L., Firth I., Mcallister P., Rhodes S. (2000). Biotechnologies for remediation and
pollution control in the mining industry. Miner. Metall. Proc., 17:105-111.
Coelho F.J.R.C., Sousa S., Santos L., Santos A.L., Almeida A., Gomes N.C.M., Cunha A.
(2010). PAH degrading bacteria in an estuarine system., Eds., N. Hamamura, S. Suzuki, S.
Mendo, C. M. Barroso, H. Iwata and S. Tanabe, Interdisciplinary Studies on Environmental
Chemistry — Biological Responses to Contaminants. p. 77–87.
Desai J.D., Banat I.M. (1997). Microbial production of surfactants and their commercial
potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 61(1):47-64.
Farias R.F. (2008). Introdução à química do Petróleo. Ciência Moderna, Rio de Janeiro, 1º Ed.,
106 p.
Lindström K., Jussila M.M., Hintsa H., Kaksonen A., Mokelke L., Mäkeläinen K., Pitkäjärvi J.,
Suominen L. (2003). Potential of the Galega – Rhizobium galegae System for Bioremediation of
Oil-Contaminated Soil. Food Technol. Biotechnol. 41(1):11–16.
Oliveira L.A., Magalhães H.P. (1999). Quantitative evaluation of acidity tolerance of root nodule
bacteria. Revista de Microbiologia, 30:203-208.
190
Poonthrigpun S., Pattaragulwanit K., Thanyanuch S., Juntongjin K.K., Thaniyavarn S., Petsom
A., Pinphanicharkarn P. (2006). Novel Intermediates of Acenaphthylene Degradation by
Rhizobium sp. Strain CU-A1: Evidence for Naphthalene-1,8-Dicarboxylic Acid Metabolism.
Applied and Environmental Microbiology, 72(9):6034–6039.
Vincent J.M. (1970). A manual for practical study of root nodule bacteria. IBP Handbook N. 15.
Blackwell Scient. Publ. 140p.
Wen Y., Zhang J., Yan Q., Li S., Hong Q. (2011). Rhizobium phenanthrenilyticum sp. nov., a
novel phenanthrene-degrading bacterium isolated from a petroleum residue treatment system. J.
Gen. Appl. Microbiol., 57:319‒329.
Wetler-Tonini R.M.C., Rezende C.E., Gravitol A.D. (2011). Biodegradação Bacteriana de

Petróleo e seus derivados. Revista Virtual Química. 3(2):78-87.
191
Espécies de bactérias associadas a larvas de Anopheles darlingi Root,

1926, em seu ambiente aquático.
Oliveira M.R.1, Gama A.M2., Katak R.1, Matos E.2, Terenius O.3, Marinotti O.4, Tadei,
W.P.5, Souza A.Q.L.2
1
Universidade Estadual do Amazonas (UEA), 2 Universidade Federal do Amazonas (UFAM
3
Swedish University of Agricultural Sciences (SLU), 4 University of California, Irvine (UCI),
[email protected], 5 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA),.
E-mail: [email protected] ; [email protected]
Resumo
A malária é uma doença parasitária responsável por milhares de mortes no

mundo. No Brasil o principal vetor da malária é o Anopheles darlingi. Este vetor
encontra-se associados a uma diversidade de micro-organismos, dentre os quais se
destacam as bactérias, que têm se tornado parte integrante dos programas de controle de
vetores. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi identificar isolados bacterianos
associados a larvas de A. darlingi em seu ambiente aquático, no estado do Amazonas.
Foram coletadas amostras de água dos criadouros naturais de A. darlingi no estado de
Amazonas. As bactérias foram isoladas a partir dessas amostras, em seguida foram
realizadas as extrações de DNA e identificação por meio da amplificação e
sequenciamento do rDNA. Foram identificadas nove espécies bacterianas, pertencentes
a três filos, sete famílias e nove gêneros diferentes. Sequencias de seis isolados não
foram encontradas no NCBI. Desta forma demonstrou-se que o habitat aquático das
larvas de A. darlingi abrigam uma rica diversidade bacteriana.
Palavras chaves: Anopheles darlingi, Malária, Microbiota Bacteriana.
Introdução
A malária é uma doença infecciosa, considerada como um dos mais graves

problemas de saúde pública do mundo, sendo estimados cerca de 250 milhões de casos
anualmente em mais de 109 países (WHO, 2009), sobretudo nos países em
192
desenvolvimento e sub-desenvolvidos. Sua transmissão é dada pela picada de
mosquitos do gênero Anopheles Meigen, 1818. Sendo o A. darlingi Root, 1926, o seu
principal vetor na região Amazônica, onde ocorrem a maioria dos casos no Brasil (Tadei
et al., 1998).
Considerando-se o desafio de longo prazo da erradicação da malária, é essencial
aumentar o conhecimento sobre a ecologia, biologia e o comportamento de seus vetores
(Hiwat e Bretas, 2011) em especial na sua fase imatura. Sabe-se que várias espécies de
larvas de mosquitos se alimentam de partículas orgânicas suspensas na água e de micro-
organismos, principalmente bactérias (Forattini, 1996), sendo essas muitas vezes sua
única fonte de alimento (Merritt et al., 1992). Várias espécies bacterianas têm sido
identificadas no intestino de mosquitos adultos através de diferentes técnicas mediadas
por cultura convencional (Iturbe-Ormaetxe et al., 2011) e estas foram adquiridas a partir
do seu ambiente aquático, durante o desenvolvimento larval. Entretanto, vale ressaltar
que estudos sobre a biodiversidade microbiana associada ao ambiente aquático desses
insetos vetores permanecem escassos.
Portanto, pesquisas que buscam conhecer a microbiota associada a insetos
vetores, são de grande relevância para implementação de políticas com estratégias mais
eficazes de controle da malária no mundo. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi
identificar isolados bacterianos associados ao ambiente aquático de larvas de A. darlingi
no estado do Amazonas.
Material e Método
A coleta do material foi realizada no lago do Puraquequara (S 03° 03. 230' W

059° 53. 533') no município de Manaus-AM, de onde foram coletadas amostras de água
de quatro pontos equidistantes (cinco metros cada um). As amostras foram recolhidas de
criadouros específicos de A. darlingi, previamente identificados pela Vigilância
Epidemiológica da Secretaria Municipal de Saúde. Em tubos Falcon de 50 mL estéreis
foram recolhidas amostras de água da superfície e mantidas a 4 0C até a chegada ao
laboratório de Genética, da Escola Superior de Ciências da Saúde da Universidade do
Estado do Amazonas- ESA/UEA.
Para cada amostra adquirida foram espalhados 100 µL em placas de Petri com
meio de cultura Luria-Bertani (LB) e Agar Nutriente (NA) contendo de 100 µg/mL de
fluconazol. As placas foram incubadas a 18, 26 e 40o C por oito dias, a partir de 24 h
193
iniciou-se o isolamento das colônias pela técnica do esgotamento por estrias cruzadas
em seguida a realização da técnica de coloração de Gram.
Posteriormente foi realizada a identificação molecular com as seguintes etapas:
lise celular por choque térmico, descrito por Stemmer (1994) com modificações para
obtenção do DNA molde, em seguida realizou-se a amplificação do gene 16S do rDNA
com os iniciadores: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) e 1100R (5’-
AGGGTTGCGCTCGTT-3’) (White et al., 1990), utilizando o protocolo de PCR
descrito por Boichenko et al, (2000), a verificação da PCR foi feita através de
eletroforese em gel de agarose 1 % coradas com GelRed®, após a corrida o gel foi
fotodocumentado em transluminador de luz UV.
Os fragmentos de rDNA amplificados na reação de PCR, foram purificados
utilizando a enzima ExoSAP®(Invitrogen) de acordo com as recomendações do
fabricante. Uma alíquota do DNA purificado foi usado para as reações de
sequenciamento, com o kit de sequenciamento BidDye Terminator V 3.1. (Life
Technologies) e 0,5 µM do mesmo oligonucleotídeo foi utilizado para a reação de
sequenciamento no sequenciador 3.500 da Applied Biosystems. A identificação das
bactérias foi feita através da comparação das sequências de nucleotídeos obtidas com as
depositadas no banco de dados do NCBI (http://www.ncbi.nih.gov) a fim de comparar
as sequências das amostras deste trabalho com as depositadas no GenBank. A partir de
todas as 19 sequencias 16S rRNA obtidas neste estudo, realizou-se a construção do
dendograma utilizando o programa MEGA, versão 4 (Tamura et al., 2007). O
alinhamento das sequencias foi feita pelo programa Clustral W e o dendograma foi
gerado pelo método Neighbor-Joining, com Bootstrap de 1000.
Resultados
A partir das quatros amostras de água coletadas do criadouro do A. darlingi,

foram isolados 180 bactérias, destas foram selecionadas 19 diferentes tipos com
características morfológicas bem distintas (representando a diversidade encontrada),
para a realização do sequenciamento do gene 16S rRNA. Por meio das análises de
bioinformática das sequencias obtidas foram identificadas nove espécies bacterianas
(Aeromonas jandaei, Bacillus pumilus, Bacillus sp, Brevibacterium, Chromobacterium,
Klebsiella pneumoniae, Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum,
Pseudomonas sp e Serratia marcescens e de seis amostras não foram possíveis realizar
194
a identificação taxonômica, uma vez que as sequencias obtidas não foram encontradas
nos bancos de dados do NCBI sendo consideradas como organismos incultos.
Foram identificados um total de três filos (Actinobactérias, Proteobacteria e
Firmicutes), sete famílias (Aeromonadaceae, Bacillaceae, Brevibacteriaceae
epidermidis, Enterobacteriaceae, Moraxellaceae, Neisseriaceae e Pseudomonadaceae)
e nove gêneros (Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Brevibacterium,
Chromobacterium, Klebsiella, Pectobacterium, Pseudomonas e Serratia).
O Dendograma com todas as 19 sequencias 16S rRNA obtidas, mostra a grande
diversidade das diferentes espécies bacterianas encontradas nesta pesquisa (Figura 1).
Figura 1 - Dendograma resultante da análise Bayesiana com sequências do

marcador 16S do rDNA sequenciadas neste estudo.
Discussão
As análises dos dados demonstraram que as diferentes espécies bacterianas

encontradas no habitat natural das larvas dos mosquitos estão intimamente ligadas a
diferentes estágios de vida do gênero Anopheles, como descritos por diversos autores.
Os gêneros Bacillus, Serratia e Pseudomonas foram encontrados no intestino médio de
diferentes vetores da malária no mundo, tais como A. arabiensis em estudo realizado na
195
Zâmbia (Cirimotich et al., 2011), A. stephensi na Índia (Rani et al., 2009) além do A.
gambiae (Lindh et al., 2005). A família com maior predominância neste trabalho foi a
Enterobacteriaceae que segundo Cirimotich et al. (2011) e Pumpuni et al. (1993) são
capazes de inibir o desenvolvimento de espécies Plasmodium no intestino médio do A.
albimanus e A. stephensi.
Dos três filos encontrados destaca-se o filo Firmicutes que apresentam espécies
de Bacillus que tem alto potencial como agentes de controle biológico de diferentes
populações de mosquitos (Minard et al., 2013; Geetha et al., 2010).
As sequencias 16S do rRNA de cinco bactérias não identificadas nos bancos de
dados do NCBI potencialmente são novas espécies ainda não descritas, uma vez que as
mesmas foram isoladas de amostras amazônicas, que apresenta uma das maiores
biodiversidade do planeta e poucos são os estudos com essa ênfase na região.
Ressaltando que ainda permanecem escassos os dados sobre a microbiota bacteriana e
seus potenciais genéticos relacionados ao habitat naturais dos Anofelinos em seus
diferentes estágios de vida.
Conclusão
Foram identificadas nove espécies bacterianas, pertencentes a três filos, sete

famílias e nove gêneros diferentes. As sequências de seis isolados não foram
encontradas no NCBI. Desta forma, conclui-se que os isolados bacterianos presente no
ambiente aquático das larvas de A. darlingi apresentam uma rica diversidade.
Referências
Boichenko LV, Boichenko DMV, Vinokurrova NG (2000) Use of Polymerase Chainn

Reaction fFor Searching fFor Produtos Of Ergot Alkaloids From Amoung Fungi.
Microbiology 70(12):360-368.
Cirimotich CM, Dong Y, Clayton AM, Sandiford AL, Souza-Neto JA, Mulenga M,
Dimopoulos, G (2011) Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium
infection in Anopheles gambiae. Science 322: 855-858.
Forattini OP (2002) Culicidologia Médica, v. 2: Identificação, Biologia, Epidemiologia.

São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo.
Forattini OP (1996) Culicidologia Médica: Identificação, Biologia, Epidemiologia. Ed.

EDUSP.
196
Geetha I, Manonmani AM, Paily KP (2010) Identification and characterization of a
mosquito pupicidal metabolite of a Bacillus subtilis subsp. subtilis strain. Appl
Microbiol Biotechnology 86:1737-1744.
Hiwat H, Bretas G (2011) Ecologia de Anopheles darlingi Root em Relação ao Vetor

Importância: uma revisão. Parasitas e Vetores 4:145-154.
Iturbe-Ormaetxe I, Walker T, O’ Neill SL (2011) Wolbachia and the Biological Control

of Mosquito-Borne Disease. EMBO Reports 12(6):508–518.
Lindh JM, Terenius O, Faye I (2005) 16S rRNA Gene-Based Identification of Midgut
Bacteria from Field-Caught Anopheles gambiae Sensu Lato and A. funestus Mosquitoes
Reveals New Species Related to Known Insect Symbionts. Appl Environ Microbiol
71:7217-7223.
Mcmeniman CJ, Lane RV, Cass BN, Fong AWC, Sidhu M, Wang YF, O'Neill SC
(2009) Stable Introduction of a Life-Shortening Wolbachia Infection Into the Mosquito
Aedes aegypti. Science 323(5920):141-144.
Merritt RW, Dadd RH, Walker ED (1992) Feeding Behavior, Natural Food, and
Nutritional Relationships of Larval Mosquitoes. Annu Rev Entomol.37:349-76.
Minard G, Mavingui P, Moro CV (2013) Diversidade e Função da Microbiota

Bacteriana no Holobiont Mosquito. Parasitas e Vetores 6:146-158.
Pumpuni CB, Beier MS, Nataro JP, Guers LD, Davis JR (1993) Plasmodium
falciparum: inhibition of sporogonic development in Anopheles stephensi by
gramnegative bacteria. Exp Parasitol 77(2):195-199.
Rani A, Sharma A, Rajagopal R, Adak T, Bhatnagar RK (2009) Bacterial diversity

analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-
independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi- an Asian
malarial vector. BMC Microbiol 9:96-118.
Sambrook J, Fritschi EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Stemmer WPC (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature
370(6488):389-391.
Tadei WP, Thatcher BD, Santos JM, Scarpassa VM, Rodrigues IB, Rafael MS (1998)
Ecologic observations on anopheline vectors of malaria in the brasilian Amazon.Am J
Trop Med Hyg 59(2):325-35
197
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0. Mol. Biol. Evol 24(8):1596–1599.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylon J (1990) Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and
applications 18:315-322.
World Health Organization (WHO) (2009) World malaria report 2009. In, World
Health Organization. 78p.
198
Atividades celulolíticas, proteolíticas e ureolíticas de rizóbios

provenientes de solos amazônicos.
Peixoto J VO 3, Minelli- Oliveira C2, Brito L L2, Oliveira L A1

1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia -INPA, Manaus -AM, 2 PPG Biotecnologia,
Universidade Federal do Amazonas UFAM, Manaus, AM 3 Universidade Estadual do
Amazonas UEA, Manaus, AM.
E-mail [email protected], ([email protected],[email protected]
[email protected].
Resumo
A associação rizóbios com leguminosa contribui para enriquecer o solo com

nitrogênio por meio da fixação biológica. Entretanto, pouco se conhece a respeito do
perfil enzimático desses microrganismos. Nesse contexto, a presente investigação
propôs avaliar a produção de enzimas por isolados de rizóbios nativos da Amazônia.
Essa triagem constitui o primeiro passo na seleção de micro-organismos nativos que são
potencialmente exploráveis como produtores de enzimas. Foram testados 20 isolados
nativos de rizóbios para as atividades celulolítica, proteolítica e ureolítica em meio
YMA modificado. Dos 20 isolados de rizóbios da coleção do INPA testados, 15 se
mostraram promissores nas atividades enzimáticas em meio contendo caseína como
fonte de carbono, 10 em meio contendo celulose e 10 em meio contendo ureia. Foram
observados isolados que atingiram crescimentos elevados nos meios com caseína e
celulose até o 9º dia, mas foi observado que os rizóbios inoculados no meio de ureia
necessitaram de 15 dias para que seu crescimento fosse completo.
Palavras-chave: Carboximetilcelulase, protease, urease
Introdução
Os micróbios são organismos muito pequenos que em geral podem ser
visualizados com o uso de microscópio (Tortora et al., 2012). Estes são de extrema
importância ecológica na manutenção do equilíbrio do ambiente pela reciclagem dos
elementos químicos entre o solo, os organismos e a atmosfera e são utilizados em
aplicações comerciais e industriais para produzir alimentos, químicos, tratamento de
detritos, controle de pestes e limpeza de poluentes.
Os micro-organismos têm um imenso potencial de degradação de material
orgânico, produzindo um “pool” de enzimas, o qual tem sido explorado comercialmente
ao longo dos anos (Jayani et al., 2005). As enzimas de origem microbiana possuem
199
menor custo de produção do que as de origem animal e vegetal, podem ser produzidas
em larga escala em fermentadores industriais e oferecem um amplo espectro de
características físico-químicas.
A identificação de novas fontes microbianas é de grande interesse estratégico,
pois garantem o suprimento de enzimas aos mais variados processos industriais. Os
resíduos lignocelulósicos vêm sendo utilizados em processos biotecnológicos devido a
aspectos econômicos, ambientais e à farta disponibilidade. Uma de suas aplicações é a
produção de enzimas celulolíticas para a obtenção de açúcares fermentescíveis,
utilizados na geração do bioetanol de segunda geração e servindo como fonte de energia
renovável (Dashtban et al., 2010).
Oliveira et al. (2006), ao estudarem a capacidade de rizóbios nativos da
Amazônia em produzir enzimas hidrolíticas, reportaram a atividade amilolítica como a
mais frequente. Porém, não se pode negligenciar as potencialidades de uso dessas
bactérias como fontes de outras enzimas de reconhecido valor industrial, caso das
lipases, pectinases e proteases (Van Beilen, 2002; Kirk et al., 2013). O presente estudo
objetivou avaliar em meios de cultura solidificados, as atividades celulolíticas,
proteolíticas e ureolíticas de rizóbios nativos da Amazônia.
Material e Métodos
Obtenções das amostras
Foram testados 20 isolados de rizóbios obtidos da Coleção de Micro-
organismos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Ecologia e
Biotecnologia de Micro-organismos do INPA.
Avaliações dos isolados capazes de usar caseína, celulose e ureia como fontes de
carbono.
Para esta avaliação, foi usado o meio de cultura YMA (Vincent, 1970)
modificado, onde se substituiu o manitol por carboximetilcelulose, caseína ou ureia
como fontes de carbono. Foram feitas três repetições de cada meio para cada isolado.
A avaliação de crescimento foi feita pelo método de Oliveira e Magalhães
(1999). Tal método leva a um processo de diluição do micro-organismo, onde a zona 1 é
a de maior concentração e a zona 4, a mais diluída (Figura 1). De acordo com o
crescimento de cada rizóbio, foram atribuídos valores variando de 1,00 (sem
200
crescimento visível na zona 1) a 4,00 (máximo crescimento na zona 4), podendo ter
valores intermediários entre esses extremos (Figura 2 e Tabela 1). As placas foram
mantidas em condições de laboratório com 28±2 °C de temperatura. As avaliações
foram realizadas a cada três dias, até os 15 dias.
Zona 2
Zona 1. Uma linha. Riscagem
Zona 3 de uma alça de platina diversas
vezes em ambas as direções
indicadas pela seta. A alça
deve ser esterilizada para cada
Zona 1 zona de riscagem.
Zona 2. Quatro linhas de

riscagem , usando-se um risco
por linha, na direção indicada
pela seta.
Zonas 3 e 4. Semelhante zona 2.
Zona 4
Figura 1. Método de avaliação do crescimento bacteriano segundo Oliveira e Magalhães

(1999).
Figura 2. Pontuações (notas) aplicadas para o crescimento das bactérias segundo

Oliveira e Magalhães (1999).
Tabela 1- Faixas de pontuação para avaliação do crescimento das bactérias.

GRAU DE CRESCIMENTO FAIXA DE
PONTUAÇÃO
Baixo 1,00 – 2,00
Médio 2,06* - 3,00
Alto 3,06** - 4,00
* Três repetições com nota 2,0 e uma com 2,25. ** Três repetições com nota 3,0 e uma
com 3,25 (Oliveira e Magalhães, 1999).
201
Avaliações do potencial de degradação de caseína, celulose e ureia.
Atividade proteolítica
A habilidade das bactérias em hidrolisar proteínas foi testada em meio YMA
modificado contendo 10 g de caseína como substituto do manitol como fonte de
carbono em pH 5,5.
Atividade celulolítica
A produção de celulase foi detectada, adicionando-se ao meio YMA modificado,

10g de carboxilmetilcelulose em substituição ao manitol, com pH 5,5. Avaliou-se a
atividade por sete dias a 28º C.
Atividade ureolítica
A atividade ureolítica foi avaliada pela metodologia proposta por Christensen
(1946), modificada com substituição da solução de ureia a 40% por 20g/L de ureia.
Além da ureia, a composição do meio em g/L foi: 1,0g de glicose, 1,0 de peptona,
15gde agar em pH 6,8. A atividade dos micro-organismos produtores de urease foi
constatada após quinze dias de incubação.
Resultados de Discussão
Avaliações dos isolados de rizóbios
Os rizóbios apresentam alta diversidade genética e conseguem se adaptar a
diferentes condições de solos, podendo se desenvolver nas rizosferas de leguminosas,
onde induzem a formação de nódulos, como também, nos de não leguminosas ou
leguminosas não compatíveis, onde, apesar de não induzirem nodulação, conseguem se
multiplicar em grandes números. Na ausência de plantas na área de solo, podem
apresentar habilidade saprofítica elevada, usando matéria orgânica como fonte de
carbono (Zilli et al., 2013).
A Tabela 2 mostra os melhores isolados quanto ao crescimento em meio de
cultura contendo carboximetilcelulose em decorrência da atividade celulolítica, que
apresentaram pontuações superiores a 3,0 até o nono dia de crescimento. Desses, os que
202
apresentaram melhores crescimentos foram os identificados como INPA R577, R549,
R547, R562, R561, R955 e R618, por já apresentarem máximo crescimento (pontuação
de 4,0) já na primeira avaliação, aos 3 dias. Segundo Oliveira e Magalhães (1999), os
que crescem mais rápidos são os que adaptam ao meio de cultura testado.
Tabela 2. Crescimento dos isolados de rizóbios em meio contendo carboximetilcelulose

como fonte de carbono.
Isolados de rizóbios Dia de incubação

(INPA) 3 6 9 12 15
R577 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
R549 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
R547 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
R562 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
R561 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
R615 1,50 3,06 4,00 4,00 4,00
R556 1,50 1,00 2,50 3,00 4,00
R955 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
R618 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Com relação aos rizóbios produtores de proteases (Tabela 3), também observou-
se que dos 20 testados, 15 mostraram crescimentos elevados como indicativo da
produção dessa enzima. Todos, exceto o isolado INPA R577, cresceram aos 3 dias de
incubação, mostrando que nesse meio de cultura é ótimo para esses rizobios.
Tabela 3. Crescimento dos isolados de rizóbios em meio contendo caseína como fonte
de carbono.
Isolados de rizóbios Dias de incubação

(INPA) 3 6 9 12 15
R577 1,0 2,5 3,0 4,0 4,0
R955 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R942 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R957 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R954 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R620 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R605 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R598 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R612 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R586 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R558 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R618 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
203
Quanto á atividade ureolítica, 10 dos 20 isolados mostraram-se superiores aos
demais (Tabela 4). Desses, o melhor foi o isolado INPA R553 que apresentou
crescimento máximo já aos 3 dias de incubação.
Tabela 4. Crescimento dos isolados de rizóbios em meio contendo ureia como fonte de
carbono.
Isolados de rizóbios Dias de incubação

(CMINPA) 3 6 9 12 15
R610 1,0 2,0 3,0 4,0 4,0
R592 1,5 2,5 3,0 4,0 4,0
R581 1,0 2,0 3,0 4,0 4,0
R942 0,5 1,0 2,5 3,0 4,0
R958 0,0 0,5 1,0 2,5 3,0
R548 0,0 0,5 1,5 3,0 4,0
R593 1,0 2,0 3,0 4,0 4,0
R553 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
R606 0,0 0,5 1,0 2,5 3,0
Conclusões
Dos 20 isolados de rizóbios da coleção do INPA testados, 10 mostraram-se

promissores como produtores de celulases, 15 como produtores de proteases e 10 como
produtores de ureases.
Os rizóbios inoculados no meio com ureia necessitaram de 15 dias para
completar o crescimento.
Este estudo revelou alguns isolados de rizóbios nativos da Amazônia como
fontes promissoras de enzimas de importância industrial para uso biotecnológico.
Agradecimentos
Agências de Fomento: CNPq e FAPEAM pelo apoio financeiro e bolsas.
Referências
Christensen WB (1946) Urea decomposition as means of differentiating Proteus and

Paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella types. J. Bact.,
52:461-466.
204
Dashtban M, Maki M, Leung KT, Mao C, Qin W (2010) Cellulase activities in biomass
conversion: measurement methods and comparison. Critical Review in Biotechnology,
30(4):302-309.
Jayani RS, Saxena S, Gupta R (2005) Microbial pectinolytical enzymes: a review.

Process Biochem., 40:2931– 2944.
Kirk O, Borchert TV, Fuglsang CC (2002) Industrial enzyme applications. Currente

Opinion in Biotechnology, 13(4):345-351.
Oliveira LA, Magalhães HP (1999) Quantitative evaluation of acidity tolerance of root

nodule bacteria. Revista de Microbiologia, 30:203-208.
Oliveira NA, Oliveira LA, Andrade JS, Chagas Júnior AF (2006) Enzimas hidrolíticas
extracelulares de isolados de rizóbia nativos da Amazônia Central, Amazonas, Brasil.
Ciênc. Tecnol. Aliment., 26:853-860.
Tortora GJ, Funke BR, Case CL (2012) Microbiologia. Tradução: Aristóbolo Mendes
da Silva et al. Revisão: Flávio Guimarães da Fonseca. 10 ed. Porto Alegre; Atmed.
Van Beilen JB (2002) Enzyme technology: an overview. Current Opinion in

Biotechnology, 14(4):338-344.
Vincent JM (1970) A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria. Oxford:
Blackwell Scientific Publications (International Biology Program Handbook, 15.
London), 164 p.
Zilli JÉ, Pereira GMD, França JI, Silva K, Hungria M, Rouws JRC (2013). Dinâmica de
rizóbios em solo do cerrado de Roraima durante o período de estiagem. Acta
Amazonica, 43:153-160. DOI: 10.1590/ S0044-59672013000200004
205
Caracterização morfológica de bactérias isoladas do habitat de larvas

de Anopheles darlingi Root. 1926 do município de Coari, AM
Rocha EM1, Katak RM2, Oliveira MR1, Gama AM1, Souza AQL2, Tadei WP3
1
Universidade do Estado do Amazonas – UEA, Manaus, AM, 2Universidade Federal do
Amazonas – UFAM, Manaus, AM, 3Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA,
Manaus, AM. Email: [email protected]
Resumo
A diversidade microbiana associada com larvas de insetos vetores de doenças é

fundamental para um bom funcionamento do habitat, pois estão relacionados com
alimentação, desenvolvimento e reprodução desses insetos. Conhecer a microbiota
associadas às larvas de mosquitos é importante, considerando que dependendo de suas
funções, esses seres microscópicos podem até serem utilizados para o controle de
insetos vetores de doenças, como a malária que na região amazônica é transmitida,
principalmente, pelo mosquito Anopheles darlingi Root, 1926. Este inseto se procria em
lagos situados, principalmente perto de áreas Peri-urbanas. Este trabalho teve por
objetivo isolar e caracterizar morfologicamente bactérias associadas ao habitat larval de
A. darlingi do Município de Coari no Estado do Amazonas. Foram obtidas 84 colônias
isoladas de amostras de água, as quais foram caracterizadas de acordo com as formas,
cor, textura, Gram positivas e negativas. A diversidade encontrada corresponde a 32
possíveis gêneros, entre bacilos Gram- com sete representantes, bacilos Gram+ com
quatro, cocos Gram- com dezesseis e cocos Gram+ com 5 representantes.
Palavras-chave: Bioprospecção, malária, microbiota aquática.
Introdução
A malária é uma doença infecciosa, causada por protozoários do gênero

Plasmodium Machiafava e Celli, 1983, transmitida ao homem pela picada da fêmea
contaminada do mosquito Anopheles Meigen, 1818, considerado vetor nessas
206
condições. A espécie de vetor mais prevalente na região Amazônica é A. darlingi Root,
1926 (OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2010).
A malária é uma doença que causa grandes impactos negativos à saúde pública e
à economia, em suas áreas de ocorrência. De acordo com o relatório mundial da malária
da Organização Mundial da Saúde, em 2013 cerca de 3,3 bilhões de pessoas vivem em
áreas de risco, situadas em regiões tropicais do planeta. Estima-se que 198 milhões de
casos de malária ocorreram no mundo com um número de 584.000 óbitos e que essa
enfermidade prevalece em 104 países, dos quais 35 estão no Continente Africano, que
apresenta o maior número de casos correspondendo 90% de todas as mortes por malária
no mundo, sendo que as crianças com idade menores de 5 anos representam 78% de
desse total (WHO, 2014).
Na Amazônia, as condições tropicais e o ciclo hidrológico da região favorecem a

formação de inúmeros criadouros propiciando a proliferação de mosquitos. Em
decorrência das alterações ocasionadas por estes fatores ambientais, o aumento na
densidade populacional dos vetores provoca a disseminação da malária, por toda a
região (TADEI et al., 2010). Além disso, outros fatores que contribuem sobre maneira
para os altos índices de malária na região tais como o limitado número de estratégias de
controle disponíveis, as condições ambientais que favorecem a proliferação do vetor,
suporte técnico limitado na implementação das ações de controle, a presença e a
densidade de vetores, áreas que apresentam vetores com resistência aos inseticidas,
dentre outros, Neste sentido, novos métodos de combate à doença são urgentemente
necessários (RIEHLE et al., 2007).
Nos últimos anos, vários experimentos realizados validaram a ideia de que
microrganismos presentes em mosquitos vetores da malária podem ser geneticamente
modificados, para inibirem o desenvolvimento do plasmódio e tornarem os vetores
refratários à transmissão da malária (SMITH et al., 2013). Porém, a microbiota
bacteriana do habitat larval dos vetores da malária é pouco conhecida, como também
não existem estudos sobre a diversidade bacteriana para o nicho destes vetores (LINDH
et al., 2005).
O isolamento de bactérias presentes no habitat aquático de larvas de A. darlingi
possibilitará identificar espécies simbiontes do inseto disseminador da malária na região
amazônica. O primeiro passo é isolar e caracterizar bioquimicamente estas espécies,
207
neste contexto, este trabalho teve por objetivo isolar e caracterizar morfologicamente
bactérias associadas ao habitat larval de A. darlingi do Município de Coari-AM.
Metodologia
As amostras de água foram coletadas no município de Coari no Estado do

Amazonas, tendo em vista que é uma área de registros de casos de malária pelo SIVEP
malária do Ministério da Saúde nos últimos anos. Foi selecionado um lago que
apresenta alto índice de procriação larval de A. darlingi, sendo estabelecidos quatro
pontos de coletas no lago. Foi utilizado um tubo falcon esterilizado para coletar 50 mL
de água em cada ponto. Após a coleta, as amostras foram transportadas em caixas de
isopor com gelo para o laboratório de controle biológico e biotecnologia da dengue e
malária do INPA em Manaus-AM, onde foram feitos os devidos procedimentos.
Para este trabalho apenas o ponto 1 do lago de Coari foi analisado. Os meios de
cultivo utilizados para o isolamento bacteriano foram: Nutriente Agar (NA), Lúria
Bertani (LB) e Agar Tripitona de Soja (TSA). Para cada meio de cultivo foram
preparadas 3 placas de Petri acrescido de 20 mg/mL de fluconazol e adicionado 50 µL
da amostra e mais 3 placas controle. Em seguida, as placas de Petri foram etiquetadas
com informações sobre a origem e armazenadas em uma estufa incubadora B.O.D a
26,4°C. Após 24 horas de crescimento foi feita a seleção das colônias presentes nas
placas para o isolamento das bactérias. Para o isolamento da bacteria utilizou-se a
técnica do esgotamento por estrias cruzadas a partir de uma única colônia. Após o
isolamento, as bactérias foram purificadas pela mesma técnica de esgotamento com
auxílio de uma alça de platina embebida em álcool 70% e flambada em chama no bico
de Bunsen. Foram utilizados meios de cultivo apropriado para cada tipo de isolamento.
Em seguida, as placas de Petri foram colocadas na B.O.D por 24 horas, para o
crescimento bacteriano. Após o isolamento foi feito a caracterização morfológica,
determinação da coloração de Gram e a contagem do número total de cada isolado
obtido. As bactérias foram preservadas nos seus respectivos meios de cultivo na forma
líquida com a adição de glicerol a 20% e estocadas em freezer a –20 ºC. Os isolados
encontram-se preservados no Laboratório de controle biológico e biotecnologia da
dengue e malária do INPA em Manaus-AM e onde foi feitas as análises moleculares.
208
Resultados
Um total de 26 colônias foi isolado em meio de cultivo, sendo que estas foram
agrupadas de acordo com a semelhança morfológica e coloração de Gram em 10
possíveis gêneros bacterianos codificados de G1 a G10. O grupo de G1, G10 e G4
apresenta o maior número de isolados com sete, quatro e três respectivamente, enquanto
aos outros grupos G2, G5, G7, G8 e G9 apresentaram dois isolados e G3 e G6 com
apenas um isolado para cada um.
Um total de 29 isolado foi obtido em meio de cultivo LB sendo que os isolados
foram agrupados de acordo com suas semelhanças morfológicas e coloração de Gram
em 9 possíveis gêneros bacterianos (G1 a G9). Os grupos G2, G5, G6 apresentaram
quatro isolados para cada grupo. Enquanto que G4 é composto de cinco isolados, e os
grupos G1 e G3 com três isolados cada um, e os demais G7, G8 e G9 com dois isolados
para cada grupo.
Em meio de cultivo TSA, houve crescimento de 29 isolados, que foram
agrupados em 13 possíveis gêneros bacterianos (G1 a G13). Destes, G3 e G9
representados com o maior número de isolados cada um com cinco. Enquanto que G1,
G2 e G6, estão representados com três isolados cada. Os grupos G5, G7 e G11 também
com dois isolados cada e os demais grupos G4, G8, G10 e G12 representados cada um
com um único isolado.
A diversidade encontrada corresponde 84 isoladas bacterianos obtido de
amostras de água, que foi caracterizado morfologicamente em 32 possíveis gêneros,
entre bacilos Gram - com sete representantes, bacilos Gram + com quatro isolados,
cocos Gram – com dezesseis isolados e cocos Gram + com 5 isolados. Estes isolados
serão identificados por métodos moleculares, além de ser feita análises estatísticas para
determinação das espécies simbiontes de A. darlingi.
Discussão
Recentes estudos têm sido realizados para investigar as espécies bacterianas

associadas a mosquitos do gênero Anopheles, a fim de entender as relações entre ambos
e utilizar estas bactérias como alternativas de controle, por meio de novas técnicas
desenvolvidas com aplicação de engenharia genética e biologia molecular, visando
elucidar como as comunidades bacterianas podem estar associadas ao inseto no
209
processo imunológicos à infecções ocasionadas por protozoários do gênero Plasmodium
que são os agentes etiológicos da malária (BOISSIÈRE, 2012; CHAVSHIN, et al.,
2012; NGO, et al 2015; RANI, et al 2009).
No trabalho de Ngo, et al (2015) amostras de mosquitos adultos do gênero
Anopheles capturados no Vietnam mostra um número expressivo de bactérias
associadas. Apesar das bactérias serem de amostras diferentes, tanto as obtidas por estes
autores como as isoladas nesta pesquisa, indica que não se pode descartar a hipótese de
que a maior parte de bactérias, encontradas no intestino médio de adultos, é oriunda dos
habitats aquáticos em que se desenvolvem as larvas do inseto (BOISSIÈRE, 2012).
Em outro estudo realizado por Costa (2012) com bactérias associadas a esponjas
isoladas da água no município de Manaus, as características morfológicas das bactérias
são semelhantes as das isoladas no presente trabalho. Embora a microbiota bacteriana
tenha sido isolada de organismos diferentes, no entanto o ecossistema aquático é da
região Amazônica. No entanto, estudos da microbiota aquática associadas a larvas de
insetos vetores de doenças na região Amazônica ainda são escassos na literatura.
Conclusão
Um total de 84 isolados bacterianos foi obtido de amostras de água no município

de Coari, AM. A diversidade encontrada corresponde a 32 possíveis gêneros, entre
bacilos Gram- com sete representantes, bacilos Gram+ com quatro, cocos Gram- com
dezesseis e cocos Gram+ com 5 representantes.
BOISSIÈRE A, TCHIOFFO M. T, BACHAR D, ABATE L, MARIE A. Midgut

Microbiota of the Malaria Mosquito Vector Anopheles gambiae and Interactions with
Plasmodium falciparum Infection. PLoS Pathog 8(5): e 1002742.
doi:10.1371/journal.ppat.1002742, 2012.
CHAVSHIN, A.R; OSHAGHI MA, V.H; POURMAND, M.R; RAEISI A, E.A.A;

MARDANI N, G.S. Identification of Bacterial Microflora in the Midgut of the Larvae
and Adult of Wild Caught Anopheles stephensi: a step toward finding suitable
paratransgenesis candidates. Acta Tropical, v. 121, n.23, p.129–134. 2012.
210
COSTA, G.C.M. Microbiota Bacteriana associada às esponjas de água doce da
Amazônia. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia)
- Manaus: UEA, 2012.
LINDH, J.M; TERENIUS, O; FAYE, I. 16S rRNA Gene-Based Identification of

Midgut Bacteria from Field-Caught Anopheles gambiae Sensu Lato and A. funestus
Mosquitoes Reveals New Species Related to Known Insect Symbionts. Applied and
Environmental Microbiology, v. 71, n.2, p.7217–7223. 2005.
NGO, C. T., AUJOULAT, F., VEAS, F., JUMAS-BILAK, E., & MANGUIN, S.
(2015). Bacterial Diversity Associated with Wild Caught Anopheles Mosquitoes from
Dak Nong Province, Vietnam Using Culture and DNA Fingerprint. PLoS ONE,10(3),
e0118634. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0118634
OLIVEIRA-FERREIRA, J.; LACERDA, M. V. G.; BRASIL, P.; LADISLAU, J. L. B.;

TAUIL, P. L.; DANIEL-RIBEIRO, C. T. Malaria in Brazil: An overview. Malaria
Journal, v. 9: p. 115, 2010.
RANI, A; SHARMA, A; RAJAGOPAL, R; ADAK, T; BHATNAGAR, R.K. Bacterial

diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and
culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an
Asian malarial vector. BMC Microbiol. 2009; 9: 96. doi: 10,1186 / 1471-2180-9-
96. PMID: 19450290.
RIEHLE M. A., MOREIRA C. K., LAMPE D., LAUZON C., AND JACOBS-
LORENA M. Using bacteria to express and display anti-Plasmodium molecules in the
mosquito midgut. International Journal of Parasitology. 37(6). 595-603. (2007).
SMITH, RYAN C; CHRISTOPHER KIZITO; JASON L. RASGON; MARCELO

JACOBS-LORENA. Transgenic Mosquitoes Expressing a Phospholipase A2 Gene
Have a Fitness Advantage When Fed Plasmodium falciparum-Infected Blood.
Published: October 01, 2013. DOI: 10.1371/journal.pone.0076097.
TADEI, W. P.; SANTOS, J. M. M.; RODRIGUES, I. B.; RAFAEL, M. S. 2010.

Malária e Dengue na Amazônia: vetores e estratégias de controle. Pesquisa
Científica e Tecnologia em Saúde. Ministério da Ciência e Tecnologia. Brasília. Cap.
MCT-INPA. p.112-125.
WHO – World Health Organization. 2014. World Malaria Report, Geneva. 242 pp.
211
Caracterização da microbiota da rizosfera resistentes ao agrotóxico

carbendazim em culturas de coentro na Comunidade Nova Esperança em
Manaus/AM
Santos J.C.1, Lima J.M.S.1, Telles Y.V.1, Araújo S.P.1, Costa Neto P.Q.1, Mota A.J.1;
Peixoto J.C.C.1, Batista I.H.2, Pereira J.O.1
1
Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Manaus-AM, Brasil.; 2Universidade Estadual do
Amazonas (UEA), Manaus-AM, Brasil. Emails: [email protected], [email protected];
[email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected]; [email protected],
[email protected]
Resumo
Os agrotóxicos são comumente utilizados na produção agrícola. No entanto, devido à

sua toxicidade e persistência, têm afetado severamente o ambiente, trazendo graves riscos à
saúde e à manutenção da qualidade de vida. Assim, o objetivo principal deste trabalho foi
isolar microrganismos envolvidos na degradação de carbendazim, a partir da rizosfera de
culturas de Coentro em Manaus, realizando ensaios de sensibilidade a este agrotóxico pelos
isolados, em diferentes concentrações. Foi feita análise de solos coletados em diferentes áreas,
buscando-se detectar resíduos do fungicida a ser utilizado neste estudo. Realizou-se ainda a
caracterização físico-química do solo rizosférico coletado para o isolamento. Três áreas
agrícolas com histórico de uso intensivo de agrotóxicos, localizadas no Município de Manaus,
Careiro da Várzea e Manacapuru foram escolhidas para o presente trabalho. Após análises de
amostras de solo desses municípios, os resultados mostraram que embora tenha uso intensivo
de agrotóxico nessas áreas, em Manacapuru e Careiro da Várzea o limite de quantificação não
foi detectado. Somente em Manaus foi possível detectar a presença do analito carbendazim.
Foram isolados dessa área 97 microrganismos resistentes a este fungicida, sendo 80 bactérias
e 17 fungos. Dentre estes microrganismos 53 bactérias e os 17 fungos foram tolerantes nas
cinco concentrações testadas. Há possibilidade destes microrganismos estarem envolvidos em
processos de biodegradação, o que reflete a necessidade de estudos posteriores para avaliar
este potencial.
Palavras-chave: microrganismos; agrotóxico; carbendazim; biodegradação.
212
Introdução
Os agrotóxicos são, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa),

produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores
de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na
proteção de florestas nativas, de culturas florestais e de outros ecossistemas e de ambientes
urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna,
a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as
substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e
inibidores de crescimento.
No estado do Amazonas a proporção de agricultores dos diferentes municípios do
Estado que cultivam frutas e legumes com uso de agrotóxico varia entre 64% e 96,7% (IBGE,
1998).
A biorremediação envolve o uso de microrganismos ou plantas para tratamento de
ambientes contaminados e surge como alternativa para amenizar os efeitos deletérios do largo
uso dos pesticidas (Chowdhury, 2008). Os microrganismos degradadores de agrotóxicos são
encontrados no mundo microbiano e estes compostos podem ser mineralizados por um
conjunto de microrganismos. A biodegradação de um complexo de moléculas normalmente
envolve o efeito interativo das comunidades mistas de microrganismos e conta com a
versatilidade metabólica das bactérias e fungos (Alexander, 1999).
O solo rizosférico contém uma grande biomassa e alta atividade microbiana, quando
comparada com solo não-rizosférico. O número de microrganismos na rizosfera pode ser até
30 vezes maior que em solo livre de raízes (Bodelier et al.,1997). O estudo da comunidade
microbiana de solo rizosférico é de grande importância, não só por entender o papel ecológico
destes microrganismos na interação com as plantas, mas também para possíveis aplicações
biotecnológicas.
Assim, o objetivo principal deste trabalho foi isolar microrganismos envolvidos na
degradação de carbendazim, a partir da rizosfera de culturas de Coentro em Manaus,
realizando ensaios de sensibilidade a este agrotóxico pelos isolados, em diferentes
concentrações. Foi feita análise de solos coletados em diferentes áreas, buscando-se detectar
resíduos do fungicida a ser utilizado neste estudo. Realizou-se ainda a caracterização físico-
química do solo rizosférico coletado para o isolamento.
213
Materiais e Métodos
O estudo foi realizado nos Municípios de Manaus (Comunidade Nova Esperança),

Careiro da Várzea (Comunidade São Francisco, Costa da Terra Nova) e em Mancapuru
(comunidade de São Francisco, no ramal do Arapapá), que constituem regiões agrícolas onde
agrotóxicos são intensamente utilizados. Destas áreas foram coletadas amostras de solo de
culturas de Coentro (Coriandrum sativum L.), Chicória (Cichorium endívia) e berinjela
(Solanum melongena) em Manaus, Careiro da Várzea e Manacapuru, respectivamente.
Para cada ponto de coleta foi usado como padrão 0-10 cm de profundidade. No
Município de Manaus, foram coletadas 9 amostras de solo de culturas Coentro (Coriandrum
sativum L.). Já no Careiro da Varzea foram coletadas 6 amostras de solo de culturas de
Chicória (Cichorium endívia), por fim em Manacapuru foram coletadas 6 amostras de solo de
culturas berinjela (Solanum melongena). Cada amostra continha aproximadamente 250 g,
armazenada em frascos estéreis. A refrigeração foi feita através de gelo seco artificial e
enviado para análise no laboratório Agrosafety através do método LC/MS para os analitos
acefato, aldicarbe, carbendazim, etoprofós, imazalil, metamidofós, tiofanato-metílico,
triclorfom e GC/MS para os analitos alacloro, aldrin, aletrina, ametrina, atrazina, azinfos
etílico, azinfos metílico, azoxistrobina, bifentrina, bioaletrina, bromopropilato, captana,
carbaril, carbofenotiona, carbofurano, carbosulfano, ciflutrinas totais, cipermetrinas totais,
ciproconazol, clorfenvinfos, Clorotalonil, clorpirifós, clorpirifós metílico, deltametrina,
diazinona, dicofol, dieldrin, difenoconazol, dimetoato, dissulfotom, dodecacloro,
endossulfam, endrin, esfenvalerato, Etion, fenamifós, fenitrotiona, fenpropatrina, fentiona,
fentoato, fenvalerato, fipronil, folpete, Forato, fosfamidom, fosmete, gama-BHC,
hexaclorobenzeno, iprodiona, lambda-cialotrina, Malationa, metidationa, metoxicloro,
mevinfós, monocrotofós, ometoato, parationa, parationa metílica, permetrina,
pirazofos,pirimifos metílico, pirimifós etílico, procimidona, procloraz, profenofós, propanil,
propargite, tebuconazol, terbufós, tetradifona, triazofós, trifluralina, vinclozolina.
O solo utilizado nesta pesquisa para o isolamento dos microrganismos foi obtido do
Município de Manaus na Comunidade Nova Esperança. Foram coletadas amostras da região
rizosférica de cultura de coentro, 5 amostras a 0-10 cm e 5 amostras e 10-20cm de
profundidade e acondicionadas em sacos plásticos estéreis. As amostras de solo foram secas
em local ventilado e peneiradas em peneira de 2 milímetros. Foram realizadas as análises de
extração de Cálcio, magnésio, alumínio trocável, enxofre, Boro, fósforo e fósforo
remanescente, potássio, pH em água, e pH cloreto de potássio (KCl), acidez potencial,
214
granulometria de acordo com o manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes
(Silva 2009).
O isolamento seletivo foi realizado em meio de cultura mínimo, solução de vitaminas,
tendo como única fonte de carbono o fungicida carbendazim a 250µg/mL. A incubação foi a
28ºC por 7 dias. Após esse período, 100mL do meio fermentado foi retirado e inoculado
novamente em 500mL do mesmo meio e incubado por mais 7 dias. Após 2 repetições, se
procedeu à diluição em série da última fermentação e semeadura no mesmo meio de cultivo,
porém sólido e contendo carbendazim. Os métodos utilizados para preservação dos
microrganismos foram: repiques contínuos, preservação em óleo mineral, água destilada ou
método de Castellani somente para fungos e em glicerol a 50% somente para bactérias. Para a
caracterização morfológica, foi realizada coloração utilizando-se a técnica de Gram e
posterior visualização por microscopia óptica. Os testes de sensibilidade foram realizados
através da técnica de difusão em poços (Pinto et al., 2003). A suspensão continha a espécie
bacteriana crescida em caldo LB a 30°C, 125rpm por 24h na escala de McFarland a 0,5. Cada
placa de Petri com meio Lurian Bertani (LB) foi semeada com a suspensão bacteriana. Em
seguida foram perfurados 05 poços de 05 mm de diâmetro, preenchido com 40µl de
carbendazim em 05 concentrações decrescentes: 1000µg/mL, 500µg/mL, 250µg/mL,
125µg/mL e 62,5µg/mL. As placas foram incubadas a 30ºC por 24 horas.
As amostras de solos foram coletadas em três áreas agrícolas para análise de resíduos
de agrotóxicos, nas coordenadas de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1 Lista dos locais de coleta das amostras de solo

Local de Coleta Sequência das Latitude (W) Longitude (S)
amostras
1 3º00'56".5 59º55'14.0"
2 3º00'56.9" 59º55'13.7"
3 3º00'57.7" 59º55'13.5"
4 3º00'57.7" 59º55'14.2"
Manaus 5 3º00'57.3" 59º55'14.1"
6 3º00'56.7" 59º55'14.1"
7 3º00'56.7" 59º55'14.3"
8 3º00'57.2" 59º55'14.3"
9 3º00'57.5" 59º55'14.5"
Careiro da 10 3º06'41.6" 59º50'37.2"

Várzea 11 3º06'41.5" 59º50'36.7"
215
12 3º06'41.7" 59º50'36.7"
13 3º06'41.6" 59º50'37.0"
14 3º06'59.8" 59º51'29.8"
15 3º06'59.8" 59º51'30.1"
16 3º17'07.6" 60º23'259"
17 3º17'08.0" 60º23'260"
18 3º17'07".0 60º23'26.2"
Manacapuru 19 3º17'08.7" 60º23'25.2"
20 3º17'10.5" 60º23'26.0"
21 3º17'10.1" 60º23'25.2"
Embora tenha uso intensivo de agrotóxico nas três áreas, em Manacapuru e Careiro da
Várzea o limite de quantificação não foi detectado. Somente em Manaus foi possível detectar
a presença do analito carbendazim (0,189µg/Kg). A ausência de resíduos nas amostras pode
estar associada, segundo Chaim (2004), ao fato de 32% dos agrotóxicos pulverizados retidos
ficarem nas plantas, 19% irem pelo ar para outras áreas circunvizinhas da aplicação e 49%,
apesar de irem para o solo, após algum tempo, parte se evaporar, parte lixiviar para o lençol
freático e outra parte se degradar. Considera-se ainda o fato de ambientes de clima tropical
apresentarem taxas de degradação de herbicidas mais rápidas, devido ao aumento de
populações de microrganismos e as modificações nas condições ambientais, como resultado
do aumento das temperaturas do solo (Laabs et al., 2002). Regiões tropicais apresentam
temperaturas mais elevadas nas camadas superficiais do solo, o que resulta em maior
decomposição da matéria orgânica e uma maior atividade microbiana (Silva et al., 1998),
razões pelas quais podem não ter sido detectado os resíduos de agrotóxico, já que segundo o
produtor de Manacapuru, a aplicação de deltametrina foi realizada três dias antes.
Somente no solo que apresentou resíduo de agrotóxico foi realizada análise físico
química. As amostras foram coletadas no período da manhã, no dia 23 de maio de 2013,
foram obtidas conforme metodologia descritas no item 4.2.2, nas seguintes coordenadas
geográficas (amostra 1: S03°00´57.0¨ W059°55´14.4¨, amostra 2:
S03°00´56.6¨W059°55´14.5¨, amostra 3 S03°00´57¨.0 W059°55´14.8¨; amostra 4
S03°00´57.0¨W059°55´14.8¨; amostras 5: S03°00´56.6¨W059°55´14.9¨).
216
A análise do solo é o instrumento que o técnico utiliza para recomendar as
necessidades de calagem e fertilizantes, melhorando as condições de fertilidade de um solo,
para que as plantas encontrem os nutrientes que elas precisam para responder com altas
produtividades. No entanto as análises foram realizadas para se verificar em quais condições
de solo, os microrganismos se encontravam quando foram isolados.
Tabela 2 Resultados da análise física do solo da Comunidade Nova Esperança, Manaus-AM
PERFIL Areia Silte Argila V% (CTCEFETIVA) m% M.O P-rem

Prof.
(cm) -------------dag kg-1 ---------- -------------cmol dm-3-------------- % dag kg-1 mg L-1
V%
0-10 92,2 7,3 0,4 38.9 2.8 0 0.5 54,3
10-20 93,5 5,9 0,5 97.5 3.2 0 1.1 54,3
saturação por bases; CTCEFETIVA capacidade de troca catiônica; m% Saturação por Alumínio;
P-rem fosforo remanescente.
O solo analisado apresentou classe textural arenosa (Tabela 2). A matéria orgânica
(M.O) na profundidade de 0-10 foi determinada como muito baixa (0,5dagKg-1), na
profundidade 10-20 foi determinada como baixa. A saturação por bases (V%), na
profundidade de 0-10, caracterizou o solo como de baixa fertilidade, já na profundidade de
10-20, com saturação bem maior que 50%, a caracterização é de solo fértil. A capacidade de
troca catiônica efetiva foi determinada como média, o nível de fósforo remanescente foi muito
bom, apresentando os valores de 54,28 mgL-1 e 54,36mgL-1 nas profundidades de 0-10 e 10-
20, respectivamente. A Saturação por Alumínio (m) foi classificado como muito baixa.
Tabela 3 Resultados da análise química do solo da Comunidade Nova Esperança, Manaus-

AM
PERFIL pH P K Ca Mg B Al H+Al SB SO4 2- CTC
P Prof.
(cm) mg dm-3 -------------------------------- cmol dm-3--------------------------------
f 0-10 7.5 824.7 14 2.6 0.2 0.4 0 4.53 2.9 0.15 7.4
ó 10-20 7.6 745.5 25 2.5 0.6 0.5 0 0.08 3.2 0.21 3.3
s
foro; K potássio M.O matéria orgânica; Mg magnésio; B boro, Al Alumínio; H+Al acidez potencial; SB
soma de bases; (CTC capacidade de troca de cátions.
Segundo Furtini Neto et al (2001), geralmente a acidez aumenta com a profundidade.

Os resultados mostraram que em ambas profundidades (0-10 e 10-20cm) o pH do solo não
apresentou diferença significativa (Tabela 3). De acordo com a classificação de Ribeiro A.
217
(1999) para o pH em água, relação 1:2,5 TFSA, o solo apresentou alcalinidade fraca,
apresentando valores na faixa entre 7.5 e 7.6 respectivamente. Segundo a classe de valores
utilizadas na agronomia quando o pH se encontra maior que 6,0, é classificado como muito
alto (Sobral, et al, 2007). O solo foi classificado como arenoso e o nível de fósforo para este
tipo de solo foi muito alto para ambas profundidades. O nível de potássio trocável quando o
valor é menor que 30 é considerado baixo (14 - 25). O nível do Cálcio é classificado como
médio (2.6 - 2.5), o magnésio e o boro em profundidade de 0-10 cm apresentaram níveis
baixos e em 10-20 cm, níveis médios. O alumínio foi detectado em níveis muito baixos e a
acidez potencial (H+Al) na profundidade de 0-10 cm apresentou nível médio e em 10-20 cm
foi detectado em nível baixo. A soma de bases (SB) foi classificada com níveis médio, e a
capacidade de troca de cátions (CTC) pH 7 na profundidade de 0-10 cm foi considerada baixa
e em 10-20, foi média.
Em geral, os solos arenosos retêm pouca umidade e são pouco férteis, no entanto por
se tratar de uma área utilizada para cultivo de hortaliças, os agricultores realizam adubação
periodicamente, ocasionando níveis de nutrientes considerados suficientes para suprir as
necessidades das plantas. Segundo Oliveira (2010) em solo arenoso, plantas e microrganismos
vivem com mais dificuldade, devido à pouca umidade. Mesmo esta área sendo arenosa e
apresentando resíduos de agrotóxico, foi possível isolar 80 bactérias e 17 fungos degradadores
de carbendazim.
Na coleta de solo foram isolados 97 microrganismos, dos quais 80 são bactérias e 17
são fungos. Dessas 80 bactérias 52 (65%) são gram-negativas e 28 (35%) são gram-positivas.
A maioria são bacilos 65 (81%), 12 (15%) são cocos, 2 (3%) são diplococos e 1 estafilococos
(1%). Dos 17 fungos, 13 são filamentosos e 4 são leveduriformes.
Figura 1 Teste de Sensibilidade (a) Halo de inibição

(b) Crescimento ao redor do poço
218
No teste de sensibilidade dos 97 microrganismos na presença do fungicida
carbendazim, observou-se que 53 bactérias e 17 fungos apresentaram crescimento ao redor do
poço (Figura 1) em todas as concentrações testadas (1(1000µg/Ml), 2 (500µg/mL), 3
(250gL/mL), 4 (125µg/mL) e 5(62,5µg/mL)).
De acordo com Yarden et al. (1990) as bactérias exercem maior influência na
biodegradação do fungicida carbendazim, quando comparado ao fungo A. alternata. Em solos
sem prévio tratamento, somente a inoculação bacteriana resultou em biodegradação acelerada
do fungicida. Tal fato sugere que enquanto o fungo contribui para a dissipação de
carbendazim no solo, as bactérias exercem maior influência na biodegradação desse
fungicida. Observaram ainda degradação mais rápida por culturas bacterianas originadas de
solos previamente tratados com carbendazim do que daquelas provenientes de solos sem
prévio tratamento. Dessa forma, nossos resultados foram bastante satisfatórios, pois dos 97
microrganismos isolados de solos tratados com carbendazim, 70 apresentaram-se resistentes
na presença do fungicida, o que sugere a possibilidade desses microrganismos possuírem
potencial na degradação do referido fungicida.
Conclusões
Os solos agrícolas da região pesquisada apesar do uso intensivo de agrotóxicos têm

retido pouco agrotóxico. Foi possível, no entanto isolar bactérias tolerantes ao Carbendazim
em variadas concentrações. Espera-se ainda que estes isolados apresentem potencial de
biodegradabilidade de carbendazim podendo ser utilizados como uma alternativa eficaz no
tratamento de áreas contaminadas por este composto. Acredita-se que seja possível obter
bioprodutos para remediação de áreas impactadas com agrotóxico. Desta forma, espera-se que
a proteção dos ecossistemas, possa ter um elemento a mais na sua efetivação.
Referências
ANVISA. (2003). AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Distribuição de resíduos

de agrotóxicos em frutas e verduras entre julho de 2001 e dezembro 2002. Brasília. p. 72.
Alvarez VVH, Novais RF, Barros NF, Cantarutti RB, Lopes, AS (1999). Interpretação dos
resultados das análises de solos. In: Ribeiro AC, Guimarães PTG, Alvarez VVH. (Ed.).
Recomendação para o uso de corretivos e fertilizantes em Minas Gerais: 5. Aproximação.
Viçosa: Comissão de Fertilidade do Solo do Estado de Minas Gerais. p.25-32.
219
Alexander, M (1999). Biodegradation and bioremediation. 2. ed. New York: Academic, p.
453.
Bodelier, PLE, Wijlhuizen, AG, Blom CWPM, Laanbroek, HJ (1997). Effects of photoperiod
on growth of and denitrification by Pseudomonas chlororaphis in the root zone of Glyceria
maxima, studied in a gnotobiotic microcosm. Plant Soil, 190:91–103.
Chowdhury A, Pradhan S, Saha M, Sanyal N. (2008). Impact of pesticides on soil

microbiological parameters and possible bioremediation strategies. Indian Journal of
Microbiology; 48(1):114-127. doi:10.1007/s12088-008-0011-8.
Chaim A (2004). Tecnologia de aplicação de agrotóxicos: fatores que afetam a eficiência e o

impacto ambiental. In: Silva CMMS e Fay EF. Agrotóxicos e ambiente. Brasilia: Embrapa; p.
289-317.
Furtini Neto, A. E.; Vale, F. R.; Resende, A. V.; Guilherme, L. R. G.; Guedes, G.A.A (2001).
Fertilidade do solo. 252f. Trabalho de conclusão de curso (Especialização em Solos e Meio
Ambiente) – Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extensão, Universidade Federal de
Lavras, Lavras.
IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) 1998. Censo Agropecuário, 1995-1996.

Rio de Janeiro.
Oliveira, DL (2010). Solos uma Questão de Sutentabilidade. Gestão & Tecnologia -

Faculdade Delta - ISSN 2176-2449. Edição III janeiro/fevereiro.
Pinto TJA, Kaneko TM, Ohara MT (2003). Controle Biológico de Qualidade de Produtos
Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos. 2.ed. São Paulo: Atheneu Editora, p. 325.
Laabs, V.; Amelung, W.; Pinto, A.; Zech, W (2002). Fate of pesticides in tropical soils of Brazil under
field conditions. Journal of Environmental Quality, Madison-WI, 31(1): 256-268.
Pinto TJA, Kaneko TM, Ohara MT (2003). Controle Biológico de Qualidade de Produtos
Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos. 2.ed. São Paulo: Atheneu Editora, 325 p.
Silva F (2009). Manual de análise química de solos, plantas e fertilizantes 2 ed. rev. Ampl.
627 p. Brasilia, DF: Embrapa informação tecnológica.
Silva, A. A., Oliveira Jr, R. S., Castro Filho, J. E (1998). Avaliação da atividade residual no
solo de imazaquin e trifuralin através de bioensaios com milho. Acta Scientiarum, Maringá-
PR, v. 20, n. 3, p. 291–295.
Sobral, L; Viegas, P.R.A., Siqueira, O.J.W. De; Anjos, J.L. Dos; Barreto, M.C De V.; Gomes,
J.B.V (2007). Recomendações para o uso de corretivos e fertilizantes no Estado de Sergipe.
Aracaju: Embrapa Tabuleiros Costeiros, p. 251
Yarden O, Salomon, R, Katan J, Aharonson N (1990). Involvement of fungi and bacteria in

enhanced and nonenhanced biodegradation of carbendazim and other benzimidazole in soil.
Can. J. Microbiol., v. 36, p. 15-36,.
220
Avaliação das emzimas CMcase e xilanase de três fungos endofíticos da

Amazônia, em três resíduos agrícolas em duas diferentes condições de
cultivo
Silva, S.R.S1; Silva, A.S.2; Santiago, P.A.L.1,; Souza, A.D.L.2; Polikarpov I.3, Martinez
J.L4, Souza, A.Q.L 2
1
Universidade do Estado do Amazonas (UEA) – PPGMBT, 2Universidade Federal do Amazonas
(UFAM) – PPGQ , 3Universdade Federal de São Carlos (UFSCar) – LCPBE, 4Faculdad de
Farmacia de La Universidad de Granada (UGR)
E-mail: [email protected],[email protected],[email protected],
Resumo
Diversos resíduos são gerados a partir de atividades humanas e esses resíduos, ao longo
dos anos, tem sido alvo para utilizá-los na produção de moléculas de interesse de diversos
setores industriais como por exemplo, as enzimas. Para a produção enzimática de CMCase
e Xilanase, três fungos (Aspergillus niger, Penicillium adametzii e Basidiomiceto) foram
submetidos a cultivo submerso em duas soluções de cultivo diferentes (Manachini e GLBN
40) com três resíduos Amazônicos como indutores (casca de maracujá, cupuaçú e
macaxeira) durante 5 e 10 dias. Todos tiveram produção enzimática, no entanto, A.niger
mostrou-se o melhor produtor de CMCase e xilanase em 5 dias com 7,2 UI/mL e 13,5
UI/mL, respectivamente, em solução de Manachini com casca de maracujá como indutor.
Os valores obtidos com P. adametzii. e o Basidiomiceto variaram de acordo com as
soluções de cultivo e com os indutores. As condições de cultivo podem ser otimizadas para
melhoramento da produção enzimática.
Palavras-chave: Enzimas, Resíduos Agrícolas, Fungos Amazônicos, CMCase, xilanase.
Introdução
As variadas atividades humanas geram inúmeros tipos de resíduos que, por sua vez,
são acumulados no meio ambiente. Diante do acúmulo de resíduos agroindustriais, ao
longo dos anos, têm-se buscado sua reutilização para redução da sua quantidade no meio
ambiente.
Na região Norte do Brasil, o estado do Pará destaca-se como o maior produtor de

macaxeira do país com produção acima de 4 milhões de toneladas, é responsável pela
maior safra de cupuaçu do Brasil com mais de 74 mil toneladas em 13 mil hectares de área
e também, é o maior produtor de maracujá da região com mais de 26 mil toneladas (IBGE
221
2014; CEPLAC,2013). Toda esta produção gera resíduos e vários bioprocessos têm sido
utilizados para a conversão de resíduos em moléculas de interesse como aminoácidos,
etanol, enzimas e outras.
A biomassa vegetal é composta por celulose, hemicelulose e lignina. Diversos

microrganismos produzem enzimas que atuam em sinergia (complexo enzimático) e assim,
conseguem degradar a biomassa vegetal. Fungos de ocorrência disseminada na natureza
como Basidiomicetos e fungosdos gêneros Trichoderma, Penicillium e Aspergillus,
possuem capacidade de produzir essas enzimas (Bom et al., 2008). Dentre outras enzimas
desse complexo enzimático, destacam-se as endoglucanases e as xilanases. Estas enzimas
são utilizadas em diversas indústrias como, por exemplo, indústrias de papel, roupa, têxtil,
farmacêutica, entre outras, que têm o interesse no melhoramento da produção dos seus
produtos.
O mercado brasileiro de enzimas, apesar de pequeno, quando comparado ao mercado

mundial, mostra-se promissor devido a grande disponibilidade de resíduos agroindustriais
e do dinamismo dos setores industriais (Mussatto et al., 2007).
O objetivo deste trabalho foi comparar a produção enzimáticade três fungos

(Basidiomiceto, Penicillium adametzii e Aspergillus niger), três substratos e duas soluções
de cultivo.
Material e métodos
Para induzir a produção de CMCase (Carboximetilcelulase) e xilanase, utilizou-se

casca de cupuaçu, maracujá e macaxeira in natura, em duas soluções de sais minerais:
Manachini (Manachini et al., 1987) e GLBN 40.
Os fungos utilizados foram um Basidiomicetos (Mas 3M 1.1.1), um Aspergillu

sniger (EjFLOR 3cont BDA) e um Penicillium adametzii(Stsp C2-3/1-2C) reativados da
coleção do Laboratório GEMMA (Grupo de Espectrometria de Massas e Microrganismos
da Amazônia), na Universidade Federal do Amazonas (UFAM) em meio BDA durante 8
dias a 28 °C.
Após a esterilização dos resíduos juntamente com as soluções, foram feitos os

inóculos adicionando-se dois fragmentos de aproximadamente 1cm2 de Basidiomiceto e 20
μL de solução de suspensão de esporos de A. niger e P. adametzii Os experimentos foram
222
cultivados em incubadora Shaker, em quintuplicata, durante 5 e 10 dias, a temperatura de
28 °C a 120 rpm. Para a extração das enzimas, todas as réplicas foram filtradas em sistema
de filtração a vácuo estéril contendo filtro Millipore 0,22 μm. Para os testes quantitativos,
foi separada uma alíquota de 1,5 mL.
Utilizou-se o método DNS (Miller, 1959), que quantifica açúcares redutores, para
quantificar as enzimas CMCase e Xilanase a partir da metodologia descrita por Ghose,
(1987). Os ensaios ocorreram em tubos de ensaio de 6 ml, em triplicata, adicionando-se
450 μL do substrato CMC (quando quantificada CMCase) e Xilano(quando quantificado
Xilanase) a 1% em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 e 50 μL de extrato enzimático.
Essa mistura foi aquecida por 10 minutos a 50°C em banho-maria. Após o tempo
reacional, adicionou-se 500 μL do reagente ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS), levando as
amostras ao banho fervente por 5 minutos e sequencialmente, as amostras sofreram
resfriamento em banho gelado por mais 5 minutos. Por fim, adicionou-se 4 mL de água
destilada. Para o controle das amostras, adicionou-se 450 μL de CMC, 500 μL de DNS e
50 μL do extrato enzimático. Para o Branco adicionou-se 500 μL de água destilada, 500 μL
de DNS e 4 ml de água destilada. As amostras foram lidas a 540 nm em espectrofotômetro
de UV.
Com relação à CMCásica, as dosagens enzimáticas revelaram que dentre as soluções

de sais minerais utilizadas no cultivo submerso, a solução de Manachini mostrou-se a
melhor solução de cultivo para atividade e xilanásica, conforme mostra as figuras 1 e 2.
Em relação ao tempo de cultivo, o melhor tempo de produção mostrou-se em 5 dias

havendo declínio desta produção com 10 dias para ambas as enzimas.Dentre os substratos
agrícolas utilizados, a casca de maracujá mostrou-se melhor indutor na solução de
Manachini tanto para CMCase quanto para Xilanase. A casca de cupuaçu mostrou-se o
segundo melhor indutor e a casca de macaxeira foi o indutor menos eficiente. Dentre os
fungos utilizados nesta pesquisa, o A.niger mostrou-se o melhor produtor de CMCase com
7,2 UI/mL em 5 dias, seguido do P. adametzii com 3,1 UI/mL em 10 diase o pior
desempenho foi o do Basidiomiceto com 3,0 UI/mL em 5 dias, todos em solução de
Manachini.Muitas espécies de Aspergillus produzem várias enzimas extracelulares sendo
elas 19 diferentes enzimas de importância biotecnológica (Pandeyet al. 1999). Dentre estas
223
estão celulase, xilanase, poligalacturonase, α-galactosidase, α-amilase, glucoamilase, β-
glucosidade e protease ácida.
Atividade CMCásica
8
7
Atde CMCase UI/mL
6
5
4
3
5 dias
2
1 10 dias
0
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
A.niger Bas. P.adametzii A.niger Bas. Pen.adametzii
GLBN 40 Manachini
Figura 1. Comparação de atividade CMCásica entre solução de Manachini e solução

GLBN 40 onde C.Cup.= casca de cupuaçu, C. Maj.=Casca de maracujá e C. Max.=casca
de macaxeira.
Atividade Xilanásica
16
14
Atde Xilanase UI/mL
12
10
8
6
4 5 dias
2 10 dias
0
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Max.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Maj.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
C. Cup.
A.niger Bas. P.adametzii A.niger Bas. P.adametzii

GLBN 40 Manachini
Figura 2. Comparação de atividade Xilanásica entre solução de Manachini e solução

GLBN 40 onde C.Cup.= casca de cupuaçu, C. Maj.=Casca de maracujá e C. Max.=casca
de macaxeira.
224
Em atividade xilanásica, o melhor desempenho foi do A. niger com13,5 UI/mL,
seguido do Basidiomiceto com 5,1 UI/mL,ambos em 5 dias, e o pior desempenho foi do P.
adametzii com 4,7 UI/mL em 10 dias, todos em solução de Manachini. Stroparo et al.
(2012) avaliaram a produção de hidrolases e dentre estas, observaram que o A.
nigerapresentou maior nível de Xilanase com 8,73 UI/mL, sendo os valores deste trabalho
superiores utilizando a casca de maracujá como indutor, em 5 dias de cultivo.
Silva (2013) avaliou a produção de CMCasee Xilanasetambém utilizando casca de
maracujá como substrato e uma espécie de Penicillium,reativado do Laboratório GEMMA
e,obteve um valor de 13,444 UI/mL e 0,510 UI/mL no 10° dia de cultivo, utilizando 20 µL
de solução de suspensão de esporos. Neste trabalho, encontrou-se os valores de 3.116
UI/mLe 4,793 UI/mL, de CMCase e Xilanase respectivamente, ambos em 10 dias,
inoculados 10 µL de solução de suspensão de esporos.Silva (2013) também avaliou a
produção de CMCase e Xilanase de Basidiomicetos e obteve 1,004 UI/mL e 0.371 UI/mL,
respectivamente. Neste trabalho, as atividadesCMCásica e xilanásica foram 3.012 UI/mL e
5.166 UI/mL, respectivamente. De acordo com Pandey et al. (1999), a enzima que será
produzida depende do tipo de substrato utilizado no processo de cultivo. Isso justifica as
diferenças de produção de xilanase e CMCase observadas dentre os substratos e soluções
utilizadas, visto que cada solução (Manachini e GLBN 40) possui componentes
diferenciados que podem interferir no crescimento fúngico e consequentemente, na
produção enzimática.
Conclusões
A melhor solução de cultivo para a produção de CMCase e Xilanasefoi a de

Manachini tendo 5 dias de cultivo como melhor tempo de produção enzimática.
Entre os três fungos utilizados, a cepa de A. niger (EjFlor 3 cont BDA) foi o melhor
produtor de ambas as enzimas e o melhor substrato, foi a casca de maracujá.
Agradecimentos
Ao apoio financeiro da FAPEAM, do CNPq e da CAPES que viabilizaram a realização
desse trabalho e pela concessão de bolsa da CAPES.
Referências
225
Bom, EPS, Ferrara MA, Corvo ML, Vermelho AB, Paiva CLA, Alencastro RB, Coelho, R
R R (2008) Enzimas em biotecnologia: produção, aplicações e mercado. Interciência. Rio
de Janeiro.
Fraife Filho, G.A. (2013) Cultivo do cupuaçuzeiro para o estado da Bahia.

CEPLAC/Centro de pesquisas do cacau – Cepec.
http://www.ceplac.gov.br/radar/cupua%C3%A7uzeiro.htm
Ghose, T.K. (1987) Measurement of cellulase activities. Pure and Applied Chemistry
59:257-268.
IBGE (2014). Lavoura Permanente. Acessado em:

http://www.ibge.gov.br/estadosat/temas.php?sigla=df&te ma=lavourapermanente2012.
Acessado em 16 de fevereiro de 2014.
Manachini PL, Fortina MG, Parini C (1987) Purification and properties of

endopolygalacturon as eproduced by Rhizopus stolonifer. Biotechnology Letters 9:21-224.
Miller GL (1959) Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing

Sugar. Analytical Chemistry 31:426-428.
Mussato SI, Fernandes M, Milagres AMF (2007) Enzimas – Poderosa Ferramenta na

Indústria. Ciência Hoje 41:28-33.
Pandey A, Benjamin S, Soccol CR, Nigam P, Krieger N, Soccol VT (1999) The realm of
microbial lipases in biotechnology. Biotechnol Appl Biochem 29:119–13,
Silva AS (2013) Avaliação da produção de celulases e xilanase pela degradação de

resíduos agrícolas regionais por fungos da Amazônia. Manaus, Brasil,104p. (Dissertação)
de Mestrado em biotecnologia.UFAM
Stroparo EC, Beite, SM, Resende JTV, Knob A (2012) Seleção de fungos filamentosos e
de resíduos agroindustriais para a produção de enzimas de interesse biotecnológico.
Semina: Ciências Agrárias 33:2267-2278.
226
Atividade enzimática em fungos endofíticos isolados seletivamente de

Eichhornia crassipes coletada em área portuária de Manaus – AM
Souza R.D.N2, Batista I.H1, Ferreira F. S.1, Santos J.C.2, Marinho, M.P.S.1, Araújo, S.P.2, Lima,
J.M.S.27, Pereira, J.O 2
1
Universidade do Estado do Amazonas- UEA, Manaus, AM, 2 Universidade Federal do Amazonas-
UFAM, Manaus, AM. E-mail: [email protected], [email protected],
Resumo
Microrganismos endofíticos vivem no interior das plantas sem causar danos aparentes,
estabelecendo com seus hospedeiros uma relação simbiótica potencialmente vantajosa. A
espécie Eichornia crassipes é uma das macrófitas mais abundantes na Amazônia, tendo
importante função ecológica nos ecossistemas. Este estudo teve o objetivo de isolar fungos
endofíticos a partir da referida macrófita coletada no porto da cidade de Manaus e realizar
ensaios de atividade enzimática com os isolados. O isolamento foi realizado em meio mineral
acrescido de petróleo, utilizando-se fragmentos de folha e raiz da planta. Realizaram-se
ensaios de atividade enzimática para amilase e lipase. Os fungos que apresentaram resultados
positivos foram caracterizados morfologicamente para identificação preliminar. Foram
isolados 28 fungos e selecionados 11 para os ensaios enzimáticos. Para o ensaio de amilase
quatro fungos revelaram atividade e para lipase apenas um. Os fungos que apresentaram
produção enzimática foram identificados como possivelmente pertencentes aos gêneros:
Aspergillus sp., Chaetomium sp. e Verticillium sp. Os fungos isolados que apresentaram
atividade enzimática são de gêneros que potencialmente podem ser promissores para uso em
processos biotecnológicos.
Palavras-chave: Microrganismos endofíticos, atividade enzimática, Amazônia
Introdução
A Amazônia é mundialmente conhecida pela sua diversidade biológica, seja de
espécies vegetais, animais ou microrganismos. Do ponto de vista biotecnológico, essa
biodiversidade apresenta uma importante ferramenta para o desenvolvimento de tecnologias e
alternativas que venham a servir para os mais variados setores da vida humana.
227
A região amazônica, em grande parte de sua área, sofre constantemente com ações
antrópicas. Como exemplo, pode ser citada a contaminação dos corpos d’água por derivados
de petróleo causando assim um impacto considerável na fauna e flora aquática. Porém,
mesmo em locais extremamente poluídos, é comum notar-se a prevalência de plantas
aquáticas. Isso acontece devido à capacidade do vegetal de resistir e se adaptar à poluição
química da água. Muitas vezes essa capacidade de resistência da planta em ambientes
contaminados está associada à existência de microrganismos em seus tecidos vegetais.
As macrófitas são plantas com ampla dispersão, podendo habitar desde brejos até
locais totalmente submersos. Elas são definidas como formas de vegetação aquáticas visíveis
a olho nu (Rejmánková, 2011). São encontradas em áreas com diferentes níveis de poluição,
o que evidencia a sua capacidade de sobreviver em locais extremamente degradados.
Os microrganismos são agentes principais na ciclagem de nutrientes na região
amazônica, desempenhando papel fundamental na manutenção de ecossistemas por meio dos
ciclos biogeoquímicos por exemplo. A prospecção desses organismos tem fundamental
importância para se manter o conhecimento da diversidade da microbiota existente nesta
região.
Fungos filamentosos destacam-se pelo seu potencial biotecnológico na síntese de
diversos compostos bioativos de interesse para o homem e para o ambiente. Os fungos
endofíticos são microrganismos que vivem no interior dos tecidos vegetais, inclusive de
macrófitas, e que não causam nenhum dano aparente ao seu hospedeiro (Azevedo, 1999). Os
fungos endofíticos diferem dos epifíticos (que vivem na superfície da planta, exteriormente), e
dos fitopatógenos, (que lhes causam doenças). As interações entre endófitos e plantas ainda
não são claramente conhecidas, mas estudos revelam a produção de metabólitos secundários
por parte dos microrganismos que auxiliam a planta em diversos setores (diminuição de
herbivoria, de ataques de insetos e aumento da resistência da planta) (Souza et al, 2004).
Dentre os metabólitos produzidos, as enzimas são amplamente estudadas atualmente. Enzimas
são catalisadores orgânicos que participam de reações químicas nos processos vitais (Cuzzi et
al., 2011). As enzimas são estritamente específicas, e para cada substrato existe uma enzima.
No caso do amido, a enzima responsável por sua quebra é a amilase. As amilases são enzimas
facilmente encontradas na natureza e de grande importância biotecnológica tais como
indústria têxtil, produção de bebidas, indústrias químicas e farmacêuticas. A utilização de
enzimas produzidas por microrganismos vem sendo ampliada devido as maiores facilidades
quando comparados a animais e vegetais. A produção em larga escala e a aplicação quase
completa da hidrólise do amido são características das enzimas sintetizadas por
228
microrganismos (Soares et al., 2009). As lipases são enzimas hidrolíticas que atuam na
aceleração dos processos de clivagem das ligações ésteres de trigliceraldeídos liberando
ácidos graxos e glicerol (Garcia, 2011). As lipases são encontradas na natureza em animais,
vegetais e microrganismos. Por serem compostos específicos e de fácil regulação, estão sendo
bastante utilizadas em indústrias de modo geral. As enzimas naturais são interessantes pela
ampla diversidade bioquímica, facilidade quanto à manipulação genética e possibilidade de
produção das mesmas em larga escala. O estudo de endófitos em macrófitas aquáticas de
ecossistemas amazônicos representa significativo conhecimento dos mecanismos de
adaptação destes vegetais aos peculiares ambientes desta região, desvendando suas vias
biossintéticas que podem ser exploradas com fins biotecnológicos.
Material e Métodos
Foram coletadas folhas e raízes de Eichhornia crassipes do porto do centro da cidade
de Manaus-AM. As amostras foram submetidas à higienização e em câmara de fluxo laminar,
o material foi lavado em água destilada e mergulhado em álcool 70% por 1 minuto,
introduzido em solução de hipoclorito a 2,5% por 1 minuto, submerso em álcool 70% por 30
segundos e por último lavado em água destilada (figura 1). O material foi inoculado em 18
placas de Petri com meio BH (L/g: sulfato de magnésio: 0,20, cloreto de cálcio: 0,02, fosfato
monopotássico: 1,0, fosfato dipotássico: 1,0, nitrato de amônio: 1,0, cloreto férrico: 0,05,
ágar: 20,0) acrescido de antibiótico e petróleo. Todas as placas foram identificadas e
incubadas em BOD à temperatura de 18º C, onde permaneceram de três a dez dias.
Figura 1: Assepsia da folha e desinfecção superficial
Conforme o crescimento, os fungos foram repicados para tubos de ensaio onde foram
datados, identificados e guardados. O índice de colonização dos fungos isolados foi calculado
dividindo o número total de fragmentos infectados pelo número total de fragmentos
inoculados. A purificação foi feita por repique sucessivo. A análise qualitativa das enzimas
lipase e amilase produzidas por fungos foi avaliada em placas de Petri contendo meio de
229
cultura específico para cada enzima. Os fungos endofíticos selecionados foram cultivados em
meio BDA por oito dias a 28º C e transferidos para placas com meio específico. Para o teste
de amilase, o meio de cultura foi acrescido de 10 g de amido de milho. Após o crescimento da
cultura, as placas de Petri foram coradas com 5 ml de solução de lugol para verificação do
halo de degradação, evidenciando a atividade amilolítica. Para testar a produção de lipase, o
meio foi acrescido de 10 ml de azeite de oliva e as placas, após crescimento dos fungos, foram
coradas com 2 ml de vermelho de fenol e submetidas a luz ultravioleta. A determinação da
atividade enzimática decorreu da razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro da colônia
acrescido da zona de precipitação. (Hankin & Anagnostakis, 1975). Os resultados foram
classificados em negativos (IE= 1), positivos (1 >IE > 0,64) e fortemente positivos (IE< 0,64).
Após os testes enzimáticos, os fungos que apresentaram resultados positivos foram
caracterizados quanto à morfologia das colônias, por meio de visualizações macroscópicas e
também microscópicas com o uso da técnica de micro cultivo.
Foram isolados 28 fungos endofíticos a partir dos fragmentos da folha e da raiz. O

índice de colonização foi de 47% para a folha e 30% para a raiz. A princípio um número
maior de fungos foi isolado, porém alguns não se tornaram viáveis após repiques sucessivos
em meio BDA. Os fungos foram codificados quanto à origem de isolamento. Após a
purificação, os fungos que demonstraram similaridade quanto às características
macroscópicas foram agrupados, sendo selecionados 11 fungos para os ensaios enzimáticos.
O teste para produção de amilase evidenciou atividade enzimática em quatro fungos e o de
produção de lipase detectou atividade em um fungo. Os isolados que apresentaram atividade
enzimática foram caracterizados morfologicamente após análise macro e microscópica, sendo
possível a identificação preliminar dos gêneros: Aspergillus sp, Chaetomium sp. e Verticillium
sp. havendo, no entanto, a necessidade de ser feita a caracterização molecular para
confirmação desses resultados (tabela 1).
Tabela 1. Relação dos fungos endofiticos isolados.
Cód Cor Textura Taxa

Anverso: Marrom Arenosa Aspergillus sp.
FEC 8
Verso: Laranja claro
Anverso: Branco/cinza Algodonosa Chaetomium sp.
FEC 15
Verso: Bege
REC Anverso: Branco Veludosa Verticillium sp.
230
Cód Cor Textura Taxa
14 Verso: Mista (marrom e verde)
Anverso: Branco/cinza Algodonosa
FEC 2 Não identificado
Verso: negro
Estes gêneros apresentaram índice enzimático para amilase de 0,77, 0,67 e 0,53
respectivamente. Não foi possível identificar o isolado codificado como FEC 2 pois não
foram visualizadas estruturas reprodutivas e/ou esporos nas lâminas. Este fungo apresentou
para a amilase o índice enzimático de 0,54 (Figuras 2 e 3). Foi detectada atividade enzimática
para lipase apenas no gênero Chaetomium sp. com o valor de 0,76 (tabela 2).
Figura 2. Testes enzimáticos para amilase em três fungos (A) Aspergillus sp.; (B) FEC 2; (C)
Verticillium sp.
Figura 3. Teste enzimático para lipase. Fungo Chaetomium sp.
Tabela 2. Resultados dos testes enzimáticos
Valor do IE Caracterização do IE
Fungo
Amilase Lipase Amilase Lipase
Aspergillus sp. 0,77 - Positivo -
Chaetomium sp. 0,67 0,76 Positivo Positivo
231
Verticillium sp. 0,53 - Fortemente positivo -
FEC 2 0,54 - Fortemente positivo -
A metodologia para isolamento de endófitos utilizada neste trabalho é descrita

também em outros estudos (Souza et al., 2004). Em meio seletivo, Batista (2009) obteve um
índice de colonização de 48,1%, para folha, e se comparado a este trabalho evidencia uma
semelhança. Já em meios não seletivos, a porcentagem de colonização é muito maior,
podendo chegar até em 100% (Silva, 2006). Cuzzi et al (2011) realizaram ensaios para
determinação enzimática usando fungos do gênero Aspergillus sp., que apresentaram um
índice enzimático de 0,66 para amilase e do gênero Chaetomium sp., que para amilase teve
um índice de 0,92 e para lipase de 0,93, resultados que corroboram com este trabalho. Neste
estudo o fungo do gênero Verticillium sp. apresentou o maior índice de atividade enzimática
que foi de 0,53 e o do gênero Chaetomium sp. apresentou resultados tanto para produção de
amilase quanto para lipase, sendo 0,67 e 0,76, respectivamente. O gênero Aspergillus sp. é
comumente encontrado em trabalhos de isolamento e identificação de fungos (Souza et al.,
2004). Cuzzi et al (2011) evidenciam a versatilidade e o potencial enzimático dos gêneros
Chaetomium sp. e Aspergillus sp., apresentando atividade enzimática para amilase, lipase e
protease com resultados positivo para todas as enzimas ensaiadas. Um estudo sobre fungos
endofíticos como fontes de metabólitos secundários relatou o isolamento de um fungo do
gênero Chaetomium sp. e sua grande potencialidade de apresentar atividade biológica
(Borges, 2008).
Conclusões
A atividade enzimática detectada em quatro dos isolados apresentou índices positivos

quando comparados a trabalhos semelhantes.
Os gêneros preliminarmente identificados podem ser promissores podendo ser
avaliados em outras condições de cultivo e com o uso de outras metodologias.
Faz-se necessária a identificação molecular dos fungos isolados.
Referências
232
Azevedo JL (1999) Botânica: uma ciência básica ou aplicada? Revista Brasileira de Botânica.
22 n.2: 225-229.
Batista IH (2009) Biorremediação de ambientes aquáticos contaminados por resíduos de

petróleo: um estudo com bactérias isoladas de Eichornia crassipes na Amazônia. Manaus,
Brasil, 185p (Tese). Doutorado em Biotecnologia-UFAM
Borges WS (2008) Estudo de fungos endofíticos associados a planta da família Asteraceae

como fonte de metabólitos secundários em processos de biotransformação. USP.
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-27082008-092456/pt-br.php
Cuzzi C, Link S, Vilani A, Onofre SB (2011) Enzimas extracelulares produzidas por fungos
endofíticos isolados de Baccharis dracunculifolia D.C. (asteraeceae). Global Science and
Technology 4(2):47-57.
Garcia, AK (2010). Avaliação da atividade lipolítica de fungos filamentosos da costa

brasileira. /Alexandre Kopte Garcia, São Paulo.
Hankin L, Anagnostakis SG (1975) The use of solid media for detection of enzyme
production by fungi. Mycology. 67:597-607.
Rejmánková E (2011) The role of macrophytes in wetland ecosystems. Journal of Ecology

and Field Biology. 34(4):333-345.
Silva RLO, et al (2006) Fungos endofíticos em Annona spp.: isolamento, caracterização

enzimática e promoção do crescimento em mudas de pinha (Annona squamosa L.). Acta
Botânica Brasileira. 20: 649-655.
Soares IA, Flores AC, Zanettin L, Pin HK, Mendonça MM, Barcelos RP, Trevisol LR,
Carvalho RD, Schauren D, Rocha CLMSC, Baroni S, (2010). Identificação do potencial
amilolítico de linhagens mutantes do fungo filamentoso Aspergillus nudulans. Ciênc. Tecnol.
Aliment. [ONLINE] 30(3):700-705.
Souza AQL, Souza ADL, Filho AS, Pinheiro MLB, Sarquis MIM, Pereira, JO (2004)
Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da Amazônia:
Palicourea longiflora (Aubl.) Rich e Strychnos cogens Bentham. Acta Amazonica. 34:185-
195.
233
Coleções de Microrganismos da Embrapa: De Requisitos Corporativos

da Qualidade à Acreditação
Castro C.S.P.
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, [email protected]
Resumo
As coleções estruturadas e organizadas por meio de um modelo de gestão único

e integrado são essenciais para a sociedade brasileira, pois geram produtos, tecnologias
e serviços que podem causar impactos diretos na melhoria da qualidade de vida da
população. São exemplos desses benefícios os bioinseticidas, capazes de controlar
insetos-praga e mosquitos transmissores de doenças sem causar danos à saúde humana,
aos animais e ao meio ambiente, o uso de microrganismos no processo de elaboração de
bebidas, alimentos, combustíveis, fixação de nitrogênio, proteção da saúde animal e
controle biológico. A acreditação de ensaios na Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025
trouxe os seguintes benefícios para o LBE e a Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia: Rastreabilidade aos ensaios (Registros); Confiabilidade dos resultados
(Programa de Equipamentos, Obras e Reformas, Programa de treinamento,
Padronização de procedimentos, Sistema de Auditoria Interna); Gestão do
conhecimento (Procedimentos, Instruções, Registros); Competência técnica atestada
(nacional/internacional); Minimização/Eliminação do retrabalho e desperdício;
Melhoria do ambiente de trabalho; Satisfação do cliente, ganho de mercado (aumento da
competitividade).
Palavras-chave: Preservação de micro-organismos, bioinseticidas.
Introdução
As coleções de microrganismos têm sido estabelecidas ao longo dos anos para

preservar exemplares da biodiversidade e garantir a conservação do patrimônio
genético.
234
Na Embrapa, as coleções de microrganismos nasceram com a própria empresa,
na década de 70, e estão distribuídas por todo o território nacional. Hoje são 16
coleções, classificadas em três categorias (Centros de Recursos Biológicos-CRBs,
Coleções Institucionais-CIs e Coleções de Trabalho-CTs), que preservam
microrganismos restritos aos níveis de risco de biossegurança 1 e 2 (fungos
filamentosos, bactérias, vírus, micoplasmas, leveduras, cogumelos e algas
microscópicas) e que possuem funcionalidades diversas, como por exemplo o controle
biológico de pragas, a fixação biológica de nitrogênio e fertilidade do solo, a
agroindústria e os agentes patogênicos de animais e de plantas. As informações
associadas a estes microrganismos estão inseridas no Sistema de Informação
AleloMicro (http://alelomicro.cenargen.embrapa.br/AleloMicro).
Os CRBs, as CIs e as CTs da Embrapa têm como missão contribuir para o

desenvolvimento científico e tecnológico do País, por meio da realização de atividades
especializadas, de serviço e suporte científico em microbiologia básica e aplicada à
agricultura, pecuária e agroindústria e da disseminação de informações científicas e
tecnológicas. O CRB da Embrapa é composto por coleções de microrganismos de
quatro Unidades da Embrapa (CENARGEN, CNPAB, CNPMA, CNPSO), que estão
buscando reconhecimento formal junto à Coordenação Geral de Acreditação
(CGCRE)/Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO), por
meio da acreditação de suas atividades de ensaio e de produção de materiais de
referência. O CRB da Embrapa atende a Requisitos Corporativos da Qualidade que
contemplam todos os requisitos das Normas NIT-DICLA 061, ABNT NBR ISO/IEC
17025, Versão Brasileira do Documento Diretrizes da Organização para a Cooperação e
Desenvolvimento Econômico (OCDE) de Boas Práticas para Centros de Recursos
Biológicos e/ou ABNT ISO GUIA 34. No Brasil, está sendo estruturada pelo Ministério
da Ciência, Tecnologia e Inovação uma Rede de CRBs (Portaria No 409 de 15/04/14) de
modo a abranger os quatro principais segmentos estratégicos para o desenvolvimento da
biotecnologia: Saúde, Agronegócios, Ambiente e Indústria, sendo a Embrapa a
instituição âncora responsável pelo CRB Agronegócio. As CIs da Embrapa são
compostas por coleções de microrganismos de cinco Unidades da Embrapa (CNPAF,
CNPGL, CNPMS, CNPSA, CNPUV) e atendem a várias pesquisas e/ou Instituições e a
Requisitos Corporativos da Qualidade estabelecidos a partir das Normas ABNT NBR
ISO/IEC 17025 e Versão Brasileira do Documento Diretrizes da OCDE de Boas
235
Práticas para Centros de Recursos Biológicos. As CTs da Embrapa são compostas por
coleções de microrganismos de sete Unidades da Embrapa (CNPAE, CNPAT, CNPC,
CPAC, CPACT, CPAO, CTAA) e estão vinculadas aos CRBs ou às CIs. As CTs da
Embrapa atendem a um único ou a vários projetos de pesquisa e a Requisitos
Corporativos da Qualidade estabelecidos a partir das Normas ABNT NBR ISO/IEC
17025 e Versão Brasileira do Documento Diretrizes da OCDE de Boas Práticas para
Centros de Recursos Biológicos.
Material e Métodos
As coleções de microrganismos da Embrapa têm sido organizadas

corporativamente desde 2001, por meio de projetos de pesquisa e de desenvolvimento
institucional estruturados em rede e financiados pela Embrapa e por Instituições
Externas. Em 2009, a gestão da qualidade passou a integrar esses projetos como o
principal pilar do processo de organização das coleções. Em 2014, como resultado dessa
iniciativa foi desenvolvido um modelo corporativo de gestão para as coleções de
microrganismos da Embrapa, tomando como base o diagnóstico das coleções, o
benchmarking de coleções nacionais e internacionais e o mapeamento dos processos de
gestão das coleções (Castro et al., 2015). O Modelo está estruturado em 13 capítulos (1.
Legislações aplicáveis a Recursos Genéticos Microbianos; 2. Estrutura Organizacional;
3. Sustentabilidade; 4. Processos de Gestão; 5. Critérios para armazenamento de
material biológico; 6. Documentos; 7. Registros; 8. Pessoal; 9. Infraestrutura; 10.
Requisitos Corporativos da Qualidade; 11. Biorrisco; 12. Serviços e Parcerias; 13.
Divulgação) e 23 anexos. A implantação desse modelo tem como objetivos: alcançar
níveis de excelência; satisfazer normas nacionais e internacionais e as regulações de
biorrisco e acessibilidade e garantir a harmonização dos procedimentos e processos das
três categorias de coleções de microrganismos da Embrapa (CRBs, CIs e CTs).
O capítulo 10 desse modelo estabelece Requisitos Corporativos da Qualidade

que devem ser implementados por cada categoria de coleção (Pontes et al., 2015). Esses
requisitos foram selecionados a partir de três normas de qualidade (ABNT NBR
ISO/IEC 17025, Versão Brasileira do Documento Diretrizes da OCDE de Boas Práticas
para Centros de Recursos Biológicos e ABNT ISO GUIA 34) e sua complexidade e
número variam de acordo com a categoria da coleção, sendo os CRBs os que possuem o
236
maior nível de exigência por estarem buscando a acreditação segundo às Normas ABNT
NBR ISO/IEC 17025, ABNT ISO GUIA 34 e NIT-DICLA 061 junto à
CGCRE/INMETRO. Os requisitos corporativos de qualidade aplicáveis às CIs e CTs
incluem documentos (internos e externos), registros (impressos e eletrônicos),
infraestrutura (instalações, condições ambientais e equipamentos) e pessoal
(treinamento e capacitação).
Uma das coleções que constitui o CRB da Embrapa, a Coleção de Bactérias de

Invertebrados, a qual integra o CRB da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e
está localizada no Laboratório de Bactérias Entomopatogências (LBE), já deu os
primeiros passos desse processo de acreditação. O LBE obteve em fevereiro de 2014 a
acreditação na Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025 junto à CGCRE/INMETRO de dois
ensaios biológicos (Determinação da toxicidade de Bioinseticidas a base de Bacillus
thuringiensis e Bacillus sphaericus (Lysinibacillus sphaericus) a larvas de mosquitos e
Determinação da toxicidade de Bioinseticidas a base de Bacillus thuringiensis a larvas
de lepidópteros) e em 2016 pretende obter a acreditação de mais três ensaios
(Identificação de Bacillus thuringiensis e Lysinibacillus sphaericus (Bacillus
sphaericus); Teste de viabilidade de amostras de Bacillus thuringiensis e Lysinibacillus
sphaericus (Bacillus sphaericus) e Teste de pureza de amostras de Bacillus
thuringiensis e Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus)) da Coleção de Bactérias
de Invertebrados na Norma NIT-DICLA 061 junto à CGCRE/INMETRO. A
metodologia utilizada pelo LBE para a obtenção da acreditação foi a desenvolvida pela
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e envolve 20 passos (Diagnóstico,
Sensibilização, Estrutura do Sistema da Qualidade, Estrutura Física da Gerência da
Qualidade, Plano de Ação da Gerência da Qualidade, Aprendizado das Normas de
Qualidade, Política e Objetivos da Qualidade, Manual da Qualidade, Procedimento
Operacional Padrão Zero, Planos da Qualidade, Lista Mestra de Documentos do
Sistema da Qualidade, Procedimentos Operacionais Padrão Gerenciais, Procedimentos
Operacionais Padrão Técnicos e de Equipamentos, Formação de Auditores Internos da
Qualidade, Sistema de Auditoria Interna da Qualidade, Análise Crítica do Sistema da
Qualidade, Solicitação de Acreditação, Auditoria Externa, Acreditação, Melhoria
Contínua). A acreditação do LBE envolveu os seguintes Núcleos, Setores e Chefias da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia: Núcleo de Gestão da Qualidade (NGQ),
Núcleo de Comunicação Organizacional (NCO), Núcleo de Tecnologia da Informação
237
(NTI), Setor de Gestão de Pessoas (SGP), Setor de Gestão de Patrimônio e Suprimentos
(SPS), Setor de Implementação de Programação de Transferência de Tecnologia (SIPT),
Chefia Geral (CGE), Chefia Adjunta de Administração (CHADM) e Chefia Adjunta de
Transferência de Tecnologia (CHTT).
Um grande número de resultados obtidos a partir da implantação do modelo

corporativo de gestão nas coleções de microrganismos e da acreditação junto à
CGCRE/INMETRO podem ser enumerados: implantação de um programa de
treinamento e sensibilização nas normas de qualidade e em temas técnicos, implantação
da gestão de documentos e registros, implantação de um sistema de informação para as
coleções de microrganismos, implantação da gestão de equipamentos e instrumentos de
medição, adequação das instalações físicas, controle das condições ambientais,
implantação do programa 5S, implantação de um sistema de auditoria interna e a
melhoria contínua.
Conclusões
As coleções estruturadas e organizadas por meio de um modelo de gestão único

e integrado são essenciais para a sociedade brasileira, pois geram produtos, tecnologias
e serviços que podem causar impactos diretos na melhoria da qualidade de vida da
população. São exemplos desses benefícios os bioinseticidas, capazes de controlar
insetos-praga e mosquitos transmissores de doenças sem causar danos à saúde humana,
aos animais e ao meio ambiente, o uso de microrganismos no processo de elaboração de
bebidas, alimentos, combustíveis, fixação de nitrogênio, proteção da saúde animal e
controle biológico.
A acreditação de ensaios na Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025 trouxe os

seguintes benefícios para o LBE e a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia:
Rastreabilidade aos ensaios (Registros); Confiabilidade dos resultados (Programa de
Equipamentos, Obras e Reformas, Programa de treinamento, Padronização de
procedimentos, Sistema de Auditoria Interna); Gestão do conhecimento
(Procedimentos, Instruções, Registros); Competência técnica atestada
(nacional/internacional); Minimização/Eliminação do retrabalho e desperdício;
238
Melhoria do ambiente de trabalho; Satisfação do cliente, ganho de mercado (aumento da
competitividade).
Referências
ABNT ISO GUIA 34:2012. Requisitos gerais para a competência de produtores de

material de referência. 2ª Ed. 04 de setembro de 2012. 41 p.
ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005. Requisitos Gerais para a Competência de

Laboratórios de Ensaio e Calibração. 2ª Ed. 30 de setembro de 2005. 31 p.
DOQ-CGCRE-034. Versão Brasileira do Documento Diretrizes da OCDE de Boas

Práticas para centros de recursos Biológicos: documento de caráter orientativo.
Coordenação Geral de Acreditação. INMETRO. Set/2012. 47 p.
NIT-DICLA-061. Requisitos sobre a Acreditação dos Laboratórios de Ensaio dos

Produtores de Materiais de Referência dos Centros de Recursos Biológicos. INMETRO.
Rev. 02. Dezembro de 2012. 13 p.
Castro CSP, Coutinho MV, Silva FA, Silva GA, Lima LHC, Brito MAVP, Cunha MH,
Avidos MFD, Burle ML, Aquino M, Lopes RB, Pontes RMS, Costa SPP (2015)
Diretrizes de Gestão para Coleções de Microrganismos da Embrapa.
https://www.embrapa.br/documents/1355163/8357672/Cartilha+Diretrizes+de+Gestao
+para+Colecoes+de+Microrganismos+da+Embrapa/4401fe79-2fa2-4135-9fb5-
db72f878b01b
Pontes RMS, Castro CSP, Coutinho MV, Lima LHC (2015) Requisitos Corporativos de
Qualidade para Coleções de Microrganismos da Embrapa.
https://www.embrapa.br/documents/1355163/8357672/Cartilha+Requisitos+Corporativ
os+de+Qualidade+para+Colecoes+de+Microrganismos+da+Embrapa/42320ac2-aebf-
471b-86ce-63a4f6f08b24
Agradecimentos
À Embrapa, ao CNPq e à FINEP pelo suporte financeiro. Às equipes do NGQ, LBE e

projeto GESTCOL por todo empenho e trabalho desenvolvido no desenvolvimento do
modelo corporativo de gestão para as coleções de microrganismos da Embrapa e no
processo de acreditação dos ensaios do LBE junto à CGCRE/INMETRO. À Chefia
239
Geral da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia pelo apoio e comprometimento
com o processo de acreditação dos ensaios do LBE junto à CGCRE/INMETRO.
240
Uso de marcadores fenotípicos e bioquímicos para caracterização de

isolados de Aspergillus seção Flavi
Couto F.A.1,2,3, Santos C.4, Dias E.S.3, Lima N.2, Batista L.R.3,5
Instituto Federal Goiano, Ceres, GO, Brasil/ 2Centro de Engenharia Biológica, Micoteca da
1,2,3
Universidade do Minho, Braga, Portugal, 3Departamento de Biologia, Universidade Federal de

Lavras, Lavras, MG, Brasil, 4Departamento de Ciências Químicas e Recursos Naturais, BIOREN-
UFRO, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile, 5Departamento de Engenharia de Alimentos,
Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, Brazil.
Resumo
Os fungos do gênero Aspergillus seção Flavi representam uma das seções mais
importantes do gênero e apresentam elevada variabilidade morfológica e bioquímica.
Com o advento da abordagem polifásica, sua taxonomia tem sido constantemente
revisada. O presente trabalho teve como objetivo utilizar diferentes metodologias para
verificar o poder discriminatório dos métodos morfológico, bioquímico, molecular e de
espectrometria de massas de isolados de Aspergillus seção Flavi. Trinta e um isolados
foram analisados pelos métodos macro e micromorfológicos, potencial micotoxigênico,
sequências parciais do gene da calmodulina e espectros de massas pela técnica de
MALDI-TOF MS. Os dendrogramas foram gerados e os resultados foram comparados.
Foi possível identificar pelo método morfológico 100% dos isolados dos quais 90,6%
foram produtores de micotoxinas. Os resultados do MALDI-TOF MS apresentaram
elevado poder discriminatório. Contudo, através da base de dados utilizada
(SARAMISTM), não foi possível a identificação de todos os isolados por MALDI-TOF
MS. Os dados da biologia molecular confirmaram todos os resultados obtidos pela
caracterização morfológica. A integração dos diferentes métodos de identificação fúngica
é fundamental para obter uma caracterização taxonômica eficiente, conduzindo a uma
utilização segura desses fungos em processos biotecnológicos.
Palavras-chave: Identificação de fungos, MALDI-TOF, Morfologia de fungos.
241
Introdução
Aspergillus seção Flavi são fungos do subgênero Circumdati (Klich, 2002)
considerados patógenos de humanos e animais, alérgenos e produtores de micotoxinas,
sendo as principais dentro destas as aflatoxinas e o ácido ciclopiazônico (Rodrigues et al.,
2009). Essas espécies representam risco à indústria de alimentos, pois provocam
deterioração aos produtos agrícolas armazenados (Baquião et al., 2013).
Tradicionalmente, os fungos pertencentes à seção Flavi têm sidos caracterizados
pela técnica morfológica. Entretanto, a identificação clássica utiliza características
morfológicas variáveis, por isso é considerada demorada e necessita de profissionais
qualificados (Sirisomboon et al., 2013). Sendo assim, a biologia molecular tem sido uma
ferramenta fundamental para complementar os dados morfológicos e permitir a correta
identificação dos fungos (Simões et al., 2013). Contudo, as técnicas moleculares também
apresentam limitações, pois observa-se com frequência que a similaridade genética entre
as espécies da Seção Flavi tem dificultado a elaboração de marcadores moleculares
eficientes (Rodrigues et al., 2009). Além de permitir a identificação das espécies de
fungos, as técnicas moleculares também têm sido requeridas para distinguir as espécies
toxigênicas das não toxigênicas, através da correlação da presença ou ausência de genes
envolvidos na biossíntese das micotoxinas (Samson e Varga, 2012).
A identificação da seção Flavi é considerada complexa e assim como em outros
grupos de fungos, está em constante evolução (Rodrigues et al., 2011). Sendo assim, é
importante compreender que até ao momento nenhum método per se, seja ele
morfológico, bioquímico ou molecular, é capaz de discriminar todas as espécies. Por esse
motivo é que a abordagem polifásica tem sido fortemente apoiada pelos taxonomistas
(Rodrigues et al., 2011; Simões et al., 2013). Adicionalmente, novas técnicas têm sido
incluídas na abordagem polifásica para a identificação de fungos, como é o caso da
técnica de MALDI-TOF MS (Rodrigues et al., 2011), que gera espectros de massa e
funcionam como “impressões digitais” únicas para cada microrganismo.
O objetivo do presente estudo foi utilizar dados morfológicos, fisiológicos,
bioquímicos, molecular e de espectrometria de massas por MALDI-TOF MS para
caracterizar 31 isolados de Aspergillus seção Flavi, oriundos da Coleção de Culturas do
Departamento de Ciência dos Alimentos (CCDCA, Universidade Federal de Lavras-
UFLA, Lavras, MG, Brasil) e da Micoteca da Universidade do Minho (MUM, Braga,
Portugal).
242
Material e métodos
Caracterização morfológica dos isolados
Vinte isolados de Aspergillus da seção Flavi foram obtidos da CCDCA (Tabela
1). Onze espécies representando linhagens tipo e de referência obtidas da MUM foram
também utilizadas (A. bertholletius- MUM 12.11, A. flavus- MUM 10.232, A.
minisclerotigenes- MUM 10.203, A. mottae- MUM 10.231, A. novoparasiticus- MUM
15.15, A. oryzae- MUM 10.242, A. parasiticus- MUM 10.201, A. sergii- MUM 10.219,
A. sojae- MUM 10.241, A. tamarii- MUM 00.10 e A. transmontanensis- MUM 10.214).
Os fungos foram crescidos em quatro meios de cultivos diferentes e padronizados:
Czapeck Yeast Ágar – CYA, incubados às temperaturas de 25 e 37 ºC por sete dias;
Extrato de Malte- MEA a 25 ºC por sete dias e Czapek – CZ a 25 ºC por sete dias. Após
o período de crescimento, foram observadas as características morfológicas (macro e
microscópicas) descritas conforme Klich (2002). Os isolados foram cultivados no meio
A. flavus e A. parasiticus Agar (AFPA; Oxoid, Basingstoke, Reino Unido), por cinco dias
a 25 °C, no escuro.
Análise micotoxigênica
Os isolados foram cultivados em meio Yeast Extract Sucrose Agar - YES e
incubados a 25 ºC por sete dias. A extração das aflatoxinas foi realizada conforme
Bragulat et al. (2001). As amostras foram analisadas utilizando um HPLC equipado com
um detector de fluorescência Jasco FP-920. As separações cromatográficas foram
realizados em uma coluna C18 (Waters Spherisorb ODS2, 4,6 mm x 250 mm, 5 mm),
equipado com uma pré-coluna com a mesma fase estacionária.
A produção de ácido ciclopiazônico também foi analisada. Todos os isolados
foram cultivados no meio Czapeck Yeast Ágar – CYA e incubados a 25 ºC por 14 dias e
a extração da micotoxina seguiu o protocolo de Gqaleni et al. (1997). As amostras foram
analisadas utilizando um HPLC equipado com um detector Varian 2050 UV (285 nm).
As separações cromatográficas foram realizadas em uma coluna EuroSpher 100 NH2
(Knauer, 4,6 mm x 250 mm, 5m), precedido de uma pré-coluna com a mesma fase
estacionária.
243
Perfis proteômicos por MALDI-TOF MS
As culturas de Aspergillus foram cultivadas em meio de cultivo MEA e incubadas
no escuro por cinco dias a 28 ºC. A Escherichia coli DH5 foi utilizada como padrão
para a calibração externa do MALDI-TOF MS. Após o período de incubação, c.a. de 1
μg da mistura esporo/micélio jovem de cada microrganismo foi transferido diretamente
da placa de cultura para o placa de aço inoxidável de MALDI-TOF MS. Imediatamente,
0,5 μl de solução de matriz (75 mg/ml de ácido 2,5- diidroxibenzoico em
água/etanol/acetonitrila (1:1:1) com 0,03% de ácido trifluoroacético) foram adicionados
a cada poço da placa.
As análises foram realizadas em um sistema Axima LNR (Kratos Analytical,
Shimadzu, UK) equipado com um laser de nitrogênio (337 nm). Após a obtenção dos
espectros, as listas de picos foram exportadas para o programa SARAMIS™ (Spectral
Archiving and Microbial Identification System, AnagnosTec, Germany,
www.anagnostec.eu), onde se obteve a identificação microbiana, por meio de comparação
das listas de picos das amostras individuais com as listas de picos disponíveis no banco
de dados SARAMIS™.
Sequenciamento parcial do gene da calmodulina

Os vinte isolados de Aspergillus seção Flavi da CCDCA foram selecionados para
esta análise. Após a extração do DNA, realizou-se a amplificação parcial do gene da
calmodulina (primers CL1 5'-GA(GA)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC-3' e CL2A 5'-
TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3'). Os produtos da amplificação foram separados por
eletroforese em gel a 1% de agarose e corados com Syber Green. Os fragmentos de DNA
foram visualizados e fotografados num transiluminador MiniBIS Pro, DNR. Os produtos
da PCR foram sequenciados pela Macrogen Inc. (Seul, Coreia do Sul). As sequências
obtidas foram comparadas com o banco de dados do GenBank, usando o algoritmo
BLAST (National Center for Biotechnology Information, Maryland, USA). As árvores
filogenéticas foram construídas pelo método de Neighbor-joining no programa MEGA5.
244
Caracterização morfológica
Com base nas análises macroscópicas (CYA, CZ e MEA) e microscópicas, os 20
isolados da CCDCA distinguiram-se em três principais morfotipos: I - 13 isolados com
coloração verde-claro, com conídios lisos a finamente rugosos e variação no morfotipo,
sendo uni e biseriados (A. flavus), II - 4 isolados que apresentaram distinta cor marrom,
presença de conídios globosos, com parede rugosa e predominantemente bisseriados (A.
tamarii), e III - três isolados que apresentaram coloração verde-escuro, esporos esféricos
com parede rugosa e morfotipos predominantemente uniseriados (A. parasiticus) (Tabela
1). Rodrigues et al. (2011) analisaram isolados de Aspergillus da seção Flavi e, com base
nas análises morfológicas, também obtiveram três morfotipos, sendo eles A. flavus, A.
parasiticus e A. tamarii. Dentre os isolados analisados neste estudo, um se destacou dos
demais (CCDCA 42), pois apresentou no reverso do meio CYA 37 °C, uma coloração
mais escura do que os outros isolados de A. tamarii. A espécie da Seção Flavi, A.
bertholletius também mostrou característica diferenciada nesse meio de cultivo, com um
crescimento lento (Taniwaki et al., 2012). Portanto, outras análises foram necessárias
para confirmar sua identificação morfológica.
Perfil micotoxigênico
As micotoxinas produzidas em vários substratos pelos fungos filamentosos
também têm sido utilizadas para auxiliar o estudo taxonômico. Entre os fungos da
CCDCA e da MUM, 70,96% (22/31) foram produtores de aflatoxinas, sendo 70,96%
(22/31) de isolados produtores de aflatoxina do tipo B e 25,8% (8/31) do tipo G (Tabela
1). Diversos autores também têm utilizado o perfil micotoxigênico para complementar os
dados taxonômicos (Silva et al., 2015; Soares et al., 2012; Taniwaki et al., 2012). Para as
estirpes de A. flavus, observaram-se diferentes padrões de síntese de aflatoxinas, de
acordo com o substrato utilizado. Quarenta por cento dos isolados (6/15) de A. flavus
sintetizaram AFLA B1 e CPA, 46,6% (7/15) produziram BI, B2 e CPA e em apenas
13,33% (2/15) dos isolados não foi detectada a síntese de micotoxinas, de acordo com a
metodologia utilizada (HPLC). Os isolados de A. tamarii também apresentaram elevado
perfil toxigênico pois 100% (4/4) dos isolados não produziram aflatoxinas, mas
sintetizaram ácido ciclopiazônico. Observou-se que o perfil micotoxigênico de A.
parasiticus foi bem consistente, pois sintetizou AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2 e não
produziu CPA (Tab 1).
245
Tabela 1 Marcadores morfológicos e bioquímicos utilizados na identificação dos isolados Aspergillus seção Flavi
Origem dos isolados Perfil químico
Código da Coleção Classificação Origem Diâmetro dos Textura Seriação AFLA AFLA AFLA AFLA CPA
fenotípica conídios (μm) B1 B2 G1 G2
MUM 12.11 A. bertholletius Castanha do Brasil 6.0 f/e u - - - - +
CCDCA 044 A. flavus Pimenta 4.5 l b + - - - -
CCDCA 046 A. flavus Uva 4.5 l b + + - - +
CCDCA 047 A. flavus Ração Humana 3.8 l b + - - - +
CCDCA 048 A. flavus Café 3.5 l u/b + - - - +
CCDCA 049 A. flavus Café 4.0 l b + + - - +
CCDCA 050 A. flavus Uva 4.0 l b + - - - +
CCDCA 051 A. flavus Uva 4.5 f/r u/b + + - - +
CCDCA 052 A. flavus Ração Humana 4.5 f/r u/b + - - - +
CCDCA 053 A. flavus Pimenta 4.5 l u/b n/d n/d - - +
CCDCA 054 A. flavus Ração Humana 3.8 f/r b + + - - +
CCDCA 055 A. flavus Ração Humana 3.8 l u/b + - - - +
CCDCA 056 A. flavus Uva 4.3 l u/b + + - - +
CCDCA 057 A. flavus Café 4.5 f/r u/b n/d n/d - - -
CCDCA 058 A. flavus Ração Humana 4.5 f/r u/b + + - - +
MUM 10.232 A. flavus Milho 4.8 l b + + - - +
MUM 10.203 A.minisclerotigenes Fruto de Prunus dulcis 3.5 l b + + - - +
MUM 10.231 A. mottae Milho 3.5 f/r b + + + + +
MUM 15.15 A. novoparasiticus - 3.5 r b + + + + -
MUM 10.242 A. oryzae - 4.5 f/r u - - - - +
CCDCA 043 A. parasiticus Café 4.5 r u + + + + -
CCDCA 045 A. parasiticus Café 4.5 r u/b + + + + -
CCDCA 059 A. parasiticus Uva 4.5 r u + + + + -
MUM 10.201 A. parasiticus Fruto de Prunus dulcis 4.5 u + + + + -
MUM 10.219 A. sergii Fruto de Prunus dulcis 3.5 r u + + + + +
MUM 10.241 A. sojae - 4.5 f/r u - - - - -
CCDCA 041 A. tamarii Café 5.0 r b - - - - +
CCDCA 042 A. tamarii Ração Humana 5.5 r b - - - - +
CCDCA 060 A. tamarii Uva 5.0 r b - - - - +
MUM 00.10 A. tamarii Fruto de Prunus dulcis 5.0 r b - - - - +
MUM 10.214 A. transmontanensis Fruto de Prunus dulcis 4.5 r b + + + + -
u: uniseriado; b: bisseriado; n/d: não detectado; AFLA: aflatoxina; CPA: ácido ciclopiazônico; l:liso; f/r: finamente rugoso;
r: rugoso; f/e: finamente; equinulado e n/d: não detectado.
246
Além das aflatoxinas, os fungos da Seção Flavi também são conhecidos por
produzirem outro tipo de micotoxina, conhecida como ácido ciclopiazônico (Chang et al.,
2009). No presente trabalho, 70,96% (22/31) dos isolados foram produtores de CPA. As
principais espécies conhecidas como produtoras de CPA são A. flavus e A. tamarii, mas
A. parasiticus não sintetiza essa micotoxina (Rodrigues et al., 2009).
Análise por MALDI-TOF MS

Os 31 isolados de Aspergillus da seção Flavi utilizados neste estudo foram
agrupados em 13 diferentes clusters. Observa-se que a análise de MALDI-TOF MS
permitiu discriminar espécies morfológicas e bioquimicamente relacionadas (Figura 1).
A. flavus (CCDCA 47)

A. sergii (MUM 10.219)
A. parasiticus (CCDCA 43)
A. parasiticus (MUM 10.201)
A. flavus (MUM 10.232)
A. minisclerotigenes (MUM 10.203)
A. oryzae (MUM 10.242)
A. novoparasiticus (MUM 15.15)
A. tamarii (CCDCA 41)
A. transmontanensis (MUM 10.214)
A. bertholletius (MUM 12.11)
A. tamarii (MUM 00.10)
A. sojae (MUM 10.241)
A. mottae (MUM 10.231)
Figura 1 Dendrogama construído com base das massas de proteínas obtidas no MALDI-
TOF MS das linhagens de Aspergillus seção Flavi.
247
Os isolados da MUM não se agruparam com os isolados da CCDCA, pois o
método de armazenamento utilizado pelas duas coleções de cultura influenciou na análise
de proteínas. Através desses biomarcadores, o isolado (CCDCA 42) identificado
morfologicamente como A. tamarii não se agrupou com os demais A. tamarii. Portanto,
a análise de biologia molecular foi necessária para esclarecer esses resultados. Neste
trabalho observa-se pela primeira vez o perfil proteômico das espécies A. novoparasiticus
e A. bertholletius e o agrupamento dessas com as outras espécies pertencentes à seção
Flavi. Por meio do número e das massas de proteínas, essas espécies notoriamente
formaram grupos separados das demais espécies.
Identificação molecular
A confirmação da identificação morfológica e por perfis proteômicos (MALDI-
TOF MS) dos 20 isolados da CCDCA foi realizada através de análises de biologia
molecular. A Figura 2 apresenta a árvore filogenética obtida a partir do sequenciamento
parcial do gene da calmodulina.
Figura 2 Árvore filogenética (Neighbor Joining) baseada no sequenciamento parcial do

gene da calmodulina dos isolados da CCDCA e de sequências de referência obtidas do
GenBank.
248
O resultado da biologia molecular confirmou a identificação dos 20 isolados da
CCDCA identificados morfologicamente, incluindo o isolado CCDCA 42, identificado
como A. tamarii, mas que não se agrupou com os isolados dessa espécie pelos dados da
técnica de MALDI-TOF MS. Novos estudos precisam ser conduzidos com maior número
de isolados de A. tamari, provenientes de diferentes origens geográficas. Neste caso,
utilizando-se o sequenciamento de outras regiões do genoma, para verificar se existem
espécies crípticas dentro da espécie Aspergillus tamarii.
Conclusões
O uso dos métodos morfológicos, bioquímicos e moleculares permitiu uma
identificação mais precisa das espécies da Seção Flavi preservadas na CCDCA.
Esses dados mostram a robustez da técnica morfológica, pois 100% dos isolados
identificados pela análise morfológica foram confirmados por biologia molecular e
quando a morfologia é comparada aos perfis proteômicos (MALDI-TOF MS) para
identificação de fungos, obteve-se 95% de confiabilidade.
Referências
Baquião AC, Oliveira MMM, Reis TA, Zorzete P, Atayde DD, Correa B ( 2013) Polyphasic
approach to the identification of Aspergillus section Flavi isolated from Brazil nuts. Food
Chemistry 139: 1127 – 1132.
Bragulat MR, Abarca ML, Cabañes FJ (2001) An easy screening method for fungi producing
ochratoxin A in pure culture. Int J Food Microbiol 71: 139 -144.
Brase S, Encinas A, Keck J, Nising CF (2009) Chemistry and Biology of Mycotoxins and
Related Fungal Metabolites. Chemical Reviews 109: 3903- 3990.
Gqleni N, Smith JE, Lacey J, Gettinby G (1997) Effects of temperature, water activity, and
incubation time on production of aflatoxins and cyclopiazonic acid by an isolate of Aspergillus
flavus in surface agar culture. Appl Environ Microb 63: 1048 -1053.
Klich MA (2002) Biogeography of Aspergillus species in soil and litter. Mycologia 94: 21–27.
249
Rodrigues P, Venâncio A, Kozakiewicz Z (2009) A polyphasic approch to the identification and
non-aflatoxigenic strains of Aspergillus Section Flavi isolated from Portuguese almonds. Int J
Food Microbiol 129:187–193.
Rodrigues P, Santos C, Venâncio A, Lima N (2011) Species identification of Aspergillus

section Flavi isolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALDI-TOF
ICMS, and molecular approaches. J Appl Microbiol 111: 877-892.
Samson R, Varga J (2012) Molecular Systematics of Aspergillus and its Teleomorphs. In

Aspergillus: Molecular Biology and Genomics. Caister Academic Press. Wymondham, UK.
Santos C, Fraga M E, Kozakiewicz Z, Lima N. Fourier transform infrared as a powerful technique

for the identification and characterization of filamentous fungi and yeasts. Res Microbiol 161:
168-175.
Silva FC, Chalfoun SM, Batista LR, Santos C, Lima N (2015) Use of polyphasi approach
including MALDI-TOF MS for identification of Aspergillus section Flavi strains isolates from
commodities in Brazil. Ann Microbiol 1-11.
Simões MF, Pereira L, Santos C, Lima N (2013) Polyphasic identification and preservation of
fungal diversity: concepts and applications. In: Malik, A., Grohmann, E., Alves, M. (eds.)
Management of Microbial Resources in the Environment. Springer, The Netherlands, 91-117.
Sirisomboon C, Putthang R, Sirisomboon P (2013) Application of near infrared spectroscopy to

detect aflatoxigenic fungal contamination in rice. Food Control 33: 207-214.
Soares C, Rodrigues P, Peterson SW, Lima N, Venâncio A (2012) Three new species of
Aspergillus section Flavi isolated from almonds and maize in Portugal. Mycologia 104: 682–697.
Taniwaki M, Pitt J, Iamanaka B, Sartori D, Copetti M, Balaiee A, Fngaro MH, Frisvad JC

(2012) Aspergillus bertholletius sp. nov. from Brazil nuts. Plos one 7: 1-7.
AGRADECIMENTOS
Fabiana Couto agradece à CAPES (Brasil), pela concessão da bolsa do PDSE- Proc.8161-12-7.
250
Variabilidade genética de Ralstonia solanacearum utilizando

marcadores AFLP.
Demosthenes L.C.R.1, Bentes J.L.S.1, Costa Neto P.Q.1.
1
.Universidade Federal do Amazonas.
Emails: [email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
Ralstonia solanacearum é considerada uma das mais importantes bactérias
fitopatogênicas do mundo, causa a murcha bacteriana, uma doença que afeta várias
espécies de plantas cultivadas, ornamentais e silvestres causando perdas econômicas. O
marcador AFLP foi utilizado para analisar a variabilidade genética entre 30 isolados de
R. solanacearum provenientes de áreas produtoras de hortaliças de quatro munícipios
no Estado do Amazonas. As seis melhores combinações de primers geraram um total de
432 loci polimórficos. Os dados dos perfis eletroforéticos dos marcadores AFLP foram
analisados para a similaridade, variando de 47 loci à 103 na combinação E+AT/M+C.
O coeficiente de similaridade de Jaccard estimado entre os 30 isolados avaliados variou
de 0,01 à 0,98. O dendrograma gerado pelo método UPGMA separou os isolados em
seis grupos com coeficiente de correlação cofenética no valor de r = 0,98. O marcador
AFLP foi eficaz em analisar a variabilidade genética entre indivíduos de R.
solanacearum.
Palavras-chave: murcha bacteriana, pimentão, marcador AFLP
Introdução
A bactéria R. solanacearum é uma espécie heterogênea, que apresenta grande
diversidade fenotípica e genotípica, refletindo numa ampla variedade de hospedeiros,
agressividade e adaptação aos diferentes climas, influenciada pelo genótipo do
hospedeiro, habitat natural e práticas agrícolas utilizadas (Castillo e Greenberg, 2007).
R. solanacearum é tradicionalmente classificada em raças e em biovares (Hayward,
1994). No entanto, em virtude da heterogeneidade da espécie os cientistas sugerem um
251
novo conceito, que não se trata de uma espécie, mas sim de um complexo de espécies,
definido como um conjunto de espécies fortemente relacionadas (Fegan e Prior, 2005).
Fegan e Prior (2005), analisaram a sequência espaçadora intergênica (ITS) 16S-23S e
propuseram uma nova classificação hierárquica na qual, a diversidade existente na
espécie foi subdividida em quatro níveis taxonômicos: espécie, filotipo, sequevar e
clone. Os filotipos são determinados por PCR-Multiplex, de acordo com as variações de
tamanho da sequência na região ITS, existindo quatro filotipos identificados: filotipo I
(estirpes da Ásia); filotipo II (Américas); filotipo III (África); e filotipo IV (Indonésia,
Austrália, Japão e Filipinas). No filotipo II está a estirpe mais conhecida como R.
solanacearum raça 3 biovar 2 que ataca várias solanáceas, incluindo tomate, pimentão e
batata (Castillo e Greenberg 2007). Cada filotipo é subdividido em grupos menores
denominados sequevares, que se refere a uma sequência altamente conservada dentro da
região sequenciada do gene da endoglucanase (egl). Já os clones são identificados por
técnicas como AFLP que permitem identificar diferenças genéticas em outras áreas do
genoma.
O objetivo deste estudo foi avaliar a variabilidade genética de isolados de R.
solanacearum utilizando marcadores AFLP, para obter informações que sirvam de
subsídio para o estabelecimento de medidas de manejo da murcha bacteriana no
Amazonas.
Material e métodos
Foram utilizados 30 isolados de R. solanacearum provenientes da coleta de plantas
com sintomas de murcha bacteriana dos municípios de Iranduba, Manacapuru, Manaus
e Presidente Figueiredo do Estado do Amazonas. Caules de plantas com sintomas foram
levados ao Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Agrárias da
Universidade Federal do Amazonas, onde foi feito o isolamento da bactéria, testes
bioquímicos de identificação da espécies e de patogenicidade.
O DNA genômico de cada um dos isolados obtidos foi extraído conforme
metodologia descrita por Rosa (2008), com modificações e a quantificação foi realizada
em gel de agarose 0,8% por comparações visuais de sua fluorescência com aquelas de
padrões de massa molecular conhecida de DNA do fago lambda nas concentrações de
50 e 100 ng.µL-1, utilizando o corante gel red (Uniscience) para coloração das amostras,
que foram diluídas em água ultra-pura, padronizadas a uma concentração de 10 ng.L-1
e armazenadas à - 20 ºC até o uso.
252
As condições de AFLP foram utilizadas seguindo os procedimentos propostos
por Vos et al. (1995). Foram realizadas reações de digestão do DNA com a combinação
das enzimas de restrição EcoRI/MseI, em seguida a ligação dos adaptadores, seguido
das reações de pré-amplificação utilizando 6 conjuntos de iniciadores complementares
às seqüências dos sítios das enzimas de restrição com um nucleotídeo seletivo e por
último as reações de amplificação seletiva onde foram testadas 25 combinações de
primers. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 6%
realizada no sistema de eletroforese Sequi-Gen GT sob potência constante de 50 W por
três horas. O padrão de bandas apresentado nos géis foi analisado visualmente,
quantificando a presença de bandas entre 50 a 450 pb. Locos polimórficos foram
analisados para presença/ausência de banda, representados por 1 e 0, respectivamente.
Os dados binários foram submetidos à análise de variância pelo programa Genes (Cruz
2006). A similaridade genética entre os genótipos foi analisada através do coeficiente de
Jaccard (Jaccard 1901). A matriz de similaridade foi analisada através do método
UPGMA – Unweightes Pair-group Method with Arithmetic Average. A consistência das
ramificações do dendrograma foi verificada por meio da amostragem repetitiva de
dados com 1000 repetições, utilizando o programa Genes (Cruz 2006).
Os testes realizados para a identificação bioquímica dos isolados produziram os
resultados esperados para R. solanacearum. A análise dos marcadores AFLP obtidos
identificou que das 24 combinações de primers testadas, variando de 1 a 3 nucleotídeos
combinados, seis foram selecionadas por terem gerado um perfil de bandas satisfatório
com boa intensidade e quantidade de loci polimórficos identificados, evidenciando o
alto nível de polimorfismo dos isolados analisados. As seis combinações de primers
utilizadas apresentaram um total de 433 bandas sendo cinco monomórficas e 428
polimórficas, variando de 47 loci na combinação E+AAC/M+CAC até 103 na
combinação E+AT/M+C A variação genética entre os isolados estimada através do
coeficiente de similaridade de Jaccard variou de 0,01 à 0,98. Os isolados mais
relacionados entre si, MAO31 e PRESFIG33 apresentaram coeficiente de similaridade
genética de 0,98.
A partir da matriz de similaridade foi gerado o dendrograma obtido pelo método
UPGMA sendo possível separar os isolados em seis grupos. No grupo I estão os
isolados MAO31, PRESFIG33, MAO30, MAO26, IRAND27, MAO28, MANAC19,
253
IRAND20, IRAND13, MANAC14, MANAC9, IRAND11, IRAND6, MANAC15,
IRAND3, MAO29, o valor de bootstrap de 100% confirma a estabilidade desta
ramificação.
No grupo II ficaram os isolados MANAC8 e MANAC16, com valor de
bootstrap de 100%, demonstrando que está ramificação é consistente, aparecendo
sempre que as análises foram efetuadas pelo programa. O grupo III foi formado pelos
isolados IRAND10, IRAND12, IRAND1, MANAC2 e PRESFIG35. O grupo IV foi
representado pelos isolados IRAND17, MAO34, IRAND21 e MANAC24. Os grupos V
e VI foram formados por apenas um isolado cada um IRAND4 e MANAC23,
respectivamente, que permaneceram isolados dos demais grupos.
O coeficiente de correlação cofenética, valor calculado entre a matriz de dados
binários e o dendrograma gerado, representa a confiabilidade dos dados e apresentou
valor de r = 0,98, confirmando a robustez do dendrograma obtido.
A utilização de testes bioquímicos se baseia em características metabólicas e a
habilidade em utilizar certos substratos, produção ou redução de substâncias,
temperatura ótima de crescimento, reações específicas a certos corantes entre outros.
Kelman (1954) avaliou a característica de isolados de R. solanacearum em vários tipos
de meios e relatou que colônias normais quando em meio contendo tetrazólio, as
colônias normais são fluídas brancas com o centro rosado, enquanto colônias
avirulentas são completamente vermelhas. Os resultados obtidos concordam como os
obtidos por Lemessa e Zeller (2007) que utilizaram testes bioquímicos clássicos para a
identificação e caracterização de isolados de R. solanacearum.
A análise AFLP dos isolados de R. solanacearum foi efetiva em detectar a
variabilidade genética deste complexo, observada pelo grande número de ramificações
detectadas no dendrograma. A análise obtida pelos primers selecionados mostrou que
aqueles que continham as bases seletivas A, C e T foram mais efetivas do que as outras
combinações, pois apresentaram perfis eletroforéticos mais informativos quanto à
diversidade entre os isolados estudados, ou seja, as combinações de primers com a
presença dessas bases apresentou maior número de bandas.
Em estudo utilizando marcadores AFLP, Kositrana et al. (2002) avaliaram a
diversidade genética de R. solanacearum isolados de diversos hospedeiros na Malásia e
Tailândia e encontraram um nível de similaridade de 30% entre as estirpes desses
países. Os autores verificaram ainda a separação em três grupos que foram correlatos às
biovares das estirpes, diferente do resultado que foi obtido com os isolados do presente
254
estudo, onde não foi possível correlacionar os grupos com as biovares das estirpes
utilizadas, possivelmente por se tratarem todos os isolados obtidos de solanáceas e
apenas dois biovares.
A análise dos coeficientes de similaridade gerados permitiu verificar que a
variabilidade genética observada entre os isolados foram causadas pelo perfil genético
de cada isolado e não pela procedência dele ou hospedeiro, uma vez que a maior
diversidade foi encontrada entre os isolados, formando grupos com isolados de
diferentes procedências. Resultado semelhante foi obtido por Jeong et al. (2007) que
analisaram a variabilidade genética de 125 isolados de R. solanacearum, sendo 109
oriundos de províncias da Coréia e 16 de outras localidades do mundo através de
marcadores moleculares AFLP. Obtiveram 110 bandas polimórficas e obtiveram um
dendrograma com a formação de dois grupos, no qual o primeiro grupo conseguiu
agrupar todos os isolados originários da Coréia e do Japão, enquanto no segundo grupo
ficaram agrupados os isolados dos países restantes. O estudo não permitiu correlacionar
a variabilidade genética com a origem geográfica do isolado, do hospedeiro ou biovar.
Algumas inconsistências também foram detectadas quando somente as biovares foram
consideradas na análise, agrupando conjuntamente isolados de raças e biovares
diferentes. O único grupo consistente foi o que agrupou todos os isolados da raça 3
biovar 2.
A análise dos coeficientes de similaridade gerados permitiu verificar que a
variabilidade genética observada entre os isolados foram causadas principalmente pelo
perfil genético de cada isolado e não pela procedência dele ou hospedeiro, uma vez que
a maior diversidade foi encontrada entre os isolados sendo formado grupos com
diferentes procedências.
Conclusão
O marcador AFLP distinguiu a variabilidade genética existente entre os isolados de
R. solanacearum utilizando seis combinações de primers com a formação de seis
grupos.
Referências
Castillo JA, Greenberg JT (2007) Evolutionary Dynamics of Ralstonia solanacearum.

Applied and Environmental Microbiology: 1225-1238.
255
Creste S, Tulmann neto A, Figueira A (2001) Detection of single sequence repeat
polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant
Molecular Biology Reporter: 19: 299-306.
Cruz CD (2006) Program Genes: multivariate analysis and simulation. UFV, Viçosa,
MG.
Fegan M, Prior P (2005) How complex is the “Ralstonia solanacearum species

complex”? In Allen C, Prior P, Hayward AC, eds. Bacterial wilt: The Disease and the
Ralstonia solanacearum Species Complex. Saint Paul, MN, USA. APS Press.
Hayward A.C (1994) Systematics and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and

related bacteria. In Hayward AC, Hartman GL, Eds.. Bacterial wilt: The disease and its
causative agente Pseudomonas solanacearum. Wallingford. CAB.
Jeong Y, Kim J, Kang Y, Lee S, Hwang I (2007) Genetic diversity and distribution of
Korean isolates of Ralstonia solanacearum, Plant disease 91: 1277-1287.
Kelman A (1954). The relationship of patogenicity in Pseudomonas solanacearum to

colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44: 693-695.
Kositrana K, Julapark C, Frederick RD, Schadd NW (2002) Genetic variability of

Ralstonia solanacearum strains from pepper (Capsicum annum) in Thailand and their
genetic relationship to strains from other hosts, Thai Journal of Agricultural Science 35:
415-426.
Lemessa F, Zeller W (2007) Isolation and characterisation of Ralstonia solanacearum

strains from Solanaceae crops in Ethiopia, Journal of Basic Microbiology 47: 40–49.
Rosa DD (2008) Método rápido de extração de DNA de bactérias, Summa

Phytopathologica 34: 259-261.
Vos PR, Hogers M, Bleeker M, Van De Lee Reijans T, Hornes M, Fritjers A, Pot, J,
Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995) AFLP: A new concept for DNA fingerprinting.
Nucleic Acids research 23: 4407-4414.
256
Análise de variáveis que influenciam a produção de biomassa de

actinomicetos
Fonseca T.R.B.1, Palheta R.A.1, Souza B.C.1, Marinho N.M.V.1, Ebinuma V.C.S.2, Teixeira
M.F.S.1
1
UFAM - Universidade federal do Amazonas (Avenida General Rodrigo Octávio, 3000 - Coroado).
2
UNESP - Faculdade de Ciências Farmacêuticas (Rodovia Araraquara - Jaú/km 01).
Emails: [email protected] , [email protected], [email protected]
Resumo
Os Actinomicetos, assim como os demais micro-organismos, sofrem influencia de diferentes
fatores no seu crescimento micelial como constituição do meio de cultura e fatores físicos. A
constituição do meio de cultura, juntamente com a capacidade metabólica do organismo,
afeta a síntese de metabólitos e o crescimento celular que está diretamente relacionado com a
formação da biomassa durante o crescimento. O objetivo deste estudo foi avaliar a
interferência da velocidade de agitação e temperatura, além dos efeitos da variação de
concentração da fonte de carbono e nitrogênio, na produção da biomassa micelial de
Actinomicetos. Para a realização dos ensaios utilizou-se um planejamento fatorial 24 com
variação dos fatores independentes. Os resultados demonstraram uma maior significância da
interação entre a velocidade de agitação e a temperatura, seguido da concentração do filtrado
de soja, influenciando positivamente na produção de biomassa. A otimização das condições
de cultivo são de extrema importância para resultados satisfatórios de produção, seja de
biomassa ou de metabólitos.
Palavras-chave: crescimento micelial, fermentação submersa, planejamento fatorial.
257
Introdução
Os Actinomicetos constituem um grupo extremamente diverso; são bactérias Gram-
positivas, classificadas na ordem Actinomycetales, aeróbias e com crescimento semelhante ao
de fungos filamentosos. Em outros membros da ordem, os filamentos se fragmentam e
consequentemente só podem ser observados em algum estádio do ciclo de crescimento.
Apresentam distribuição cosmopolita, sendo encontrados predominantemente no solo.
Entretanto, podem também estar presentes em ambientes aquáticos e em associação com
liquens e plantas (Batista et. al., 2010; Silva-Vinhote et. al., 2011).
Destacam-se por apresentar um papel importante na ecologia, atuando na ciclagem de
nutrientes, fixação de nitrogênio, além de serem produtores metabólitos secundários
extremamente diversos como antibióticos, vitaminas e enzima (Silva-Vinhote et. al., 2011).
A constituição do meio de cultura, juntamente com a capacidade metabólica do
organismo, afeta a síntese de metabólitos e o crescimento celular que está diretamente
relacionado com a formação da biomassa durante o crescimento. Fontes nutricionais como
carbono, nitrogênio, minerais e fatores ambientais como tempo, temperatura e pH têm uma
profunda influência. A temperatura é um dos principais fatores ambientais que afetam o
crescimento de muitos micro-organismos (Sales-Campos e Andrade, 2010; Antunes et al.
2013). O objetivo deste estudo foi a avaliar a interferência da velocidade de agitação e
temperatura, além dos efeitos da variação de concentração da fonte de carbono e nitrogênio
na produção da biomassa micelial de Actinomicetos.
Material e Métodos
Este experimento foi realizado no laboratório de Micologia do Departamento de
Parasitologia/Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Amazonas.
O micro-organismo selecionado, Actinomiceto A8, foi reativado a partir do preservado pelo
método Castellani em meio ágar ISP2A (amido 1%, extrato de levedura 0,4%, extrato de
malte 1%, dextrose 0,4%, ágar 2%), pH 7,3 em placa de Petri por 10 dias a 25 ˚C com
manutenção da cultura a cada 30 dias.
258
Em frascos de vidro com capacidade de 125 mL foram distribuídos 50 mL de cada
meio de cultura e em seguida levados à autoclave a 121 ˚C por 15 minutos. Após a
esterilização e o crescimento do micro-organismo, retirou-se 10 discos de 0,8 cm de diâmetro
e inoculou-se no meio de fermentação selecionado, MPE, composto por cloreto de sódio
(NaCl) 0,5%, carbonato de cálcio (CaCO3) 0,2%, glicose e farelo de soja com variação das
suas concentração de acordo com o planejamento fatorial. As inoculações foram feitas
assepticamente em Câmara de Fluxo Laminar Contínuo.
Ao término do terceiro dia de fermentação realizou-se a filtração em papel de filtro
Whatmann nº 1 da biomassa micelial com o auxilio de uma bomba à vácuo. A biomassa
retida no filtro foi levada à estufa a 105 ˚C até a obtenção de peso constante. O peso seco foi
determinado pela diferença entre o peso total e o peso do papel de filtro.
A fermentação foi conduzida com base em um planejamento fatorial de 24 com
repetição do ponto central em shaker, onde a variável resposta foi a produção de biomassa e
os fatores independentes foram temperatura (25 ˚C, 30 ˚C, 35 ˚C), velocidade de agitação
(150 rpm, 180 rpm, 210 rpm), concentração de glicose (1%, 2%, 3%) e concentração de
nitrogênio (1%, 2%, 3%).
Para análise estatística dos resultados foi usado o software Statistica 10.0 com base na
tabela de ANOVA e no gráfico de Pareto.
Visando atingir os objetivos, planejamentos experimentais vêm sendo empregados
para aperfeiçoar vasta gama de bioprocessos (Gonçalves et al., 2012). Através do
planejamento fatorial, é possível reduzir o número de experimentos e avaliar as variáveis
significativas juntamente com seus efeitos (Bruns e Scarmino, 2006). Em adição, juntamente
com a ferramenta estatística, a metodologia de superfície de resposta (MSR) é
frequentemente usada para aperfeiçoar um processo usando ferramenta estatística. Este
modelo é usualmente construído para os fatores definidos de um meio por equação
polinomial quadrática para descrever os efeitos de interação entre as variáveis (Zafar et al.,
2012). O objetivo deste conjunto de técnicas estatísticas é executar o plano experimental pela
construção de modelos empíricos e avaliar o efeito independente das variáveis na desejável
variável resposta. Esta metodologia reduz o número de experimentos e fornece informação
suficiente para um resultado aceitável estatisticamente (Guo et al., 2012).
259
Para avaliar o efeito de diferentes variáveis (velocidade de agitação, temperatura,
concentração de glicose e concentração do filtrado de soja) no crescimento microbiano do
Actinomiceto A8, empregou-se um planejamento fatorial completo 24, constituindo 20
ensaios. A análise de variância (ANOVA) mostrou que as variáveis independentes,
concentração de filtrado de soja, temperatura e a interação entre as variáveis temperatura e
velocidade foram significativas ao processo para um intervalo de confiança de 95%. O
planejamento apresentou falta de ajuste não significativa, o que demonstra a boa interação
entre os resultados previstos e obtidos experimentalmente.
Tabela 1. Tabela de análise de variância (ANOVA) para um intervalo de confiança de 95%,

onde a variável resposta é a produção de biomassa do Actinomiceto A8.
ANOVA: Var. : Biomassa; R2: 0,8513; Adj: 0,68607;

2** (4-0) design; MS Residual = 0,580668; DV:
Biomassa
Fatores SS df MS F p
(1) Concentração de glicose (%) 0,3425 1,0 0,3425 0,5899 0,4621
(2) Concentração de filtrado de 4,6322 1,0 4,6322 7,9773 0,0199
soja (%)
(3) Temperatura (°C) 5,7900 1,0 5,7900 9,9713 0,0116
(4) Agitação (rpm) 2,4925 1,0 2,4925 4,2924 0,0682
1 by 2 0,0000 1,0 0,0000 0,0000 0,9972
1 by 3 1,7128 1,0 1,7128 2,9498 0,1200
1 by 4 0,3502 1,0 0,3502 0,6030 0,4573
2 by 3 2,6479 1,0 2,6479 4,5602 0,0615
2 by 4 1,1702 1,0 1,1702 2,0152 0,1894
3 by 4 10,7797 1,0 10,7797 18,5644 0,0020
Erro 5,2260 9,0 0,5807
Total SS 35,1441
Os parâmetros da fermentação tais como tempo, agitação, temperatura, pH e

vitaminas, fontes de carbono e de nitrogênio podem ser determinantes no controle do
processo, por isso é necessário um conhecimento da fisiologia microbiana e do
comportamento celular do micro-organismo.
De acordo com o gráfico de Pareto (Figura 1), a interação entre as variáveis
apresentou o efeito mais significativo, no nível positivo. A temperatura como variável
sozinha apresentou um efeito negativo, o que indica que trabalhar com esta variável no nível
inferior (25 ˚C) promoverá resultados superiores. Por outro lado, a concentração de filtrado
de soja apresentou efeito positivo e trabalhar com uma maior concentração (> 3%) deste
260
substrato gerará melhores resultados. Como a interação entre temperatura e velocidade de
agitação apresentou efeito positivo e a variável independente temperatura sozinha efeito
negativo, trabalhar com a velocidade de agitação no nível inferior (150 rpm) acarretaria em
resultados mais promissores.
Fatores como velocidade de agitação, concentração de glicose e as demais interações
não apresentaram resultados significativos para a produção da biomassa micelial.
Figura 1. Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável resposta a produção de biomassa do
Actinomiceto A8.
261
Corroborando com os dados obtidos para o Actinomiceto A8, o gênero Streptomyces
apresenta um maior crescimento micelial quando se tem uma maior concentração de filtrado
de soja, 4% e uma baixa concentração de glicose 1% (Nascimento et al., 2010). As fontes de
nitrogênio também proporcionaram um melhor crescimento em Penicillium citrinum, sendo o
farelo de soja o segundo melhor substrato (Tavares e. al., 1998).
No trabalho de Tavares et. al (1998) verificou-se também que o uso de temperaturas
em torno de 25 ºC favorecem a maior produção de biomassa.
Conclusão
As interações físicas, agitação e temperatura apresentaram uma maior significância na
produção de biomassa micelial do Actinomiceto A8 quando comparado aos outros fatores
avaliados, no entanto para otimização das condições é necessário a realização de mais
estudos.
Referências
Antunes, et al. (2013). Influência da fonte nutricional no crescimento ótimo e na produção de
antimicrobianos produzidos por isolados de Streptomyces sp. Rev. Bras. Bioc., 11(2):131-
138.
Batista, et al. (2010). Avaliação de actinomicetos com potencial para promoção de
crescimento em plântulas de tomateiro (Lycopersicon esculentum) de diferentes cultivares.
Unimontes Cien., 12(1):60-69.
Bruns, R.E.; Scarminio, B.B.N. (2006). Statistical design: chemometrics. Amsterdam:
Elsevier. 412p.
Gonçalves, et al. (2012). Use of response surface methodology to optimize production of
pectinases by recombinant Penicillium griseoroseum T20. Biocatalysis and Agri.
Biotech,1(2):140-146.
Guo, J. et al. (2012). Process optimization for microwave-assisted direct liquefaction
of Sargassum polycystum C. Agardh using response surface methodology. Biores. Tech., 120,
19-25.
262
Sales-Campos, et al. (2010). Produtividade de Pleurotus ostreatus em resíduos da Amazônia.
Interciencia, Caracas, 35(3):198-201.
Silva-Vinhote, et al. (2011). Taxonomic Characterization and Antimicrobial Activity of
Actinomycetes Associated with Foliose Lichens from the Amazonian
Ecosystems. Australian J. Basic Appl. Sci., 5, 910-918.
Tavares, et al. (1998). Utilização do resíduo líquido de indústria de processamento de suco de
laranja como meio de cultura de Penicillium citrinum: depuração biológica do resíduo e
produção de enzima. Química Nova, 21, 6.
Zafar, et al. (2012). Optimization of polyhydroxybutyrate (PHB) production
by Azohydromonas lata MTCC 2311 by using genetic algorithm based on artificial neural
network and response surface methodology. Biocatalysis and Agri. Biotech., 1(1):70-79.
263
Identificação molecular de fungos filamentosos isolados dos sintomas

de superbrotamento em guaranazeiro
Lobo, I.K.C. 1,2, L.B. Almeida1,2, Souza Á.2, Sousa N. R. 2, Silva G.F.2
Universidade Federal do Amazonas – UFAM (Av. General Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000,
1
Coroado I - Manaus/AM), 2EMBRAPA Amazônia Ocidental (Rodovia AM-010, Km 29, Zona Rural,
Caixa Postal 319 - Manaus/AM, Brasil). E-mail: [email protected]
Resumo
O complexo superbrotamento, cujo agente causal é o fungo Fusarium

decemcellulare, destaca-se como uma das principais doenças que acometem o
guaranazeiro na região Amazônica. Entender a dinâmica da comunidade de fungos
presente nas lesões e a interação com fatores bióticos e abióticos pode contribuir com o
combate à doença. O objetivo deste trabalho foi identificar os diferentes fungos
presentes nos três sintomas do superbrotamento em guaranazeiro e nos tecidos
assintomáticos. Foi obtido um total de 77 fungos isolados a partir de tecidos
sintomáticos e assintomáticos. Após uma triagem realizada por meio da técnica ERIC-
PCR, 46 isolados foram analisados com base nas regiões ITS e D1/D2 da subunidade
28S do DNA ribossomal, resultando na identificação de 9 gêneros e 8 diferentes
espécies de fungos no material analisado, além de 4 gêneros que não puderam ser
identificados a nível de espécie. F. decemcellulare foi detectado nos três sintomas do
superbrotamento, como esperado. Além disso, foram constatados fungos endofíticos
com potenciais de controle biológico, como Fusarium poae e fungos do gênero
Pestalotiopsis. O presente trabalho, portanto, apresenta informações que podem
fundamentar novas táticas de combate ao superbrotamento.
Palavras-chave: complexo superbrotamento, comunidade de fungos, ITS.
Introdução
O guaraná é extraído das sementes de Paullinia cupana H.B.K. Typica e Paullinia

cupana var. sorbilis (Mart.) e assume importante papel social e econômico na
Amazônia brasileira e no estado da Bahia, devido a seu uso na agricultura familiar, suas
propriedades medicinais e estimulantes (Atroch et al., 2010).
264
O clima amazônico contribui para maior proliferação de doenças e estas são uma
das principais causas da diminuição da produção de guaraná no estado do Amazonas,
sendo que os danos e a incidência variam de acordo com o agente causal. Diante das
dificuldades de controle, o complexo superbrotamento é, atualmente, um dos principais
problemas da cultura do guaranazeiro na região amazônica. O primeiro relato atribuindo
a causa do superbrotamento a F. decemcellulare foi feito por Bastista (1983). No
estudo, 30 dias após as inoculações, foram observados os sintomas típicos da doença.
O complexo superbrotamento ataca diferentes partes da planta e apresenta três
sintomas bem característicos: 1- hiperplasia floral, ocorrendo hiperplasia e hipertrofia
atingindo toda a inflorescência; 2- superbrotamento de gemas vegetativas e florais,
consistindo em brotações sucessivas a partir de pontos muito próximos uns dos outros,
ao longo dos ramos; 3- galhas do caule, que é o entumescimento do coleto, podendo
tomar grandes extensões do caule (Batista, 1983). Em função desse quadro, é inviável
economicamente a realização de pulverizações com fungicidas como estratégia de
controle da doença.
Muitos micro-organismos são fundamentais na prevenção de doenças da planta,
bem como no seu crescimento e entender a dinâmica da comunidade fúngica presente
nas lesões pode colaborar com o desenvolvimento de táticas mais eficientes de combate
à doença. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar os diferentes fungos presentes
nos três diferentes sintomas do superbrotamento em guaranazeiro.
Material e Métodos
Isolamento, Cultivo Monospórico e Extração de DNA genômico
O isolamento foi feito dos três sintomas de superbrotamento, além de material

seco e tecidos assintomáticos provenientes dos clones 48 e 70, em condições de
ocorrência natural da doença, no campo experimental da Embrapa Amazônia Ocidental
(Rodovia AM 010, km 29, Manaus-AM). Foram realizadas a assepsia (álcool 70% por 1
minuto e hipoclorito de sódio 2% por 1 minuto) e lavagem com água estéril,
procedimento repetido 3 vezes. Em seguida, fragmentos dos diferentes tecidos foram
inoculados em placas de Petri com meio de cultura Ágar-Água. Depois, as colônias
crescidas foram repicadas para o meio BDA (2 g L-1 de peptona, 10 g L-1 de dextrose,
16 g L-1 de ágar, 1,5 g L-1 de caseína, 2 g L-1 de extrato de levedura e 250 g L-1 de
batata). O cultivo monósporico foi realizado por meio de diluição em água estéril a 1-10
265
unidades por campo microscópico (lente de 10x). Em seguida, 1 mL desta suspensão foi
vertido em meio BDA, sendo as placas incubadas invertidas, à temperatura ambiente,
por 24 a 36 horas. O esporo germinado foi transferido para outra placa de Petri com
meio de cultura BDA. O DNA total dos fungos foi extraído segundo Doyle e Doyle
(1990).
Análise da diversidade e identificação dos isolados
Amplificações e Sequenciamento
Após o isolamento, os 77 isolados obtidos (Tabela 1) foram, posteriormente,

triados por meio da técnica ERIC-PCR, para definir os isolados com diferentes perfis de
bandas a seguirem para o sequenciamento.
Tabela 1. Fungos isolados dos sintomas de superbrotamento, tecido assintomático e

material seco dos clones 48 e 70, antes da triagem, totalizando 77 isolados.
Clone Superbrotamento Superbrotamento Hiperplasia Galhas Tecido

de gemas de gemas floral do caule Assintomático
vegetativas vegetativas
(material seco)
F52, F53, F45, F46, F59, F60, F68, F69, F70,

F54, F55, F47, F48, F61, F62, F71, F72, F73,
48 F56, F57, F49, F50, F63, F64,
- F74, F75, F76,
F58 F51 F65, F66, F67 F77
F12, F13, F14, F15, F22, F23, F24, F25, F34, F35, F1, F2,
F16, F17, F26, F27, F36, F37, F3, F4,
70 F18, F19, F20, F21 F28, F29, F30, F31, F38, F39, F5, F6,
F32, F33 F40, F41, F7, F8, -
F42, F43, F44 F9, F10,
F11
Os fungos selecionados tiveram a região do DNA ribossomal ilustrada na Figura

1 sequenciada e os primers utilizados para a amplificação foram ITS5 (F) (5’-
GGAAGTAAAAGTCGTAACAGG-3’) (White et al., 1990) e NL4 (R) (5’-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (O’Donnel, 1993).
266
Figura 1. Região para identificação dos isolados (1000 a 1200 pb).
Análises das sequências, alinhamento e filogenia

Cada fragmento teve as duas fitas sequenciadas pelo método de Sanger e uma
sequência consenso foi obtida para as análises subsequentes. As sequências foram
comparadas com o banco de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com o auxílio
da ferramenta BLAST. Em seguida, foram alinhadas e os filogramas foram construídos
por meio do software Mega 6.0.
Isolamento e identificação molecular
Após a triagem com ERIC-PCR, 46 isolados tiveram a região do DNA

ribossomal, ilustrada na Figura 1, sequenciada e os fungos identificados são os que
constam na Tabela 2:
Tabela 2. Identificação de fungos isolados dos clones 48 e 70.

Clone Superbrotamento Superbrotamento Hiperplasia Galhas do caule Tecido
de gemas de gemas floral Assintomático
vegetativas vegetativas
(material seco)
Diaporthe sp., Fusarium
Nigrospora Microdochium - - poae,
48 oryzae, sp. Fusarium sp.,
Pestalotiopsis Diaporthe
citri
Nigrospora Phomopsis sp., Albonectria Poitrasia
oryzae, Diaporthe rigidiuscula, circinans,
70 Diaporthe sp., phaseolorum, Diaporthe Fusarium -
Diaporthe Colletotrichum citri polyphialidicum
phaseolorum, thailandicum
Phomopsis sp.,
A comunidade fúngica isolada inclui Poitrasia circinans, Pestalotiopsis sp.,

Nigrospora oryzae, Fusarium sp., F. polyphialidicum, F. poae, Albonectria
267
rigidiuscula, Colletotrichum thailandicum, Diaporthe sp., D. citri, D. phaseolorum,
Phomopsis sp. e Microdochium sp.. Desta forma, foi possível a identificação de 9
gêneros e 8 espécies de fungos. O fato de as demais espécies do presente trabalho não
terem sido identificadas pode ser justificado pela região que foi trabalhada (ITS), uma
vez que para o gênero Colletotrichum, por exemplo, o gene gapdh é mais eficiente na
distinção de espécies (Weir et al., 2012). Assim, há a necessidade de complementação
das análises com outras regiões do DNA.
Este tipo de estudo, acerca da comunidade fúngica presente nos sintomas do
superbrotamento em guaranazeiro, ainda não havia sido realizado. Em guaranazeiro,
fungos associados à planta saudável têm sido estudados e os gêneros mais comuns
encontrados em Paullinia cupana var. sorbilis são Guignardia, Phomopsis, Glomerella
(Colletotrichum) e Xylaria. Gêneros menos frequentemente encontrados são Fusarium,
Dreschrella, Pestalotia, Curvularia, Humicola e Nodulisporium (Azevedo et al., 2000).
Figura 2. Análise filogenética molecular pelo método de Máxima Verossimilhança dos

isolados identificados como Phomopsis/Diaporthe. Bootstrap mostrado próximo de
cada ramo. Análises evolucionárias conduzidas no software MEGA 6.0. 14: F14, 16:
F16, 17: F17, 19: F19, 21: F21, 24: F24, 28: F28, 35: F35, 52: F52, 76: F76.
No presente trabalho, fungos do gênero Phomopsis/Diaporthe (Figura 2) foram

predominantes na identificação dos isolados e também de maior número de espécies
268
identificadas, seguidos por fungos dos gêneros Fusarium/Albonectria (Figura 3),
Nigrospora (Figura 4), Poitrasia (Figura 5), Pestalotiopsis (Figura 6), Colletotrichum
(Figura 7) e Microdochium (Figura 8).

isolados identificados como Fusarium/Albonectria. Bootstrap mostrado próximo de
cada ramo. Análises evolucionárias conduzidas no software MEGA 6.0. 3: F3, 8: F8,
34: F34, 69: F69, 72: F72.

isolados identificados como Nigrospora oryzae. Bootstrap mostrado próximo de cada
ramo. Análises evolucionárias conduzidas no software MEGA 6.0. 12: F12, 20: F20,
55: F55.
269
Figura 5. Análise filogenética molecular pelo método de Máxima Verossimilhança do
isolado identificado como Poitrasia circinans. Bootstrap mostrado próximo de cada
ramo. Análises evolucionárias conduzidas no software MEGA 6.0. 2: F2.

isolado identificado como Pestalotiopsis sp.. Bootstrap mostrado próximo de cada
270
isolado identificado como Colletotrichum thailandicum. Bootstrap mostrado próximo
de cada ramo. Análises evolucionárias conduzidas no software MEGA 6.0. 32: F32.

isolado identificado como Microdochium sp.. Bootstrap mostrado próximo de cada
Os fungos do gênero Diaporthe, cuja forma assexuada é denominada

Phomopsis, ocorrem como endofíticos, sapróbios e também como patógenos de plantas
271
(Gomes et al., 2013). Foram identificados como sendo também alguns dos endofíticos
isolados dos sintomas de superbrotamento em guaranazeiro F. polyphialidicum e F.
poae. F. poae produz, comumente, uma ou mais micotoxinas (Stenglein, 2009),
interessante a estudos de antagonismo contra F. decemcellulare, agente causal do
superbrotamento. Alguns isolados foram identificados como N. oryzae, do qual
observou-se uma especificidade pelo sintoma superbrotamento de gemas vegetativas,
uma vez que N. oryzae não é comum como endofítico em guaranazeiro (Azevedo et al.,
2000). Em todos os sintomas analisados foram obtidos isolados identificados como F.
decemcellulare (teleomorfo Albonectria rigidiuscula). Segundo Guimarães (2013), F.
decemcellulare trata-se de um complexo de espécies homotálicas e heterotálicas.
Guimarães (2013) observou, ainda, que os isolados heterotálicos causadores de galhas e
superbrotamento em cacaueiro e mangueira pertencem a uma espécie filogeneticamente
distinta da espécie homotálica, não causadora dos sintomas. Os gêneros com menos
isolados identificados neste trabalho foram, além de Colletotrichum, os gêneros
Poitrasia, Microdochium e Pestalotiopsis.
Conclusões
Foram observados endofíticos com potenciais para controle biológico, como

Fusarium poae e fungos do gênero Pestalotiopsis.
Foi observada também a especificidade de Nigrospora oryzae pelo sintoma
superbrotamento de gemas vegetativas, considerando que o mesmo não está sequer
entre os fungos menos frequentemente isolados de guaranazeiro.
O primeiro relato de isolamento da comunidade fúngica dos sintomas de
superbrotamento em guaranazeiro, portanto, apresenta informações essenciais a estudos
mais aprofundados sobre estes fungos, buscando melhores estratégias para o controle do
superbrotamento.
Referências
Atroch AL, Nascimento filho FJ do, Resende MDV, Lopes R, Clement CR (2010)
Avaliação e seleção de progênies de meios-irmãos de guaranazeiro. Amazonian Journal
of Agricultural and Environmental Sciences 53:123-130.
272
Azevedo JL, Maccheroni Jr W, Pereira JO, Araújo WL (2000) Endophytic
microorganisms: a review on insect control and recent advances on tropical plants. EJB
Electronic Journal of Biotechnology 3:40-65.
Batista MF (1983) Doenças do guaranazeiro. Embrapa UEPAE – Circular Técnica 9.

http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/handle/doc/665065.
Doyle J J, Doyle J L (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15.
Gomes RR, Glienke C, Videira SIR, Lombard L, Groenewald JZ, Crous PW (2013)
Diaporthe: a genus of endophytic, saprobic and plant pathogenic fungi. Persoonia 31:1-
41.
Guimarães EA (2013). Biologia reprodutiva, filogenia e patogenicidade de Fusarium

decemcellulare. Lavras, Minas Gerais, Brasil, 58 p. (Dissertação de Mestrado.
Universidade Federal de Lavras).
O’Donnell K, (1993) Fusarium and its near relatives. In: Reynolds, D.R.; Taylor,
J.W.(eds). The fungal holomorph: mitotic, meiotic and pleomorphic speciation in fungal
systematics, CAB International, Wallingford, United Kingdom, 225–233.
Stenglein SA (2009) Fusarium Poae: A Pathogen That Needs More Attention. Journal
of Plant Pathology 91: 25-36.
Weir BS, Johnston PR, Damm U (2012) The Colletotrichum gloeosporioides species
complex. Studies in Mycology 73: 115-180.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor JW (1990) Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M.A.; Gelfand, D.H.;
Sninsky, J.J.; White, T.J.(eds). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,
Academic Press, Inc., New York, USA, 315-322.
273
Variáveis que influenciam a produção de biomassa de actinomicetos
Marinho N.M.V.1, Fonseca T.R.B.1, Palheta R.A.1, Souza B.C.1, Ebinuma V.C.S.2, Teixeira
M.F.S.1.
1
Universidade Federal do Amazonas (UFAM). Av. Gal. Rodrigo O. Jordão Ramos, 3000,
2
Universidade Estadual de São Paulo, Rodovia Araraquara-Jaú/km 01 CEP 14801-902 - Araraquara -
SP/Brasil. E-mail: [email protected]
Resumo
Os actinomicetos, bactérias filamentosas, Gram positivas, assim como os demais micro-

organismos sofrem influência de diferentes fatores no seu crescimento micelial como
constituição do meio de cultura e fatores físicos. A composição do meio de cultura,
juntamente com a capacidade metabólica do organismo afeta a síntese de metabólitos e o
crescimento celular que está diretamente relacionado com a formação da biomassa durante o
crescimento. O objetivo deste estudo foi a avaliar a interferência da velocidade de agitação e
temperatura, além dos efeitos da variação de concentração da fonte de carbono e nitrogênio,
na produção da biomassa micelial de actinomicetos. Para a realização dos ensaios utilizou-se
um planejamento fatorial 24 com variação dos fatores independentes. Os resultados
demonstram uma maior significância da interação entre a velocidade de agitação e a
temperatura, seguido da concentração do filtrado de soja influenciado positivamente na
produção de biomassa. A otimização das condições de cultivo são de extrema importância
para resultados satisfatórios de produção, seja de biomassa ou de metabólitos.
Palavras-chave: Bactérias filamentosas, Planejamento Fatorial; Agitação; Temperatura.
Introdução
Os actinomicetos constituem um grupo extremamente diverso, são bactérias Gram-
positivas, classificadas na ordem Actinomycetales, aeróbias e com crescimento semelhante ao
de fungos filamentosos. Em outros membros da ordem, os filamentos se fragmentam e
consequentemente só podem ser observados em algum estágio do ciclo de crescimento.
274
Apresentam ampla distribuição no ecossistema, sendo encontrados predominantemente no
solo, entretanto, podem também estar presentes em ambientes aquáticos e em associação com
liquens e plantas (Batista et. al., 2010; Silva-Vinhote et. al., 2011).
Destacam-se por apresentar um papel importante na ecologia, atuando na ciclagem de
nutriente, fixação de nitrogênio, além de serem produtores metabólitos secundários
extremamente diversos como antibióticos, vitaminas e enzimas (Silva-Vinhote et. al., 2011).
Dentre os metabólitos secundários os actinomicetos destacam-se principalmente pela
produção de uma grande diversidade de antibióticos (Rincón-Enríquez et al., 2014). Estima-
se que a ordem produza em torno de 3.000 antibióticos, sendo 90% pelo gênero
Streptomyces. Este o único gênero microbiano capaz de produzir todos os grupos de
antibióticos: aminoglicosídeos, macrolídeos, ansamacrolídeos, β-lactâmicos, peptídeos,
glicopeptídeos, antracic linas, tetraciclinas, nucleosídeos, polienos e quinonas (Nascimento
et al., 2010, Carvalho, 2011, Nascimento et al., 2014).
A constituição do meio de cultura, juntamente com a capacidade metabólica do
organismo, afeta a síntese de metabólitos e o crescimento celular que está diretamente
relacionado com a formação da biomassa durante o crescimento. Fontes nutricionais como
carbono, nitrogênio e fatores ambientais como tempo, temperatura e pH têm uma profunda
influência. A temperatura é um dos principais fatores ambientais que afetam o crescimento de
muitos micro-organismos (Sales-Campos e Andrade, 2010; Antunes et. al, 2013).
Os estudos da interação das fontes de carbono e nitrogênio são importantes na medida
em que estes compostos apresentam uma complexidade estrutural e são fontes utilizadas para
um bom desempenho metabólico. O efeito da interação das diferentes concentrações e de
fontes de carbono e nitrogênio pode ser um fator importante para promover melhoria na
eficiência fermentativa e melhorar a produção dos metabólitos (Santos et al., 2014).
O objetivo deste estudo foi a avaliar a interferência da velocidade de agitação e
temperatura, além dos efeitos da variação de concentração da fonte de carbono e nitrogênio
na produção da biomassa micelial de actinomicetos.
Material e métodos
Este experimento foi realizado no laboratório de Micologia do Departamento de
Parasitologia/Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Amazonas-UFAM.
Meios de esporulação e manutenção dos micro-organismos

O micro-organismo (Streptomyces sp. DPUA 1549) preservado pelo método
275
Castellani foi reativado em meio ágar ISP-2A (amido 1%, extrato de levedura 0,4%, extrato
de malte 1%, dextrose 0,4%, ágar 2%), pH 7,3 em placa de Petri por 10 dias a 25 ˚C até
esporulação do mesmo, com manutenção da cultura a cada 30 dias.
Fermentação Submersa
Em frascos de vidro com capacidade de 125 mL foram distribuídos 50 mL de cada

meio de cultura e em seguida levados à autoclave a 121 ˚C por 15 minutos. Após a
esterilização e o crescimento do micro-or ganismo retirou-se 10 discos de 0,8 cm de diâmetro
e inoculou-se no meio de fermentação selecionado, MPE, composto por cloreto de sódio
(NaCl) 0,5%, carbonato de cálcio (CaCO3) 0,2%, glicose e farelo de soja com variação das
suas concentração de acordo com o planejamento fatorial. As inoculações foram feitas
assepticamente em Câmara de Fluxo Laminar Contínuo.
Ao término do terceiro dia de fermentação realizou-se a filtração em papel de filtro
Whatmann nº 1 da biomassa micelial com o auxilio de uma bomba à vácuo. A biomassa
retida no filtro foi levada à estufa a 105 ˚C até a obtenção de peso constante. A biomassa seca
ou o peso seco foi determinado pela diferença entre o peso total e o peso do papel de filtro.
Planejamento fatorial para o crescimento micelial

Os estudos de produção foram realizados baseados em um planejamento
experimental. Inicialmente foram avaliados fatores como diferentes concentrações de fontes
de nitrogênio e de carbono, agitação e temperatura utilizando um planejamento completo 24
com 4 pontos centrais (Tabela 1). Após os experimentos foram realizadas as análises
estatísticas dos resultados (biomassa), com o auxílio do software Statistica 10.0 e Minitab 16.
Tabela 1. Níveis dos fatores estudados no planejamento fatorial completo 24 para o

crescimento micelial e produção de antibióticos por Streptomyces sp. DPUA 1549.
Fatores Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)
Concentração de glicose (%) 1 2 3
Concentração de filtrado de soja (%) 1 2 3
Temperatura (°C) 25 30 35
Agitação (rpm) 150 180 210
276
Para avaliar o efeito de diferentes variáveis (velocidade de agitação, temperatura,

concentração de glicose e concentração do filtrado de soja) no crescimento microbiano do
Streptomyces sp. DPUA 1549 empregou-se um planejamento fatorial completo 24 (Tabela 2),
constituindo 20 ensaios. A análise de variância (ANOVA) mostrou que as variáveis
independentes, concentração de filtrado de soja, temperatura e velocidade de agitação e a
interação entre as variáveis temperatura e velocidade foram significativas ao processo para
um intervalo de confiança de 95%. O planejamento apresentou falta de ajuste não
significativa, o que demonstra a boa interação entre os resultados previstos e obtidos
experimentalmente. A partir das análises dos resultados pôde-se observar que o R2 apresentou
resultado significativo.
Tabela 2. Planejamento fatorial para avaliação do crescimento micelial de Streptomyces sp.

DPUA 1549.
Design: 2**(4-0) design
Concentração Concentração Temperatu Velocida Biomassa
Standard de glicose (%) de filtrado de ra (°C) de de (g)
Run soja (%) agitação
1 1 1 25 (rpm)
150 3,843
2 1 1 25 210 3,400
3 1 1 35 150 3,363
4 1 1 35 210 4,574
5 1 3 25 150 5,592
6 1 3 25 210 5,065
7 1 3 35 150 2,361
8 1 3 35 210 5,934
9 3 1 25 150 5,547
10 3 1 25 210 2,581
11 3 1 35 150 1,342
12 3 1 35 210 4,534
13 3 3 25 150 5,873
14 3 3 25 210 5,485
15 3 3 35 150 2,410
16 3 3 35 210 4,158
17 (C) 2 2 30 180 4,805
18 (C) 2 2 30 180 5,172
19 (C) 2 2 30 180 5,006
20 (C) 2 2 30 180 4,113
De acordo com o gráfico de Pareto, a interação entre as variáveis apresentou o efeito

mais significativo, no nível positivo. A temperatura como variável sozinha apresentou um
277
efeito negativo, o que indica que trabalhar com esta variável no nível inferior (25 ˚C)
promoverá resultados superiores. Por outro lado, a concentração de filtrado de soja
apresentou efeito positivo e trabalhar com uma maior concentração (> 3%) deste substrato
gerará melhores resultados. Como a interação entre temperatura e velocidade de agitação
apresentou efeito positivo e a variável independente temperatura sozinha efeito negativo,
trabalhar com a velocidade de agitação no nível inferior (150 rpm) acarretaria em resultados
mais promissores.
Fatores como velocidade de agitação, concentração de glicose e as demais interações
não apresentaram resultados significativos para a produção da biomassa micelial.
A Tabela de análise de variância (ANOVA) mostrou que a interação entre as variáveis
temperatura e velocidade de agitação (3by4) foram significativas ao processo para um
intervalo de confiança de 95%. De acordo com o gráfico de Pareto (Gráfico 1), a interação
entre as variáveis apresentou o efeito mais significativo, no nível positivo, logo este fator
influencia diretamente no crescimento micelial de Streptomyces sp. DPUA 1549.
A temperatura como variável sozinha apresentou um efeito negativo, o que indica que
trabalhar com esta variável no nível inferior promoverá resultados superiores. Por outro lado,
a concentração de filtrado de soja apresentou efeito positivo e trabalhar com uma maior
concentração deste substrato pode gerar melhores resultados. Como a interação entre
temperatura e velocidade de agitação apresentou efeito positivo e a variável independente
temperatura sozinha efeito negativo, trabalhar com a velocidade de agitação no nível inferior
ocasionaria resultados mais promissores.
Os parâmetros da fermentação tais como tempo, agitação, temperatura, pH e
vitaminas, fontes de carbono e de nitrogênio podem ser determinantes no controle do
processo, por isso é necessário um conhecimento da fisiologia microbiana e do
comportamento celular do micro-organismo.
Corroborando com os dados obtidos para o Streptomyces sp. DPUA 1549, o gênero
Streptomyces apresenta um maior crescimento micelial quando se tem uma maior
concentração de filtrado de soja, 4% e uma baixa concentração de glicose 1%
(NASCIMENTO et. al, 2009). As fontes de nitrogênio também proporcionaram um melhor
crescimento em Penicillium citrinum, sendo o farelo de soja o segundo melhor substrato
(TAVARES et. al, 1998). No trabalho de Tavares et. al (1998) verificou-se também que o uso
de temperaturas em torno de 25 ºC favorecem a maior produção de biomassa.
278
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Biomassa (g)
2**(4-0) design; MS Residual=,919319
DV: Biomassa (g)
3by4 3,662869
(3)Temperatura ( °C) -2,27104
(2)Concentração de filtrado de soja (%) 2,00613
2by3 -1,45858
(4)Velocidade de agitação (rpm) 1,407993
1by3 -1,40121
2by4 ,8896433
1*3*4 ,6622784
1by4 -,580928
(1)Concentração de glicose (%) -,574148
2*3*4 -,410926
1*2*4 -,298286
1*2*3 ,1350631
1by2 ,0391109
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Figura 1. Gráfico de Pareto dos efeitos das variáveis, tendo como variável
resposta a produção de biomassa de Streptomyces sp. DPUA 1549.
Conclusão
As interações físicas, agitação e temperatura apresentaram uma maior significância na

produção de biomassa micelial do Streptomyces sp. DPUA 1549 quando comparado aos
outros fatores avaliados, entretanto para otimização das condições é necessário a realização
de mais estudos.
Referências
Antunes, TC, Salamoni SP, Frazzon APG, Germani JG, Van Der Sand ST (2013) Influência
da fonte nutricional no crescimento ótimo e na produção de antimicrobianos produzidos por
isolados de Streptomyces sp. Ver. Bras. Bioc., 11, 2, 131-138.
Batista WB, Nobre SAM, Nobre PB, Fernandes BHA, Gomes HAR, Aguiar RM, Melo GA,
Pereira GVN (2010) Avaliação de actinomicetos com potencial para promoção de
crescimento em plântulas de tomateiro (Lycopersicon esculentum) de diferentes cultivares.
Unimontes Científica, v. 12, n. 1/2, p. 60-69.
279
Carvalho TS (2011). Avaliação da atividade antimicrobiana de actinomicetos endofíticos
contra bactérias Gram-negativas resistentes a beta-lactâmicos. Trabalho de conclusão de
curso (Farmácia), Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil, 26 fls.
Nascimento RP (2006) Estudo da produção de endoxilanases por Streptomyces malaysiensis

AMT-3 Utilizando resíduos agro-industriais. Tese de doutorado: Doutor em Ciências
(Microbiologia), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil, 164 fls.
Nascimento TP, Porto TS, Porto ALF (2009) Efeito da fonte de carbono e de nitrogênio na
produção de metabólitos antimicrobianos por Streptomyces sp. IX Jornada de ensino,
pesquisa e extensão, 2009. Recife. <http://www.eventosufrpe.com.br/
jepex2009/cd/resumos/R0833-1.pdf>.
Nascimento TP, Porto CS, Teixeira MFS, Porto TS, Porto ALF (2014) Produção de
biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite
caprina. Arq. Bras. de Med. Vet. e Zoot, 66(1):101-108.
Rincón-Enríquez G, López-Pérez L, Quiñones-Aguiar EE (2014) Efectividad biológica in

vitro de actinomicetos sobre el agente causal del tizón de halo en frijol. Revista Fitotecnia
Mexicana, 37(3):229-234.
Sales-Campos C, Minhoni MTA, Andrade MCN (2010) Produtividade de Pleurotus ostreatus

em resíduos da Amazônia. Interciencia, Caracas, 35(3):198-201.
Santos EFS, Schautz CA, Cardoso CAL, Ernandes JR, Batistote MO (2014) Efeito da
complexidade estrutural da fonte de carbono e nitrogênio no desempenho fermentativo de
leveduras industrias. Ciência e Natura, 35(2):9-14.
Silva-Vinhote NM, Pereira TM, Astolfi Filho S, Matsuura T (2011) Taxonomic

Characterization and Antimicrobial Activity of Actinomycetes Associated with Foliose
Lichens from the Amazonian Ecosystems. Australian Journal of Basic e Applied Sciences, 5(
5): 910-918.
Tavares VB, Sivieri K, Ceron CR, Silva R e Trabuco e (1998) Utilização do resíduo líquido
de indústria de processamento de suco de laranja como meio de cultura de Penicillium
citrinum: depuração biológica do resíduo e produção de enzima. Química Nova, 21, 6.
280
Diagnóstico molecular por PCR-RFLP e gene LYS2 para identificação

de Fusarium decemcellulare
Matos K.S1, Hanada R.E.1, Silva G.F.2
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Fitopatologia, 69080-971,
Manaus, AM, Brasil. 2Embrapa Amazônia Ocidental, Laboratório de Biologia Molecular,
69010-970, Manaus, AM, Brasil. E-mail: [email protected]
Resumo
Fusarium decemcellulare é encontrado como agente causal de doenças com
diferentes sintomas em diversas espécies de plantas em regiões tropicais e subtropicais.
Em guaranazeiro, espécie nativa da Amazônia de importância econômica e social, a
doença denominada de complexo superbrotamento é atualmente um dos principais
problemas da cultura. Técnicas moleculares são cada vez mais requeridas para
identificação rápida e segura de patógenos como complemento as técnicas
convencionais. O objetivo do trabalho foi desenvolver métodos moleculares por PCR e
PCR-RFLP para rápida identificação de F. decemcellulare. O desenvolvimento do
método baseado em PCR-RFLP foi realizado com base em 42 sequências do rDNA
(18S, ITS1,ITS2, 5.8S e 28S) de 26 espécies do gênero Fusarium e identificado perfil
de clivagem específico para Fdc com a enzima HaeIII. O diagnóstico baseado em PCR
foi feito com base em sequências do gene lys2 de 26 espécies do gênero Fusarium
foram analisadas e primers específicos foram desenvolvidos para Fdc, denominados de
Fdc Lys2 399F e Fdc Lys2 R, e Fdc Lys2 654F e Fdc Lys2 832R. Ambos os métodos
mostraram-se eficientes para diagnóstico de Fusarium decemcellulare.
Palavras-chave: superbrotamento, hiperplasia floral, galhas, Paullinia cupana, marcador

molecular.
Introdução
Fusarium decemcellulare Brick (teleomorfo Albonectia rigidiuscula) é
encontrado como agente causal de doenças em mais de 80 espécies de plantas em
281
regiões tropicais e subtropicais (Farr e Rossman, 2016). No Brasil, culturas
economicamente importantes como mangueira, cacaueiro, seringueira e guaranazeiro
são afetadas pelo patógeno. Em guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis (Mart.),
espécie nativa de importância econômica e social da Amazônia, a doença é
caracterizada por diferentes sintomas, como hiperplasia floral, superbrotamento das
gemas vegetativas e galhas no caule. A doença denominada de complexo
superbrotamento é atualmente um dos principais problemas da cultura (Atroch, 2002).
A identificação de F. decemcellulare (Fdc) é comumente realizada por
caracteres morfológicos, em que muitas vezes pode ser complicada e demorada, devido
à plasticidade das caraterísticas morfológicas e das condições a serem testadas. O uso de
técnicas moleculares é cada vez mais requerido para identificação rápida e segura de
patógenos. Nas últimas décadas várias técnicas e marcadores moleculares têm sido
desenvolvidos contribuindo para a identificação e diferenciação de espécies em
Fusarium, dentre eles PCR-RFLP (Polimerase Chain Reaction - Restriction Fragment
Length Polymorphism) baseada em padrões de restrição com o uso de enzimas
selecionadas com base em sua habilidade de revelar polimorfismo nos fragmentos de
DNA analisado (Lee et al., 2000; Bogale et al., 2007) e o gene lys2 Aminoadipato
redutase, específico em fungos e importante para a biossíntese da lisina foi indicado
como um possível marcador genético para identificação de isolados do gênero Fusarium
(Watanabe et al., 2011a; 2011b).
O objetivo do trabalho foi desenvolver métodos moleculares baseados em ITS
PCR-RFPL e via amplificação do gene lys2 para rápida identificação de Fusarium
decemcellulare.
Material e métodos
A presente pesquisa foi realiza no Laboratório de Biologia Molecular na
Embrapa Amazônia Ocidental em Manaus, AM.
O desenvolvimento da técnica baseada em PCR-RFLP foi realizada com base
em 42 sequências do rDNA (18S, ITS1,ITS2, 5.8S e 28S) de 26 espécies do gênero
Fusarium obtidas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology
Information): F. acuminatum, F. armeniacum, F. asiaticum, F. avenaceum, F.
culmorum, F. decemcellulare , F. dimerum, F. dimerum var. violaceum, F. equiseti, F.
incarnatum, F. kyushuense, F. langsethiae, F. lateritium, F. nurragi, F. oxysporum f.
282
sp. raphani, F. oxysporum f. sp. rapae, F. poae, F. phyllophilum, F. solani, F. solani f.
sp. mori, F. sporotrichioides, F. subglutinans, F. tricinctum, Gibberella moniliformis,
G. intermedia e G. zeae. O alinhamento das sequências foi realizado usando o programa
MUSCLE e sítios de restrição foram identificados usando a ferramenta Search (Find
motif) no programa MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013). O método foi validado usando
isolados monospóricos previamente identificados como F. decemcellulare de
guaranazeiro e como controle Fusarium solani f. sp. piperis e Fusarium oxysporum f.
sp. cubense. O DNA dos isolados foi extraído usando o método CTAB de Doyle e
Doyle (1987). A amplificação foi realizada usando os primers ITS5 (White et al., 1990)
e NL4 (O’Donnell, 1993) com posterior clivagem com a enzima HaeIII (sítio de
restrição GGCC) a 37 °C por 3 horas. O produto da PCR foi visualizado em gel de
agarose a 2%.
Primers específicos para o Fdc com base no gene lys2 foi realizado com base em
40 sequências de 26 espécies do gênero Fusarium (mesmas espécies da metodologia
anterior), incluindo duas sequências de F. decemcellulare utilizadas por Watanabe et al.,
(2011b) (AB586966 e AB586967) foram obtidas no banco de dados do NCBI e
alinhadas no programa MEGA 6.0. Por meio da análise da homologia das sequências e
da presença de dois íntrons encontrados somente nas sequências de F. decemcellulare,
pares de primers específicos foram desenvolvidos para a amplificação da região
conservada do gene lys2 denominados de Fdc lys2 399F (5’-
GTGCAGCTTCTTGTCATTG-3’) e Fdc lys2 639R (5’-TCTCGCTCCTAAAGGCC
GTATAC-3’), e Fdc lys2 654F (5’-CATCAGTGGCTAACAGACA G-3’) e Fdc lys2
832R (5’-GCTGTCAATATCATTGAGCTC-3’) (Figura 1).
Figura 1 Esquema estrutural (éxons e íntrons) da região conservada do gene lys2 em F.

decemcellulare. Primers (F - forward e R - reverse) foram desenvolvidos a partir do
íntron II localizado apenas em F. decemcellulare.
283
A reação da PCR foi realizada com um volume final de 25 μl contendo 1µL de
DNA de F. decemcellulare, 1µL de cada primer, 2,5 µL de tampão, 1,0 µL de dNTPs,
1,5 µL de MgCl2 e 0,2 µL de Taq DNA. Na amplificação, a desnaturação inicial foi de
94 °C por 3 minutos, seguida por 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos, temperatura de
anelamento de 60 °C por 30 segundos, 72 °C por 30 segundos e extensão final de 72 °C
por 1 minuto. O produto da PCR foi visualizado em gel de agarose a 2%.
Nas análises de polimorfismo, a perda do primeiro sítio de restrição localizado na
região ITS 1 ocorreu devido a inserção de cinco nucleotídeos (GCTCG) entre as duas
citosinas (Figura 2) que gerou um fragmento de restrição ~500pb em F. decemcellulare
(A. rigidiuscula e Albonectria albosuccinea) e fragmentos menores nas outras espécies
de Fusarium que possuem pelo menos cinco sítios de restrição (Figura 3).
Figura 2 Alinhamento das sequencias da região rDNA (18S, ITS1,ITS2, 5.8S e 28S) das
espécies do gênero Fusarium. Na região ITS 1 ocorre a inserção de cinco nucleotídeos
(GCTCG) entre duas citosinas (seta) em Fusarium decemcellulare (fase sexuada:
Albonectria rigidiuscula e A. albosuccineum.
A digestão do produto ITS com diferentes enzimas de restrição revelou perfis

diferentes entre F. decemcellulare e a espécie controle, possibilitando a diferenciação
inter e intra-específica. Análise in silico com HaeIII permite diferenciar 24 das 26
284
espécies de Fusarium analisadas neste trabalho. O método de PCR-RFLP foi validado
utilizando isolados de F. decemcellulare de guaranazeiro e como controle F. oxysporum
f. sp. cubense e F. solani f. sp. piperis o que permitiu separar as espécies podendo ser
observado o padrão de bandas geradas após clivagem com a enzima HaeIII em gel de
agarose a 2% (Figura 3).
Figura 3 PCR-RFLP clivagem com a enzima HaeIII em gel de agarose (2%). M representa o
marcador 1kb plus (invitrogen). Números 1, 3-7 representam isolados de Fusarium
decemcellulare, 2 - F. oxysporum f. sp. cubense e 8 - F. solani f. sp. piperis.
As análises de PCR-RFLP baseiam em tamanho de fragmentos gerados por

amostras de DNA após clivagem com enzimas de restrição e são comparadas entre
número e tamanho de fragmentos que surgem após a digestão do DNA (Marques et al.,
2002). As relações genéticas de 12 espécies de Fusarium foram investigadas uzando a
região ITS e PCR-RFLP com sete enzimas de restrição e cinco grupos foram
encontrados de acordo com o polimorfismo observado entre as espécies analisadas (Lee
et al., 2000). A técnica de PCR-RFLP proporcionou um diagnóstico simples e barato
para a identificação de Fusarium redolens e membros de três clados de F. oxysporum
(Bogale et al., 2007).
Validação do diagnóstico para Fdc baseado no gene lys2 foi confirmado tanto
em gel por meio da amplificação do fragmento do tamanho esperando (~260pb), quanto
por meio do sequenciamento do amplicon. Das diferentes combinações de primers
desenvolvidas neste trabalho os primers Fdc lys2 399F e 639R foram selecionados
como os primers mais eficientes (Figura 4).
285
Figura 4 Identificação de Fusarium decemcellulare com base na amplificação do gene lys2
usando os primers Fdc 399R e Fdc 639R. M - representa o marcador 1kb plus (invitrogen).
Números de 1 a 5 representam diferentes fungos filamententos isolados de guaranazeiro, e 6 a
14 representam isolados de F. decemcellulare.
O gene lys2 é específico em fungos e está relacionado com a síntese da lisina.

Resultados indicam que esse gene foi submetido à seleção positiva dentro do gênero
Fusarium. Estudo avaliou seis marcadores genéticos para identificar isolados de
diferentes espécies do gênero Fusarium e o gene lys2 apesar de não ser considerado um
bom marcador para análise filogenética em Fusarium, devido a possível transferência
horizontal (Watanabe et al., 2011a; 2011b), neste trabalho mostrou-se um interessante
marcador para identificação de Fdc, devido a ocorrência de um íntron presente apenas
nessa espécie.
As técnicas de diagnóstico molecular têm sido utilizadas na taxonomia de
microrganismos e aplicadas também em programas de melhoramento genético. Elas
permitem avaliar a variabilidade em nível de DNA e identificar diferenças entre
isolados e espécies (Marques et al., 2002). O uso de ferramentas moleculares para a
identificação de fungos apresenta diversas vantagens como, alta sensibilidade,
especificidade e rapidez, e pode ser um diagnóstico mais rápido do que por métodos
convencionais. De acordo com os resultados obtidos nesse estudo os marcadores
moleculares PCR-RFLP e gene lys2 podem ser utilizados para diagnóstico rápido e
seguro de F. decemcellulare como complemento a identificação convencional.
286
Conclusão
Os métodos moleculares desenvolvidos no estudo, PCR-RFLP e amplificação da
região correspondente ao íntron II do gene lys2, foram eficientes para a identificação de
Fusarium decemcellulare.
Referências
Atroch AL (2002) Aspectos gerais da cultura do guaraná. Foods and Food Ingredients.
J Jpn 204:53-59.
Bogale M, Wingfield BD, Wingfield MJ, Steenkamp ET (2007) Species-specific
primers for Fusarium redolens and a PCR-RFLP technique to distinguish among three
clades of Fusarium oxysporum. FEMS Microbiol Lett 271:27-32.
Doyle JJ, Doyle JL, Hortorium LHB (1987) Isolation of plant DNA from fresh tissue.
Focus 12:13-15.
Farr DF, Rossman AY. (2016). Fungal Databases, Systematic Mycology and
Microbiology Laboratory, ARS, USDA. Disponível em: http://nt.ars-grin.gov/
fungaldatabases. Acessado em 12 Jan 2016.
Lee Y, Yong C, Byung M (2000) PCR-RFLP and Sequence Analysis of the rDNA ITS
Region in the Fusarium spp. J Microbiol 38:66-73.
Marques EK, Ikuta N, Lunge VR, Fonseca ASK (2002) Diagnóstico molecular e
biotecnologia. In: Serafini, A.M., Barros, N.M., Azevedo, J.L. Biotecnologia: avanços
na agricultura e na agropecuária, Caxias do Sul, 101-130.
O’Donnell K (1993) Fusarium and its near relatives. In: Reynolds, D.R., Taylor, J.W.
The fungal holomorph: mitotic, meiotic and pleomorphic speciation in fungal
systematic. Wallingford, CAB International, 225-233.
Rossman AY, Samuels GJ, Rogerson CT, Lowen R (1999) Genera of Bionectriaceae,
Hypocreaceae and Nectriaceae (Hypocreales, Ascomycetes). Stud Mycol 42:134-137.
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S (2013) MEGA6: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30:2725-2729.
Watanabe M, Yonezawa T, Lee K, Kumagai S, Sugita H, Gotod K, Hara Y (2011a)

Evaluation of genetic markers for identifying isolates of the species of the genus
Fusarium. J Sci Food Agric 91:2500-2504.
Watanabe M, Yonezawa T, Lee K, Kumagai S, Sugita Y, Goto K, Hara Y (2011b)

Molecular phylogeny of the higher and lower taxonomy of the Fusarium genus and
differences in the evolutionary histories of multiple genes. BMC Evolutionary Biology
11:322.
287
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: A guide to methods
and application, Academic Press, 315-322.
288
Avaliação de metodologias de preservação para manutenção de

microrganismos do Filo Ascomycota e leveduras do gênero Candida
pertencentes à Coleção de Microrganismos de Interesse Médico do
INPA
Oliveira L.A.1, Cortez A.C.A.2, Souza J.V.B.3

1
. INPA ([email protected]); 2. PPG-BIONORTE ([email protected]); 3. INPA
(joã[email protected])
Resumo
Os fungos têm grande importância na microbiologia, pois atuam como agentes das
infecções conhecidas como micoses que acometem todos os seres vivos. Para a
medicina e a indústria estes são de suma importância devido à produção de metabólitos,
para o desenvolvimento e produção de medicamentos, drogas, fermentos, corantes e
conservantes, e atuam também como agentes de controle biológico. O Filo Ascomycota
compreende inúmeros gêneros de fungos. Entre eles estão os gêneros Aspergillus sp,
Penicillium sp, Fusarium sp e Cladosporium sp, alvos deste estudo. São encontrados na
poeira e no ar e desempenham papel importante na patologia médica, como elementos
alergizantes. Assim, muitas asmas ditas “de clima” estão na dependência ou em relação
íntima com a flora micótica do ar. O gênero Candida compreende leveduras que
possuem um habitat bastante amplo. No homem, essa levedura habita a mucosa
digestiva e a mucosa vaginal. A infecção pode atingir mucosas, tecido cutâneo e em
alguns casos pode ser sistêmica. A grande diversidade genética do Reino Fungi torna
relevante a conservação de suas culturas em coleções de laboratórios de
microrganismos. A manutenção dos microrganismos por longos períodos é de vital
importância para a utilização destes em pesquisas e na indústria. Por isso, técnicas de
conservação foram desenvolvidas sendo todas alternativas plausíveis para a manutenção
fúngica, embora os resultados sejam variados. Os métodos usualmente empregados em
laboratórios de coleção para a manutenção de microrganismos são repique contínuo,
água destilada esterilizada, liofilização, sílica gel, e os que foram avaliados neste
trabalho que são óleo mineral, criopreservação a -70ºC e refrigeração a 5ºC. O presente
trabalho consistiu em investigar qual metodologia é mais adequada para a manutenção
289
de microrganismos do filo Ascomycota e leveduras do gênero Candida incorporados à
coleção de microrganismos de interesse médico do INPA no período de janeiro de 2007
a fevereiro de 2010 que vinham sendo mantidos sob óleo mineral e repique contínuo.
Da Coleção de Fungos de Interesse Médico do INPA, foram selecionadas 223 amostras
de Candida sp e 250 amostras de fungos do Filo Ascomycota. Estas foram reativadas
em Agar Sabouraud e submetidas aos métodos de preservação. A cada 90 dias durante
180 dias as culturas foram avaliadas quanto a sua viabilidade. As três metodologias
avaliadas apresentaram resultados satisfatórios tanto para os microrganismos do Filo
Ascomycota como para as leveduras do gênero Candida.
Palavras-chave: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium.
Introdução
Os fungos têm grande importância na microbiologia, pois atuam como agentes

das infecções conhecidas como micoses que acometem todos os seres vivos (Lacaz et
al., 2002). Para a medicina e a indústria estes são de suma importância devido à
produção de metabólitos, para o desenvolvimento e produção de medicamentos, drogas,
fermentos, corantes e conservantes (Rocha et al., 2009). O Filo Ascomycota
compreende inúmeros gêneros de fungos. Entre eles estão os gêneros Aspergillus,
Penicillium, Fusarium e Cladosporium, alvos deste estudo. São encontrados na poeira e
no ar e desempenham papel importante na patologia médica, como elementos
alergizantes. O gênero Candida compreende leveduras que possuem um habitat bastante
amplo. No homem, essa levedura habita a mucosa digestiva e a mucosa vaginal. A
infecção pode atingir mucosas, tecido cutâneo e em alguns casos pode ser sistêmica. A
grande diversidade genética do Reino Fungi torna relevante a conservação de suas
culturas em coleções de laboratórios de microrganismos. A manutenção dos
microrganismos por longos períodos é de vital importância para a utilização destes em
pesquisas e na indústria. Por isso, técnicas de conservação foram desenvolvidas sendo
todas alternativas plausíveis para a manutenção fúngica, embora os resultados sejam
variados. Os métodos usualmente empregados em laboratórios de coleção para a
manutenção de microrganismos são repique contínuo, água destilada esterilizada,
liofilização, sílica gel, e os que foram avaliadas neste trabalho que são óleo mineral,
criopreservação a -70º C e refrigeração a 5º C (Figueiredo, 2001; Nakasone et al.,
290
2004). O presente trabalho consistiu em investigar qual metodologia é mais adequada
para manutenção de microrganismos do filo Ascomycota e leveduras do gênero
Candida incorporados à Coleção de Microrganismos de Interesse Médico do INPA no
período de janeiro de 2007 a fevereiro de 2010 que vinham sendo mantidos sob óleo
mineral e repique contínuo.
Material e Métodos
Foram selecionadas 223 amostras de Candida sp. e 250 amostras de fungos do

Filo Ascomycota da Coleção de Microrganismos de Interesse Médico do INPA. Estas
foram reativadas em Agar Sabouraud e submetidas aos métodos de preservação.
Foram avaliadas três metodologias de preservação: conservação em óleo mineral,
conservação em refrigeração a 5º C e Criopreservação a -70º C.
Conservação em óleo mineral: A técnica de preservação foi realizada como
descrito por Braz et al. (2009). As culturas foram repicadas em tubos contendo meio de
cultivo Agar Sabouraud com cloranfenicol. Em seguida, essas foram cobertas com uma
camada de óleo mineral esterilizado. As culturas foram mantidas a temperatura
ambiente.
Conservação em Refrigeração a 5º C: A técnica de preservação foi realizada
como descrito por Diogo et al. (2005). As culturas também foram repicadas em tubos
contendo meio de cultivo Agar Sabouraud. Em seguida, as culturas foram armazenadas
em refrigerador com temperatura controlada em 5º C.
Criopreservação a -70º C: A técnica de preservação foi realizada como
desenvolvida no Laboratório de Micologia, CSAS-INPA. Em microtubos de 2mL
estéreis foram acrescidos de 0,8 mL de água destilada estéril, 0,05 mL de dimetil-
sulfóxido DMSO (crioprotetor), 0,1 de glicerol (crioprotetor), 10 mg de miçangas
(2mm, com orifício) estéreis e 100 mg de biomassa dos isolados fúngicos, essa última
obtida como descrito nos itens anteriores. Os frascos foram armazenados a temperatura
de -70º C.
Reativação dos microrganismos submetidos às metodologias de preservação: A
cada 90 durante 180 dias as culturas foram reativadas como descrito por Girão et al.
(2004), modificado para que fossem avaliadas quanto a sua viabilidade. Para as
amostras submetidas às metodologias de óleo mineral e refrigeração a 5º C, uma alçada
da colônia foi semeada em meio de cultivo Agar Sabouraud. Na metodologia de
291
criopreservação a -70º C, uma miçanga foi retirada e também semeada em meio de
cultivo Agar Sabouraud.
Resultados
Das 223 amostras de leveduras preservadas, 100% apresentaram viabilidade para

a metodologia de óleo mineral, 98% para a refrigeração a 5ºC e 97% para a
criopreservação a -70ºC após 90 dias. Portanto, após 180 dias, o percentual de
viabilidade para a metodologia de óleo mineral baixou para 67% e as demais
metodologias permaneceram em média 97% de viabilidade. Das 250 amostras do filo
Ascomycota preservadas, sendo Aspergillus sp. (n=58), Penicillium sp. (n=54),
Fusarium sp. (n=77) e Cladosporium sp (n=61), também apresentaram resultados
satisfatórios quanto a viabilidade em todas as três metodologias após 90 dias. O gênero
Aspergillus sp. apresentou um percentual de 98% tanto para a metodologia de óleo
mineral quanto para a refrigeração a 5º C. E a metodologia de criopreservação teve uma
viabilidade de 94% para os microrganismos deste gênero. Os demais gêneros
apresentaram resultados semelhantes, onde as três metodologias tiveram um percentual
em média de 95% de viabilidade para as três metodologias empregadas. Após 180 dias,
o percentual de 90% se manteve para as três metodologias nos gêneros Aspergillus sp e
Penicillium sp. e 100% no gênero Cladosporium sp. Apenas o gênero Fusarium
apresentou um percentual em média de 65% após 180 dias.
Em relação aos casos de contaminação, nas amostras do gênero Candida, a
metodologia que apresentou maior frequência foi a conservação sob óleo mineral.
Porém, a frequência dos casos não foi significativa, sendo apenas 0,6% e 0,5% após 90
e 180 dias, respectivamente. Nas amostras do Filo Ascomycota, as três metodologias
apresentaram casos de contaminação, mas também não foram tão significativos.
Nas amostras de leveduras, os casos de inviabilidade celular foram observados nas três
metodologias de preservação. Porém, a metodologia de óleo mineral obteve um
percentual de 31, 6% após a segunda recuperação (180 dias). Nas amostras do Filo
Ascomycota, as três metodologias também apresentaram casos de inviabilidade celular.
Discussão
292
Lima (1991) obteve 98,7 % de viabilidade na preservação de espécies de
Fusarium sp. sob óleo mineral durante períodos de 4 a 35 anos. No estudo realizado por
Da Silva et al. (2010), a viabilidade de culturas de espécies de Penicillium sp. também
preservadas sob óleo mineral foi de 43,3 %. Segundo o autor, a inviabilidade foi
observada somente nas culturas estocadas por 12 a 16 anos.
Em trabalho realizado por Oliveira et al. (2010) utilizando a técnica de
criopreservação a -70º C em amostras de leveduras do gênero Malassezia obteve-se
100% de viabilidade entre as amostras.
Conclusões
As três metodologias avaliadas neste estudo apresentaram resultados

satisfatórios tanto para os microrganismos do Filo Ascomycota como para as leveduras
do gênero Candida. Porém, verificou-se que a metodologia de criopreservação a -70º C
foi a que obteve melhores resultados tanto em relação a contaminação, uma vez que as
amostras se apresentaram com maior pureza, como a inviabilidade celular das amostras,
pois foi a que demonstrou melhor crescimento fúngico.
A metodologia de conservação sob óleo mineral foi a que esteve mais
relacionada com contaminação e inviabilidade celular. Apenas o gênero Fusarium
apresentou casos significativos de inviabilidade celular em todas as metodologias após
180 dias de conservação.
Referências
Braz SCM, Motta CMS, Massa DML, Neves RP, Magalhães OMC (2009) Viabilidade,
confirmação taxonômica e detecção enzimática de espécies de Acremonium preservadas
sob óleo mineral na Coleção de Culturas University Recife Mycology. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.42, p.63.
Da Silva JC, Fernandes OCC, Martins MS, Rodrigues AC, Teixeira MFS (2010)
Atividade antimicrobiana de espécies de Penicillium mantidas sob duas condições de
preservação. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 30: 48-54.
Diogo HC, Sarpleri A, Pires MC (2005) Fungi preservation in distilled water. An Bras
Dermatol, 8: 591- 4.
Figueiredo MB (2001) Métodos de preservação de fungos patogênicos. Biológico. 63:

73-82.
Girão MD, Prado MR, Brilhante RSN, Cordeiro RA, Monteiro AJ, Sidrim JJC, Rocha
MFG (2004) Viabilidade de cepas de Malassezia pachydermatis mantidas em diferentes
293
métodos de conservação. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 37:
229-233.
Lacaz CS, Porto E, Martins JEC, Heins-Vaccari EM, De Melo NT (2002) Tratado de
Micologia Médica. 9. ed. São Paulo: Sarvier. Lima, D.M.M. 1991. Preservação de
espécies de Fusarium sob óleo mineral. Pesq. agropec. bras., Brasília, 26: 853-855.
Lima DMM (1991) Preservação de espécies de Fusarium sob óleo mineral. Pesq.
agropec. bras, 26: 853-855 p.
Nakasone KK, Peterson AW, Jong S (2004) Preservation and distribution of fungal
cultures. In: Mueller G.M, Bills, G.F, Foster, M.S. Biodiversity of fungi, inventory and
monitoring methods. Elsevier Academic Press, 37-47.
Oliveira ACP, Oliveira JAA, Cortez ACA (2010) Malassezia spp. (Cryptococcaceae)
Identificação e Criopreservação das amostras conservadas na Coleção de Fungos de
Interesse Médico do INPA do ano de 2006. XIX Jornada de Iniciação Científica PIBIC
INPA.
Rocha RM et al (2009) Trichophyton rubrum: manutenção e viabilidade por crio e

hidropreservação.
294
Identificação de espécies do gênero Candida mantidas na Coleção de

Microrganismos de Interesse Médico do INPA
Oliveira1L.A.1, Cortez A.C.A.2, Souza J.V.B.3
1
. INPA ([email protected]); 2. PPG-BIONORTE ([email protected]); 3. INPA
(joã[email protected])
Resumo
O gênero Candida compreende um grupo de leveduras encontrado em diversos

ecossistemas. São considerados patógenos oportunistas, produzindo infecções com
vários tipos de manifestações clínicas. A onicomicose é uma infecção fúngica que
acomete tanto as unhas das mãos como dos pés. Pode afetar a matriz, placa ungueal e
leito ungueal. É conhecida a manifestação de resistência no gênero Candida nas
diferentes espécies, o que dificulta o tratamento da candidíase e o que justifica
identificar leveduras em nível de espécie, pois consiste em um passo crucial para
prescrição da terapêutica antifúngica adequada. O presente trabalho consistiu em
identificar isolados do gênero Candida sp. mantidos na Coleção de Microrganismos de
Interesse Médico do INPA em nível de espécie para que sejam conhecidas as principais
espécies relacionadas com infecções de unha em seres humanos. Foram utilizadas 15
amostras de Candida sp. pertencentes a Coleção de Microrganismos de Interesse
Médico do INPA. Os testes utilizados para identificação das leveduras foram avaliações
dos aspectos macro e micromorfológicos, filamentação em ágar-fubá, meio cromógeno
e assimilação de carbono. As amostras provenientes de unhas de pacientes com
onicomicose foram identificadas como 67% (10) Candida parapsilosis, 13% (2)
Candida tropicalis e 7% (1) Candida albicans.
Palavras-chave: Candida spp, onicomicose, identificação de leveduras.
295
Introdução
O gênero Candida compreende um grupo de leveduras encontrado em diversos

ecossistemas, inclusive na microbiota residente de humanos e animais. São
considerados patógenos oportunistas, produzindo infecções que se manifestam
clinicamente por lesões superficiais da pele e mucosas, ou em alguns casos pode ser
sistêmica, muitas vezes severa ou letal. Há uma ocorrência crescente de infecções por
esses fungos, assim como a identificação de novas espécies patogênicas, principalmente
em imunocomprometidos (Dal Vesco et al., 2011). A Candida, em parasitismo no
hospedeiro, no exame direto do material clínico, apresenta blastosporos ou pseudohifas
com tamanho de 2-3x4-6μm, ovalada e/ou alongada com brotamento; e quando isolada
em meio de cultivo são visualizados blastoconídeos, hifas e pseudohifas. Quando
cultivada em ágar Sabouraud dextrose a 35°C tem crescimento em 24-48h,
apresentando macroscopicamente colônias com aspectos brilhantes ou opacas,
coloração branca a creme, textura cremosa, bordas regulares ou irregulares e odor de
levedo. Microscopicamente é possível observar blastoconídeos esféricos de 8-12μm ou
ovais (6-10x3,6-6μm) com paredes finas, ausência de cápsula, algumas espécies podem
apresentar clamidoconídeos terminais ou intercalares (Lacaz et al., 2002). As principais
espécies dentro do gênero são C. albicans, C. parapsilosis, C. krusei, C. lusitanie, C.
dubliniensis, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. glabrata e C. rugosa (Sidrim e Rocha,
2004). É conhecida a manifestação de resistência no gênero Candida nas diferentes
espécies, o que dificulta o tratamento da candidíase e o que justifica identificar
leveduras no nível de espécie, pois consiste em um passo crucial para prescrição da
terapêutica antifúngica adequada (Atique, 2006). Este trabalho consistiu em identificar
as amostras de Candida sp. mantidas na Coleção de Microrganismos de Interesse
Médico do INPA em nível de espécie através dos testes usualmente utilizados para
identificação de leveduras.
Material e Métodos
Foram utilizadas 15 amostras de Candida sp. pertencentes a Coleção de

Microrganismos de Interesse Médico do INPA. Os testes utilizados para identificação
das leveduras foram avaliações dos aspectos macro e micromorfológicos, filamentação
em ágar-fubá, meio cromógeno e assimilação de carbono.
296
Aspectos macromorfológicos: A caracterização macromorfológica das colônias
leveduriformes foi realizada através da observação em ágar Sabouraud dextrose
cloranfenicol.
Aspectos micromorfológicos: Foi realizado microcultivo em lâmina como

descrito por Lacaz, 2002. O meio de cultura Agar fubá acrescido de TWEEN 80 foi
distribuído 3mL ainda líquido em lâminas de microscopia. Após a solidificação, as
leveduras cultivadas foram semeadas em estrias nesta lâmina, e recobertas com lamínula
estéril. Essa preparação foi mantida de 2 a 3 dias à 25 ºC e em seguida foram realizadas
leituras microscópicas diárias para a verificação de produção de filamentação e de
clamidoconídios.
Meio Cromogênico: As leveduras foram semeadas em placas com meio de
cultivo CHROMagar Candida®. Após um período de incubação de 24 a 48 h, foi
observada a coloração que as leveduras apresentaram no meio e feito a identificação
específica.
Assimilação de carboidratos: Foi aplicado o teste de assimilação de carboidrato
como descrito por Sidrim e Moreira (1999). Foi utilizado um meio basal destituído de
qualquer fonte de carbono. Foi preparada uma suspensão da levedura a partir de
colônias jovens, com crescimento de 48h em ágar Sabouraud dextrose e cloranfenicol a
36ºC, a qual foi diluída em água destilada estéril. Uma alíquota do inóculo foi
adicionada a uma placa de Petri contendo Agar base carbono. Foram adicionados os
seguintes açúcares: glicose, lactose, sacarose, galactose, maltose, rafinose. As mesmas
foram observadas quanto à turbidez na placa ou formação de um halo ao redor do
açúcar desenvolvido pela assimilação especifica de cada levedura confirmando assim a
espécie.
Resultados
As 15 amostras estudadas, possuíam as características macromorfológicas de

leveduras do gênero Candida. Após 24 ou 48 h da semeadura dessas em meio
Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol, mostraram-se com colônias
esbranquiçadas, aspectos brilhantes ou opacas, lisas ou rugosas, textura cremosa e odor
de levedo.
297
Quanto ao microcultivo, onde as leveduras foram semeadas em meio de cultivo
Agar-fubá acrescido de Tween 80, das 15 amostras estudadas, uma apresentou
positividade para presença de clamidoconídeos.
Todas as 15 amostras também foram semeadas em meio CHROMagar Candida®
para identificação das espécies de acordo com a coloração. Neste meio de cultivo C.
albicans aparece com uma coloração verde, C. tropicalis tem uma coloração azul e as
demais espécies como rosa claro, lilás ou branca. Uma colônia apresentou coloração
verde, duas apresentaram coloração azul e 12 apresentaram coloração rosa claro, lilás ou
branca.
A prova de assimilação de carbono determina a capacidade das diferentes
espécies de leveduras desenvolverem-se a partir de diferentes substratos. A positividade
caracteriza-se pela presença de um halo ao redor do açúcar assimilado. Nesse estudo
foram utilizados os seguintes açúcares: glicose, galactose, maltose, rafinose, sacarose e
lactose. A leitura foi realizada como descrita por Koneman (2001).
Portanto, das 15 amostras mantidas na Coleção de Microrganismos de Interesse Médico
do INPA, 80% (12) foram identificadas como espécies não albicans, sendo 67% (10)
Candida parapsilosis e 13% (2) Candida tropicalis. Foi identificada apenas 7% (1)
como Candida albicans. E 2 amostras não puderam ser identificadas pelas metodologias
utilizadas e foram caracterizadas como Candida spp.
Discussão
Em um estudo realizado por Demitto et al. (2012), foram obtidos 91 isolados

provenientes de amostras de urina, hemocultura, ponta de cateter, secreção orotraqueal,
entre outros, sendo 38 Candida albicans, 23 C. tropicalis, 16 C. gabrata, 10 C.
parapsilosis e quatro C. krusei, confirmando que são frequentes as infecções por
leveduras do gênero Candida spp., o que torna essas espécies um importante alvo de
estudos. Em um estudo realizado por Nogueira (2005), dos 200 isolados provenientes de
onicomicoses de unhas dos dedos das mãos de pacientes de Belo Horizonte, 40% (80
isolados) foram identificados como C. parapsilosis, 32% (64 isolados) como C.
albicans, 26% (52 isolados) como C. tropicalis e 2% (4 isolados) como C.
guilhermondii. Souza et al., (2007) em seu estudo realizado em Maringá, Paraná
também teve como espécie mais frequentemente isolada C. parapsilosis (44,61%),
seguida por C. tropicalis (21,59%) e C. albicans (14,78%). Alguns autores como
298
Gautret e Rodier (2000) e Silva et al., (2005) também observaram a prevalência da
espécie Candida parapsilosis, a qual, também neste trabalho foi encontrada como
principal espécie envolvida em infecções causados por leveduras do gênero Candida.
Conclusão
Nos últimos anos, cada vez mais vem ocorrendo o surgimento de espécies não
albicans como agentes da Candidíase, em especial, a Candida parapsilosis que foi a
espécie mais observada nesse estudo. Este tipo de infecção esteve por muito tempo
relacionada com a presença de Candida albicans, sendo esta a espécie de Candida mais
bem estudada.
Referências
Atique TSC (2006) Pesquisa das Espécies e Sensibilidade Antifúngica de Candida sp.
em Indivíduos Soropositivos para o HIV. Dissertação apresentada a Faculdade de
Medicina de São José do Rio Preto para obtenção do Título de Mestre no Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde- Eixo Temático Medicina e Ciências Correlatas.
São José do Rio Preto.
Dal vesco ED, Ricci B, Costa, GA, Lamonato, IR; Oliveira, NM, Onofre, SB (2011)
Quantificação e identificação de Candida na cavidade oral de crianças. RBAC, 43: 217-
21.
Demitto FO, Do Amaral RCR, Biasi RP, Guilhermetti E, Svidzinski TIE, Baeza LC
(2012) Suscetibilidade a antifúngicos in vitro de Candida spp. em pacientes do Hospital
Universitário Regional de Maringá-PR. J Bras Patol Med Lab. v. 48. n. 5. 315-321 p.
Gautret P, Rodier MH, Lacroix KC, Jacquemin JL (2000) Case Report and Review.
Onychomycosis due to C. parapsilosis. Mycoses. v. 43, 433-435 p.
Koneman EW (2001). Micologia. In: Koneman E W (2001) Diagnóstico

microbiológico: texto e atlas colorido. 5. ed. São Paulo: MEDSI; 995-1078 p.
Lacaz CS.; Porto E, Martins, JEC, Heins-vaccari EM, De Melo NT (2002) Tratado de
Micologia Médica. 9. ed. São Paulo: Sarvier.
299
Nogueira CC (2005) Prevalência, fatores de virulência e susceptibilidade a drogas
antifúngicas de amostras de Candida spp. Isoladas de pacientes com onicomicoses
provenientes de Belo Horizonte, MG. Dissertação de mestrado, UFMG.
Sidrim JJC, Moreira JLB (1999) Fundamentos Clínicos e Laboratoriais da Micologia

Médica. Editora Guanabara Koogan. cap. 09. 77-88 p.
Sidrim JJC, Rocha MFG (2004) Micologia médica à luz de autores contemporâneos.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 408p.
Silva JO, Capuano DM, Takayanagui OM, Giacometti JRE (2005) Enteroparasitoses e
onicomicoses em manipuladores de alimentos do município de Ribeirão Preto, SP,
Brasil. Revista Brasileira de Epidemiologia. v. 8, n. 4, 385-92 p.
Souza EAF, Almeida LMM, Guilhermetti E, Mota VA, Rossi RM, Svidzinski TIE
(2007) Frequência de onicomicoses por leveduras em Maringá, Paraná, Brasil. An Bras
Dermatol; 82 (2): 151-6 p.
300
Caracterização de Fusarium decemcellulare isolado de guaranazeiro

(Paullinia cupana var. sorbilis) por meio de ERIC-PCR
Queiroz C.Á.1, Silva A.F.1, Cruz J.C.2, Silva G.F.2, Sousa N.R.2, Matos K.S.3, Hanada R.E.4
Pós-graduação em Biotecnologia - Universidade Federal do Amazonas – UFAM / Embrapa Amazônia

1
Ocidental; 2Embrapa Amazônia Ocidental; 3Pós-doutoranda - Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia; 4Instituto de Pesquisa da Amazônia. E-mail: [email protected]
Resumo
O guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis) é uma espécie de grande importância

para a região Amazônica, suas sementes são ricas em cafeínas sendo utilizadas como matéria-
prima para a produção de bebidas industrializadas e energéticos. O Brasil é o único produtor
mundial de guaraná em escala comercial, sendo os estados do Amazonas e Bahia responsáveis
por 19,5% e 72,4% da produção. Um dos principais responsáveis pela baixa produção no
Amazonas são as doenças caudas por fungos, entre elas o superbrotamento que tem como
agente etiológico Fusarium decemcellulare que vem se tornando um problema sério para a
cultura. Neste trabalho foram analisados 76 isolados obtidos dos três principais sintomas 26 da
hipertrofia da gema vegetativa, 16 hipertrofia floral, 18 isolados de galha no caule e 16 isolados
de raiz, caule e folhas de guaranazeiro que apresentava sintomas. A diversidade foi avaliada via
marcador ERIC-PCR por meio de 18 bandas polimórficas obtidas. A similaridade genética
variou de 0,43 a 1 e com base na similaridade genética maior que 0,48% foi possível reunir os
isolados em três grandes grupos independentes do local de coleta ou sintomas.
Palavras-chave: Superbrotamento, Hipertrofia floral, galhas e marcador molecular.
301
Introdução
O guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis (Mart.) Ducke) é uma espécie nativa da
Amazônia de grande importância para a região, pois suas sementes são ricas em cafeína,
matéria-prima para a produção de bebidas industrializadas e energéticos. Além da cafeína, o
guaraná apresenta outros compostos químicos como flavonóides e taninos, que lhes conferem
características estimulantes e medicinais (Campos et al., 2011). O Brasil é praticamente o único
produtor de guaraná em escala industrial, o Estado da Bahia contribui com 72,4% da produção
e o Amazonas com 19,5% (IBGE 2013). Entre os vários fatores que contribuem para essa baixa
produtividade no Estado do Amazonas, o superbrotamento é uma doença que foi detectada no
amazonas no início da década de 80 e só em 2014 nas plantações baianas, causada pelo agente
etiológico Fusarium decemcellulare, atualmente vem se tornando um problema sério para a
cultura do guaraná, pois afeta desde o estádio de mudas às plantas adultas impedindo seu
desenvolvimento (Araújo et al., 2007).
Em levantamento realizado por Araújo et al. (2007) constatou-se que a doença tem
ocorrência generalizada nos municípios produtores do estado do Amazonas, contudo a maior
prevalência foi observada em Urucará (41,36%), Itacoatiara (31,43%), Maués (27,89%) e Boa
Vista do Ramos (23,77%). A doença afeta órgãos em crescimento ativo como as gemas
vegetativas e apresenta pelo menos três sintomas bem característicos como o superbrotamento
das gemas vegetativas (caracterizado pela presença de inúmeras brotações a partir de uma
gema, apresentando entrenós curtos a partir dos quais surgem vários ramos secundários),
hipertrofia floral (caracterizada pelo endurecimento e secamento das flores impossibilitando a
polinização) e galhas no caule (caracterizadas por inúmeros brotos numa mesma gema,
formando uma massa desordenada e compacta).
Desde a identificação do agente etiológico na década de 80 por Batista e Bolkan
(1982) e os trabalhos epidemiológicos realizados por Araújo et al. (2007), pouca importância
foi dada a este patossistema e inúmeras questões ainda continuam sem respostas, não se sabe
exatamente como esse fungo penetra no hospedeiro, se em guaranazeiro existe a ocorrência de
formas homotálicas (não patogênicas) e heterotálicas (patogênicas) como observado em
cacaueiro, muito menos sobre a diversidade e comportamento da população nas área produtoras
de guaraná. Diante disso, a presente pesquisa visa analisar a diversidade genética de F.
decemcellulare isolado de mudas e plantas adultas de guaranazeiro com sintomas de
superbrotamento, hipertrofia floral ou galhas por meio do marcador molecular ERIC-PCR.
302
Material e métodos
A presente pesquisa foi realiza no laboratório de Biologia Molecular na Embrapa da

Amazônia Ocidental (CPAA) localizada na cidade de Manaus-AM.
Isolamento de F. decemcellulare
O isolamento de F. decemcellulare foi realizado a partir dos três diferentes sintomas

de 39 plantas de guaranazeiro de Manaus, Maués e Presidente Figueiredo em 2013. Todos os
tecidos coletados foram submetidos ao isolamento indireto conforme descrito por Santos
(1983). A partir do isolamento foi realizado o cultivo monospórico onde foram obtidos 76
isolados de F. decemcellulare (Tabela 1). Os isolados foram crescidos em meio batata-dextrose
BD sob agitação de 150 rpm para obtenção de massa micelial, que foi filtrada e em seguida
realizada a extração de DNA utilizando o protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990). A
quantificação de DNA foi mensurada por meio de espectrofotômetro Nanodrop e em gel de
agarose (0,8%).
Marcadores ERIC-PCR
A diversidade genética de F. decemcellulare foi analisada por meio do marcador

molecular ERIC-PCR utilizando os primers ERIC 1R 5`-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-
3´ e ERIC F- 5`-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3´. As reações de PCR foram realizadas
com: 1X de tampão (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.4, 1% de T), 1,5 mM de cloreto de
magnésio, 0,5mM de dNTP, 50ng de DNA, 0,2µM de cada primer e 1U de enzima Taq DNA
polimerase (Karpa). As reações foram realizadas nas seguintes condições: desnaturação inicial
94 ºC por 5 min, 30 ciclos de 94 ºC por 1 min, 48 ºC por 1 min, 65 ºC por 5 min, seguido pela
extensão final de 65ºC por 16 minutos.
Análises de dados
A partir dos géis obtidos pelo marcador ERIC-PCR, foi construído uma matriz de
dados binários onde 1 representa a presença e 0 a ausência da banda. A diversidade foi
calculada pelo coeficiente de similaridade de Dice usando o software NTSYSpc-2.02 (Rohlf et
al., 2009). A matriz de similaridade foi utilizada para construção do dendrograma baseada pelo
método UPGMA (Unweighted Pair Group Method Averages).
303
Tabela1- Isolados de Fusarium decemcellulare obtidos de mudas e plantas adultas de
guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis) com sintomas de superbrotamento (hiperplasia da
gema vegetativa, hipertrófica floral ou galhas)
LOCAL ORIGEM SINTOMA LOCAL ORIGEM SINTOMA

DA DO DA DA DO DA
ISOLADOS COLETA GENOTIPO TECIDO PLANTA ISOLADOS COLETA GENOTIPO TECIDO PLANTA
F01 Mudas/Ma PL 001 RM HGV F82 Mudas/Ma 38 Flor HF
F02 Mudas/Ma PL 002 RM HGV F85 Mudas/Ma 41 Flor HF
F04 Pl.Ad/Ma CL 003 RM HGV F86 Mudas/Ma 41 Flor HF
F08 Pl.Ad/Mu CL 601 Flor HF F90 Mudas/Ma FMI 305 A RM HGV
F12 Mudas/Mu 626 RM HGV F92 Mudas/Ma FMI 305 A RM HGV
F14 Mudas/Mu 300ª Flor HF F94 Mudas/Ma FMI 305 A RM HGV
F17 Pl.Ad/Mu CL 300-C RM HGV F96 Mudas/Ma 306 B Ra Ga
F19 Pl.Ad/Mu CL 300-B Flor HF F97 Mudas/Ma 307 B Ra Ga
F19B Pl.Ad/Mu CL 300-B Flor HF F100 Mudas/Ma 310 B Ra Ga
F20 Pl.Ad/Mu CL 300-C RM HGV F105 Mudas/Ma P384 Ra I Ga
F21 Pl.Ad/Mu CL 217-A RM HGV F109 Mudas/Ma P382 Ra Ga
F22 Pl.Ad/Mu CL 217-A RM HGV F112 Mudas/Ma P385 Fo TA
F23 Pl.Ad/Mu CL 300-A Flor HF F114 Mudas/Ma E29 Ra Ga
F24 Pl.Ad/Mu CL 300-A Flor HF F115 Mudas/Ma E29 Ra Ga
F26 Pl.Ad/Mu CL 619 RM HGV F119 Mudas/Ma E29 Ca Ga
F27 Mudas/Mu 021 Flor HF F120 Mudas/Ma E29 Ca Ga
F28 Mudas/Ma 022 (887) Ca Ga F121 Mudas/Ma E29 Ca Ga
F29 Mudas/Ma 023 (889) Ca Ga F125 Mudas/Ma E29 Fo TA
F30 Mudas/Ma 023 (889) Ca Ga F127 Mudas/Ma FMI 305 A Ca Ga
F31 Mudas/Ma 023 (889) Ca Ga F129 Mudas/Ma 1816 Ca Ga
F34 Mudas/Ma 24 Fo TA F132 Mudas/Ma 1816 Ra HGV
F37 Mudas/Ma 24 Fo TA F134 Mudas/Ma 1816 Ca HGV
F38 Mudas/Ma 24 Fo TA F135 Mudas/Ma 1816 RM HGV
F40 Mudas/Ma 24 Fo TA F137 Mudas/Ma 575 B Ca Ga
F41 Mudas/Ma 24 Fo TA F139 Mudas/Ma 576 B Ca Ga
F52 Mudas/Mu 12 RM HGV F141 Mudas/Ma 1752 Flor HF
F53 Mudas/PF 26 Flor HF F143 Mudas/Ma 1752 Flor HF
F54 Mudas/PF 26 Flor HF F145 Mudas/Ma 1752 Fo TA
F57 Mudas/PF 26 RM HGV F146 Mudas/Ma 1752 Fo TA
F58 Mudas/PF 26 RM HGV F147 Mudas/Ma 1752 Fo TA
F59 Mudas/PF 28 RM HGV F148 Pl.Ad/Ma 1779 (217) Fo TA
F60 Mudas/PF 28 RM HGV F149 Pl.Ad/Ma 1779 (217) Fo TA
F62 Mudas/PF 29 RM HGV F152 Mudas/Ma (296) (145) Ca HGV
F63 Mudas/Ma 29 RM HGV F155 Mudas/Ma (296) (145) Ca HGV
F80 Mudas/Ma 37 Flor HF F170 Mudas/Ma P 702 Ca Ga
‘Origem: Pl.Ad (Planta Adulta); Ma (Manaus); Mu (Maués); PF (Presidente Figueiredo).
‘’Sintomas Tecidos: HGV (Hiperplasia Gema Vegetativa); HF (Hiperplasia Floral); Ga (Galha); Ra
(Raiz); Ca (Caule); Fo (Folhas); RM (Ramo); TA (Tecido assintomático).
304
Com uma ampla gama de hospedeiros, F. decemcellulare já foi reportado em mais de

75 diferentes espécies de plantas em regiões tropicais e subtropicais (Farr e Rossman 2016).
Porém recentes trabalhos indicam a existência de um complexo de espécies morfologicamente
semelhantes por meio dos caracteres usualmente utilizados para identificação como a análise de
macro e microconídios. Análise filogenética realizada por Guimarães (2013) confirmam a
separação entre homotálicos e heterotálicos, já verificada deste a década de 70 por meio de
marcador morfológico no qual os homotálicos apresentam quatro ascósporos por asco,
enquanto que os isolados heterotálicos possuem oito ascósporos por asco.
Apesar da importância econômica deste patógeno, ainda não foram realizados estudos
sobre a diversidade genética ou estrutura de população. Neste trabalho foram analisados 76
isolados caracterizados morfologicamente como F. decemcellulare, obtidos de 38 plantas de
guaranazeiro, sendo 28 mudas mantidas em casa de vegetação e 10 clones adultos. Dos tecidos
sintomáticos foram obtidos 26 isolados oriundos da hiperplasia da gema vegetativa, 16 da
hipertrofia floral e 18 das galhas do caule e 16 isolados foram obtidos da raiz, caule ou tecido
foliar de plantas que apresentavam sintomas de hiperplasia da gema vegetativa ou galhas
(Tabela 1).
A análise da diversidade genética dos 76 isolados foi realizada por meio do marcador
ERIC-PCR por meio de 18 bandas polimórficas foram obtidas. Com base na similaridade
genética maior que 0, 48% foi possível verificar que a técnica de ERIC-PCR foi capaz de reunir
os isolados em grupos independentes do local de coleta ou sintomas (Figura 1). Demonstrando
que a variação do tipo de sintoma não estar relacionado com uma possível especialização
fisiológica ou genética do patógeno e sim com o local de infecção no hospedeiro que vai
expressar sintomas com morfologia diferentes.
A elevada diversidade observada para F. decemcellulare em guaranazeiro e a possível
indicação de uma única população independentemente do local de coleta, pode ser um
indicativo de fluxo de material vegetal ou do patógeno entre as diferentes regiões de coleta.
Outro fator determinante no aumento da diversidade genética de um patógeno é possibilidade
de terem diferentes tipos de reprodução podendo ser sexuada/fluxo gênico, assexuada/fluxo
genotípico ou mista, aumentando capacidade de mutação e seleção de genes de virulência que é
maior que a capacidade de mutação e seleção de gene de resistência do hospedeiro
(MCDonalds e Linde 2002).
305
Outra explicação para essa alta diversidade seria a ocorrência das formas homotálica e
heterotálica em F. decemcellulare e consequentemente dos alelos funcionais idiomorfos
conhecidos como MAT-1 e MAT-2 presentes no mesmo cromossomo (Alexander e
Carmichael, 1973; Leslie e Summerell, 2006; Guimarães 2013). Isolados homotálicos possuem
os MAT-1 e MAT-2 podendo se autofecundar, nesses casos é raro os recombinantes serem
reproduzidos, já a forma heterotálica para sua reprodução é indispensável o encontro de
isolados que possuem mating types distintos e tem como consequência o aumento da
diversidade genética da população (Duarte et al., 1999; Leslie e Summerel, 2006).
306
Figura 1 Dendrograma da similaridade entre os 76 isolados de Fusarium decemcellulare, obtido
pelo método UPGMA. Cada planta utilizada foi caracterizada de acordo com os sintomas em
hiperplasia da gema vegetativa, hipertrofia floral e galha. A origem de cada tecido é indicada
pelos círculos:
Folha; Hipertrofia floral; Galha; Hipertrofia da gema vegetativa.
307
Resultado semelhante aos encontrados neste trabalho foram visto por Silva (2009) que
utilizando os marcadores RAPD e SSR em 66 isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense
coletado em diferentes municípios em Santa Catarina, viu que os mesmos não se agruparam por
origens geográficas, os isolados foram distribuídos indistintamente nos grupos apresentando
uma alta diversidade entre eles.
Conclusão
Com a utilização da técnica do ERIC-PCR foi possível observar o agrupamento dos

isolados independente do sintoma ou local de coleta, confirmando uma alta diversidade
genética de F. decemcellulare em guaranazeiro.
Referências
Alexander JV, Cook R J (1965) Fusarium species and Calonectria associated with cushion gall
of Cacao in Central America. Cacao 10: 15-16.
Alexander JV, Carmichael NM (1973) "Divergent patterns of ascus development in

homothallic and heterothallic isolates of Calonectria rigidiuscula." Bulletin of the Torrey
Botanical Club 100: 35-40.
Araújo JCA, Pereira JCR, Gasparotto L, Arruda MR, Moreira A (2007) Embrapa -
Comunicado Técnico. Antracnose do guaranazeiro e seu controle. Disponível em:
https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/681674/1/ComTec462007.pdf
Batista MF, Bolkan HA (1982) O superbrotamento do guaranazeiro. Fitopatol. Bras. 7: 315-

317.
Campos MPO, Riechelmann R, Matins LC, Hassan BJ, Casa FBA, Del-Giglio A (2011)
Guarana (Paullinia cupana) improves fatigue in breast cancer patients undergoing systemic
chemotherapy. J. Altern. Complement. Med. 17: 505-512.
Doyle JJ, Doyle JL, Hortorium LHB (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus
12: 13-15.
Duarte M LR (1999) Doenças de plantas no Trópico úmido Brasileiro. Belém: Embrapa

Amazônia Oriental. 296p.
Farr DF, Rossman AY (2016) Fungal Databases, Systematic Mycology and Microbiology
Laboratory, ARS, USDA. Retrieved December 12, disponível em: http://nt.ars-
grin.gov/fungaldatabases.
308
Guimarães EA (2013) Biologia Reprodutiva, Filogenia e patogenicidade de Fusarium
decemcellulare. (Dissertação). Mestrado em Microbiologia Agrícola, Universidade Federal de
Lavras, Minas Gerais, Brasil.
IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (2013) Levantamento Sistemático da
Produção Agrícola. Disponível em: <http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/
agropecuaria/lspa_201308.pdf>. Acesso em: 10 de Set. 2014.
Leslie JF, Summerell BA (2006) The Fusarium laboratory manual. Malden: Blackwell. 388p.
McDonald B.A, Linde C (2002) "Pathogen population genetics, evolutionary potential, and
durable resistance." Ann. Rev. Phytopathol. 40: 349-379.
Rohlf FJ (2009) NTSYS-pc, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, version
2.2. Exeter Software, Setauket, NY.
Santos ABC, Tabosa SAS, Mendes RGP, Ataíde PF (1983) Etiologia do Superbrotamento da
mangueira no estado do Pará. In: Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Resumos do
Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Brasília, 1985, v.8, p.595.
Silva CMD (2009) Análise da diversidade genética por marcadores RAPD e SSR em Fusarium
oxysporum f. sp. cubense no Estado de Santa Catarina (Tese). Doutorado em Recursos
Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina, Santa Catarina, Brasil.
309
Minipreparação de múltiplas amostras para extração de DNA

total bacteriano em microplacas de 96 poços
Silva M.S.1, Gama A.M.2, Moraes A.B.1, Nonato L.S.1, Carvalho N.O.1, Spira B.2,
Yamane T.3,4, Mota .J.1
1
UFAM - Universidade Federal do Amazonas, 2USP - Universidade de São Paulo 3UEA -
Universidade do Estado do Amazonas, 4CBA – Centro de Biotecnologia da Amazônia
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected]
Resumo
Para acessar o DNA bacteriano, são empregados vários processos de
rompimento da parede celular: aqueles baseados no uso de enzimas como lisozima e
proteinase K; químicos, como o tiocianato de guanidina, e físicos, como maceração do
material congelado, ou em agitadores na presença de esferas de vidro. Entretanto, várias
metodologias em uso são normalmente demoradas e com muitas etapas, aumentando a
probabilidade de contaminação resultante da excessiva manipulação e ainda a utilização
recorrente de solventes orgânicos como o fenol e clorofórmio que geram resíduos
tóxicos e danosos ao ambiente. Diante o exposto, o objetivo deste trabalho foi
estabelecer um método prático e rápido de extração de DNA bacteriano de múltiplas
amostras simultaneamente, ajustado para o padrão de microplacas de 96 poços. O
protocolo apresentado nesse trabalho permite a extração de DNA bacteriano de
múltiplas amostras simultaneamente, em quantidade e qualidade compatíveis com
metodologias baseadas em PCR. O procedimento é rápido, prático e barato, tornando
viáveis economicamente diversos trabalhos de prospecção de micro-organismos
cultiváveis que necessitam de identificação molecular.
Palavras-chave: Genética de micro-organismos, extração do DNA.
Introdução
O primeiro passo de todas as técnicas que precisam acessar a informação
genética é a extração dos ácidos nucleicos. Com exceção das metodologias que usam
310
RNA como a fonte inicial de informação genética, todas as demais que buscam
determinar, manipular, reproduzir, modificar ou recombinar, necessitam em primeira
instância de DNA em quantidade e qualidade que permitam seu processamento
(Fiorentin et. al. 2009).
Para acessar o DNA bacteriano, são empregados vários processos de
rompimento da parede celular: aqueles baseados no uso de enzimas como lisozima e
proteinase K; químicos, como o tiocianato de guanidina, e físicos, como maceração do
material congelado, ou em agitadores na presença de esferas de vidro. Entretanto, várias
metodologias em uso são normalmente demoradas e com muitas etapas, aumentando a
probabilidade de contaminação resultante da excessiva manipulação e ainda a utilização
recorrente de solventes orgânicos como o fenol e clorofórmio que geram resíduos
tóxicos e danosos ao ambiente.
Explorando as dificultadas citadas, a indústria da biotecnologia tem investido em
alternativas viáveis e eficientes para superar tais limitações, os “kits” para extração de
DNA e RNA trouxeram praticidade e ganho de tempo na bancada, entretanto o custo
ainda é elevado, variando entre R$ 20,00 e R$ 30,00, por amostra, o que em geral
obriga o pesquisador a rever estudos mais amplos, e eventualmente combinar amostras
para reduzir os custos com a extração.
Diante o exposto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um método prático e
rápido de extração de DNA bacteriano de múltiplas amostras simultaneamente, ajustado
para o padrão de microplacas de 96 poços.
Material e métodos
Coleta e isolamento das amostras

Para reproduzir as condições de muitos trabalhos realizados com amostras
ambientais, foram utilizadas bactérias oriundas de amostras coletadas do Rio Negro, Rio
Araçá e Solimões. As coletas foram realizadas na profundidade de 15 cm, conforme
determina CETESB (2011) para esse tipo de coleta, com o auxilio de garrafas
devidamente esterilizadas.
As amostras coletadas foram diluídas sucessivamente em 0.9% Solução Salina
até a concentração de 10-5, e semeadas pela técnica de espalhamento de placa nos
seguintes meios de cultura: Ágar Triptona de Soja (TSA) e Ágar Luria-Bertuni (LB) e
Cetrimide Ágar; depois incubadas a 30º C pelo período de 24 horas.
311
Cultivo e extração de DNA
O protocolo foi modificado a partir de Mota e Nobrega (2013), que
estabeleceram o método de minipreparação de DNA de leveduras em microplacas de 96
poços.
Algumas amostras selecionadas ao acaso foram inoculadas em uma microplaca
de 96 poços fundo chato (Costar 96) com 300 µl de caldo TSA. Essas foram incubadas à
30º C por um período de 18h sem agitação.
Após o período de incubação, 50 µl da cultura foram transferidos para outra
microplaca e centrifugadas a 3650 g, durante 10 min, em temperatura ambiente. O
sobrenadante foi descartado e o excesso do meio de cultura foi drenado por inversão da
placa em papel absorvente.
Foram adicionados 100 µL da solução de lise 1 (50 mM Tris, 10 mM EDTA,
2mg/ml lisozima), seguida de incubação à 37º C por 30 min; Para lise da membrana
citoplasmática foram adicionados 10 µL de 10% SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) e 5 µg
de proteinase K, seguido de incubação a 55º C por 30 min, ou até a obtenção de uma
solução translúcida, o que indica lise celular completa.
Para extração dos debris celulares e proteínas totais, foram adicionados 110 µl
de 5M acetato de potássio, homogeneizando bem as amostras com aspirações sucessivas
de forma cautelosa para não contaminar os poços adjacentes, seguido de incubação a -
20 ºC durante 30 min. O esperado para essa fase é um precipitado branco viscoso.
A placa foi então, centrifugadas a 3650 g por 15 min e 100 µl do sobrenadante
foram transferidos para uma nova microplaca de fundo em “V” previamente preparada
com 100 µL de álcool isopropílico em cada poço. A placa permaneceu a -20°C por 15
min seguido de centrifugação a 3650 g e 4 °C por 10 min. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado lavado uma vez com 200 µL de 70% etanol, seguido de
centrifugação a 3650 g por 5 min, o sobrenadante foi novamente descartado e o
precipitado permaneceu à temperatura ambiente para a evaporação do etanol residual.
O DNA foi hidratado com 30 µL tampão de TE/RNAse (10 mM Tris HCl, pH 7,5, 0,1
mM EDTA e 10 μg.ml-1 RNAse). Cinco microlitros de cada extrato foram aplicados em
gel de agarose 0,8 % corado com 0.2 µg.ml-1 brometo de etídio. O DNA total também
foi analisado em NanoDrop2000c para se determinar quantidade e qualidade das
amostras.
312
Foram testados com esse protocolo aproximadamente 300 isolados, e após o

período de incubação, houve massa celular suficiente para a realização das extrações
para a maioria das amostras. Nessa etapa é desnecessário determinar o crescimento
celular, como o protocolo visa objetividade, havendo turvação mínima do meio já se
atinge o número suficiente de células para uma extração com bom rendimento.
Entretanto, para isolados de crescimento rápido onde grande massa celular é atingida
em um período curto, a diluição das células torna-se necessária, pois a quantidade
elevada de massa celular satura o tampão de extração dos debris celulares, e portanto a
qualidade dos produtos de extração cai.
Tentativas em usar um tampão de extração sem proteinase K renderam bem
menos DNA por amostra e em muitos casos, não houve produto que pudesse ser
visualizado em gel de agarose, dessa forma optamos por manter a enzima no tampão. O
tempo de incubação com o tampão de lise 2 é variável, a lise de algumas amostras
ocorre quase que instantaneamente, outras, porém, demoram mais, entretanto, em
nossos ensaios, 20 min foram suficientes para a lise completa de todas as amostras
testadas que pode ser facilmente constatada pela transição de uma solução turva para
uma solução cristalina.
Foi possível extrair DNA de todas as amostras isoladas o que sugere um
protocolo de extração eficiente para os mais diversos tipos bacterianos e com diferentes
estruturas de parede (Fig. 1).
Figura 1. Gel de agarose 0.8% corado com brometo de etídio. Perfil eletroforético do DNA total
bacteriano extraído. L10, L50 e L100, marcador lambda contendo 10, 50 e 100 ng de DNA
respectivamente. Números de 1 a 18, isolados testados nesse estudo. Imagem representativa.
313
A quantidade média de DNA total extraído foi de 200 ng/µl, sendo a menor
concetração 108 ng/µl e a maior, 476 ng/µl. As diferenças observadas se devem, em
geral, à massa celular, algumas bactérias conseguem atingir uma maior densidade que se
reflete diretamente no produto da extração.
Existem diversas técnicas para extração de DNA bacteriano a partir de
amostragem ambiental, entretanto, nenhum método é universalmente aplicável, já que
algumas amostras, devido à sua própria natureza, requerem a adaptação do método
(Zhou et al., 1996). Com o protocolo de extração proposto nesse trabalho foi possível
realizar a extração de DNA de todos os isolados. As diferenças entre os isolados, nas
quantidades de DNA extraído, podem ser explicadas pelo crescimento diferencial
apresentado pelas diferentes amostras.
A quantidade total de DNA extraído varia dentro da escala de nanograma, o que
é suficiente para todas as metodologias que usam como base a PCR. Para técnicas que
necessitam de maior quantidade de DNA (escala de micrograma) ou um DNA com
excelente grau de pureza esse não é o método mais indicado.
O grande diferencial do protocolo proposto nesse trabalho é que ele permite a
extração de DNA total de múltiplos isolados bacterianos simultaneamente, em
microplacas de 96 poços. Além disso, há uma redução significativa no número de
passos e a utilização de solventes orgânicos quando comparado com metodologias
muito difundidas como a extração com fenol e clorofórmio.
Levando-se em consideração a diversidade cultivada, este método se apresenta
como uma alternativa viável para trabalhos que precisam genotipar um grande número
de amostras ambientais. A extração de DNA em geral é uma dificuldade para a maioria
desses trabalhos, por dois motivos básicos: custo e tempo.
Todas as etapas de identificação molecular subsequentes à extração já são feitas
com a manipulação simultânea de múltiplas amostras usando microplacas com 96
poços, sendo as mais comuns, PCR e sequenciamento. Dessa forma, o presente método
certamente é uma contribuição importante, principalmente para a realidade da região
Norte, onde pesquisas envolvendo prospecção de micro-organismos resultam em um
grande número de isolados armazenadas e identificadas em criotubos de preservação.
Conclusões
314
O protocolo apresentado nesse trabalho permite a extração de DNA bacteriano
de múltiplas amostras simultaneamente, em quantidade e qualidade compatíveis com
metodologias baseadas em PCR.
O procedimento é rápido, prático e barato, tornando viáveis economicamente
diversos trabalhos de prospecção de micro-organismos cultiváveis que necessitam de
identificação molecular.
Referências
Fiorentin, F.; Moraes, A.J.; Celant, V.A.; Bonett, L.P. (2009). Testes de extração
de DNA de Anticarsia gemmatalis e Spodoptera frugiperda usando o protocolo
miniprep (modificado de Raeder; Broda, 1985). Anais do I Seminário Internacional de
Ciência, Tecnologia e Ambiente, 28 a 30 de abril de 2009. UNIOESTE, Cascavel –
Paraná – Brasil.
Miranda, R.R., Montanhini, M.T.M., Boreiko, S., Bittencourt, J.V.M. (2011).
Evaluation of genomic dna extration from food interest bactéria. Guia nacional de coleta
e preservação de amostras: água, sedimento, comunidades aquáticas e efluentes
líquidos. Companhia Ambiental do Estado de São Paulo; Org. Carlos Jesus Brandão et
al., São Paulo: CETESB; Brasília: ANA.
Mota, A.J., Back-Brito G.N., Nobrega F.G. (2009). "A practical and rapid microplate
method for yeast genomic DNA extraction." MYCOSES. Vol. 52. Commerce Place,
350 Main ST, Malden 02148, MA USA: Wiley-Blackwell Publishing, INC.
315
Primers específicos para a determinação de MAT-1 em Fusarium decemcellulare
Siqueira V.K.S.1, Matos K.S.1, Hanada R.E.1, Gualberto G.F.2, Silva G.F.2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Fitopatologia, 69080-971, Manaus,

1
AM, Brasil. 2Embrapa Amazônia Ocidental, Laboratório de Biologia Molecular, 69010-970, Manaus,
AM, Brasil. E-mail: [email protected]
Resumo
Fusarium decemcellulare (Fdc) é caracterizado por ser endófito ou patogênico a

diversas plantas em regiões tropicais e subtropicais. Em guaranazeiro é o agente causal de
superbrotamento um dos principais problemas da cultura. O estudo do sistema mating type,
idiomorfos MAT-1 e MAT-2, além de fornecer uma compreensão detalhada para delimitar
espécies dentro de complexos de espécies, é fundamental para estudo da dinâmica e do
potencial de variação genética de um patógeno. Primers degenerados disponíveis na literatura
para determinar mating type em várias espécies de Fusarium, não foi capaz de amplificar o
MAT-1 em Fdc. Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver primers específicos para
determinar MAT-1 em F. decemcellulare. Incialmente primers degenerados foram desenhados
com base nas sequencias do MAT-1 disponíveis no NCBI, amplificado em Fdc e o fragmento
do tamanho esperado foi clonado e sequenciado para o desenho de iniciadores específicos que
foram validados usando população de isolados de Fdc de diferentes locais de coleta no
Amazonas.
Palavras-chave: superbrotamento, heterotalismo, homotalismo, gene MAT.
Introdução
Fusarium decemcellulare Brick (teleomorfo Albonectria rigidiuscula) está presente

principalmente em regiões tropicais, podendo ser endófito ou patogênico a diversas plantas
(Farr e Rossman, 2016).
Em guaranazeiro, espécie nativa da Amazônia, F. decemcellulare causa a doença
denominada de superbrotamento (hipertrofia floral, hiperplasia das gemas vegetativas e galhas
no caule) sendo um dos principais problemas da cultura (Atroch, 2002). E apesar da
316
relevância econômica da doença, ainda pouco se conhece sobre a biologia reprodutiva,
variabilidade genética, estrutura da população ou sobre o potencial evolutivo e risco deste
patógeno.
A identificação de espécie biológica por meio de cruzamentos em laboratório pode ser
útil quando não há marcadores morfológicos suficientes para delimitar espécies (Rossman et
al. 1999; Leslie e Summerell, 2006) como em F. decemcellulare que existem evidências de
que representa um complexo de espécies com diferença filogenética entre isolados
homotálicos e heterotálicos, uma clara identificação molecular por PCR dos Mating type é útil
e pode auxiliar nos cruzamentos entre os isolados (Guimarães, 2013).
O sistema de cruzamento entre fungos é denominado de mating type, consiste em um
loco MAT e geralmente apresenta dois idiomorfos, MAT-1 e MAT-2. Os genes do loco MAT
possuem regiões conservadas entre espécies distantes, que codificam proteínas denominadas
HMG-box (high mobility group) e α-box que regulam todo o processo de reprodução sexual.
Em espécies heterotálicas o cruzamento ocorre entre isolados de mating types opostos,
enquanto que em espécies homotálicas, os isolados são autoférteis (Leslie e Summerell,
2006).
Estudos baseados em determinação de mating type e cruzamentos têm sido utilizados
para delimitar espécies dentro de Gibberella fujikuroi species complex (GFC) que é composto
por distintas espécies filogenéticas e biológicas, e que anteriormente eram denominadas
apenas como Fusarium moniliforme (Leslie e Summerell, 2006). Primers degenerados foram
desenvolvidos para determinar mating type em várias espécies de Fusarium (Kerényi et al.,
2004). Esses primers foram testados em F. decemcellulare, entretanto, somente o idiomorfo
MAT-2 foi amplificado. O presente trabalho teve como objetivo desenhar primer específico
para determinar MAT-1 em F. decemcellulare para auxiliar estudos de indução da fase
sexuada em laboratório.
Material e Métodos
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular na Embrapa

Amazônia Ocidental em Manaus, AM.
Sequências da região conservada MAT-1 de 20 isolados de Fusarium foram obtidas no
banco de dados do GenBank (AJ535627.3, AJ535626.3, AJ535625.4, AM295820.1,
AF100925.1, AM295817.1, AM295819.1, AM295818.1, AM295816.1, AM295815.1,
AM295814.1, AM295302.1, AM295301.1, AJ876530.1, AM072517.1, AM072514.1,
317
AM072513.1, AM072512.1, AJ876534.1, AJ876531.1). As sequências foram alinhadas no
programa MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) e primers degenerados foram desenhados para
MAT-1 denominados de fus052 F (5’-AAGCGCCCTCTBAAYGSYTTC-3’) e MAT-1 fus241
R (5’-TTRGCAATYARRGCCCATTTG-3’).
Os primers degenerados desenhados para MAT-1 foram testados com as amostras de
DNAs de F. decemcellulare. A reação da PCR foi realizada com um volume final de 20 µL,
com 1µL de primers (0,25 µM), tampão 10X (500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,4; 1%
Triton X-100), 1,2 µL MgCl2 (1,5 mM), 0,4 µL dNTP (0,2 mM), 0,05 U/µL Taq polimerase,
20 ng/µL de DNA e água destilada. As condições de ciclos foram: desnaturação inicial de 94
ºC por 30 segundos, seguida por 30 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, temperatura de
anelamento de 60 ºC por 30 segundos, extensão de 72 ºC por 90 segundos, e extensão final de
70 ºC por 1 minuto.
Os fragmentos amplificados foram clonados com o kit CloneJET PCR Cloning
(Thermo Scientific), segundo as recomendações descritas pelo fabricante. Os clones foram
selecionados por PCR de colônia para confirmação de cada fragmento, para extração de
plasmídeo e purificados para sequenciamento, usando o kit BigDye® Terminator v3.1 e
sequenciados em um sequenciador 3500 Genetic Analyser.
O alinhamento das novas sequências de nucleotídeos foi através do programa MEGA 6.0
e a partir da homologia dessas sequências foi realizado o desenho de primers específicos para
determinação de MAT-1 para F. decemcellulare no PRIMER 3. Os primers degenerados
MAT-2 de Kerényi et al., (2004) também foram testados com os isolados de F.
decemcellulare.
O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1,5 % para a
visualização dos resultados. O comprimento dos fragmentos amplificados foi comparado com
o marcador Fermentas 1 Kb.
Os primers degenerados desenhados para determinação de MAT-1 foram testados com

isolados de F. decemcellulare e dois fragmentos foram observados com 189 pb e 373 pb. Os
fragmentos foram clonados e sequenciados.
A sequência do fragmento de 373 pb do gene MAT-1 de F. decemcellulare apresentou
dois íntrons e dois blocos de sequências conservadas (Figura 1).
318
Figura 1 Sequência do fragmento de 373 pares de base do gene MAT-1 de Fusarium
decemcellulare obtido a partir do DNA genômico. Os aminoácidos deduzidos são
apresentados abaixo de cada sequência. Em vermelho dois íntrons localizados in silico e em
negrito dois blocos de sequências conservadas.
Os primers específicos para MAT-1 em F. decemcellulare foram desenhados através do

alinhamento das sequências clonadas no MEGA 6.0, denominados de MAT-1 FDC F (5’-
ACGCTTTCATGGCTTTTCG-3’) e MAT-1 FDC R (5’-GCCCATTTGTTGCGATTATG-3’).
Figura 2 Gel de agarose mostrando a determinação de mating type em cinco isolados de

Fusarium decemcellulare utilizando os primers desenhados para MAT-1 e os primers para
MAT-2 (Kerényi et al., 2004). A) Amplificação do gene MAT-1 (190 pb). B) Amplificação do
gene MAT-2 (260 pb). M- marcador 1 Kb Plus (Fermentas); C + – controle positivo para cada
mating type.
319
O total de 42 isolados de F. decemcellulare foram testados com os primers específicos
desenhados para MAT-1 e com os primers de Kerényi et al., (2004) para MAT-2, resultando
em 26 isolados MAT-1 e 16 isolados MAT-2, com 190 e 260pb, respectivamente (Figura 2).
O conceito biológico de espécies vem sendo aplicado com sucesso para delimitar
espécies principalmente dentro de complexo de espécies (Leslie e Summerell, 2006; Zhan et
al., 2007). No gênero Fusarium, o complexo de espécies amplamente estudado é o GFC, em
que primers foram desenvolvidos para determinar mating type e auxiliar na identificação de
várias espécies biológicas (Steenkamp et al., 2000). De acordo com Guimarães (2013), F.
decemcellelulare representa um complexo de espécies com caracteres morfológicos
semelhantes.
Primers degenerados testados anteriormente para determinar o mating type de
espécies de Fusarium (Kérenyi et al., 2004) forneceram resultado satisfatório somente para o
idiomorfo MAT-2 em isolados de F. decemcellulare. Provavelmente, a não funcionalidade
dos primers para MAT-1 pode estar relacionada com a divergência de sequência que pode
ocorrer mesmo em regiões conservadas para esse gênero (Steenkamp et al., 2000). O
idiomorfo MAT-1 é relativamente mais complexo, pois possui três genes (MAT-1-1, MAT-1-2
e MAT-1-3), sendo que MAT-1-1 codifica proteína da α-box com funções importantes na
formação de peritécios e ascósporos. MAT-1-2 e MAT-1-3 aumentam a eficiência dos
cruzamentos. Já o idiomorfo MAT-2 tem somente a proteína HMGbox, que desempenha papel
importante na ascosporogênese e na determinação de cruzamentos específicos (Yun et al.,
2000).
Os primers específicos desenvolvidos no presente estudo podem ser utilizados com
sucesso para determinar o MAT-1 em F. decemcellulare e assim, auxiliar estudos de indução
da fase sexuada em laboratório para a identificação de espécies biológicas. Além disso, é
possível identificar isolados heterotálicos de isolados homotálicos. Em homotálicos, ocorre a
amplificação de ambos idiomorfos, como foi observado em F. graminearum (Kerényi et al.,
2004). As espécies homotálicas carregam genes para ambos os mating types que podem estar
ligados ou não no mesmo genoma (Yun et al., 2000).
Conclusão
Os primers específicos desenvolvidos no presente estudo podem ser utilizados com
sucesso para determinar o MAT-1 em F. decemcellulare e assim, auxiliar estudos de indução
da fase sexuada em laboratório para a identificação de espécies biológicas.
320
Referências
Atroch AL (2002) Aspectos gerais da cultura do guaraná. Foods and Food Ingredients. J Jpn
204:53-59.
Farr DF, Rossman AY (2016) Fungal Databases, Systematic Mycology and Microbiology
Laboratory, ARS, USDA. Disponível em: http://nt.ars-grin.gov/ fungaldatabases. Acessado
em 12 Jan 2016.
Guimarães EA (2013) Biologia reprodutiva, filogenia e patogenicidade de Fusarium

decemcellulare. Minas Gerais, Brasil, 68p. (M.Sc. Dissertação Universidade Federal de
Lavras. UFLA).
Kerényi Z, Moretti A, Waalwijk C, Oláh B, Hornok L (2004) Mating type sequences in

asexually reproducing Fusarium species. Appl. Environ. Microbiol 70:4419-4423.
Leslie JF, Summerell BA (2006) The Fusarium laboratory manual. Malden: Blackwell. 388p.
Rossman AY, Samuels GJ, Rogerson CT, Lowen R (1999) Genera of Bionectriaceae,
Hypocreaceae and Nectriaceae (Hypocreales, Ascomycetes). Stud Mycol 42:134-137.
Steenkamp ET, Wingfield BAD, Coutinho TA, Zeller KA, Wingfield MJ, Marasas WFO,
Leslie JF (2000) PCR-based identification of MAT-1 and MAT-2 in the Giberella fujikuroi
species complex. Applied and Environmental Microbiology 66:4378-4382.
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S (2013) MEGA6: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30:2725-2729.
Yun SH, Arie T, Kaneko I, Yoder OC, Turgeon BG (2000) Molecular organization of mating
type loci in heterothallic, homothallic and asexual Gibberella/Fusarium species. Fungal
Genet Biol. 31:7-20.
Zhan J, Torriani SFF, McDonald BA (2007) Significant difference in pathogenicity between

MAT1-1 and MAT1-2 isolates in the wheat pathogen Mycosphaerella graminicola. Fungal
Genet Biol. 44:339-346.
321
Produção de proteases por Aspergillus spp estocados na Coleção de

Fungos da Amazônia - CFAM do Instituto Leônidas e Maria Deane
Araújo CPM1,2, Silva LM1,2, Lima AKS1, Torres DR1, Silva JC1, Fernandes OCC1. 1Instituto
Leônidas e Maria Deane - ILMD/FIOCRUZ, Manaus - AM. 2Faculdade Estácio do Amazonas,
Manaus – AM. Email: [email protected]
Resumo
O aproveitamento de fontes naturais, como microrganismos, para produção de

novos bio-produtos vem sendo o principal incentivo para o desenvolvimento de diversos
setores da indústria. As proteases de Aspergillus spp. são largamente exploradas em
diversas indústrias devido à sua atividade em vários pH e temperaturas. Para o presente
estudo foram selecionadas 11 amostras de Aspergillus da Coleção de Fungos da
Amazônia- CFAM/FIOCRUZ –AMAZÔNIA, com o objetivo de encontrar cepas
produtores de protease. As culturas foram reativadas e autenticadas mantendo assim
suas características morfológicas e fisiológicas para todas as amostras viáveis. Quanto a
atividade proteolítica qualitativa observou-se que todos os isolados de Aspergillus
apresentaram positividade para produção de proteases, como também apresentaram
bons índices enzimáticos destacando-se Aspergillus japonicus (CFAM 0240) com 7 mm
de halo ao redor do “cup plate”. A atividade proteolítica variou entre os indivíduos da
mesma espécie, sendo estes capazes de degradar a caseína presente no meio sólido. Já
na avaliação quantitativa observamos que houve uma variação da atividade proteolítica,
com valores variando de 8,09 U/ml (A. japonicus CFAM 0240) a 22,49 U/ml (A. oryzae
CFAM 0540), o que demonstra que a produção de proteases pode variar entre fungos de
espécies diferentes. Esse estudo contribuiu para que futuramente a importação de
enzimas para o Brasil não seja uma necessidade e sim, mais uma opção, tendo em vista
que microrganismos oriundos da região amazônica apresentam potencial para produção
enzimática.
Palavras-chave: Aspergillus, Fungos, Proteases microbianas.
322
Introdução
O aproveitamento de fontes naturais, como microrganismos, para produção de

novos bio-produtos vem sendo o principal incentivo para o desenvolvimento de diversos
setores da indústria. A biodiversidade do Brasil apresenta grande potencial para a busca
de novos fármacos e biomarcadores enzimáticos, disponível para transformação em
produtos úteis e de maior valor agregado, dentre eles as enzimas (Zimmer et al., 2009).
As proteases estão classificadas dentro do grupo das hidrolases, estas
correspondem à aproximadamente 75% das enzimas industriais, sendo 65% das enzimas
comercializadas mundialmente representadas por aquelas que degradam proteínas (Yin
et al., 2014). Embora as enzimas mais estudadas sejam de origem animal e vegetal, as
enzimas de origem microbiana surgem como uma alternativa mais simples e barata,
correspondendo a 90% das proteases comercializadas (Inácio et al., 2014).
Os microrganismos representam uma excelente fonte de proteases devido a sua
grande diversidade bioquímica, requerem espaço limitado para cultivo e são
susceptíveis à manipulação genética (Bon et al., 2008). Os fungos são uma das
principais fontes desta enzima, estes a secretam para o meio externo com a finalidade de
degradar as proteínas cujos produtos desta hidrólise servem como fonte de nutrientes
para o processo de multiplicação celular.
As proteases de Aspergillus spp. são largamente exploradas em diversas
indústrias devido à sua atividade em vários pH e temperaturas (Haq, 2006). Algumas
espécies deste gênero apresentam a capacidade de produzirr proteases neutras, ácidas e
alcalinas, como é o caso de Aspergillus oryzae (Inácio, 2014; Said & Pietro, 2004).
A relevância deste grupo de enzimas rica em diversidade estrutural e
mecanismos de ação se refletem na importância das suas aplicações em processos
industriais, tais como, proteases utilizadas em detergentes que precisam ter estabilidade
em ampla gama de pH e em altas temperaturas, bem como compatibilidade com agentes
oxidantes (Sumantha, 2006) .
Para obtenção destas enzimas pode-se utilizar dois métodos, a fermentação
submersa e a fermentação em estado sólido. Na fermentação submersa a cultura estoque
a ser utilizada é cultivada em frascos contendo meio de crescimento e mantidos em
agitação até atingir a fase de crescimento exponencial. Este tipo de fermentação é
bastante utilizado devido a facilidade de crescimento dos micro-organismos em
323
condições controladas de pH e temperatura, além de tornar fácil a recuperação das
enzimas extracelulares (Feitosa, 2009).
Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de Aspergillus spp.
quanto à produção de proteases.
Material e métodos
Para o desenvolvimento deste trabalho, foram testadas 11 amostras de fungos

filamentosos, estocados na Coleção de Fungos da Amazônia - CFAM. Este trabalho foi
realizado nas dependências do Laboratório multiusuário em saúde/Micologia do
Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/FIOCRUZ Amazônia.
Reativação das culturas preservadas
As culturas fúngicas foram repicadas em placas de Petri contendo o meio de

cultura Extrato de Malte- Ágar (MEA) e mantidos à 28 ºC, em incubadora tipo BOD,
durante sete dias, para reativação, verificação da pureza e realização dos testes.
Condições de cultivo para produção de enzima
Os testes foram realizados segundo a metodologia descrita por Manachini et al.

(1987). Inicialmente, 1mL da suspensão de esporos na concentração de 5x106 dos
isolados serão transferidos para frascos erlenmeyer contendo 30mL da solução de
Manachini suplementado com gelatina à 0,5% com a finalidade de estimular a secreção
da enzima em questão. Esses meios foram mantidos à 120 rpm por 96 horas a 28 ºC em
agitador orbital. Após esse período, a massa micelial foi separada do extrato enzimático
por filtração a vácuo em sistema de milipore, e o filtrado obtido foi utilizado nos testes
de atividade enzimática. Cada isolado foi individualmente testado para secreção de
proteases.
Avaliação qualitativa em meio sólido
Após o período de crescimento celular e separação da massa micelial,

aproximadamente 150 µL dos extratos enzimáticos foram inoculados nas placas de Petri
contendo o meio ágar gelatina à 5% suplementado com leite desnatado à 5%, onde
foram feitas perfurações circulares (técnica de “cup plate”), com diâmetro de 1cm. As
324
placas foram incubadas em estufa a 28 ºC por 18 a 24 horas. Os extratos enzimáticos
foram avaliados qualitativamente, onde a produção enzimática foi avaliada pela
formação de halos determinados em mm. Não foi necessária adição de revelador, uma
vez que a hidrólise da caseína do leite pode ser percebida, pelo halo incolor, ao redor do
ponto de aplicação do filtrado.
Determinação da Atividade de proteolítica
A atividade de protease foi determinada utilizando-se caseína como substrato,

como descrito por Fleuri & Sato (2008). A mistura de reação contendo 1,5 mL de
solução 2,0% de caseína; 1,0 mL de tampão fosfato 0,15 M, pH 7,5 e 0,5 mL de solução
enzimática foi incubada a 30 °C por 30 minutos. A reação foi paralisada pela adição de
3,0 mL de solução a 0,4 M de ácido tricloroacético (TCA), seguida de centrifugação
refrigerada por 15 minutos a 4000 rpm. A absorbância do filtrado foi determinada a 280
nm, sendo uma unidade de atividade definida como aquela capaz de aumentar em uma
unidade a absorbância do filtrado, nas condições do ensaio. Foi preparado um tubo
branco para cada amostra, com a adição de TCA antes da adição da enzima. Todos os
ensaios foram realizados em triplicata (Fleuri & Sato 2008).
Resultados
Durante o processo de reativação e autenticação nos 11 isolados de Aspergillus

spp. em meio Extrato de Malte-Ágar (MEA) estocados na Coleção de Fungos da
Amazônia-CFAM, foi possível observar suas características morfológicas e fisiológicas,
como a coloração e tamanho da colônia, textura e tamanho de conídios e conidióforos.
Verificou-se que 100% dos isolados mantiveram suas características morfofisiológicas
após o período de 11 a 15 anos de conservação em água destilada.
Quanto aos resultados obtidos acerca da atividade proteolítica pela técnica de
“cup plate” (protease qualitativa) foi possível observar que todos os isolados
apresentaram halos translúcidos ao redor do “cup plate”, com diâmetros variando de 1 a
7 mm, o que indicam bons índices enzimáticos para a enzima testada, destacando-se o
isolado Aspergillus niger (CFAM, 0240) com 7 mm. Observou-se que a atividade
proteolítica variou entre os indivíduos da mesma espécie, sendo estes capazes de
degradar a caseína presente no meio sólido. Características de produção de proteases
por esses isolados também similares aos obtidos em estudos realizados por Yadav
325
(2015), que caracterizou uma serina protease alcalina obtida a partir de A. flavus
(MTCC 9952).
Já na avaliação quantitativa observamos que houve uma variação da atividade
proteolítica, com valores variando de 8,09 U/ml (A. japonicus CFAM 0240) a 22,49
U/ml (A. oryzae CFAM 0540), o que demonstra que a produção de proteases pode
variar entre fungos de espécies diferentes, em que algumas se destacam em relação às
outras (figura 1).
Atividade Proteolítica de espécies de Aspergillus

25,00
Atividade Proteolítica U/ml
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
Espécies
Figura 1. Atividade proteolítica (U/mL) de Aspergillus spp. por fermentação submersa
326
Discussão
Os resultados obtidos em nossos estudos acerca da autenticação mostraram que

as culturas estudadas mantiveram as suas características peculiares de acordo com
Monteiro (2012), que também avaliou as características macro e micromorfológicas do
gênero Aspergillus spp, sendo que estes foram isolados de solo preservado do cerrado.
Provavelmente, a predominância da viabilidade das culturas esteja relacionada à
ausência de subcultivo, a idade do inóculo e à permanência do micélio em estado de
latência, condições as quais auxiliam na diminuição de mutações (Silva et al., 2010).
Com base na análise proteolítica qualitativa nota-se que Aspergillus é um
produtor significativo da enzima estudada, sendo estas muito utilizadas na indústria,
devido apresentarem atividade em uma ampla faixa de pH e temperatura e uma única
espécie pode produzir proteases neutras, ácidas ou alcalinas, como é o caso de
Aspergillus oryzae (Inácio, 2014; Said e Pietro, 2004).
Nos dados quantitativos, o valor máximo de atividade proteolítica foi observado
em A. oryzae CFAM 0540: 22,49 U/ml, valore, acima dos encontrados por Murthy &
Kusumoto (2015) que avaliaram a produção de proteases na espécie de A. oryzae RIB40
(ATCC 42149) em fermentação em estado sólido utilizando pó de polpa de batata como
substrato. Em outro estudo feito por Shirasaka et al. (2012), ao avaliar a espécie A.
oryzae KSK-3 obtiveram produção de proteases de 2,96 U/ml, este foi submetido à
fermentação em meio GYP, onde a protease encontrada apresentou ação fibrinolítica e
indicada para tratamento fibrinolítico de uso oral e aplicações nutracêuticas. Isso
demonstra que a atividade proteolítica pode variar entre fungos da mesma espécie,
dependendo da metodologia e condições de cultivo utilizadas.
Conclusão
O Brasil, hoje, é um país essencialmente importador de enzimas, além de

apresentar um uso ainda reduzido de enzimas em processos industriais quando
comparado com outros países. Assim, a inserção e consolidação do Brasil como
produtor de tecnologia enzimática faz-se necessário. Estudos como este contribuem para
opção de obtenção de enzimas de cepas de Aspergillus oriundas da região amazônica e
que futuramente poderão ser alternativa às enzimas importadas.
327
Referências
Bon EPS, Ferrara MA, Carmo ML (2008) Enzimas em Biotecnologia: Produção,
aplicação e mercado. Rio de Janeiro: Interciencia: 433-488.
Feitosa IC (2009) Produção de enzimas lipolíticas utilizando bactéria isolada de solo

com histórico de contato com petróleo em fermentação submersa. Sergipe, Brasil, 104p.
(Dissertação), Mestrado em Engenharia de processos, Universidade Tiradentes.
Fleuri LF, Sato HH (2008) Study of different parameters in the production of Lytic
enzymes. Ciência e Tecnologia de Alimentos 28: 299-310.
Haq IU, Mukhtari H, Umber H (2006) Production of protease by Penicillium

chrysogenum through optimization of environmental conditions. J. Agricult. Soc. Sci.
2:23-25.
Inácio FD, Ferreira RO, Araujo CAV, Brugnari T, Castoldi R, Peralta RM, Souza CGM
(2014) Proteases of wood rot fungi with emphasis on the genus Pleurotus. Biomed
Research International. 1-10.
Manachini PL, Fortina MG, Parini C (1987) Purification and properties of an

endopolygalacturonase produced by Rhizopus stolonifer. Biotechnology Letters 9: 219-
224.
Monteiro MCP (2012) Identificação de fungos do gênero Aspergillus e Penicillium em

solos preservados do cerrado. Minas gerais, Brasil, 76p. (Dissertação) Mestrado em
Microbiologia Agricola.Universidade Federal de Lavras, UFLA.
Murthy PS, Kusumoto Ken-Ichi (2015) Acid protease production by Aspergillus oryzae
onpotato pulp powder with emphasis on glycine releasing activity: A benefit to the food
industry. Food and Bioproducts Processing. 96: 180-186.
Said D, Pietro RCLR (2004) Enzimas como agentes biotecnológicos. Legis Summa,
Ribeirão Preto, Brasil. 412p.
Shirasaka N, Naitou N, Okamura K, Kusuda M, Fukuta Y, Terashita T (2012)

Purification and characterization of a fibrinolytic protease from Aspergillus oryzae
KSK-3. Mycoscience 53: 354–364.
Silva JC, Fernandes OCC, Martins MS, Rodrigues Jr AC, Teixeira MFS (2010)
Atividade antimicrobiana de espécies de Penicillium mantidas sob duas condições de
preservação. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología 30: 48-54.
Sumantha A, Larroche C, Pandey A (2006) Microbiology and industrial biotechnology

of food-grade proteases: a perspective. Food Technology and Biotechnology 44: 211–
220.
Yadav SK, Bisht D, Tiwari S, Darmwal NS (2015) Purification, biochemical

characterization and performance evaluation of an alkaline serine protease from
328
Aspergillus flavus MTCC 9952 mutant. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology:
667-677.
Yin C, Zheng L, Chen L, Tan Q, Shang X, Ma A (2014) Cloning, expression, and

characterization of a milk-clotting aspartic protease gene (Po-Asp) from Pleurotus
ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology 172: 2119–2131.
Zimmer KR, Borré GL, Trentin DS, Woicickoski Jr C, Frasson AP, Graeff AA, Gomes
P, Macedo AJ (2009) Enzimas Microbinas de uso terapêutico e diagnóstico clínico.
Revista Liberato 10: 123-137.
329
Bactérias lácticas e sua importância na indústria de alimentos e saúde: Uma

revisão
Lima AKO1; Taube Júnior PS²
¹Universidade Federal do Oeste do Pará – UFOPA. ²Universidade Federal do Oeste do Pará –

UFOPA. E-mail: [email protected], [email protected]
Resumo
Sem compreender, o ser humano produz culturas naturais altamente resistentes contra
a ação de patógenos alimentares e contribui para a sustentação da saúde humana. As bactérias
ácido-lácticas (BAL) estão envolvidas nesse estágio produzindo substâncias que agem contra
o ataque de patógenos e possuem importância na gênese de alimentos conservados. Os
produtos fermentados vêm utilizando estas bactérias de forma eficaz e adquirindo menos
efeitos nocivos. Através desse processo são formados microrganismos que atenuam o tempo
de fermentação dos alimentos inibindo o crescimento de deteriorantes e formando produtos
menos tóxicos à saúde. Por meio de pesquisa bibliográfica, observou-se o interesse de
pesquisadores e consumidores na busca de alimentos processados que exprimissem segurança
e a partir da utilização de bactérias lácticas e sua incontestável relevância para a obtenção de
produtos de melhor qualidade, custo e validade conclui-se que estudos aprofundados sobre o
tema são necessários para o emprego de pesquisas em torno da aplicação das BAL em
diversas novas classes de alimentos.
Palavras-chave: bactérias ácido-lácticas, bacteriocinas, alimentos fermentados.
Introdução
Desde que os antibióticos passaram a ser utilizados em larga escala, bactérias

começaram a desenvolver capacidade de resistência (Martinez e Baquero, 2000). A
contaminação de alimentos por microrganismos patogênicos é um problema sério uma vez
que causa grandes índices de morbidade (Jay, 2000). De acordo com Dias et al. (2008),
microrganismos com propriedades antimicrobianas são utilizados como conservantes naturais
e tem como vantagem a inibição do desenvolvimento de bactérias deteriorantes e patogênicas
sem o uso de substâncias indesejáveis.
As bactérias ácido-lácticas (BAL) são consideradas o maior grupo de bactérias com

ação probiótica (Collins et al., 1998) e apesar de serem aerotolerantes são bactérias
características de ambientes anaeróbios e suportam valores de pH muito baixos, porém a
tolerância à acidez é variável entre as estirpes. Segundo Axelsson (1993), elas são cocos ou
330
bastonetes gram-positivos, não esporogênicos, fermentadores e produtores de ácido lático
como resultado final da fermentação, apresentando metabolismo e características fisiológicas
semelhantes. Ocorrem na microbiota normal após o processamento de alimentos e suas
atividades metabólicas contribuem para inibir ou retardar a multiplicação de bactérias
patogênicas ou deteriorantes (Chesca et al., 2009).
O potencial antagônico que promove biopreservação conferido às bactérias lácticas

deve-se a produção de enzimas bacteriolíticas, subprodutos da via metabólica e entre elas
destacam-se as bacteriocinas (Pereira e Gomez, 2007). Trata-se de um peptídeo
antimicrobiano que apresenta atividade antimicrobiana sobre um amplo espectro de bactérias
(Benech et al., 2002).
Esta revisão reúne diversos trabalhos publicados que retratam o cenário da história,
aplicação e benefícios das bactérias lácticas na indústria alimentícia, além da sua relação no
tratamento e prevenção de doenças através da conservação e posterior ingestão de alimentos
livres de contaminação e tem como finalidade revisar de forma sistêmica as referências
disponíveis, investigar e analisar a utilização das BAL na melhoria na qualidade de vida das
pessoas.
Material e Métodos
Para esse estudo de revisão da literatura foram realizadas pesquisas em diversas bases
eletrônicas de dados, entre elas: Portal FAPESP, CAPES, Elsevier, Lilacs, Pubmed, SCIELO
e SCIENCE DIRECT usando os seguintes descritores: ácido láctico, lactic acid bacteria e
bactérias lácticas. Ao final da pesquisa foram selecionados artigos científicos publicados em
revistas, anais de congressos, além de capítulos de livros, teses, dissertações e monografias.
Os assuntos mais procurados nesses trabalhos consultados eram aqueles que focavam a
relação direta da produção e conservação de alimentos, principalmente os fermentados, a
partir da utilização de bactérias ácido-lácticas e suas substâncias, tais como as bacteriocinas e
também o alcance desse grupo de microrganismos na saúde humana a partir da ingestão de
alimentos minimamente processados. Buscou-se entender os processos antigos e atuais que
levaram ao uso, impactos, benefícios, custos e perspectivas dessas bactérias como método
biológico eficiente para melhorar a condição dos alimentos provenientes de origens
fermentadas. Esta revisão bibliográfica reúne opiniões de vários autores e de seus estudos
para os mais diversos fins sobre a produção e utilização de bactérias ácido-lácticas.
331
Utilizar microrganismos com propriedades antimicrobianas para conservar alimentos

tem como vantagem a inibição do desenvolvimento de bactérias deteriorantes e patogênicas
sem o uso de substâncias indesejáveis (Dias et al., 2008).
As bactérias ácido-lácticas (BAL) compõem um importante grupo de alimentos

funcionais definidos como suplementos alimentares que ao serem ingeridos apresentam
benefícios sobre a saúde do hospedeiro (Sanders, 2003). Dentre os possíveis mecanismos de
ação estão a síntese de substâncias microbianas contra bactérias patogênicas, a competição
por nutrientes necessários para o crescimento de microrganismos patogênicos e a inativação
de suas toxinas e seus receptores (Matsumoto et al., 2005; Pant et al., 2007). O interesse pelos
efeitos benéficos à saúde promovidos pelas bactérias com características probióticas tem
provocado um aumento mundial nas vendas de produtos alimentícios contendo esses
microrganismos (Araújo, 2007).
Duarte et al. (2013), concluíram que essas bactérias são capazes de inibir o crescimento
de estirpes patogênicas, com cepas da mesma espécie, conferindo especificidade e o gênero
Lactobacillus é, com certeza, o mais amplo dos gêneros incluídos nesse grupo e são
amplamente distribuídos na natureza.
Esse grupo de bactérias está presente na natureza, principalmente no leite e também

habitam os tratos digestivo, respiratório e urogenital dos animais (Hove et al., 1999). Um dos
principais metabólitos produzido por elas é o ácido láctico e ele é o responsável por diminuir
o pH do meio e isso seria o suficiente para diminuir o efeito de inibição sobre muitos
microrganismos (Redondo, 2008)
Devido à grande importância econômica das bactérias lácticas para a indústria de

fermentação, os estudos sobre a fisiologia, bioquímica, genética e biologia molecular desses
microrganismos tiveram um avanço significativo, o que levou à detecção de outros compostos
que ocasionam o fenômeno da antibiose, como as bacteriocinas (Davidson e Hoover, 1993).
Em geral são pequenas proteínas catiônicas, heterogêneas e hidrofóbicas, apresentam de 20 a
60 resíduos de aminoácidos, alto ponto isoelétrico e variam quanto ao organismo produtor,
espectro de ação, peso molecular e propriedades bioquímicas (Verheul et al., 1997)
Seu mecanismo de ação das bacteriocinas é complexo sendo que geralmente atuam
destruindo a integridade da membrana citoplasmática pela formação de poros, o que provoca
a perda de pequenos compostos e íons. Aparentemente, as bacteriocinas se ligam à membrana
332
plasmática por meio de ligações eletrostáticas com fosfolipídios carregados negativamente
(Montville e Chen, 1998).
A atividade dessas proteínas no alimento pode ser afetada por diversos fatores, como
por exemplo, a mudança na solubilidade e carga eletrostática, ligação aos componentes do
alimento, inativação por proteases e mudanças morfológicas no organismo alvo (Ganzle et al.,
1999).
A natureza química das bacteriocinas faz com que essas substâncias sejam facilmente
degradadas no trato gastrintestinal do homem e animais, muitas vezes perdendo sua
toxicidade (Piard et al., 1992). De acordo com Marugg (1991), estudos realizados com várias
bacteriocinas mostraram que elas não são tóxicas nem provocam reações imunológicas
adversas e, por isso, possuem grande potencial como conservadores naturais nos alimentos.
Conclusões
Com isso, a aplicação de bactérias ácido-lácticas para uso no processo de

melhoramento e conservação de produtos da classe dos fermentados demonstra-se eficaz.
Mesmo com avanços, sob aspectos futuros é importante a realização de novos trabalhos
buscando aprofundar os conhecimentos a respeito da aplicação das bactérias lácticas como
agentes conservadores de alimentos para preencher lacunas ainda existentes.
Referências
Araújo EA (2007) Desenvolvimento e caracterização de queijo tipo Cottage adicionado de

Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 e de Inulina. Viçosa, Brasil, 67p. (Dissertação).
Mestrado em Tecnologia de Alimentos. UFV.
Axelsson L (2004) Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In: Salminen, S.,
Wright, A.T., Ouwehand, A. (eds). Lactic Acid Bacteria: Microbiology and functional
aspects. Marcel Dekker, New York, USA, 1-66.
Benech, RO, Kheadr EE, Laridi R, Lacroix C, Fliss I (2002) Inhibition of Listeria innocua in
cheddar cheese by addition of nisin Z in liposomes or by in situ production in mixed culture.
Appl Environ Microbiol, 68:3683-3690.
Chesca, AC, Castro HKD, Silveira MD, D’Angelis CEM (2009) Atividade antimicrobiana de
bactérias lácticas isoladas de queijo de baixa umidade frente a Staphylococcus aureus
ATCC6538 e Listeria monocytogenes ATCC7644. Hig Aliment, 23:123-128.
Collins JK, Thornton G, Sullivan GO (1998) Selection of probiotic strains for human
applications. Int Dairy J, 8:487-490.
333
Davidson PM, Hoover DG (1993) Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In:
Salminen, S., Wright, A.T., (eds). Lactic Acid Bacteria. Moscow, USA, 127-159.
Dias PA, Steurer K, Zonta MN, Timm CD (2008) Atividade antimicrobiana de

microrganismos isolados de grãos de kefir contra Staphylococcus aureus. 35º Congresso
Brasileiro de Medicina Veterinária, Gramado, RS.
Duarte MCKH, Cortez NMDS, Cortez MAS, Franco RM (2013) Ação antagonista de
bactérias láticas frente ao crescimento de estirpe patogênica. Enciclopédia Biosfera, 9:25-36.
Ganzle MG, Weber S, Hammes WP (1999) Effect of ecological factors on the inhibitory
spectrum and activity of bacteriocins. Int J Food Microbiol, 46:207-217.
Hove H, Nørgaard H, Mortensen PB (1999) Lactic acid bacteria and the human
gastrointestinal tract. Eur J Clin Nutr, 53:339-350.
Jay JM (2000) Modern food microbiology. London: Aspen Publ.
Martinez JL, Baquero F (2000) Mutation frequencies and antibiotic resistance. Antimicrob
Agents Chemother, 44:1771-1777.
Marugg JD (1991) Bacteriocins, their role in developing natural products. In: Dekker M.
(eds). Food Biotechnol, New York, USA, 305-312.
Matsumoto S, Hara T, Hori T, Mitsuyama K, Nagaoka M, Tomiyasu N, Suzuki A, Sata M

(2005) Probiotic Lactobacillus‐induced improvement in murine chronic inflammatory bowel
disease is associated with the down‐regulation of pro‐inflammatory cytokines in lamina
propria mononuclear cells. Clin Exp Immunol, 140:417-426.
Montville TJ, Chen Y (1998) Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and
unresolved questions. Appl Microbiol Biotechnol, 50:511-519.
Pant N, Marcotte H, Brussow H, Svensson L, Hammarstrom L (2007) Effective prophylaxis

against rotavirus diarrhea using a combination of Lactobacillus rhamnosus GG and
antibodies. BMC Microbiol, 7:86-94.
Pereira VG, Gómez RJHC (2007) Atividade antimicrobiana de Lactobacillus acidophilus

contra microrganismos patogênicos veiculados por alimentos. Semina: Ciências Agrárias,
28:229-240.
Piard JC, Muriana PM, Desmazeaud MJ, Klaenhammer TR (1992) Purification and partial
characterization of lacticin 481, a lanthionine-containing bacteriocin produced by
Lactococcus lactis subsp. lactis CNRZ 481. Appl Environ Microbiol, 58:279-284.
Redondo NC (2008) Avaliação in vitro de características probióticas do Enterococcus faecium

CRL 183 e do Lactobacillus helveticus ssp jugurti 416. Araraquara, Brasil, 109p.
(Dissertação).Mestrado em Alimento e Nutrição. Faculdade de Ciências Farmacêuticas.
UNESP).
Sanders ME (2003) Probiotics: considerations for human health. Nutrit Reviews, 61:91-100.
334
Verheul A, Russell NJ, Hof RV, Rombouts FM, Abee T (1997) Modifications of membrane
phospholipid composition in nisin-resistant Listeria monocytogenes Scott A. Appl Environ
Microbiol, 63:3451-3457.
335
Enzimas extracelulares de Aspergillus e Penicillium conservados na

Coleção de Fungos da Amazônia-CFAM
Lima A.K.S.1,Torres D.R.1, Fernandes O.C.C.1, Silva J.C.1 , Mendes L.2, Araújo
C.P.M.2
1
-Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/FIOCRUZ. 2- Universidade – Faculdade
Estácio do Amazonas. E-mail: [email protected]
Os microrganismos, como fontes de recursos renováveis atreladas às vantajosas

características microbianas, tem sido alvo de constantes investigações em função do seu
potencial biotecnológico, como produção de enzimas extracelulares, catalisadoras
naturais e não tóxicas ao meio ambiente. Este estudo avaliou enzimas extracelulares de
30 culturas dos gêneros Aspergillus e Penicillium conservados na Coleção de Fungos da
Amazônia. As culturas foram reativadas em meio seletivo e incubadas a 28 oC por sete
dias. Na indução enzimática foi utilizado meio líquido solução de Manachini
suplementado com os respectivos substratos indutores e após o processo de fermentação,
os extratos foram filtrados a vácuo e submetidos a avaliação qualitativa em meio sólido
específico: ágar celulose, ágar lipase, ágar amido e ágar leite acrescentado 5% de gelatina
e incubadas a 28 °C por 24 horas para avaliação da capacidade de produção das enzimas.
A detecção da atividade enzimática baseou-se na observação de um halo formado ao redor
das colônias. Das 30 amostras selecionadas para o estudo, 80% (24) mostraram-se viáveis
após o processo de reativação e destas, 91,6% (22) apresentaram halo de degradação nos
ensaios enzimáticos para pelo menos uma das enzimas estudadas, sendo que 27,2% (06)
das culturas apresentaram halo de degradação para todas as enzimas. Com este estudo
observa-se que as culturas mostraram-se promissoras para a produção de enzimas
extracelulares de interesse industrial.
Palavras-chaves: Fungos Filamentosos, Água, Enzimas,Amazônia.
Introdução
A tecnologia enzimática é um dos campos mais promissores dentro das novas

tecnologias para a síntese de compostos de alto valor agregado. Processos industriais
biocatalisados apresentam menor impacto ambiental e menor consumo energético, já que
as enzimas são biodegradáveis e, sendo altamente específicas, minimizam os efeitos
indesejáveis. São importantes insumos intermediários nas indústrias químicas,
alimentares, têxteis entre outras. Apresentam maior interesse, aquelas obtidas a partir de
336
micro-orrganismos, devido em grande parte à diversidade dos mesmos e um maior
rendimento em relação aos processos extrativos de tecidos animais e vegetais (Orlandelli
et al., 2012; Rocha, 2010; Chandra et al., 2010).
Dentre os fungos produtores de enzimas extracelulares, os gêneros Aspergillus e
Penicillium, mesmo apresentando uma especificidade de degradação de alimentos,
biodeterioração e patogenicidade ao homem e animais, estão sendo muito utilizados nas
aplicações biotecnológicas devido às suas propriedades metabólicas, sendo fontes de
produção de diversas enzimas de interesses orgânicos, antibióticos e micotoxicológicos
(Tavares et al., 2012).
Dentre as enzimas produzidas por estes gêneros estão as lipases, que apresentam
múltiplas aplicações nas indústrias de detergentes, medicamentos, alimentos, biodiesel e
também no tratamento de efluentes; as celulases, utilizadas na indústria têxtil e de
papel/celulose e na produção de bioetanol de segunda geração; as amilases, aplicadas nas
indústrias de panificação, têxtil, farmacêutica, laticínios e sucroalcooleira e as proteases,
que apresentam larga aplicação em produtos industriais e domésticos, além de possuírem
grande aplicação farmacêutica devido ao potencial fibrinolítico destas enzimas, sendo
usadas no tratamento da trombose (Singh et al., 2014; Li et al., 2013; Doolotkeldieva e
Bobusheva, 2011).
Diante a importância industrial das enzimas, este trabalho avaliou o potencial de
produção de enzimas extracelulares de fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium
conservados na Coleção de Fungos da Amazônia-CFAM.
Material e métodos
Foram selecionadas 30 amostras fúngicas dos gêneros Aspergillus (CFAM 0158,

0555, 0161, 0540, 0701, 0115, 0034, 0143, 0052, 0148, 0131, 0006, 0004 e 0160) e
Penicillium (CFAM 0180, 0059, 0061, 0250, 0271, 0991, 0021, 0134, 0065, 0510, 0105,
0047, 0190, 0290, 0155 e 0289) conservadas em blocos de gelose na Coleção de Fungos
da Amazônia – CFAM, da FIOCRUZ Amazônia - ILMD.
Reativação das culturas preservadas
As amostras testadas foram reativadas em placas de Petri contendo
e mantidas em estufa de crescimento, do tipo BOD, a 28 oC por sete dias.
337
Para a indução enzimática foi utilizado meio líquido solução de Manachini
suplementado com o substrato indutor para cada enzima. Em Erlemayer de 25mL
contendo 10mL da solução de Manachini e seus respectivos substratos indutores, foram
inoculados 1mL da suspensão de esporos na concentração de 5x106. A fermentação
líquida ocorreu nas seguintes condições: 120 rpm por 96 horas a 28 ºC.
Após o período de fermentação, os cultivos foram filtrados a vácuo e o extrato
enzimático foi avaliado qualitativamente em meio sólido específico para cada enzima,
ágar celulose, ágar lipase, ágar amido e ágar leite acrescentado de 5% de gelatina.
(Teixeira et al., 2011), onde a produção enzimática foi avaliada pela formação de halos
determinados em mm e
Das 30 amostras selecionadas para o estudo, 80% (24) mostraram-se viáveis após
o processo de reativação e destas, 91,6% (22) apresentaram halo de degradação para pelo
menos uma das enzimas estudadas, sendo que 27,2% (06) das culturas apresentaram halo
de degradação para todas as enzimas estudadas, sendo elas: Penicillium fellutanum
CFAM 0061, Aspergillus niger CFAM 0161, Penicillium sp. CFAM 0290, CFAM 0289
e CFAM 0180 e P. fellutanum CFAM 0059, com halos variando de 1 a 2mm para
proteases, 1 a 3mm para amilases, 2 a 5mm para celulases e 1 3mm para lipases (Figura1).
Nos testes de lipases observou-se que 81,8% (18) das culturas apresentaram
resultado positivo, sendo quatorze (14) pertencentes ao gênero Penicillium.
Nos ensaios de proteases, 68,1% (15) das culturas apresentaram resultado positivo
com formação de halo de degradação, variando de 1mm (Penicillium sp. CFAM 0179,
CFAM 0155 e CFAM 0289) a 5mm (A. niger CFAM 0158).
338
Nos testes de amilases, 54,5% (12) das culturas apresentaram halo de degradação
variando de 2mm (Penicillium sp. CFAM 0290 e CFAM 0289; P. fellutanum CFAM
0061) a 16mm (A. sydowii CFAM 0115).
Figura 1. (A) Penicillium sp. produtor de proteases; (B) Aspergillus sydowii; produtor de
amilases e (C) Penicillium sp. produtor de celulases.
E nos ensaios de celulases, 54,5% (12) das culturas apresentaram halo de

degradação entre 1,5mm (P. citrionigrum CFAM-0105, A. niger CFAM-0158, P.
rugullosum CFAM-0250) a 5mm (Penicillium sp. CFAM-0289) para doze (Figura 2).
Pereira (2012) avaliou o potencial de produção de celulases para fungos de vários
gêneros isolados do solo, dentre estes, representantes dos gêneros Aspergillus e
Penicillium. Foi observado por estes autores, a variação de produção entre os gêneros e
também entre espécies do mesmo gênero, conforme também foi observado neste estudo.
Esses autores encontraram, usando A. niger e Penicillium. sp., halos com tamanhos
maiores dos encontrados neste estudo. Com isolados de P. rugulosum e P. fellutanum,
Ruegger e Tornisielo (2004) não encontraram produção de enzimas celulolíticas.
De acordo com Messias et al. (2011), as lipases podem ser produzidas por
diferentes micro-organismos, tais como A. niger, A. oryzae e P. citrinum, corroborando
com os resultados obtidos neste estudo, com exceção de Aspergillus oryzae que não
apresentou produção da enzima.
Silva et al. (2013) destacam o gênero Aspergillus spp como produtores de
proteases, assim como o gênero Penicillium sp. Desta forma, os resultados encontrados
no presente estudo são corroborados com os dados da literatura, visto que as diferentes
espécies de Aspergillus e Penicillium utilizadas foram produtoras de proteases.
339
Figura 2. Total de culturas produtoras de enzimas.
Segundo a literatura e dados apresentado por Souza et al. (2010), o gênero

Aspergillus apresenta-se promissor na produção de amilases e os resultados obtidos
confirmam esses resultados, já que das oito amostras, seis apresentaram positividade nos
testes e o Aspergillus sydowii CFAM 115 apresentou o maior halo de degradação.
Conclusões
Cepas dos gêneros Aspergillus e Penicillium apresentam-se promissoras para a

produção de enzimas extracelulares de interesse industrial, com destaque para a produção
de lipases e celulases. São recomendados ensaios mais específicos, a fim de quantificar a
atividade enzimática e otimizar a produção enzimática, podendo ser estudados substratos
alternativos, de baixo custo, a fim de reduzir os custos com a produção das enzimas.
Referências
Castro MA, Pereira Jr N (2010) Produção, propriedades e aplicação de celulases na

hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova 33: 181-188.
340
Chandra M, Kalra A, Sharma PK, Kumar H, Sangwan RS (2010) Optimization of
cellulases production by Trichoderma citrinoviride on marc of Artemisia annua and its
application for bioconversion process. Biomass and Bioenergy 34:805-811.
Doolotkeldieva TD, Bobusheva ST (2011) Screening of Wild-Type Fungal Isolates for

cellulolytic Activity. Microbiology Insights 4: 1–10.
Li Q, Yi L, Marek P, Iverson BL (2013) Commercial proteases: Present and

future. FEBS Letters 587:1155–116.
Messias JM, Costa BZ, Lima VMG, Giese EC, Dekker RFH, Barbosa AM (2011) Lipases
microbianas: Produção, propriedades e aplicações biotecnológicas. Semina: Ciências
Exatas e Tecnológicas, Londrina 213-234.
Orlandelli RC, Specian V, Felber AC, Pamphile JA (2012) Enzimas de interesse

industrial: produção por fungos e aplicações. Sabios Revista de Saúde e Biologia.
Pereira VM (2012) avaliação do potencial enzimático de fungos filamentosos e

otimização da produção de celulases por Aspergillus sulphureus (Fresen). Universidade
Federal de Lavras /UFLA.
Rocha CP (2010) Otimização da Produção de enzimas por Aspergillus niger em

Fermentação em estado sólido. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química. Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.
Ruegger MSJ, Tauk-tornisielo MS (2004) Atividade da celulase de fungos isolados do

solo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins, São Paulo, Brasil. Revista Brasil. Bot., 27:
205-211.
Singh S, Singh S, Bali V, Sharma L, Mangla J (2014) Production of Fungal Amylases

Using Cheap, Readily Available Agriresidues, for Potential Application in Textile
Industry. Department of Biotechnology and Biosciences, Lovely Professional University,
Punjab, India.
Souza PM, Magalhães PO (2010) Application of microbial α-amylase in industry: A

review. Brazilian Journal of Microbiology 41: 850-861.
Tavares ACD, Fonseca JS, Fonseca TRB, Barroncas JF, Souza RAT, Silva TA, Teixeira
MFS (2012) Enzimas Extracelulares de Fungos Anamórficos Isolados de Morinda
citrifolia L. Universidade Federal do Amazonas – Faculdade de Biotecnologia. Manaus-
AM. BBR - Biochemistry and Biotechnology Reports 5433: 2316-5200.
Teixeira MFS, Silva TA, Palheta RA, Carneiro ALB, Atayde HM (2011) Fungos da
Amazônia: Uma riqueza inexplorada (Aplicações biotecnológicas). Manaus-AM: Edua
255: 142-143.
341
Produção de etanol a partir de meio de cultura hidrolisado de bagaço

de cana-de-açúcar
Maciel MJM1, Farias JA2, Silva IR2, Souza FRF2, Procópio REL2
1
Universidade Federal do Amazonas – UFAM, Manaus, AM, 2Centro de Biotecnologia da
Amazônia – CBA, Manaus, AM. Emails: [email protected],
[email protected]
Resumo
O bagaço da cana-de-açúcar é um dos resíduos advindos da intensa atividade das

indústrias da cana-de-açúcar sendo o Brasil destaque mundial no uso de energias
renováveis. Para conversão do açúcar do bagaço de cana em etanol são utilizadas as
leveduras desde a antiguidade. As leveduras utilizadas no trabalho foram a Pichia
stipitis, a CBAFB07 e CBAFB09. O meio de cultura líquido utilizado foi o hidrolisado
de bagaço de cana-de-açúcar a 50%. Cada levedura foi inoculada no período de 10 dias
em 3 litros de meio líquido, no fermentador BIOFLO 110, para verificar a produção de
etanol foram retiradas alíquotas de 100 ml a cada 24 horas, e para verificar o
crescimento das leveduras, elas foram crescidas em meio ágar sabouraud no intervalo de
12 horas até 96 horas. A produção de etanol foi verificada, e desde o primeiro dia foi
obtido álcool, a levedura CBAFB09 apresentou maior produção no quarto dia com 5,7%
em comparação com as outras leveduras. No crescimento em placas de Petri a levedura
Pichia stipitis foi a que apresentou o maior crescimento em 48 horas de incubação.
Palavras-chave: Metabolismo microbiano, fermentação, biocombustível.
Introdução
O Brasil possui uma ampla diversidade de ecossistemas, devido à sua extensão,

possui diferentes hábitats, assim como muitas espécies de animais, plantas e micro-
342
organismos. A região amazônica ainda abriga espécies desconhecidas, dentre eles
algumas espécies de fungos, que se reproduzem com grande facilidade nesta área
(Bruce et al, 2012; Rodrigues et al. 2012).
Os fungos são seres heterotróficos, eucariontes, que se alimentam de matéria morta,

sendo muito importantes para o ambiente por decomporem matéria orgânica, ajudando
na ciclagem de nutrientes. Além de serem ubíquos, encontrando-se em animais, solos e
plantas. Eles podem ser unicelulares, como as leveduras, ou multicelulares, como os
fungos filamentosos (Womack et al. 2015; Souza et al. 2004). Os fungos têm sido muito
utilizados na Biotecnologia, por serem capazes de degradar diversos resíduos
agroindustriais, gerando produtos diversos como o etanol, por exemplo.
O Brasil gera diversos resíduos agroindustriais. Entre estes, o bagaço de cana-de-açúcar

é predominante com relação a outros países. Ele também gera outros resíduos
agroindustriais como palha de cana-de-açúcar, palha de soja, palha de arroz e sabugo de
milho (Sarrouh et al. 2014).
Fig. 1. Cana-de-açúcar e seu bagaço triturado
Os resíduos agroindustriais, fontes renováveis de carbono e energia, têm sido

objeto de intensa pesquisa, para a produção de alimentos, forragens, químicos, além de
combustíveis líquidos.
A biotecnologia industrial tem sido considerada uma das rotas mais promissoras
para sustentabilidade das atividades industriais. Utilizar leveduras da microbiota
amazônica capazes de crescer em meio de cultura contendo hidrolisado ácido do bagaço
da cana-de-açúcar como fonte de carbono e verificar a capacidade de produção de
etanol dessas leveduras utilizando o bagaço de cana-de-açúcar foram os objetivos deste
estudo.
343
Material e métodos
As leveduras utilizadas foram a Pichia stipitis, como padrão, e a CBAFB07 e

CBAFB09, que são leveduras selvagens isoladas de fezes de bovinos. As leveduras
foram crescidas em meio de extrato de levedura por 48 horas. O meio de cultura líquido
utilizado foi o meio de cultura de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, que foi feito
utilizando a proporção de 50 g de bagaço seco de cana-de-açúcar adicionando 250 ml de
ácido sulfúrico a 1%, a mistura foi deixada em repouso por 24 horas, autoclavada por 40
minutos. O bagaço foi prensado e neutralizado com NaOH, até chegar ao pH 5, depois a
mistura foi filtrada à vácuo. Para compor o meio hidrolisado de bagaço de cana-de-
açúcar a 50%, foram adicionados 1,25 g/L de extrato de levedura, 1,1 g/L de KH2PO4 e
40 ml/L de solução de sais e ácido cítrico.
Fig 2. a) placas de Petri contendo as quatro leveduras. b) fermentador BIOFLO 110. c)

alcoômetro utilizado para verificar a produção alcoólica. d) erlenmeyers contendo o
meio de cultura hidrolisado de cana de açúcar. e) plaqueamento das leveduras em meio
ágar sabouraud para crescimento.
Cada levedura foi inoculada no período de 10 dias em 3 litros de meio líquido, no

fermentador BIOFLO 110 com béquer de 5 litros, a 35 graus celsius, 103 rpm e pH
inicial 5.
344
Para verificar a produção de etanol foram retiradas alíquotas de 100 ml a cada 24
horas, adicionou-se 5 ml de hidróxido de cálcio e 3 gotas de antiespumante, depois
foram colocadas no destilador eletrônico, as amostras foram resfriadas a 20 graus
celsius para leitura no alcoômetro.
Para verificar o crescimento das leveduras, elas foram crescidas em meio ágar
sabouraud no intervalo de 12 horas até 96 horas, totalizando 8 contagens, a 35 graus
celsius em BOD. As placas foram feitas em triplicata, e retirada uma média da
contagem delas para demonstrar o seu desenvolvimento.
As leveduras tiveram crescimento em todas as placas de onde se fez a média de

crescimento das triplicatas, a levedura CBAFB07 foi a que teve menor crescimento,
apresentando um pico somente às 24 horas com 9 UFC, e não apresentando crescimento
nos outros horários verificados.
A levedura CBAFB09 teve um pico de crescimento até às 48 horas, e tendo um

declínio nas próximas 12 horas, permanecendo estável nas 12 horas seguintes, e teve
mais um pico de crescimento às 84 horas de incubação, mesmo assim ela cresceu em
todos os horários, e apresentou picos maiores de crescimento às 48 e 72 horas.
A levedura Pichia stipitis foi a que apresentou o maior crescimento às 48 horas de

incubação, diminuindo o crescimento nas 12 horas seguintes, apresentando o segundo
pico semelhante ao primeiro às 72 horas.
345
6
Produção de álcool (%) 5
3 Ps
7
2
9
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tempo (dias)
Fig. 4. Produção de álcool no período de 10 dias pelas leveduras Ps (Pichia stipitis), 7

(CBAFB07) e 9 (CBAFB09).
Na produção de etanol se verificou que desde o primeiro dia foi obtido o álcool, a
levedura CBAFB09 se manteve estável na produção com 4% inicialmente, e apresentou
maior produção no quarto dia com 5,7%, diminuindo nos dias subsequentes até chegar a
3% e não produzindo mais nos 3 dias restantes, já a levedura CBAFB07 iniciou com
4,5% de álcool e no quinto e no sexto dia teve os maiores picos de crescimento no com
5,5% de etanol produzido em ambos, caindo para 3% de produção nos dias restantes. A
Pichia stipitis não teve produção alcoólica no primeiro dia, no segundo dia teve 3,5% de
resultado, aumentando gradativamente nos dias seguintes até a sua maior produção no
sétimo dia com 5,5% de etanol produzido, no dia seguinte produziu 5% de álcool, e não
apresentou resultado nos dois dias finais de experimento.
A busca por mais alternativas de produção de biocombustíveis é primordial, uma

vez que o uso exclusivo de combustíveis fósseis é arriscado para a população mundial,
uma vez que não é um recurso renovável. A utilização do meio hidrolisado de bagaço de
cana-de-açúcar propiciou o carbono necessário para o crescimento das cepas de
leveduras e produção do álcool.
A reutilização deste resíduo é viável economicamente, desde que se tenha bastante

material disponível. A busca por leveduras selvagens é de fundamental importância para
a descoberta de mais espécies com potencial biotecnológico. A metodologia utilizada
346
visou a melhor produção de etanol sob as condições testadas. A temperatura ótima de
fermentação das leveduras é em torno de 25 a 33 oC e o ph ótimo está entre 4,5 e 5,5 (du
Preez et al. 1985) estando os experimentos dentro desta faixa de pH e temperatura para
obtenção de melhores resultados.
De acordo com Agbogbo e Coward-Kelly (2008), a levedura Pichia stipitis tem sido
usada na fermentação de vários tipos de biomassa pré-tratadas como, sabugo de milho,
palha de arroz, bagaço de cana-de-açúcar, entre outras. Delgenes et al (1988), mostrou
que a levedura produziu 50 g/L de etanol inicialmente, ou seja 5%, o que corrobora com
os resultados obtidos, onde se chegou à máxima de 5,7% com a levedura CBAFB09.
Estudos com a Pichia stipitis mostraram que o meio de cultura e seus nutrientes
influenciaram o crescimento e a produção de etanol (Slininger et al. 2006). O
crescimento das leveduras no meio de cultura ágar sabouraud, nas 96 horas de
incubação foram ideais apenas para Pichia stipitis e a CBAFB09, sendo que a levedura
CBAFB07 não obteve tanto sucesso em seu desenvolvimento, apresentando um pico em
24 horas. Este resultado nos mostra que novas análises devem ser feitas, variando a
composição do meio e as influências físicas, como temperatura, pH e tempo de
incubação.
Conclusão
Os problemas ambientais e de escassez de reservas energéticas no mundo mostram que

soluções alternativas devem ser buscadas, e uma delas é o etanol, álcool produzido
através de fermentação de açúcares por leveduras, portanto tecnologias capazes de
melhorar o desempenho da produção etanólica ganham importância no país. O setor de
cana-de-açúcar brasileiro é um dos maiores produtores de álcool combustível, gerando
muitos resíduos da planta, o que pode ser utilizado como fonte de carbono para
fermentação e produção alcoólica por micro-organismos. Dessa forma, o presente
trabalho buscou avaliar a produção de etanol pelas leveduras selvagens e de uma
levedura padrão na fermentação do bagaço de cana-de-açúcar, além do seu crescimento
microbiano. Os resultados de produção alcoólica com as leveduras selvagens foram
concernentes com as referências citadas, o que nos mostra que mais estudos nesta
abordagem devem ser feitos, como análises cromatográficas, por exemplo.
347
Referências
Agbogbo FK, Wenger KS (2008) Cellulosic ethanol production using the naturally
occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol Lett 30:1515–1524.
Bruce T, Castro A, Kruger R, Thompson CC, Thompson FL (2012) Microbial diversity

of Brazilian biomes. Genom Appl Dev World 217-247.
Delgenes JP, Moletta R, Navarro JM (1988) The ethanol tolerance of Pichia stipitis
Y7124 grown on a D-xylose, Dglucose and L-arabinose mixture. J Ferment Technol
66(4):417–422.
Du Preez JC, Bosch M, Prior BA (1985) Xylose fermentation by Candida shehatae and
Pichia stipitis: effects of pH, temperature and substrate concentration. Enzyme Microb
Technol 8:360–364.
Rodrigues JLM, Pellizari VH, Mueller R, Baek K, Jesus EC, Paula FS, Mirza B,
Hamaoui Jr GS, Tsai SM, Feigi B, Tiedje JM, Bohannan BJM, Nussiein K (2013)
Conversion of the Amazon rainforest to agriculture results in biotic homogenization of
soil bacterial communities. Proc Natl Acad Sci U S A.110(3): 988-93.
Sarrouh BF, Santos JC, Cunha MAA, Franco RF (2014) Potential biomass resources for
cellulosic ethanol production in Brazil: availability, feedstock analysis, feedstock
composition, and conversion yields. Biof. Braz. 97-123.
Slininger PJ, Dien BS, Gorsick SW, Liu ZL (2006) Nitrogen source and mineral
optimization enhances D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis
NRRL Y- 7124. Appl Microbial Cell Physiol 72(6):1285–1296.
348
Produção e extração de proteases por fermentação extrativa

Martim SR1, 1Silva TA1, Teixeira LS1, Cruz-Filho R F1, Fonseca TRB1, Marinho
NMV1, Santos-Ebinuma, VC2, Teixeira MFS1.
1
Universidade Federal do Amazonas – UFAM, Manaus, AM, 2 Universidade Estadual Paulista-
UNESP E-mails: [email protected], [email protected];
[email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected]; [email protected]
Resumo
A etapa de extração é importante passo para introduzir bioprodutos no mercado. O

método de fermentação extrativa é atrativo por integrar produção e extração em uma
única etapa. O objetivo deste trabalho foi avaliar fermentação extrativa utilizando
sistemas de duas fases aquosas (SDFA)-polietileno glicol (PEG)/sais de fosfato- para
produzir e extrair proteases de diferentes micro-organismos (Actinomiceto, Aspergillus
pulverulentus, Fusarium solani e Serratia sp). O cultivo submerso foi realizado em
agitador rotativo em sistemas compostos por PEG 4000 g/mol e fosfato de potássio. Os
parâmetros de purificação determinados foram: coeficiente de partição (K) e
seletividade (Se). Dentre os resultados obtidos, as proteases produzidas por
Actinomiceto, A. pulverulentus e F. solani particionaram para a fase rica em PEG (K>1)
enquanto que as proteases de Serratia sp para a fase pobre em PEG (K<1). Em termos
de Se, as proteases que migraram para a fase PEG apresentaram resultados satisfatórios,
demonstrando que é possível produzir e extrair testes biocatalisadores por fermentação
extrativa.
Palavras-chaves: protease, fermentação extrativa, micro-organismo, biotecnologia
349
Introdução
O sistema de duas fases aquosas (SDFA) é amplamente utilizado para purificação

de biomoléculas com aplicação nos mais diversos campos da biotecnologia, como por
exemplo, enzimas, anticorpos e proteínas estruturais. Tais sistemas se separam em duas
fases aquosas quando dois polímeros (por exemplo, PEG e dextrana) ou um polímero e
um sal apropriado (por exemplo: fosfato ou citrato) são misturados e determinadas
condições termodinâmicas sejam estabelecidas. A alta concentração de água (entre 70-
90%) em tais sistemas favorece a estabilidade de moléculas biologicamente ativas
durante a separação quando comparado com sistemas de duas fases em solvente
orgânicos (Hatti-Kaul, 2000; Johansson, 1998). Uma aplicação alternativa destes
sistemas aquosos é o processo da fermentação extrativa, o qual integra o processo de
fermentação e o de extração visando aumentar a produtividade e diminuir os custos do
processo (Viana-Marques et al., 2011). O conceito desta técnica é um processo de
purificação que envolve a integração de uma etapa de extração como primeiro estágio
de processo de extração para simultaneamente sintetizar e remover o bioproduto de
interesse (Show et al., 2012). Além disso, neste sistema de extração as células são
consideradas imobilizadas em uma das fases enquanto que o produto-alvo é
particionado para a outra fase do sistema (Baniket al., 2003). Nos últimos anos, o
interesse pela aplicação da fermentação extrativa tem aumentado e diversas
biomoléculas têm sido extraídas por essa tecnologia, tais como: ácido clavulânico
(Viana-Marques et. al., 2011), lipase (Ooiet al., 2011; Show et al., 2012), fosfatase
(Pandey e Banik, 2011), β-caroteno e luteína (Chavez-Santoscoy et al., 2010) e elastase
(Ying et al., 2005). Neste contexto, este trabalho visa estudar a extração de proteases
produzidas por diferentes micro-organismos pelo método de fermentação extrativa em
um sistema polimérico de duas fases aquosas (SPDFA) composto por PEG/sal fosfato.
Material e Métodos
Os micro-organismos testados foram Actinomiceto, Aspergillus pulverulentus,

Fusarium solani, os quais foram cedidos pela Coleção de Cultura do Departamento de
Parasitologia da Universidade Federal do Amazonas (DPUA) e Serratia sp, oriundo do
350
Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Amazonas. Os meios
empregados para o cultivo dos micro-organismos foram: extrato MGYP, para fungos;
caldo Muller Hinton, para bactérias, e; meio MPE, para actinomiceto. Para a
fermentação extrativa foram preparados sistemas de duas fases aquosas de Polietileno
Glicol 4000 g/mol - Sais de fosfato de potássio (PEG-Sal) com uma massa total de 20
gramas, por pesagem das quantidades apropriadas de soluções concentradas de PEG
(50% p/p) e sais de fosfatos (40% p/p) e meio de cultivo em frascos Erlenmeyer de 125
mL. O meio foi esterilizado a 121°C por 15 minutos. O cultivo submerso foi realizado
em agitador rotativo a 150 rpm, 30º C e 72 horas. O caldo proveniente da fermentação
extrativa foi centrifugado a 5.500xg por 20 minutos a 4 °C. Após a centrifugação, o
sistema de duas fases foi visualizado e as fases inferior e superior cuidadosamente
coletadas com auxílio de seringa sem perturbar a interface. A dosagem de proteína do
sobrenadante foi realizada através do método de Bradford (1976) modificado enquanto
que a atividade da protease foi determinada de acordo com método descrito por
Leighton et al. (1973). Os parâmetros de purificação determinados foram: coeficiente de
partição (K = atividade da enzima na fase polimérica/atividade da enzima na fase salina)
e seletividade (Se = coeficiente de partição da enzima alvo/coeficiente de partição de
proteínas totais).
Em todas as condições experimentais avaliadas houve separação de fases e todos

os micro-organismos utilizados nessa pesquisa foram capazes de produzir proteases no
sistema de fermentação extrativa com duas fases aquosas. Para os micro-organismos F.
solani e A. pulverulentos obteve-se um coeficiente de partição de 1,91 ± 0.00 e 2.01 ±
0,52, respectivamente. Para o actinomiceto foi obtido um coeficiente de partição de 1,38
± 0,43. Este resultado indica que as proteases destes micro-organismos migraram
preferencialmente para a fase top do sistema, rica em PEG. Por outro lado, as proteases
produzidas por Serratia sp migraram preferencialmente para a fase bottom do sistema,
pobre em PEG, com K= 0.51 ± 0,03. Considerando o coeficiente de partição das
proteínas, para todos os micro-organismos estas apresentaram K inferior a 1, sendo seus
valores de 0,57 ± 0,18, 0,65 ± 0,03, 0,41 ± 0,11 e 0,28 ± 0,04 para F. solani, A.
pulverulentos, Actinomiceto e Serratia sp, respectivamente. Estes resultados
351
demonstram que de maneira geral, as proteínas presentes no meio fermentado de todos
os micro-organismos avaliados apresentam maior afinidade pela fase rica em sal do
sistema. Em relação a seletividade, a qual é dependente dos valores de coeficiente de
partição das proteases e proteínas totais, o Actinomiceto apresentou melhor resultado de
Se (3,78 ± 0,39), sendo este 2 vezes superior ao obtido para proteases de Serratia SP
(1,81 ± 0,21). Os resultados de Se para F. solani e A. pulverulentos foram 3,41 ± 1,19 e
3,09 ± 0,71, respectivamente.
A produção de proteases por todos os micro-organismos no sistema de

fermentação extrativa era esperado devido ao alto conteúdo de água e a baixa tensão
interfacial as quais constituem ambiente biocompatível para a célula. As proteases
produzidas por Actinomiceto, F. solani e A. pulverulentos migraram preferencialmente
para a fase superior rica em PEG, possivelmente pela forte interação das regiões
apolares da proteína com o polímero. Todavia, as proteases produzidas por Serratia sp
migraram preferencialmente para a fase pobre em PEG. e o resultado de Se foi inferior a
das outras cepas. Os altos resultados de Se para as proteases de Actinomiceto, F. solani
e A. pulverulentos eram esperados uma vez que foi obtido valores de K superiores a 1
para as proteases e inferiores a 1 para as proteínas. A presença de contaminantes e as
interações de cargas, hidrofóbicas, entre pontes de hidrogênio e forças de Vander Walls
são fatores que podem interferir na eficiência da partição e na Se (Cavalcanti et al.,
2006). Assim, os resultados de Se para as proteases obtidas por Actinomiceto, F. solani
e A. pulverulentos foi satisfatório e mostrou que a técnica de extração empregada
conseguiu separar as enzimas alvo de proteínas provenientes do meio fermentado destes
micro-organismos. A Serratia sp é uma bactéria gram-negativa enquanto que
actinomiceto é uma bactéria filamentosa e os demais micro-organismos são fungos
filamentosos (Tortora et al., 2005). Desta maneira e considerando os resultados obtidos,
as proteases obtidas possuem estruturas químicas diversas e pertencem a diferentes
classes, sendo que as produzidas por Serratia sp apresentam baixa afinidade pelo PEG.
De acordo com o exposto, o sistema de fermentação extrativa utilizando duas fases
aquosas (PEG-Fosfato) pode ser utilizado para produção e separação de proteases dos
micro-organismos testados. Porém, o tipo de protease e a sua afinidade por uma das
fases do sistema é dependente da cepa empregada.
Conclusão
352
O sistema de fermentação extrativa utilizando duas fases aquosas (PEG-Fosfato) pode
ser utilizado como sistema integrado de produção e extração de proteases dos micro-
organismos testados. Entretanto, o tipo de protease e a sua afinidade por uma das fases
do sistema é dependente da cepa empregada.
Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e a Capes

(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior) pelo suporte
financeiro.
Referências
Chavez-Santoscoy A, Benavides J, Vermaas W, Rito-Palomares M (2010) Application

of aqueous two-phase systems for the potential extractive fermentation of
cyanobacterial products.Chem Eng Technol.33:177-182.
Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem72:248-
254.
Cavalcanti MTH, Porto TS, Barros Neto B, Lima-Filho JL, Porto ALF, Pessoa Jr A
(2006) Aqueous two-phase systems extraction of α-toxin from Clostridium perfringens
type A. J Chromatogr B 833:135-140.
Hatti-Kaul R (2000) Aqueous two-phase systems: methods and protocols: methods and
protocols. Humana Press, Totowa, NJ.
Johansson, G (1998) Affinity partitioning of proteins using aqueous two-phase systems.

In: JANSON, J.-C.; RYDÉN, L., eds. Protein purification: principles, high-resolution
methods, and applications. 2.ed. New York: Jan-Christer Janson & Lars Rydén, Wiley-
VCH, 1998
Leighton TJ, Doi RH, Warren RAJ, Kelln RA (1973) The relationship of serine protease
activity to RNA polymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis. J Mol
Biol 76:103-122.
Ooi CW, Hii SL, Kamal SMM, Ariff A, Ling TC (2011) Extractive fermentation using
aqueous two-phase systems for integrated production and purification of extracellular
lipase derived from Burkholderia pseudomallei. Process Biochem 46:68-73.
353
Pandey SK, Banik RM (2011) Extractive fermentation for enhanced production of
alkaline phosphatase from Bacillus licheniformis MTCC 1483 using aqueous two-phase
systems. Bioresource Technol 102:4226-4231.
Show PL, Tan CP, ShamsulAnuar M, Ariff A, Yusof YA, Chen SK, Ling TC (2012)
Extractive fermentation for improved production and recovery of lipase derived
from Burkholderia cepacia using a thermoseparating polymer in aqueous two-phase
systems. BioresourTechnol 116:226-233.
Tortora GJ, Funke BR, Case CL (2005) Microbiologia. Artmed, Porto Alegre, RS.
Viana Marques DA, Pessoa Jr A, Lima-Filho JL, Converti A, Perego P, Porto AL

(2011) Extractive fermentation of clavulanic acid by Streptomyces DAUFPE 3060 using
aqueous two-phase system. Biotechnol Prog 27:95-103.
Ying X, Guo-Qing H, Jing-Jun L (2005) Effective extraction of elastase from Bacillus

sp. fermentation broth using aqueous two-phase system. J Zhejiang Univ Sci B 6:1087-
1094.
354
Extração líquido-líquido de proteases de Pleurotus albidus (DPUA 1692)

empregando sistema de duas fases aquosas (peg-fosfato)
Martim SR1, Silva LSC1, Machado ARG1, Teixeira RA1, Santos-Ebinuma VC2, Cruz-Filho R F1,
Teixeira MFS1
1
Universidade Federal do Amazonas – UFAM, Manaus, AM. 2UNESP - Universidade Estadual
Paulista - UNESP Emails: [email protected]; [email protected];
[email protected]; [email protected]; - [email protected];
[email protected]@yahoo.com.br
Resumo
No presente estudo, sistema de duas fases aquosas (SDFA) composto de polietilenoglicol

(PEG) e fosfato de potássio foi utilizado para avaliar a influência da massa molar do PEG
(MMPEG), concentração do PEG (CPEG) e concentração de fosfato (CFOSF) na partição da
protease produzida por cultivo submerso de Pleurotus albidus DPUA 1692. As maiores CPEG e
CFOSF exerceram efeitos positivos no rendimento de partição das proteases. Levando em
consideração o fator de purificação foi observado que maiores valores de MMPEG, CPEG e
CFOSF promoveram resultados superiores. As melhores condições de extração foram obtidas
com 6000 g mol-1 (MMPEG), 19,7 % (CPEG) e 17,7 % (CFOSF), que proporcionaram
rendimento de 78,57 % e fator de purificação de 1,65. Os resultados obtidos neste estudo
revelaram que maiores massa molares de PEG geram melhor resultados e que SDFA pode ser
empregado como técnica de purificação de baixa resolução a fim de extrair proteases do meio
fermentado de Pleurotus albidus DPUA 1692.
Palavras-chaves: purificação, cogumelo, enzima
355
Introdução
O desenvolvimento de novos processos de extração e purificação de proteínas é uma etapa
limitante na produção de bioprodutos. A extração líquido-líquido é um sistema formado por duas
fases aquosas imiscíveis ou parcialmente miscíveis entre si, obtidas pela adição de polímeros
hidrofílicos ou um desses polímeros e um sal (Porto et al., 2008). As proteases somam cerca de
60% do total de enzimas comercializadas mundialmente (Gupta et al., 2008). Esses
biocatalisadores têm uma grande variedade de aplicações biotecnológicas, principalmente em
formulação de detergentes, bebidas e processamento de alimentos, amaciamento de couro,
tratamento de águas residuais e formulações médicas (Merheb et al., 2007). Os fungos fazem
parte do grupo de organismos investigados quanto à produção destas enzimas, e como produtores
destas moléculas apresentam muitas vantagens. Um desses benefícios se deve ao fato de que as
enzimas produzidas são normalmente extracelulares, facilitando sua recuperação (Germano et
al., 2003). O gênero Pleurotus compreende um grupo de cogumelos comestíveis de interesse
comercial devido a seu sabor refinado, capacidade de produzir biocompostos antitumorais,
antivirais, antibióticos, anti-inflamatórios, antioxidantes entre outros. O cultivo deste fungo vem
crescendo devido principalmente a menor complexidade das técnicas de cultivo, e sua
capacidade de adaptar-se a diferentes meios de crescimento, graças a sua capacidade em produzir
uma grande variedade de enzimas (Campos et al., 2010; Lechner e Albertó, 2011). Porém, há
carência de estudos reportando a purificação de proteases produzidas por P. albidus encontrados
na Amazônia. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da massa molar do PEG
(MMPEG), concentração do PEG (CPEG) e concentração de fosfato (CFOSF) no rendimento e
na purificação de protease produzida por P. albidus DPUA 1692.
Material e Métodos
Culturas viáveis e puras de P. albidus reativadas em ágar batata dextrose + extrato de levedura
0,5% (p/v) foram usadas neste trabalho. Para o bioprocesso foram utilizados frascos Erlenmeyer
(125 mL) nos quais foram adicionados 50 mL de meio de cultivo GYP que foram esterilizados
por 15 minutos. Em seguida foram adicionados ao meio de cultivo discos miceliais de 5 mm de
P. albidus e a fermentação submersa foi conduzida durante cinco dias, a 30 °C em agitador
356
orbital a 150 rpm. Posteriormente os extratos foram filtrados em papel de filtro comum. O
filtrado foi submetido ao processo de extração líquido-líquido utilizando o sistema de duas fases
aquosas (SDFA) que foi preparado utilizando solução de polietilenoglicol de diferentes pesos
moleculares (550, 4000 e 6000), a 50%, solução de Sais de Fosfato de 40 % e extrato enzimático,
constituindo uma massa total de 3 gramas. Em tubos cônicos graduados (15 mL), quantidades
necessárias de PEG e de sal foram misturadas para a manutenção do pH 5,8 e, em seguida, o
conteúdo destes tubos foi agitado em vortex, adicionando-se em seguida o extrato enzimático.
Após agitação em vortex, os SDFA permaneceram em repouso até separação das fases.
Posteriormente os volumes das fases foram medidos, as fases foram coletadas e analisadas
quanto à concentração de proteínas totais utilizando-se o Kit Comercial Doles, Brasil. A
atividade proteolítica foi determinada de acordo com a metodologia descrita por Leighton et al.
(1973) que utiliza azocaseína a 1% (p/v) como substrato enzimático. Uma unidade de atividade
proteolítica foi definida como a quantidade de enzima capaz de produzir um aumento na
absorbância de 0,1 em 1 hora e expressa em U/mL. Para avaliação da purificação pelo SDFA
foram avaliados os parâmetros (rendimento e fator de purificação).
Para avaliação da purificação das proteínas pelo sistema de duas fases aquosas foram analisadas
as respostas, rendimento e fator de purificação. Para o sistema composto por 550 g mol-
1
(MMPEG), 16,7 % (CPEG) e 14,8 % (CFOSF) não foram observados valores de rendimento
extrativo e de fator de purificação. Com a utilização de PEG com massa molecular de 500 g mol-
1 foram observados apenas valores intermediários de rendimento e de fator de purificação. Em
relação ao rendimento extrativo os três maiores valores deste parâmetro (62,08; 69,15 e 78,57)
foram observados quando foram empregadas concentrações de 19, 7 % (PEG) e 17,7 % (sais de
fosfato), independementemente da massa molar de PEG utilizada no sistema. Os resultados
obtidos neste estudo variaram de 3,93 % a 78,57 %. Os menores de rendimento foram
-1
observados quando foram empregadas 6000 g mol (MMPEG), 11,8 % (CPEG) e 9,8 %
(CFOSF). Os maiores rendimentos (78,57%) observados para P. albidus obtidos foram
verificados quando utilizou-se 6000 g mol-1(MMPEG), 19,7 % (CPEG) e 17,7 % (CFOSF). Em
relação ao fator de purificação verificou-se que o maior (1,65) e o menor valor (0,08) do fator de
357
purificação foram obtidos com a utilização de 6000 g mol-1(MMPEG). O menor valor para este
parâmetro foi observado com MMPEG (6000 g mol -1), CPEG (11,8 %), CFOSF (9,8 %), ao
passo que o maior valor do fator de purificação foi encontrado quando foram utilizados MMPEG
(6000 g mol -1), CPEG (19,7 %) e CFOSF (17,7 %). Houve incremento deste parâmetro com a
elevação de (CPEG) e de (CFOSF).
O rendimento indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de partida
foi recuperado ao final da purificação. Em relação a este parâmetro verificou-se que CPEG e
CFOSF exerceram efeitos positivos, isso significa que o aumento de CPEG e CFOSF favoreceu
o incremento deste parâmetro. Porém, a elevação da MMPEG não influenciou positivamente no
rendimento extrativo das proteases excretadas por P. albidus. Este resultado difere daqueles
obtidos por Ratanapongleka (2010) que ao utilizar PEG de baixas massas molares observaram
elevação de 80 % no rendimento de lacases extraídas de Agaricusbisporus. Além disso, os
resultados obtidos neste estudo são inferiores aos encontrados por Cavalcanti et al. (2008) que
reportaram rendimentos de 168 % na extração de fosfolipase C utilizando SDFA composto por
PEG/ fosfato. Segundo Mayerhoffet al. (2004) altos valores na recuperação dessas biomoléculas
podem ser explicadas pela diminuição na concentração de inibidores enzimáticos e ativação da
enzima pela interação com os componentes do sistema que podem favorecer a atividade
enzimática. Quanto ao fator de purificação verificou-se influência positiva com a elevação dos
parâmetros MMPEG, CPEG, CFOSF. Estes resultados corroboram com aqueles obtidos por
Kirsch et al., 2012 que verificaram interação significativa e positiva entre MMPEG, CPEG e
CFOSF, indicando que aumento simultâneo destas três variáveis contribuíram para melhorar o
fator de purificação de proteases excretadas por Lentinus citrinus.
Conclusão
O sistema de duas fases aquosas de PEG / fosfato aquosa revelou baixa eficiência na purificação
total de proteases a partir de P. albidus, embora represente uma ferramenta simples,
economicamente viável e promissora para uso nas etapas iniciais de processos de purificação
enzimática.
Agradecimentos
358
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e a Capes (Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior) pelo suporte financeiro.
Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254.
Campos C, Dias DC, Valle JS, Colauto NB, Linde GA (2010) Produção de biomassa, proteases e
exopolissacarídeos por Pleurotus ostreatus em cultivo líquido. Arq Ciênc Vet Zool 13:19-24.
Cavalcanti MTH, Porto TS, Barros Neto B, Lima-Filho JL, Porto ALF, Pessoa Jr A (2006)
Aqueous two-phase systems extraction of α-toxin from Clostridium perfringens type A. J
Chromatogr B 833:135-140.
Cavalcanti MTH, Porto TS, Barros Neto B, Lima-Filho JL, Porto ALF, Pessoa Jr A (2008)
Purification of α-toxin from Clostridium perfringens type A in PEG-phosphate aqueous two-
phase systems: a factorial study. J Chem Technol Biotecnol 83:158-162
Germano S, Pandey A, Osaku CA, Rocha SN, Soccol CR (2003) Characterization and stability
of proteases from Penicillium sp. produced by solid-state fermentation. Enzyme Microb Tech
32:246-251.
Gupta A, Joseph B, Mani A, Thomas G (2008) Biosynthesis and properties of an extracellular

thermostable serine alkaline protease from Virgi bacillus pantothenticus. World J Microbiol
Biotechnol 24:237-243.
Kirsch LS, Pinto ACS, Teixeira MFS, Porto TS, Porto ALF (2012) Partition of proteases from
Lentinuscitrinus DPUA 1535 by the peg/phosphate aqueous two-phase system. Quim Nova
35:1912-1915.
Lechner BE, Albertó E (2011) Search for new naturally occurring strains of Pleurotus to
improve yields. Pleurotus albidus as a novel proposed species for mushroom production. Rev
Iberoam Micol 28:148-154.
Leighton TJ, Doi RH, Warren RAJ, Kelln RA (1973) The relationship of serine protease activity
to RNA polymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis. J Mol Biol 76:103-122.
Mayerhoff ZDVL, Roberto IC, Franco TT (2004) Purification of xylose reductase from Candida
mogii in aqueous two-phase systems. Biochem Eng J 18:217-223.
Merheb CW, Cabral H, Gomes E, Da-Silva R (2007) Partial characterization of protease from a
thermophilic fungus, Thermoascus aurantiacus, and its hydrolytic activity on bovine casein.
Food Chem 104:127-131.
359
Nitsawang S, Hatti-Kaul R, Kanasawuda P(2006) Purification of papain from Carica papaya
latex: Aqueous two-phase extraction versus two-step salt precipitation. Enzyme Microb Tech
39:1103-1107.
Porto TS, Silva GMM, Porto CS, Cavalcanti MTH, Barros Neto B, Lima-Filho JL, Converti A,
Porto ALF, Pessoa Jr A (2008) Liquid-liquid extraction of proteases from fermented broth by
PEG/citrate aqueous two-phase system. Chem Eng Process 47:716-721.
Ratanapongleka, K (2010) Recovery of Biological Products in Aqueous Two Phase Systems. Int.
J. Chem. Eng. Appl.1:191-198.
360
Comparação entre processos de fermentação na produção de enzimas

por cogumelos comestíveis
Silva LSC¹, Machado ARG1, Martim S1, Teixeira RA1, Cruz Filho RF1, Teixeira MFS1.
1
UFAM/ Universidade Federal do Amazonas. E-mail. [email protected]
Resumo
Dentre os fungos que produzem enzimas de interesse comercial, os cogumelos

tem despertado interesse devido a sua facilidade de cultivo e alta produção de enzimas
extracelulares por processos biotecnológicos. Neste estudo foi avaliada a produção de
amilase, celulase, lipase e protease por A. mixotricha e P. albidus, em fermentação
submersa (FSm) e fermentação semi-sólida (FSS). Os macrofungos foram cultivados
em BDA+YE, por 12 dias. A FSm foi realizada em GYP (extrato de peptona-glicose-
extrato de levedura) e conduzida a 25 ºC, 150 rpm. A FSS foi feita em casca de
cupuaçu+semente de açaí (1:1, p/p). A atividade enzimática qualitativa foi determinada
pelo método de cup plate nos meios ágar amido, ágar celulose, ágar gelatina leite e ágar
lipase, medindo-se o diâmetro do halo formado, em milímetros. A determinação
quantitativa de proteases foi feita segundo Leighton (1973). Os cogumelos testados
apresentaram atividade enzimática nos dois tipos de fermentação, com exceção de
lipase, sendo P. albidus o mais promissor. Os resultados demonstram o potencial desses
fungos na produção de enzimas utilizando os dois tipos de fermentação, porém a FSS
foi considerada mais eficaz.
Palavras-chave: basidiomicetos, enzimas, fermentação submersa.
Introdução
Cogumelos comestíveis são macrofungos que possuem propriedade nutricional e

medicinal, além de serem importantes fontes de compostos bioativos como,
antimicrobiano, antioxidantes e enzimas, tais como proteases, celulases, amilases,
lipases, xilanases, pectinases, entre outras (Orsine et al., 2012). Durante o crescimento
do micélio as enzimas são liberadas no meio para degradar os materiais insolúveis
361
presentes no substrato em moléculas simples e solúveis, que são posteriormente
utilizadas por enzimas intracelulares pelo cogumelo (Iketani et al., 2013). A produção
de enzimas vem ganhando espaço no mercado por serem relativamente fáceis de
produzir em larga escala, eficientes e exigirem investimentos de baixo custo. Ocupam
um importante papel em diversos segmentos industriais, como fábricas têxteis,
farmacêuticas, de detergentes, de alimentos e bebidas, processos de recuperação de
prata, entre outros (Abhijit, 2012). Dentre os bioprocessos empregados na produção de
enzimas, a fermentação submersa e a fermentação semi-sólida têm sido amplamente
utilizadas (Sankaralingam et al., 2012). A fermentação submersa, por ser realizada em
meio nutriente liquido, tem a facilidade de crescimento dos micro-organismos em
condições controladas de pH e temperatura (Anbu, 2008). Já a fermentação semi-sólida,
o meio de cultura é composto por substratos sólidos e apresenta pouca disponibilidade
de água, o que faz com que essa condição de crescimento tente se aproximar do habitat
natural do cogumelo (Fonseca et al., 2014). Deste modo, o objetivo deste trabalho foi
avaliar a produção de enzimas (amilase, celulase, lípase e protease) pelos cogumelos
comestíveis Auricularia mixotricha e Pleurotus albidus por fermentação submersa e
fermentação semi-sólida.
Material e métodos
As espécies A. mixotricha (DPUA 1695) e P. albidus (DPUA 1692) foram cultivadas

em ágar batata dextrose (BDA) com extrato de levedura 0,5% (p/v), a 25 ºC, sem luz,
durante doze dias. Dos cultivos obtidos foram retirados 10 discos miceliais (10 mm)
para serem inoculados em 50 mL de GYP [(glicose 2% (p/v) + peptona 1% (p/v) +
extrato de levedura 0,5% (p/v), pH 7,0]. A FSm foi conduzida a 25º C, 150 rpm, por
cinco dias. O extrato bruto foi separado da massa micelial em membrana de acetato de
celulose (0,45 µm). Na FSS, 10 discos miceliais de 10 mm de diâmetro foram
inoculados em casca de cupuaçu + semente de açaí (1:1, p/p), pH 7,0, umidade 65%.
Após miceliação do substrato, as enzimas foram extraídas em água destilada esterilizada
[resíduo miceliado/mL de água destilada (2:20, p/v)] em frascos de Erlenmeyer de
125mL, mantidos a 30 °C, 180 rpm. Após 30 minutos os extratos foram recuperados por
filtração em membrana de acetato de celulose (0,45 µm). Para avaliação da atividade
enzimática em meio sólido, 100 µL do extrato bruto foram inoculados em cup plate de 5
mm de diâmetro em ágar amido (amilase), ágar celulose (celulase), ágar gelatina leite
362
(protease) e ágar lipase. Todos os testes foram realizados em triplicata. As placas foram
mantidas a 25 °C durante 18 horas. Para evidenciar a atividade de amilase, foi utilizado
vapor de iodo sublimado como revelador. Para evidenciar o halo de celulase, foi
utilizada solução de vermelho Congo a 0,1% e NaCl 1M. A atividade das enzimas foi
determinada medindo-se o diâmetro do halo formado, em milímetros. Para a
determinação quantitativa da atividade de proteases, utilizou-se 150 µL do extrato e 250
µL de azocaseina 1% em tampão Tris-HCl, pH 7,2, realizando-se a leitura a 440nm.
Uma unidade de atividade proteolítica foi definida como a quantidade de enzimas capaz
de produzir um aumento na absorbância de 0,01 em 1 hora. Todos os experimentos
foram realizados em triplicata.
Resultados
Independentemente do bioprocesso empregado A. mixotricha e P. aldidus

produziram pelo menos duas das enzimas estudadas. Nos ensaios qualitativos realizados
com os extratos de A. mixotricha obtidos por fermentação submersa foram observados
halos de degradação para celulase (16,5 mm) e protease (18 mm). Na determinação
quantitativa de protease a atividade média enzimática foi de 21,56 U/mL. Porém, este
macrofungo não apresentou atividade enzimática para amilase e lipase. Os extratos de
P. albidus apresentaram atividade para amilase (24 mm), celulase (19 mm) e protease
(21,5 mm), sendo estes resultados superiores aos encontrados para A. mixotricha. Na
determinação proteolítica quantitativa a atividade média enzimática foi de 42, 44 U/mL.
Conforme observado para a A. mixotricha também não foi encontrada atividade de
lípase para P. albidus. Nos ensaios qualitativos realizados com os extratos de A.
mixotricha obtidos por fermentação semi-sólida, foram observados halos de degradação
para amilase (16 mm) e celulase (22 mm). Porém, não foram encontradas atividades
enzimáticas para protease e lipase. Na determinação quantitativa de protease a atividade
média enzimática foi de 35,48 U/mL. Os extratos de P. albidus apresentaram halo de
degradação para atividade de amilase (26 mm), celulase (24-25 mm) e protease (15-26
mm). Na determinação proteolítica quantitativa a atividade média enzimática foi de
78,29 U/mL. Na fermentação semi-solida não foi observada produção de lipase por P.
albidus.
363
Discussão
Enzimas são produzidas por diferentes micro-organismos, incluindo fungos

filamentosos, leveduras e bactérias, tanto em fermentação submersa quanto em
fermentação semi-sólida (Rao et al., 1998). Nesta pesquisa foi observada a atividade de
amilase por A. mixotricha apenas quando cultivada na matriz sólida enquanto que P.
albidus expressou essas enzimas quando submetido aos dois bioprocessos. Amilases são
muito utilizadas na indústria de alimentos, constituindo aproximadamente 25% do
mercado de enzimas (Sindhu et al., 1997). Em relação às celulases, as produzidas por
fungos têm sido bastante estudadas devido o seu potencial em biotecnologia, são
utilizadas nas indústrias têxteis e de papel (Souza et al., 2010). De acordo com os
resultados obtidos os dois macrofungos foram eficientes na síntese de celulase, o que os
torna uma potencial fonte dessas enzimas. Estudo realizado por Fonseca et al. (2014)
avaliaram a produção de proteases por P. ostreatoroseus no mesmo substrato utilizado
nesta pesquisa encontraram resultados semelhantes aos obtidos neste estudo com A.
mixotricha e P. albidus. Enzimas proteolíticas somam 60% do total de vendas e são
utilizadas em diversos setores industriais, tais como de alimentos e bebidas, formulação
de detergentes (Aftab et al., 2006; Santos e Sato, 2009). Há uma diferença muito grande
nos dois tipos de fermentação em relação a produção de enzimas e metabólitos
secundários. Os resultados desta pesquisa se assemelham com os de pesquisas atuais
que sugerem que a fermentação semi-sólida apresenta vantagens quando comparada a
fermentação submersa (Santos et al., 2008). Aspectos físico-químicos, como baixa
quantidade de água, são fatores que contribuem para o melhor rendimento deste
processo. É um método barato, com baixos níveis de água residual e fácil recuperação
das enzimas de interesse (Viniegra-Gonzales, 1997).
Conclusão
Em todos os experimentos realizados, P. albidus foi o mais eficiente,

expressando maior atividade enzimática quando comparado a A. mixotricha, dado que
evidencia a capacidade dessa espécie em produzir enzimas de interesse comercial por
processos biotecnológicos e utilizando substrato de baixo custo.
364
Referências
Abhijit R (2012). Protease Enzyme- Potential Industrial Scope. IJTech 2:01-04.

Aftab S, Ahmed S, Saeed S, Rasool SA (2006) Screening, Isolation and
Characterization of Alkaline Protease Producing Bacteria from Soil. Pak J Biol Sci
9:2122-2126.
Anbu P, Annaduray G, Lee J-F, Hur B-K (2009). Optimization of alkaline protease
production from Shewanella oneidensis. J. Chem. Technol. Biotechnol 84:54-62.
El-Zalaki ME, Hamza MA (1979). Edible mushrooms as producers of amylases. Food
Chem 4:203-211.
Fonseca TRB, Barroncas JF, Teixeira MFS (2014) Produção em matriz sólida e
caracterização parcial das proteases de cogumelo comestível da floresta amazônica.
RBTA 8:1227-1236.
Iketani A, Nakamura M, Suzuki Y, Awai K, Shioi Y (2013). A novel serine protease
with caspase- and legumain-like activities from edible basidiomycete Flammulina
velutipes. Fungal Biol 117: 173-181.
Leighton TJ, Doi RH, Warren RAJ, Kelln RA (1973) The relationship of serine protease
activity to RNA polymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis. J MolBiol
76:103-122.
Souza HQ, Oliveira LO, Andrade JS (2008). Seleção de Basidiomycetes da Amazônia

para produção de enzimas de interesse biotecnológico. SBCTA 28.
Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Desh-Pande VV (1998). Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases. MMBR 62:597-635.
Sankaralingam S, Shankar T, Ramasubburayan R, Prakash S, Kumar C (2012).
Optimization of Culture Conditions for the Production of Amylase from Bacillus
licheniformis on Submerged Fermentation. AEJAES 12: 1507-1513.
Santos D, Sarrouh B, Santos J, Pérez V, Silva S (2008) Potencialidades e aplicações da
fermentação semi-sólida em Biotecnologia. Janus 3:4-11.
Santos LF, Sato HH (2009). Production of alkaline protease from Cellulosi microbium
cellulans. Braz J Microbiol 40:54-60.
Sindhu GS, Sharma P, Chakrabarti T, Gupta, JK (1997). Strain improvement for the
production of a thermostable α-amylase. Enzyme Microb Technol 21:525-530.
Orsine, JVC, Brito LMB, Novaes MRCG (2012). Cogumelos comestíveis: uso,
conservação, características nutricionais e Farmacológicas. Revista HCPA 4: 452-460.
Agradecimentos: CAPES, CNPq
365
Atividade proteolítica dos extratos aquosos de biocompósitos

formulados com cogumelos comestíveis utilizando como matriz casca
de abacaxi
Souza1, R.A.T.; Fonseca2, T.R.B.; Silva3, L.S.C.; Teixeira2, M.F.S.
1
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia – UFAM, Manaus – AM. 2 Coleção de Culturas
DPUA – UFAM, Manaus - AM. 3 Programa de Pós Graduação em Diversidade Biológica –
UFAM, Manaus – AM. Emails: [email protected], [email protected],
Resumo
Os cogumelos comestíveis são importantes veículos de nutrientes e além de suas
características nutritivas excretam diversos biocompostos de interesse industrial. Podem
ser produzidos nos mais diversos substratos, inclusive em resíduos agroindustriais. O
objetivo do trabalho foi avaliar a produção de proteases por três diferentes
biocompósitos originados da miceliação de cogumelos comestíveis na casca de abacaxi,
um resíduo abundante na cidade de Manaus. O biocompósito foi obtido através de
fermentação submersa, conduzida a 25 °C até completa miceliação do substrato. Do
biocompósito, foram retirados 2g e adicionados a 20mL de água destilada esterilizada
para obtenção do extrato aquoso. A atividade proteolítica foi determinada utilizando-se
azocaseína como substrato. Os extratos exibiram excelente atividade proteolítica, com
média variando de 277 a 294 U/ml. Esses resultados mostram que os resíduos
agroindustriais são substratos em potenciais para o cultivo de cogumelos e possibilitam
a secreção de importantes metabólito secundários por esses fungos.
Palavras-chave: Fermentação semi-sólida, basidiomicetes, resíduos agroindustriais.
Introdução
Cogumelos comestíveis são macrofungos extensamente cultivados ao redor do
mundo desde a antiguidade. Estes basidiomicetes são muito apreciados pelas suas
características gastronômicas e propriedades medicinais, pois possuem alto teor de
366
proteínas e fibras, baixo teor de lipídeos e ainda produzem vários metabólitos como
antimicrobianos, antioxidantes, imunoestimuladores, entre outros (FINIMUNDY et
al.,2013).
Além das características nutricionais, os cogumelos possuem um elevado
potencial produtivo, tempo de geração curto, são mais fáceis de serem trabalhados de
modo independente e crescem nos mais diversos substratos. Desta forma, a produção de
cogumelos surge como uma alternativa promissora para a reciclagem de resíduos,
diminuindo o impacto ambiental causado pelo descarte de resíduos da agricultura A
produção destes macrofungos agrega valor a partir de produtos de baixo ou nenhum
custo e permite, ainda, a utilização dos resíduos secundários gerados no processo
(Campos-Sales et al., 2011).
Estes basidiomicetes também são fontes de enzimas proteolíticas. As proteases
constituem uma classe de enzimas participantes em diversas funções fisiológicas e
importantes ferramentas tecnológicas em diversos processos, principalmente nas
indústrias de alimentos, detergentes e farmacêutica. Deste modo, as enzimas
proteolíticas representam as enzimas mais produzidas comercialmente na atualidade e
ocupam cerca de 65% das vendas mundiais de enzimas (Kumar e Takagi, 1999).
Assim sendo, o objetivo do presente estudo foi investigar proteases em extrato
aquoso de biocompósito produzido a partir da miceliação de casca de abacaxi pelos
cogumelos comestíveis Pleurotus florida, Pleurotus albidus e Lentinus citrinus.
Material e métodos
Os biocompósitos utilizados nesse estudo foram elaborados a partir de
fermentação semi sólida, utilizando-se casca de abacaxi como substrato e como inóculo
discos miceliais retirados de culturas matriz dos cogumelos comestíveis Pleurotus
albidus, Pleurotus florida e Lentinus citrinus, cultivados em ágar Saboraud. De cada
cultura matriz foram retirados 20 discos miceliais e inoculados no substrato, com 70%
de umidade. A fermentação semi-sólida foi conduzida a 25 °C até completa miceliação
do substrato. O produto final foi desintegrado e desidratado a 60ºC, em estufa de
secagem com circulação de ar forçado.
Para recuperação dos extratos, os biocompósitos foram triturados em triturador
doméstico e depois de triturados, 2g do resíduo miceliado foi adicionado em 20 mL de
água destilada esterilizada, em frascos Erlenmeyer de 125 mL. Os frascos foram então
mantidos em shaker, com temperatura de 30 °C e agitação 180 rpm. Após 30 minutos os
367
extratos brutos foram recuperados por filtração em tecido de algodão e filtrado em
membrana de polietersulfônica com porosidade de 0,22µm para a posterior
determinação da atividade de proteases. O pH dos extratos foi mensurado com o auxílio
de peagâmetro.
A atividade proteolítica foi determinada utilizando-se 150 µL do extrato bruto
adicionado a 250 µL de azocaseína 1% (p/v), preparada em tampão Tris-HCl 0,1M, pH
7,2. As amostras e os brancos foram preparados em triplicata e incubados a 25 °C por 1
hora em câmara escura. A reação foi, então, interrompida com 1,2 mL de TCA [ácido
tricloroacético 10% (p/v) e em seguida centrifugada por 10 minutos a 4 °C. Do
sobrenadante foi retirado 800 µL, adicionando-se 1,4 mL de NaOH 1M. Por fim, foi
realizada a leitura em espectrofotômetro a 440 nm. Uma unidade proteolítica foi
definida como a quantidade de enzima capaz de produzir um aumento na absorbância a
440 nm de 0,1 em 1 hora. Os resultados foram submetidos à análise estatística descritiva
(média e desvio padrão).
As enzimas proteolíticas têm origem de diversas fontes e nos últimos anos, os
fungos se caracterizam como uma fonte muito promissora de compostos bioativos.
Diversos cogumelos comestíveis vêm sendo relatados como fonte de proteases, como a
exemplo Pleurotus eryngii (Cha et al., 2010), Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa
(Park et al., 2007) e Pleurotus ostreatoroseus (Fonseca, 2014).
Atualmente, diversos trabalhos vêm explorando o potencial de resíduos
agroindustriais para a produção de proteases. Ravikumar et al., (2012) cultivaram
Pleurotus sajor-caju em diversos resíduos, selecionando o melhor para a produção de
proteases e Liang et al., (2006) observaram a produção destas enzimas no cultivo de
Monascus purpureus em meio composto por casca de camarão e caranguejo.
Os resultados mostram a produção de proteases em extrato aquoso extraídos dos
três diferentes compósitos formulados a partir de resíduo agroindustrial e diferentes
espécies de cogumelos comestíveis e podem ser observados na tabela 1. Em todos os
extratos recuperados dos compósitos foram determinados a atividade de proteases.
Apesar de todos os extratos terem produzido atividade enzimática bastante expressiva,
dentre os três extratos avaliados, a maior atividade proteolítica foi determinada no
extrato aquoso composto por casca de abacaxi e Lentinus citrinus (296,55 U/mL). Nos
biocompósitos formulados com Pleurotus albidus e Pleurotus flórida a atividade
368
proteolítica foi 270,44 U/mL e 280,55 U/mL, respectivamente, com diferença
significativa entre os três valores observados.
Tabela 1. Atividade proteolítica dos extratos aquosos de casca de abacaxi e cogumelos

comestíveis.
pH do extrato Atividade
Amostra aquoso proteolítica (U/mL)
Casca de abacaxi e Pleurotus albidus 4,3 270,44 ± 1,39c
Casca de abacaxi e Pleurotus florida 5,5 280,55 ± 3,87b
Casca de abacaxi e Lentinus citrinus 6,0 296,55 ± 2,41a
* médias que não dividem uma letra são significativamente diferentes
Os resultados obtidos para os cogumelos do gênero Pleurotus foram superiores

aos encontrados por Fonseca et al. (2014), que avaliaram diversos substratos miceliados
por Pleurotus ostreatoroseus. Os valores obtidos para o cogumelo comestível Lentinus
citrinus também foi superior ao encontrado por Kirsch et al. (2011) estudando o
cogumelo de mesma espécie.
Quanto aos valores de pH nos extratos, foi verificado variação dos valores nos
três extratos avaliados. O extrato aquoso do biocompósito obtido a partir da miceliação
de casca de abacaxi por Pleurotus albidus apresentou o valor mais baixo, com uma
média de pH de 4,3, sendo classificado como ácido. O extrato do biocompósito de
Pleurotus florida, apresentou uma faixa de pH de 5,5, e o extrato obtido de
biocompósito de Lentinus citrinus, por outro lado, apresentou um valor de pH médio de
6, podendo ser classificados como levemente ácidos. Estes resultados mostraram que os
cogumelos estudados produziram enzimas proteolíticas de pH ácido a levemente ácido e
apesar de pertencerem a famílias próximas, as características de suas proteases são
distintas, podendo ser aplicadas em diversos fins industriais, incluindo indústria
farmacêutica, têxtil, alimentícia e química.
O uso de resíduos agroindustriais na fermentação submersa de microrganismos é
uma alternativa para a redução da contaminação ambiental oriunda do descarte
inadequado destes resíduos, além de ser uma fonte alternativa de produção de
metabólitos, auxiliando na redução do custo de produção desses compostos bioativos
(Nakamura, 2011).
369
Conclusões
A casca de abacaxi é um substrato com grande potencial para o cultivo de
cogumelos comestíveis.
O biocompósito gerado ao final deste processo pode ser utilizado como fonte de
enzimas proteolíticas derivadas de basidiomicetos.
Referências
Campos-Sales C, Andrade MCN (2011) Aproveitamento de resíduos madeireiros para o
cultivo do cogumelo comestível Lentinus strigosus de ocorrência na Amazônia. Acta
Amazonica 41: 1-8.
Cha WS, Park SS, Kim SJ, Choi DB (2010) Biochemical and enzymatic properties of a
fibrinolytic enzyme from Pleurotus eryngii cultivated under solid-state conditions using
corn cob. Bioresource Technol 101: 6475–6481.
Finimundy TC, Gambato G, Fontana R, Camassola M, Salvador M, Moura S, Hess J,

Henriques JÁ, Dillon AJ, Roesch-Ely M (2013) Aqueous extracts of Lentinula edodes
and Pleurotus sajor-caju exhibit high antioxidant capability and promising in vitro
antitumor activity. Nutr Res 33:76-84.
Fonseca TRB, Barroncas JF, Teixeira MFS (2014) Produção em matriz sólida e
caracterização parcial das proteases de cogumelo comestível da floresta amazônica. Rev
Bras Tecnol Indust. 8:1227-1236.
Kirsch LS, Pinto AC, Porto TS, Porto AL, Teixeira MFS (2011) The influence of
different submerged cultivation conditions on mycelial biomass and protease production
by Lentinus citrinus Walleyn et Rammeloo DPUA 1535 (Agaricomycetidae). Int J Med
Mushrooms 13:185-192.
Kumar CG, Takagi H (1999) Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial view
point. Biotechnol Adv, Oxford 17:561-594.
Liang TW, Lin JJ, Yen YH, Wang CL, Wang SL (2006) Purification and
characterization of a protease extracellularly produced by Monascus
370
purpureus CCRC31499 in a shrimp and crab shell powder medium. Enzyme Microb
Tech 38:74-80.
Nakamura M, Iketani A, Shioi Y (2011) A survey of proteases in edible mushrooms

with synthetic peptides as substrates. Mycoscience 52:234–241.
Park SE, Li MH, Kim JS, Sapkota K, Kim JE, Choi BS, Yoon YH, Lee JC, Lee HH,
Kim CS, Kim SJ (2007) Purification and characterization of a fibrinolytic protease from
a culture supernatant of Flammulina velutipes mycelia. Biosci Biotech Biochem
71:2214-2222.
Ravikumar G, Gomathi D, Kalaiselvi M, Uma C (2012) A protease from the medicinal

mushroom Pleurotus sajor-caju: production, purification and partial characterization.
Asia Pac J Trop Biomed 2:411-417.
371
Clonagem e expressão do um inibidor de fosfolipase A2
Verçosa J.V.M.¹, Neiva M.1, Carmo E.J.³, Asfolfi Filho S.1
¹ Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected],

Resumo
Uma das consequências dos envenenamentos por serpentes do gênero Bothrops é o

edema formado no local da picada que freqüentemente gera efeitos secundários como a
necrose tecidual e a mionecrose, podendo levar à perda tecidual, levando em muitos
casos à perda parcial ou total do membro. Essa necrose é mediada em grande parte pelas
fosfolipases A2 devido ao processo inflamatório induzido por sua atividade enzimática.
Existem diversos inibidores naturais de fosfolipases A2 de origem animal e vegetal.
Esses inibidores de fosfolipases A2 isolados e caracterizados de plasmas ou soros de
serpentes, denominados de PLIs tornaram-se importantes alvos de pesquisa, devido suas
possíveis aplicações biotecnológicas. O gene de um inibidor de fosfolipase de Bothrops
moojeni foi obtido por síntese química e clonado no vetor de expressão pGSM, dando
origem ao vetor pGSMPLI, que foi inserido na bactéria BL21 (DE3). Os clones
recombinantes foram induzidos por adição de IPTG por 4 horas e a expressão analisada
por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE). Essa análise
apresentou como resultando uma banda forte de massa aproximadamente de 20 kDA,
correspondente a massa esperada da proteína recombinante, indicando assim a
expressão do inibidor PLI. A proteína expressa será futuramente analisada quanto a sua
atividade biológica.
Palavras-chave: expressão heteróloga; inibidor; fosfolipase;
372
Introdução
As fosfolipases A2 (PLA2) compõem uma família de enzimas chave no

metabolismo de fosfolipídios de membranas celulares e são encontradas em diversos
tecidos de mamíferos, artrópodes e venenos de serpentes. As Fosfolipases A2
secretórias constituem um dos principais componentes dos venenos de serpentes do
gênero Bothrops e tem sido estudada principalmente devido aos diversos efeitos
fisiopatológicos em que está envolvida, como miotoxicidade, indução de edema.
Também são muito estudadas no ramo da neurociência, principalmente na doença de
Alzheimer (DA). (Schaeffer, 2004).
Uma das consequências dos envenenamentos por serpentes do gênero Bothrops

é o grande edema formado no local da picada que frequentemente gera efeitos
secundários como a necrose tecidual e a mionecrose, podendo levar à perda tecidual
abundante levando em muitos casos à perda parcial ou total do membro afetado. Essa
necrose é mediada em grande parte pelas fosfolipases A2 devido ao intenso processo
inflamatório induzido por sua atividade enzimática bem como pela rabdomiólise
(Gutierrez e Lomonte, 1989; Arantes, 2012). Do veneno da população de B. atrox de
Manaus, foram isoladas e parcialmente seqüenciadas duas isoformas de fosfolipase A2
(Lopez-Lozano et al., 1999). Uma delas possui estrutura com homologia para Lys-49 e
foi denominada BaPLA2M-I miotóxica sem atividade enzimática e a outra com
homologia para Asp-49 denominada BaPLA2M-II com atividade enzimática. Em
estudo feito com veneno de 21 exemplares adultos de B. atrox procedentes de diferentes
regiões geográficas do Estado do Amazonas, com a finalidade de verificar a freqüência
das duas isoformas de PLA2, observou-se que 76,19% apresentaram BaPLA2M-I e
100% BaPLA2M-II. (Neiva, 2009).
Os inibidores de fosfolipases (PLIs) são glicoprotéinas monoméricas ou

multiméricas que formam complexos solúveis com PLA2 inibindo sua ação (Ohkura et
al, 1997). Esses inibidores de fosfolipases A2 isolados e caracterizados de plasmas e/ou
soros de serpentes, denominados de PLIs tornaram-se importantes alvos de pesquisa,
devido suas possíveis aplicações biotecnológicas, na busca de novos fármacos de
interesse na clínica-médica e científica. (Soares, 2009).
Obter novas informações a respeito de inibidores de PLA2 é de grande

importância a fim de avaliar sua possível aplicação como novo modelo terapêutico na
373
neutralização de diferentes tipos de Fosfolipases A2. Seu uso seria de grande valia na
suplementação da soroterapia convencional, aliado a isso, o entendimento de sua
interação molecular com essas enzimas tão importantes torna esse inibidores possíveis
modelos para a melhor compreensão dos mecanismos de ação destas enzimas
multifuncionais. (Santos filho, 2012).
Uma vez que essas proteínas são expressas no plasma dessas serpentes, sua
obtenção a partir de material biológico torna-se dispendiosa e devido à necessidade de
um serpentário e a coleta de uma grande quantidade de sangue para a extração do
plasma. Diante dessas limitações, a expressão heteróloga se torna uma importante
metodologia para obtenção desses inibidores sem a necessidade de manipulação da
serpente. A bactéria Escherichia coli é o organismo mais utilizado na expressão
heteróloga de proteínas, pelo fato de ter um crescimento rápido, usar meio de cultura
simples e barato, além de linhagens bem caracterizadas. Porém, dependendo da fonte
nativa da proteína, a expressão pode ser obtida com outros organismos, como leveduras.
(Jonasson et al., 2002). O objetivo geral consiste em clonar e expressar um inibidor de
fosfolipase A2.
Material e Métodos
Isolamento do gene codificador do inibidor de fosfolipase A2
A correspondente à região codificadora da proteína madura foi desenhada com

base na sequência do mRNA codificador do γ-inibidor de fosfolipase A2 de
Bothropsmoojeni depositada no GenBank sob o número de acesso EU155175. Na
região flanqueadora da seqüência gênica foram inseridos os sítios de restrição das
enzimas EcoRI e Not Ia fim de direcionar a clonagem no vetor de expressão. O inserto
foi então sintetizado e previamente clonado no vetor pUC57 pela empresa Genscript
(Piscataway, NJ, USA). O isolamento do inserto foi feito por digestão do vetor Puc57
com as enzimas EcoRIe NotI, segundo o esquema de reação abaixo (Tabela 1).
O produto da digestão foi visualizado em gel de agarose preparativo a 1%

corado com brometo de etídeo, e a banda correspondente ao inserto foi cortada e
purificada utilizando o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE
Healthcare).
374
Tabela 1: Esquema da reação de restrição do vetor pUC57
Componente Volume (µL)

DNA 5
Tampão 3 2
EcoRI 1
NotI 1
BSA 0,2
Água 10,8
TOTAL 20
Construção do vetor de expressão
Para a expressão da proteína heteróloga foi utilizado o vetor pGSM1 cuja

transcrição da proteína é controlada pelo promotor T7 induzido por IPTG (isopropil-β-
tiogalactopiranosídeo) e possui no cassete de expressão um gene de resistência à
ampicilina como marca de seleção, o sítio múltiplo de clonagem e a sequencia
codificadora para uma cauda de histidina na porção C-terminal expressa em fusão com a
proteína heteróloga e um terminador de transcrição T7.
O vetor foi previamente digerido com as enzimas EcoRI e NotI segundo o
esquema de reação abaixo (Tabela 2).
Tabela 2: Reação de digestão do vetor pGSM1

DNA 5
Tampão 3 2
EcoRI 1
NotI 1
BSA 0,2
Água 10,8
TOTAL 20
375
Após a digestão o vetor linearizado foi purificado a partir do gel de agarose a 1%
utilizando o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE
Healthcare).
Após a purificação foi feita a ligação do inserto ao vetor segundo o esquema de
reação abaixo (Tabela 3) a 16ºC durante a noite.
Tabela 3: Reação de ligação ao vetor de expressão

Vetor (pGSM) 2
Inserto (PLI) 5
Tampão 1
T4 DNA Ligase 1
Água 1
Total 10
Após a ligação 1µL da reação foi utilizado para a transformação da linhagem

DH5α de E. coli por eletroporação. Uma alíquota de 100µL foi semeada em meio LB
com ampicilina (100µg/mL) para seleção dos clones transformantes.
A partir dos clones obtidos na transformação, foram selecionados 6 colônias, que
foram inoculadas para extração plasmidial, e nova digestão com as enzimas de restrição
EcoRI e NotI para confirmação da presença do inserto.
Indução da Expressão do PLI E. coli
Os clones positivos para a presença do inserto, foram selecionados para a

indução da expressão da proteína heteróloga e o vetor obtido foi denominado pGSMPLI
(Figura 1).
376
Figura 1: Mapa do Vetor pGSPLI – PLI: gene codificador do inibidor de fosfolipase
A2; AmpR: gene de resistência à ampicilina; ori: origem de replicação; múltiplo sitio de
clonagem (MCS).
O vetor construído foi utilizado para transformação de bactérias da linhagem

BL21 (DE3) por eletroporação, nas condições de1900V e 8,9ms. Para indução foi feito
um pré-inóculo de 8 colônias em5 mL demeio LB contendo ampicilina (100µg/mL) que
foram incubados durante a noite a 37ºC sob agitação. Após isso, foi retirada uma
alíquota de 500µL que foram inoculados em 30mL meio LB nas mesmas condições
anteriores. O inóculo foi monitorado até atingir a densidade óptica DO=0,7, quando
então foi adicionado 1 mM de IPTG e a cultura foi mantida sob agitação por mais 5
horas. Após esse tempo, a cultura bacteriana foi centrifugada por 10 minutos a 4000rpm
a 4ºC. Após esse período o material foi mantido a -80°C até o processamento para
extração das proteínas.
Extração de proteínas solúveis e insolúveis
O pellet obtido em cada amostra foi ressuspendido em 400µL de Tampão TE (20

mM Tris-HCl pH 7,5; EDTA 5mM), 10µL de lisozima (20mg/mL) e incubados por 10
minutos a 20ºC. A as células foram lisadas em sonicador com pulsos de 30 segundos
durante 5 minutos. Ao extrato foi obtido foram então adicionados 4µL de TritonX100
10% e centrifugado por 10 minutos, a 4ºC a 4000 rpm. Após a centrifugação o
sobrenadante foi separado do pellet, que foi ressuspendido em 400µL de tampão TE e
4µL de Triton 100x 10%.
377
Análise da proteína recombinante em gel de SDS-PAGE
A análise da expressão da proteína recombinante foi feita inicialmente por

eletroforese em gel SDS-PAGE a 12%, utilizando as amostras contendo tanto as
proteínas solúveis, quanto os insolúveis. Para aplicação no gel, 10µL das amostras
foram misturadas com 10µL de tampão de amostra e fervidas por 5 minutos.
O sistema de expressão escolhido foi o de E. coli, que é um dos mais eficientes

e rápidos, utilizando o vetor pGSM1 que foi extraído e clivado com as enzimas EcoRI e
NotI, como demonstra a Figura 2.
M 2 3 4
Figura 2: Digestão do vetor pGSM1- M- marcador de peso molecular 1kb; 2- vetor

pGSM íntegro; 3 e 4- vetor digeridocom EcoRI e NotI.
O vetor pUC57 com o inserto PLI também foi digerido com as mesmas enzimas,
como demonstra a Figura 3.
378
Figura 3: Digestão do vetor PUC57 – com EcoRI e NotI, liberando o inserto PLI com
aproximadamente 600pb (detalhe em vermelho). No poço M, o marcador, e de 1 a 3 os
plasmídeos digeridos.
A linhagem BL21 (DE3) foi escolhida para a expressão ser deficiente na

produção de proteases, evitando assima degradação da proteína heteróloga. A extração
plasmidial de 8 clones selecionados e confirmados como recombinantes por análise de
restrição.
1 2 3 4 5 6 7 8
M1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 4: Análise de restrição com as enzimas EcoRI e NotI dos clones transformantes -
Na parte de cima o resultado da extração do gel (plasmídeos de 1 a 8) e na parte de
baixo, a confirmação por digestão, mostrando a liberação do inserto em torno de 500pb,
confirmando com a presença do marcador de peso molecular no primeiro poço.
Dos 8 clones recombinantes foram selecionados 6 para indução e os extratos

celulares são mostrados Figura 5. A análise por SDS-PAGE confirmou a presença da
379
proteína heteróloga na fração insolúvel no tamanho esperado de aproximadamente
20kDa.
M BSA 1 2 3 4 5 6
50
28
20
17
Figura 5: Gel SDS- PAGE mostrando as proteínas insolúveis extraídas e a banda mais
porte, em torno de 20 kDA, o iPLA2. O primeiro poço é o marcador, seguido do
controle positivo BSA, e os poços 1 a 6 são as amostras insolúveis.
Conclusão
Em virtude dos resultados obtidos, concluiu-se que o inibidor da fosfolipase foi

expresso na Escherichia coli com excelência. O fato de a proteína ter sido encontrada
no meio insolúvel corrobora os estudos realizados a partir da literatura e conhecimentos
da linhagem utilizada, e o peso molecular foi confirmado a partir de técnicas de
bioinformática, no Expasy. No entanto, proteínas de origem eucarionte tendem a serem
expressas em sistema eucarionte, para obter as modificações pós-traducionais
necessárias para seu correto enovelamento, conseqüentemente, bom funcionamento.
Portanto, é imprescindível que não se pare apenas na expressão, mas que se prossiga
com testes de atividade e, se houver necessidade, uma nova expressão em outro
organismo.
380
Referências
Gutiérréz J. M., Lomonte B. (1989). Local Tissue Damage Induced by Bothrops Snake
Venoms. A Review. Memórias do Instituto Butantan, 51:211-223.
Jonasson P., Liljeqvist S., Nygren P.A., Stahl S. (2002). Genetic design for facilitated
production and recover of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Appl.
Biochem. 35: 91-105.
López-Lozano J.L., Morhy L., Sousa M.V., Fontes W., Dias A.K.B., Muniz E.,
Buhrnheim P. (1998). Isolation, characterization and N-terminal amino acid sequence of
two phospholipases A2 isoforms from Bothropsatrox snake venom from Manaus-Brazil.
Toxicon, 38:487-595. Supplement. V symposium of the Brazilian Society on
Toxinology.
Neiva M. (2011). Transcriptoma da glândula de veneno de Bothropsatrox – São Paulo.
Soares A. M. (2011). Molecular characterization of an acidic phospholipase A2 from

Bothrops pirajai snake venom: synthetic C-terminal peptide identifies its antiplatelet
region. Arch Toxicol, 85:1219-1233.
Schaeffer E.L. (2010). Enriquecimento ambiental como estratégia para promover a
neurogênese na doença de Alzheimer: possível participação da fosfolipase A2. Rev.
Psiquiatr. Clín. vol.37 no.2 São Paulo.
381
Avaliação da atividade anticandida de extratos de fungos do gênero

Pestalotiopsis spp. isolados de ambientes amazônicos
Banhos E.F.1, Souza A.Q.L. 2, Lima G.A.1, Souza A.F.1, Souza A.D.L.2.
1
Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia (Bionorte), Universidade Federal
do Amazonas – UFAM. 2Universidade Federal do Amazonas – UFAM, Manaus, AM
Emails: [email protected], [email protected],

Resumo
Os fungos do gênero Pestalotiopsis da ordem Melaconiales, família Amphisphariaceae,

demonstram potencial biotecnológico como fonte de recursos naturais na busca de
fármacos. Esta pesquisa avaliou a atividade anticandida de Pestalotiopsis spp isolados da
Amazônia. 24 linhagens foram cultivadas em Erlenmeyer (250mL), com 100mL de BDL,
por 25 dias, 24°C. O meio fermentado extraído com AcOEt e o micélio com
MeOH:AcOEt(1:1). Testados frente à Candida albicans (Fiocruz-CFAM–1342). Utilizou-
se método de diluições em caldo, com NBT como revelador e Nistatina (2.0mg mL-1)
controle positivo. 11 demonstraram resultado positivo, seis do micélio e cinco de meio
líquido. O meio líquido é geralmente a fonte mais rica de moléculas bioativas. Contudo,
isolou-se substâncias bioativas do micélio, indicando que o extrato do micélio também
deve ser investigado na busca de compostos bioativos desse gênero. As linhagens são
promissoras a atividade anticandida, por apresentarem atividade em quase 23% dos
extratos avaliados.
Palavras-chave: Pestalotiopsis, anticandida, extratos fúngicos, bioatividade.
Introdução
Na biotecnologia os fungos já são utilizados há séculos, desde a fermentação de

bebidas alcoólicas no antigo Egito, como também servindo de alimentos desde a idade
382
média na Europa, passando pela fabricação de pães e queijos na atualidade, até a produção
de compostos bioativos através de sua capacidade metabólica, como por exemplo, a
produção de antibióticos como a penicilina e ácidos (Borzani et al., 2001).
O gênero Pestalotiopsis pertence à ordem Melaconiales, família Amphisphariaceae
caracteriza-se pela presença de conidióforo dentro do corpo de frutificação denominado
acérvulo. Os conídios apresentam cinco células, sendo três medianas de coloração marrom
e duas células hialinas (apical e basal), com dois ou mais apêndices apicais. (Jeewon et al.,
2002).
No Brasil o gênero tem sido encontrado associado a espécies tropicais, este fato
demonstra a capacidade de adaptação e a importância ecológica do gênero (Hanada et al.,
2010). Os endofíticos pertencentes ao gênero Pestalotiopsis tem demonstrado um grande
potencial biotecnológico, sobretudo para a indústria farmacêutica, tanto da obtenção de
compostos antimicrobianos, isolando antifúngico como o de P. adusta, quanto na obtenção
de compostos com atividade citotóxica frente a células tumorais humanas, como isolados
de P. photiniae (Che et al., 2009).
Esse gênero tem sido isolado como endofítico de diversas plantas tropicais e tem
sido utilizado também como organismo modelo em diversos estudos de pesquisa básica e
aplicada (Hanada et al., 2010; Strobel et al., 1996). A diversidade de compostos isolados
produzidos por fungos desse gênero demonstra como esse gênero é rico do ponto de vista
de seu metabolismo secundário, o que o coloca como uma fonte de recursos naturais
importantes para estudos relacionadas a busca de novos fármacos. Neste trabalho avaliou-
se a atividade anticandida dos extratos obtidos de linhagens de Pestalotiopsis associadas a
espécies vegetais Amazônicas.
Material e Métodos
Foram selecionadas 24 linhagens de Pestalotiopsis isoladas de espécies

Amazônicas inoculadas em triplicata, em frascos Erlenmeyer de 250 mL, com 100 mL de
meio líquido batata-dextrose (BD), acrescido de 0,2% de extrato de levedura sob condições
estéreis (Souza et al., 2004).
Os frascos foram incubados por um total de 25 dias, sob temperatura de 24°C. Os
parâmetros de tempo e temperatura de cultivo foram determinados pelas necessidades
fisiológicas do gênero. Os constituintes fixos foram divididos em extracelulares (meio de
cultura fermentado) e intracelulares (micélio) para extração com solventes orgânicos
383
conforme descrito a seguir: AcOEt 100%, por 3 vezes, para o meio de líquido fermentado,
e o micélio foi macerado em MeOH:AcOEt (1:1) por 48h e depois filtrado, por 3 vezes.
Todas as amostras foram secas em rotaevaporador e pesados. Todos os 48 extratos obtidos
foram avaliados quanto a atividade anticandida, e para isso foi utilizada uma estirpe de
Candida albicans, cedida pela coleção de microrganismos patogênicos da Fiocruz – AM
código CFAM-1342, os testes foram determinados pelo método de diluições sucessivas em
caldo, conforme recomendado pelo Subcommitte on Antifungal Susceptibility Testing do
US National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997).
O bioensaio foi realizado em placas de 96 poços com 100µL de caldo saboraud
dobrado, 100µL de solução dos extratos teste (2.0 mg.mL-1), e 10 µL de suspensão fúngica
com 1.0x107 UFC.mL-1, seguido por incubação a 37°C (24h) em triplicatas. Para solução
dos extratos teste, estes foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma
concentração de 10% completado o volume final (90%) com água destilada autoclavada.
A bioatividade foi registrada como ausência de coloração nos poços depois da
adição de 10µL de revelador azul de nitrotetrazólio (NBT). Nistatina (2,0mg.mL-1) foi
usado como controle positivo e cultivo em meio saboraud, sem aditivos, foi usado como
controle negativo.
Dos 48 extratos brutos testados frente a C. albicans 11 demonstraram resultado

positivo, desses, seis foram obtidos da maceração do micélio extraído com MeOH:AcOEt e
cinco foram obtidos da extração líquido-líquido do meio líquido fermentado extraído com
AcOEt. As linhagens de Pestalotiopsis que apresentaram resultado positivo foram
codificadas como P10, P11, P12, P47, P46, P40, P31, P19, P23 e P33, sendo que a
linhagem P10 apresentou resultado tanto no extrato obtido do meio líquido fermentado,
quanto no extrato bruto obtido do micélio, completando os onze extratos brutos com
resultado positivo.
O número de linhagens com resultado positivo demonstra o potencial desse gênero
para obtenção de substâncias bioativas. Da mesma forma os resultados obtidos revelaram
que linhagens de diferentes hospedeiros apresentaram atividade, o que indica que esse
gênero possui uma versatilidade metabólica provavelmente promovida pela interrelação
com seu hospedeiro, como o descrito em trabalhos como o de Strobel et al., (1996).
384
De forma geral, os trabalhos com esse gênero têm demonstrado que uma boa
seleção do hospedeiro para o isolamento de linhagens desse gênero é fundamental para a
obtenção de linhagens com potencial biotecnológico (Strobel et al., 1996).
Dentre os resultados obtidos também chama atenção o modo de cultivo, pois das dez
linhagens que apresentaram resultado positivo frente a C. albicans oito foram cultivadas
sob agitação (P10, P11, P12, P46, P31, P19, P23 e P31) e apenas duas em modo estático
(P40 e P47). Essa informação demonstra que a aeração deve ser um fator a ser levado em
consideração quando se busca compostos bioativos obtidos dessas linhagens.
Dentre as linhagens que apresentaram resultados positivos duas (P11 e P12) foram
isoladas da casca do caule de Rollinia sp, um gênero de anonácea bem conhecida na região
Amazônica. Outras duas linhagens (P19 e P47) foram isoladas das raízes da Euterpe
oleracea, a espécie conhecida popularmente como açaizeiro. Também apresentaram
resultados positivos linhagens de Pestalotiopsis isoladas do caule de Myrcia guianensis
(P23), uma Myrtaceae bem distribuída na região amazônica, conhecida popularmente
como pedra-ume-caá ou vassourinha. Duas linhagens foram isoladas de Basidiomicetes
(P31 e P33).
Os trabalhos de isolamento de compostos de Pestalotiopsis, nos diferentes meios de
cultivo, tem mostrado que o meio líquido fermentado é a fonte mais rica de moléculas
bioativas quando comparada com os extratos do micélio (Che et al., 2009). Contudo em
trabalho realizado por Wray et al., (2011) foi possível o isolamento de Pestalotiopsonas,
uma cromona presente no micélio de Pestalotiopsis sp, sendo que uma de suas isoformas
mostrou citotoxidade moderada, indicando que o extrato do micélio também deve ser
investigado quando se busca compostos bioativos de fungos desse gênero.
Das espécies que apresentaram atividade biológica podemos destacar a espécie P.
microspora, comumente descrita como endófito de uma variedade de espécies vegetais,
tanto plantas de clima tropical quanto temperado, bastante versátil do ponto de vista
metabólico, produzindo compostos bioativos como o taxol, ácido torreiânico, ácido
ambuíco entre outros (Strobel, 1996, Lee et al., 1996; Li et al., 2001).
A linhagem P40 foi isolada das folhas de uma espécie de Gustavia elliptica, além e
uma linhagem isolada dos espinhos de Pinus elliottii (P10). Das dez linhagens que
apresentaram resultado positivo frente a C. albicans oito foram cultivadas sob agitação, em
incubadora B.O.D. (P10, P11, P12, P46, P31, P19, P23 e P31) e apenas duas em modo
estático (P40 e P47).
385
Podemos destacar também os resultados de P10, identificada por biologia molecular como
P. disseminata (B5-3) que apresentou resultados positivos tanto nos extratos de seu meio
líquido fermentado quanto de seu micélio. A capacidade metabólica de fungos dessa
espécie já foi descrita anteriormente por Gloer et al., (2006), no isolamento das 6-
Hidroxipunctaporonina A e B, sesquiterpenos em que a forma B apresentou atividade
contra Staphylococcus aureus (ATCC 29213).
Conclusões
As linhagens testadas são promissoras a obtenção de compostos com atividade

anticandida, por apresentarem atividade em quase 23% dos extratos.
A produção de compostos com atividade anticandida demonstrou depender da
aeração para sua obtenção.
A maioria dos extratos com bioatividade foi obtida do meio líquido, o que
demonstra que este é uma fonte mais rica dessas biomoléculas.
Através do trabalho foi possível selecionar 11 linhagens do gênero Pestalotiopsis
para etapas subsequentes de investigação, sendo elas o isolamento e identificação de
compostos com propriedade biativas.
Agradecimentos
Nosso agradecimento ao apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico – CNPq, a Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP e a
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM, que viabilizaram a
realização desse trabalho.
Referências
Borzani W, Schmidell W; Lima UA; Aquarone E (2001) - Biotecnologia Industrial vol 1.

Ed.Blucher.
Che Y, Ding G, Zheng Z, Liu S, Zhang H, Guo L (2009) Photinides A-F, Cytotoxic
Benzofuranone-Derived γ- Lactones from the Plant endophytic Fungus Pestalotiopsis
photiniae. J Nat Prod 72: 942-945.
Gloer JB, Deyrup ST, Swenson DC, Wicklow DT (2006) Caryophyllene Sesquiterpenoids
from a Fungicolous Isolate of Pestalotiopsis disseminata. J Nat Prod 69: 608-611.
386
Hanada RE, Pomella AWV, Costa HS, Bezerra JL, Pereira JO (2010) Endophytic fungal
diversity in Theobroma cacao (cacao) and T. grandiflorum (cupuaçu) trees and their
potential for growth promotion and biocontrol of Black-pod disease. Fungal Biol 30: 1-10.
Jeewon R, Liew ECY, Hyde KD (2002) Phylogenetic relationships of Pestalotiopsis and

allied genera inferred from ribosomal DNA sequences and morphological characters. Mol
Phylogen Evol 25: 378–392.
Lee JC, Strobel GA, Lobkosky E, Clardy JC (1996) Torreyanic acid: a selectively
cytotoxic quinone dimer from the endophytic fungus Pestalotiopsis microspora. J Organ
Chem 61: 3232-3233.
Li JY, Harper JK, Grant DM, Tombe BO, Bashyal B, Hess WM, Strobel GA (2001)
Ambuic Acid, a Highly Functionalized Cyclohexenone with Antifungal Activity from
Pestalotiopsis spp. and Monochaetia sp. Phytochem 56(5): 463-468.
NCCLS (1997) Methods for dilution and antimicrobial susceptibility tests for bacteria that
grow aerobically, NCCLS Approved Standard M7-A4.
Souza AQL, Souza ADL, Filho AS, Pinheiro MLB, Sarquis MIM, Pereira JO (2004)
Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da Amazônia:
Palicourea longiflora (aubl.) rich e Strychnos cogens bentham. Acta Amazonica 34(2):185-
195.
Strobel GA, Yang X, Sears J, Kramer R, Sidhu RS, Hess WM (1996) Taxol from
Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallachiana. Microbiol 142:
435–440.
Wray V, Xu J, Aly AH, Proksch P (2011) Polyketide derivatives of endophytic fungus

Pestalotiopsis sp. Isolated from the Chinese mangrove plant Rhizophora mucronata Tetrah
Letters 52: 21-25.
387
Pesquisa de endoparasitas em bovinos abatidos no matadouro municipal de

Parintins, Amazonas
Brelaz ECDO¹, Teixeira NS², Galúcio VCA2, Nunes AS2 Sales-Campos C3
¹Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas – IFAM, Manaus, AM,

²Universidade Federal do Amazonas – UFAM, Manaus, AM, ³Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia – INPA, Manaus, AM. Emails: [email protected], [email protected],
Resumo
A proposta desta pesquisa foi analisar amostras de fezes de bovinos antes de serem abatidos
no Matadouro Municipal de Parintins - AM. Foram coletadas amostras nos meses de agosto,
setembro e outubro (período seco) do ano de 2013, retiradas diretamente da ampola retal dos
animais, conservadas sob refrigeração e levadas ao laboratório de Ciências do Instituto
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas - Campus Parintins. As amostras
foram avaliadas quanto a presença de microrganismos como bactérias, hifas e leveduras, além
de formas evolutivas de protozoários e helmintos, endoparasitas responsáveis pela ocorrência
de verminoses no rebanho, sendo comum nas análises a presença de bactérias e fungos, assim
como cistos de protozoários. Somente no mês de outubro foram encontrados ovos de
helmintos nas amostras, este período é caracterizado pelo início da transição entre período de
cheia das águas e o período seco.
Palavras-chave: Epidemiologia; Exame parasitológico de fezes; Microrganismos.
Introdução
O controle de parasitoses em bovinos e bubalinos é um importante fator na produção,

por causarem grandes perdas econômicas por queda da produtividade e até morte dos animais.
Os prejuízos chegam de 20% a 30% na produção de leite e carne (EMBRAPA, 2006).
Animais jovens acabam sendo mais susceptíveis conforme descrição de Gottschall et
al.(2010) em seu trabalho de levantamento da Taxa de Mortalidade de propriedades rurais,
onde há perdas de 11,5% a 16,9% em grupos de animais entre 1 a 2 anos e de 0 a 1 ano de
idade, respectivamente, causada por verminoses.
Os agentes etiológicos responsáveis pelas principais parasitoses são bastante
resistentes podendo permanecer viáveis por longo período de tempo mesmo fora do trato
gastrointestinal do hospedeiro, sendo depositados no solo, ração, forragem, pastagens, entre
388
outros. Além disso, algumas infecções são assintomáticas, tornado o animal um reservatório,
com grande potencial de contaminação para o rebanho.
O controle estratégico de verminoses tende a reduzir a contaminação, evitar altas
cargas parasitárias e contribuir para uma melhor relação custo-benefício para o produtor. De
acordo com Vidotto (2002) no Brasil, bovinos criados em pastagens naturais, estão expostos à
infecção por larvas de nematódeos gastrintestinais e pulmonar, particularmente dos gêneros,
Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Strongyloides, Trichostrongylus, Oesophagostomum e
Dictyocaulus. A incidência e distribuição destes parasitos apresentam variações regionais e
sazonais, dependendo de vários fatores como regime pluvial, ecossistema, manejo, tipo e
idade dos animais, estando diretamente ligado ao conhecimento da epidemiologia dos
organismos tanto das formas de vida livre como das formas patológicas (Molento, 1999). As
propostas de manejo sanitário podem resultar em uma melhor relação custo-benefício para o
produtor fazendo com que este não tenha gastos com a administração excessiva de compostos
químicos, sem o devido efeito na população parasitária (Mello et al., 2006).
O controle das infecções parasitárias em animais de produção depende em grande
parte da utilização sistemática de agentes químicos. E, apesar de o surgimento desses
compostos serem um marco da tecnologia devido à sua elevada eficácia, o uso excessivo ou
inadequado pode levar ao desenvolvimento de resistência nos animais às essas drogas como
uma adaptação evolutiva (Heck et al., 2005).
Cezar et al. (2008) cita que o controle das nematodíases é mais eficiente se baseado
em um bom conhecimento epidemiológico básico e de particularidades regionais ou mesmo
específicas do local e do tipo de sistema produtivo. Neste sentido, controlar, significa manter
a carga parasitária abaixo dos níveis capazes de provocar perda econômica, assim como o
pastejo simultâneo de bovinos e ovinos como descrito por Torres (2009) proporciona melhor
controle da carga parasitária, e tão importante quanto conhecer os efeitos e prejuízos causados
pelos endoparasitas é saber o grau em que a mesma está ocorrendo.
Comercialmente, a carne tem como finalidade alimentar a população com garantia de
qualidade sanitária e saúde do consumidor. A ingestão de carne crua ou mal passada pode
conter cisticercos que podem sobreviver por mais de 30 anos, nas espécies de Taenia, os ovos
ou as proglotes eliminadas, quando ingeridas pelos hospedeiros intermediários (boi e o porco)
liberam as larvas no intestino destes hospedeiros, o homem se infecta ao ingerir carne
contendo cisticercos viáveis. Estes resistem à acidez gástrica e liberam larvas no lúmen
intestinal, que aí mesmo evoluem para vermes adultos (Pereira, 2011).
389
Neste contexto, a cidade de Parintins, situada a aproximadamente 400 km2 da capital
Manaus – AM, com 102.033 habitantes (IBGE, 2012) detém a segunda maior economia do
estado, sendo a pecuária a atividade de maior importância no setor primário contando com um
rebanho efetivo de 147.382 (Neto, 2012), sua produção é destinada para o consumo local e o
excedente é exportado para outros municípios, porém pouco se conhece sobre as
características epidemiológicas das principais parasitoses, tão necessárias para um controle
sanitário adequado.
Diante do exposto, realizou-se a análise de fezes de bovinos abatidos no Matadouro do
Município para observar a presença de formas evolutivas de endoparasitas que poderiam
acometer esses animais e comprometer sua comercialização.
Material e métodos
O trabalho foi desenvolvido no laboratório de Ciências no Instituto Federal de

Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas - Campus Parintins – AM, no período de 01 de
agosto a 17 de outubro de 2013. As coletas foram realizadas mensalmente, de acordo com o
cronograma de abate do matadouro, onde 5 animais do sexo masculino, com peso aproximado
de 200 Kg em média, eram selecionados aleatoriamente sem levar em consideração aspectos
físicos, raça ou localidade de origem. Foram coletadas quinze amostras no total, em duplicata,
com amostras de aproximadamente 6 gramas retiradas diretamente da ampola retal dos
animais.
Para a coleta do material utilizou-se a metodologia descrita por Monteiro (2010),
sendo realizada nas primeiras horas do período da manhã, com uso de luvas descartáveis. As
amostras foram depositadas em potes coletores, lacrados com papel filme PVC (50),
devidamente identificados e acondicionados em caixa de isopor fechada até a chegada ao
laboratório.
O material utilizado foi previamente separado e a análise foi realizada pelo método
direto, utilizado para a pesquisa de parasitas em pequenas quantidades de fezes, além de
outras vantagens como o uso de poucos equipamentos e ser de fácil execução. Este método
consiste na realização de esfregaço em lâmina com cerca de 10 – 15 mg de fezes em uma gota
de solução salina com a adição de uma gota de corante Lugol forte, coberto com lamínula
para em seguida ser observado em microscópio óptico.
390
Após a análise das amostras, as formas evolutivas encontradas foram fotografadas e
comparadas morfologicamente com a literatura especializada (Taylor et al., 2010), para
possível identificação a nível de gênero.
Os resultados obtidos no mês de agosto (Tabela 1), caracterizado por grande volume
de água nos rios, evidenciaram a presença de quantidade significativa de fibras normalmente
oriundas da alimentação, grânulos de gordura, células de descamação, presença de hifas e
bactérias em abundância, além de raros piócitos, células do sistema imunológico, em 40% das
amostras que também apresentaram cistos característicos de protozoários com morfologia
sugestiva de Entamoeba sp. (Figura 1).
Tabela 1: Descrição de amostras fecais coletadas e analisadas no mês de agosto.

Cistos de
Amostra Sexo Bactérias Piócitos Hifas Fibras Outros
ameba
01 F Presença Presença Presença Presença Ausência
Células de
02 F Abundante Raros Ausência Ausência Ausência
descamação
03 F Presença Ausência Ausência Ausência Presença
04 M Presença Raros Presença Presença Ausência
05 F Presença Ausência Ausência Ausência Presença
Figura 1: Cisto de protozoário com morfologia sugestiva de Entomoeba sp.
391
No mês de setembro (Tabela 2), período em que muitas áreas ainda se encontram
alagadas, observou-se a ausência de formas evolutivas de protozoários e helmintos em todas
as amostras avaliadas, sendo frequente e em grande quantidade a presença de bactérias e
fungos.
Tabela 2: Descrição de amostras fecais coletadas e analisadas no mês de setembro.

Cistos de
Amostra Sexo Bactérias Piócitos Hifas Fibras
ameba
01 M Presença Ausência Ausência Presença Presença
02 M Presença Ausência Ausência Ausência Ausência
03 M Presença Ausência Ausência Ausência Presença
04 M Presença Ausência Ausência Ausência Presença
As análises realizadas no mês de outubro (Tabela 3) demonstraram um maior índice de

contaminação baseado na presença de formas evolutivas características de cistos de
protozoários e ovos de helmintos em 40% das amostras (Figura 02), além de uma flora
bacteriana e fúngica abundante, neste período o peso médio dos animais diminuiu para 150
Kg.
Tabela 3: Descrição de amostras fecais coletadas e analisadas no mês de outubro.

Ovos de Cistos de
Amostras Sexo Bactérias Hifas Fibras
Helmintos Ameba
01 F Presença Ausência Abundantes Presença Presença
02 M Presença Ausência Poucas Ausência Presença
03 M Presença Ausência Abundantes Ausência Presença
04 M Presença Ausência Poucas Ausência Poucas
05 M Presença Presença Poucas Ausência Poucas
06 M Presença Presença Abundantes Ausência Presença
392
Figura 02: Imagem de ovo de helminto com morfologia sugestiva de Estrongyloides sp.
O matadouro possui uma política efetiva de orientação aos produtores rurais quanto a
vermifugação dos animais, assim como disponibiliza informações sobre o calendário de
vacinas nacional, para que se obtenha um padrão de qualidade da carne comercializada no
município.
Em todas as análises foi observada uma flora bacteriana abundante, o que se deve ao
processo de digestão dos ruminantes, onde é comum a presença de bactérias no líquido
ruminal, no intestino e massa fecal (Pimentel, 2002). Nessas amostras observou-se também
numerosas hifas que acabam sendo liberadas nas fezes, pois segundo Fondevila (1998) a
presença de fungos favorece a ruptura das partículas de forragens, aumentando também a
superfície acessível para a ação das bactérias.
A presença de microrganismos no sistema ruminal contribui para o bom desempenho do
processo de digestão, Fondevila (1998) também já descrevia a importância da função de cada
um, e sua capacidade de degradar polissacarídeos estruturais, processo que dependerá de
fatores ecológicos, como sua abundancia no rúmen, sua relação com outras espécies
microbianas, fatores relacionados com o substrato, com a estrutura anatômica e composição
química das forragens e as condições ambientais para a fermentação.
O período de maior contaminação, principalmente por ovos característicos de helmintos
foi o mês de outubro, período de vazante dos rios, onde a contaminação das águas está mais
concentrada refletindo no em um aumento de ocorrência de verminoses (Neto, 2012).
Através do exame parasitológico de fezes pode-se obter um indicativo do estado
nutricional e imunológico dos animais, pois a presença de parasitas estava normalmente
associada a ocorrência de muco, diarreia e sangue nas fezes, indicativo de infecção e de maior
risco de contaminação de outros animais e do próprio homem. O consumo de carne e vísceras
393
mal cozidas contaminadas por formas evolutivas de parasitas pode significar um sério risco
saúde humana (Monteiro, 2010).
Apesar de o matadouro municipal ter uma política de orientação, não existe uma
cobrança efetiva acerca dos procedimentos praticados pelos produtores que acaba por
contribuir para a ocorrência de animais contaminados.
Conclusões
Os resultados demonstraram que bovinos abatidos no Matadouro Municipal de Parintins

– AM, apresentam flora bacteriana e fúngica dentro do esperado, com a ocorrência de cistos
de protozoários de vida livre ou oportunistas e, em geral estão livres de formas evolutivas de
helmintos, com exceção dos animais abatidos no mês de outubro, possivelmente resultante do
período de vazante dos rios, resultante do início do período de Terra firme no Amazonas e
final do período de Várzea, onde a contaminação das águas está mais concentrada refletindo
em um aumento na quantidades de parasitas no ambiente e consequentemente aumentando a
ocorrência de verminoses no homem e nos animais.
Faz-se necessária uma maior fiscalização pelos órgãos competentes, assim como
incentivo e conscientização dos produtores rurais quanto às boas práticas de manejo e
condição sanitária dos animais.
Referências
Cezar A.S., Catto J.B., Bianchin, I. (2008). Controle alternativo de nematódeos

gastrintestinais dos ruminantes: atualidade e perspectivas. Ciência Rural, Santa Maria,
38(7):2083-2091.
Embrapa (2006). Informação técnica: Francelino Goulart da Silva Netto, Méd. Vet.,M.Sc.,
Porto Velho, RO, outubro, 2006.
Fondevila M. (1998). Procesos implicados en la digestión microbiana de los forrajes de baja

calidad. Rev. Fac. Agron. (LUZ). Universidad de Zaragoza, España. 15: 87-106.
Gottschall C. S. et al. (2010). Principais causas de mortalidade na recria e terminação de

bovinos de corte . Rev. Acad., Ciênc. Agrár. Ambient., Curitiba, 8(3):327-332.
394
Heck I., Leandro A., Leite C. (2005). Efeito do clima sobre a infecção parasitária em bezerros
e presença de larvas em manejo rotativo de pasto em Santa Maria, RS, Brasil. Ciência Rural,
35:116-119.
IBGE(2014). Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. - www.ibge.gov.br.<Acessado em

11/09/2014>
Mello M.H.A., Depner R.A., Molento M.B., Ferreira J. (2006).Resistência lateral às

macrolactonas em nematodas de bovinos. Arch. Vet. Sci., 11:8-12.
Molento M.B.; Prichard R.K. (1999). Nematode control and the possible development of
anthelmintic resistance. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 8:75-86.
Monteiro S.G. (2010) Parasitologia na medicina veterinária. 1. Ed. Rio de Janeiro: Roca.
Neto F.A.C., Pimentel N. (2012). Perfil Econômico dos Municípios do Amazonas – 8ª Sub
Região – Parintins. SEPLAN. Manaus-AM.
Pereira J.R. (2011). Práticas de controle e prevalência de helmintos gastrintestinais parasitos

de bovinos leiteiros em Pindamonhangaba, São Paulo, Brasil. Revista de Ciências
Agroveterinárias. Lages, 10(1):16-22.
Pimentel Neto M., Fonseca A.H. (2002). Epidemiologia das helmintoses pulmonares e
gastrointestinais de bezerros em região de baixada do estado do Rio de Janeiro. Pesquisa
Veterinária Brasileira, 22(4):148-152.
Taylor M.A, Coop R,L, Wall RL. (2010). Parasitologia Veterinária. Terceira Edição. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan.
Torres et al. (2009). Nematódeos de ruminantes em pastagem com diferentes sistemas de

pastejo com ovinos e bovinos. Pesq. agropec. bras., Brasília, 44(9):1191-1197.
Vidotto O. (2002). Estratégias de combate aos principais parasitas que afetam os bovinos. In.
Simpósio sobre sustentabilidade da pecuária leiteira na região sul do Brasil / editores Geraldo
Tadeu dos Santos et al. – Maringá :UEM/CCA/DZO- NUPEL, p.192-212.
395
Candidemia em Unidades de Terapia Intensiva: Diagnóstico e

avaliação da capacidade de aderência e formação de biofilme
Couto F.M.M.1, Andrade S.L.2, Buonafina M.D.S.1, Leal A.F.G.1, Magalhães O.M.C.1,
Vasconcelos F.M.T.S.1, Santos F.A.G. 1, Neves R.P. 1.
1
Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, 2Universidade do Estado do Amazonas – UEA,
Manaus, AM. Email: [email protected]
Resumo
Candidemia é a infecção da corrente sanguínea causada por leveduras do gênero
Candida. A capacidade de Candida em aderir às células hospedeiras, infectar e causar doença é
dita como potencial fenômeno de virulência sendo aderência, o evento inicial na patogênese,
assim como formação de biofilmes, que podem provocar resistência terapêutica. Neste estudo
foram avaliados pacientes em setores de cuidados intensivos quanto a ocorrência de candidemia
e cepas de Candida foram testadas quanto à capacidade de adesão e formação de biofilme.
Foram obtidos 11 isolados de Candida distribuídos entre as espécies C. albicans, C.
parapsilosis, C. guilliermondii e C. tropicalis. Todas apresentaram capacidade de aderir-se com
intensidades forte e fraca, formando biofilmes de moderado a fraco. Pode-se ressaltar que a
epidemiologia fornece relevantes informações sobre incidência de agentes etiológicos.
Outrossim, testes de virulência como aderência e formação de biofilme, proporciona o
conhecimento do grau patogênico do agente infeccioso e condução de uma terapêutica
direcionada.
Palavras-chaves: Candida, Candidemia, Aderência, Biofilme
Introdução
O número de casos de infecções fúngicas invasivas tem aumentado
substancialmente na América Latina e no mundo, estando esse elevado número
relacionado a fatores que tornam os pacientes susceptíveis a tais infecções, destacando-
se as causadas por leveduras (Garnacho-Montero et al., 2012).
A severidade da doença de base comumente conduz à internação em Unidades
de Terapia Intensiva (UTI) por vezes associado a um tempo prolongado, bem como uso
de procedimentos invasivos. Neste sentido, as leveduroses assumem um papel de
destaque como causa de infecções endógenas e exógenas por consequência da
396
diminuição na imunidade humoral e celular, exposição a procedimentos invasivos que
medeiam a quebra das barreiras de defesas naturais, antibioticoterapia de amplo
espectro, uso de imunossupressores, tempo prolongado de permanência hospitalar e
outras condições que favorecem essas micoses (Monteiro et al., 2011).
Nas leveduroses, espécies de Candida são predominantes tendo atualmente
conduzido a diversos quadros clínicos, desde superficiais a invasivos, a exemplo das
infecções da corrente sanguínea, sendo causa de morbidade e em muitos casos,
mortalidade Garnacho-Montero et al., 2012; Ye et al., 2013).
A capacidade destas leveduras, agentes etiológicos de candidemia, em se aderir
às células do hospedeiro, infectar e causar doença é definida como potencial de
virulência, sendo o evento inicial na patogênese destas infecções. Outra condição que
facilita o estabelecimento de infecções invasivas é a formação de biofilmes, os quais são
agregados celulares embebidos por uma matriz polimérica extracelular que confere
elevada resistência terapêutica (Lacaz et al., 2002).
Este estudo fundamenta-se em pesquisas que busquem indicar a epidemiologia
para casos de candidemia em UTIs e fatores de virulência relacionados.
Material e Métodos
Coleta de amostras clínicas e obtenção dos isolados de Candida spp.
Coletas foram realizadas em pacientes internados em UTI de Hospitais do
Recife-PE após aprovação pelo comitê de ética da UFPE. Amostras de sangue venoso
foram coletadas, por punção e adicionadas em tubos contendo meio Brain Heart
Infusion (BHI) para diagnóstico laboratorial micológico. Estes foram acondicionados
por 72 horas a 37ºC e após turvação, alíquotas foram transferidas para placas contendo
meio Sabouraud Dextrose Ágar (DIFCO) e mantidas em até 15 dias.
Após o surgimento das colônias estas foram identificadas através da taxonomia
clássica e confirmadas pelo método automatizado, baseados nas características
morfofisiológicas (Barnett, 2000).
Realização de testes de patogenicidade

Para análise da capacidade de aderência, células epiteliais foram obtidas da
cavidade bucal de hospedeiro jovem livre de caries, com previa higienização oral, e
mantidas em banho de gelo. Em todas as etapas sobre testes de aderência foi utilizado o
tampão fosfato (PBS). Os isolados de Candida foram semeados no meio ágar
397
Sabouraud com de 0,5% extrato de levedura. Após 72h, as leveduras foram suspensas
em 2ml de PBS contidos em tubos, centrifugadas três vezes a 1.580 rpm por 10 minutos
e re-suspendidas para uma concentração final de 2 x 107cels/mL. As células de
leveduras e as epiteliais foram homogeneizadas e agitadas durante duas horas.
Posteriormente, foram montadas lâminas com azul de metileno e realizada a
microscopia. Os resultados foram expressos pela média aritmética e de acordo com a
quantidade de leveduras aderidas foram interpretados como forte aderência (F), fraca
aderência (f) e sem aderência visível (0).
A avaliação da capacidade de formação de biofilme foi realizada com uma
suspensão salina dos isolados de Candida com concentração final de 106 UFC/mL. 20µl
foram inoculados em 180µl de ágar Sabouraud líquido contido em microplacas,
mantidas a 35ºC por 24h. O conteúdo foi aspirado e os poços lavados com água
destilada, colocando safranina para avaliação de acordo com a intensidade da coloração,
interpretando como fraca coloração (1+); coloração mediana (2+ e 3+) e fortemente
corados (4+), representados como fraca, mediana e forte formação de biofilme.
Resultados
Foram acompanhados 1.462 pacientes internados nas UTIs dos hospitais
públicos Agamenon Magalhães e Getúlio Vargas, ambos localizados na cidade do
Recife, PE. Destes, foram obtidas 1.275 amostras de sangue, das quais o diagnóstico de
candidemia foi conclusivo em 11 casos.
Com base na avaliação clínica, todos pacientes com suspeita de candidemia
apresentaram estados febris. Vômitos, diarréia e problemas respiratórios também foram
sintomas diagnosticados em nossa pesquisa.
Quanto às doenças de base dos que apresentaram a infecção, as de origem
cardiovascular, diabetes mellitus, doenças hepáticas e neoplasias até o momento foram
as mais incidentes. Entre as condições de risco associadas, as mais frequentes foram
idade avançada, uso de terapia profilática com antifúngicos, antibioticoterapia e
corticoidoterapia por longo período, nutrição parenteral e transplantes.
Nas etapas de diagnóstico laboratorial micológico foram isoladas culturas de
leveduras com coloração de branca a creme, superfície de textura lisa e bordos regulares
e irregulares.
398
O método de taxonomia clássica permitiu a identificação dos agentes etiológicos
em nível de espécie, assim como o sistema automatizado Vitek-2 (Vitek Systens Inc.,
Hazelwood, Mo, EUA).
Dos casos de candidemia diagnosticados quatro corresponderam a espécie C.
albicans, três C. parapsilosis, duas C. gilliermondii e uma C. tropicalis (Tabela 1). Os
11 isolados de Candida foram analisados quanto a capacidade de aderência às células
epiteliais, importante evento caracterizado como inicial para determinar a
patogenicidade das cepas, sendo demonstrado de forma diversificada nesta pesquisa.
Tabela 1. Capacidade de aderência e formação de biofilme por isolados de

Candida obtidos do sangue de pacientes internados em Unidades de Terapia
Intensiva.
Número de Espécie Capacidade de Formação de
registro aderência biofilme
12199 Candida albicans F 3+
8338 C. albicans f 1+
12680 C. albicans F 1+
633 C. guiliermondii f 1+
772 C. guiliermondii F 3+
13477 C. parapsilosis f 2+
5551 C. parapsilosis F 1+
13531 C. parapsilosis f 1+
269 C. tropicalis f 3+
F: Forte aderência, f: fraca aderência; 1+: fraca formação, 2+ e 3+: moderada formação.
A B
Figura1. Células de leveduras do gênero Candida sp.

aderidas às células do epitélio bucal. A) Fraca
aderência; B) Forte aderência.
Nossos resultados apontaram forte e fraca capacidade de adesão às células

epiteliais (Figura 1). Nenhum dos isolados de Candida avaliados apresentou
incapacidade de aderir-se às células epiteliais. Todos os isolados mostraram capacidade
de formação de biofilme; porém, de moderado a fraco (Figura 2). Uma cepa de C.
399
albicans (12199) e uma de C. guiliermondii (772) foram destaques com maiores
capacidades de adesão e formação de biofilme, ou seja, maior grau de virulência.
2+ 3+
1+
Figura 2. Placa de micro diluição demonstrando a intensidade da

formação de biofilme pelos isolados de Candida sp. obtidas de
amostras de sangue de pacientes com candidemia. 1+ (fraco); 2+ e 3+
(moderado)
Discussão
Durante as duas últimas décadas, tem ocorrido mudança no perfil
epidemiológico das espécies de Candida isoladas em UTI. Recentemente, uma
proporção crescente de episódios de candidemia tem sido causada por espécies de
Candida não albicans, dado este que reflete em uma mudança epidemiológica
importante (Chow et al., 2008). Contudo, C. albicans continua a ser a espécie
predominante na maioria dos países (Calandra e Marchetti, 2002) isolada em infecções
invasivas de diferentes sítios anatômicos (Leroy et al., 2009), estando também, esse
dado, verificado em nossa pesquisa.
Com base no diagnóstico clínico, este é inespecífico sendo a febre o sinal mais
comum, o que torna o diagnóstico de candidemia um desafio (Couto et al., 2011).
Frequentes estudos tem demonstrado importância em se investigar fatores de
virulência de agentes patogênicos, sobretudo as leveduras do gênero Candida
responsáveis por candidemia, para estabelecer estratégias de prevenção, controle e
tratamento eficaz. Resultados obtidos por Tamura et al. (2007), também inferiram alto
poder de aderência para isolados de C. albicans, conforme nossos resultados. Segundo
os autores é consenso que a maior parte das candidemias seja precedida pelo evento de
colonização do próprio paciente pela mesma espécie de levedura responsável pela
infecção.
Biofilmes de Candida são difíceis de erradicar, especialmente devido a sua alta
resistência a alguns antifúngicos. Consequentemente, investigações sobre a
400
patogenicidade de Candida têm sido foco na prevenção e gestão de desenvolvimento de
biofilme, sua arquitetura, e resistência (Seneviratne et al., 2008). Kuhn et al. (2002), ao
comparar os biofilmes formados por diferentes espécies de Candida, observaram que C.
albicans produziu biofilmes mais fortes que as espécies de Candida não albicans.
Contudo, conforme nossos achados, outros autores relatam que isolados de Candida
oriundos de sangue apresentam, normalmente, biofilmes mais fracos.
Neste estudo foi observado que duas cepas se destacaram quanto a capacidade
de melhor aderir-se e formar biofilme. Estes isolados podem possuir uma melhor
capacidade de infecção assim como, possuir maior barreira e resistência às terapias
antifúngicas devido a estes fatores. Podemos ainda salientar que todos os isolados
capazes de realizar adesão às células epiteliais também apresentaram capacidade de
formar biofilmes, podendo estas condições estarem correlacionadas, contudo, outros
estudos precisam ser realizados para consolidar estas afirmações.
Conclusões
Espécies de C. albicans continuam a ser predominantes para casos de
candidemia, contudo espécies não albicans, como C. parapsilosis tem também
predominado.
Fatores de virulência como aderência a células epiteliais e formação de biofilme
são de suma importância para avaliar o poder patogênico do agente no curso da infecção
e conduzir a uma terapêutica melhor direcionada.
Agradecimentos
Os autores agradecem à CAPES, FACEPE, PROPESQ/UFPE pelo fomento
necessário à realização das etapas inerentes a esta pesquisa.
Referências
Barnett JÁ, Payne RW, Yarrow D (2000) Yeasts: characteristics and identification.
Third edition.
Calandra T, Marchetti, O (2002) Antifungal prophylaxis for intensive care unit patients:
let's fine tune it. Intens Care Medic. 28.12.
401
Chow JK, Golan Y, Ruthazer R, Karchmer AW, Carmeli Y, Lichtenberg D (2008)
Factors associated with candidemia caused by non Candida albicans species versus
Candida albicans in the intensive care unit. Clin. Infect. Dis. 46:1206-1213.
Couto FMM, Macedo DPC, Neves RP (2011) Fungemia in a university hospital: an

epidemiological approach. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 44 (6):745-748.
Garnacho-Montero J, Díaz-Martín A, Márquez-Vácaro JA (2012) Management of

Invasive Candidiasis in the Critically III. Annual Update in Intensive Care and
Emergency Medicine. 324-336.
Kuhn DM, George T, Chandra J, Mukherjee PK, Ghannoum MA (2002) Antifungal

susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin B lipid formulations
and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46(6), 1773-1780.
Lacaz, C. S., et al. 2002. Tratado de Micologia Médica, 9 ed., São Paulo, Sarvier.
Leroy O, Gangneux JP, Montravers P, Mira JP, Gouin F, Sollet JP, Lortholary O (2009)
Epidemiology management and risk factors for death of invasive Candida infections in
critical care: a multicenter prospective observational study in France (2005-2006). Crit
Care Med. 37:1612-1618.
Monteiro DU, de Brum TF, Bolson C, de Oliveira, LTO, de La Rue ML (2011)

Prevalência de Candida e Cryptococcus em hemoculturas oriundas de pacientes do
Hospital Universitário de Santa Maria, RS (HUSM) no ano de 2006. R Saúde (Santa
Maria) Vol. 37, n. 2.
Seneviratne CJ, Jin L, Samaranayake LP (2008) Biofilm lifestyle of Candida: a mini

review. Oral Dis. 14(7):582–590.
Tamura NK, Negri MFN, Bonassoli LA, Svidzinski, TIE (2007) Virulence factors for
Candida spp recovered from intravascular catheters and hospital workers’ hands. Rev
Soc Bras Med Trop. 40(1):91-93.
Ye XR, Hu BJ, Gao XD, Ma J, Zhou Q, Zhou ZY, Zhou CM (2013) Analysis of clinical
characteristics and risk factors associated with prognosis of patients with candidemia.
Zhonghua. Oct. 93(40):3193-6.
402
Fatores de risco para o desenvolvimento de fungemia em pacientes de

Unidade de Terapia Intensiva em hospital terciário de Manaus
Cunha G.S.1, Pimenta L.A.1, Oliveira A.D.1, Pio C.H.S.2, Andrade S.L.1.
1
Universidade do Estado do Amazonas (ESA/UEA), 2Fundação Hospital Adriano Jorge (FHAJ)
Emails: [email protected], [email protected],
Introdução
Fungemia é a infecção da corrente sanguínea por fungos (Arendrup et al., 2011).
É um tipo de sepse, principal causa de óbito em pacientes internados em Unidade de
Terapia Intensiva (UTI) (Chen et al., 2013). Os mesmos são submetidos a múltiplas
condições de risco, como exposição a procedimentos invasivos (Colombo e Guimarães
2003), além da morbidade intrínseca à doença de base.
Outros fatores de risco para a fungemia na população em geral são
frequentemente observados em pacientes de UTI, como a imunossupressão, o uso de
cateter venoso central, nutrição parenteral total, hemodiálise, ventilação mecânica e
múltiplas transfusões de sangue ou hemoderivados ( Garey et al. 2006).
A incidência de fungemia entre o fim do século XIX e início do século XX
apresentou aumento de 207% (Giri e Kindo 2012), tornando-se a quarta causa mais
comum de infecções em corrente sanguínea, com índice de mortalidade situado entre 40
e 60%. No Brasil, a incidência é de 2,49 casos para cada 1000 admissões em hospital,
média maior que a obtida nos EUA (0,5 casos para cada 1000 admissões) (Arendrup et
al. 2011).
Há maior acometimento de homens (56%), com idade média de 51 anos entre os
adultos, sendo 32% dos pacientes crianças, das quais 21% são menores de um ano
(Chen et al., 2013). O gênero Candida é o responsável por 80% dos casos de fungemia
(Colombo e Guimarães 2003), com índice de mortalidade podendo chegar a 85.9% em
pacientes de UTI (Chen et al., 2013). Essa elevada taxa de mortalidade é correlacionada
principalmente com a terapia antifúngica tardia (Sardi et al. 2013). Dentre as espécies
mais comuns, C. albicans (40,9%) é a mais prevalente (Montagna et al. 2014).
403
Material e métodos
No presente estudo foram analisados os dados clínicos obtidos a partir da
avaliação de prontuários eletrônicos do sistema iDoctor de 50 pacientes internados na
Unidade de Terapia Intensiva da Fundação Hospital Adriano Jorge (FHAJ). No período
de cinco meses, compreendido entre março e julho de 2014, foram selecionados
somente aqueles pacientes que possuíam diagnóstico ou suspeita clínica de septicemia,
independente de seu tempo de internação hospitalar, e para os quais havia sido
solicitada a realização de uma hemocultura pelos médicos responsáveis pelos casos.
Os resultados das culturas foram acompanhados através dos laudos liberados
pelo laboratório de análises clínicas da instituição, posteriormente adicionados aos
prontuários pelos profissionais locais. No laboratório era realizada a rotina própria do
hospital de isolamento em meio ágar-sangue.
Todos os pacientes incluídos na pesquisa assinaram o Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE), concordando em participar do estudo e sendo informados
sobre o que seria coletado de informações pessoais, tendo garantido seu sigilo.
Foram analisados alguns dos dados relevantes para o desenvolvimento de
fungemia, como sexo; raça; faixa etária; doenças de base; utilização de medicações
prévias, como corticoide, antibióticos e antifúngicos, além de outros medicamentos com
efeito imunossupressor; realização de cirurgias e utilização de materiais de
procedimento invasivos, como cateteres, sondas, nutrição parenteral e ventilação
mecânica.
No presente estudo foram analisados os dados clínicos de 50 pacientes

hospitalizados em UTI da FHAJ, no período de março a julho do ano de 2014. Dentre
eles, 56% eram homens e a faixa etária encontrada se estendeu dos 27 aos 79 anos, com
idade média de 55 anos. Quanto à raça, 10% consideravam-se brancos, 80% pardos, 4%
negros e 6% declararam-se indígenas.
As doenças de base encontradas e que foram causa de internação em UTI eram:
Lúpus eritematoso sistêmico - LES (15 casos), hepatite crônica (11 casos), perfuração
intestinal (um caso), insuficiência cardíaca descompensada - ICC (um caso), pneumonia
404
aspirativa (três casos), câncer (19 casos), dos quais sete eram hepáticos, nove gástricos,
um de vesícula biliar e dois de próstata.
Observou-se ainda presença Diabetes Mellitus tipo 2 - DM2 - em 14 dos
pacientes estudados, nunca de forma isolada como causa da internação, mas sempre
concomitante à condição de base do paciente. Destes, cinco eram portadores de LES,
seis de hepatite crônica, um de ICC, um de câncer hepático e um de câncer de próstata.
Quanto ao uso cateter venoso central, 30% dos pacientes o utilizaram e, 100%,
acesso venoso periférico. Aproximadamente 40% utilizaram sonda vesical e 48%, sonda
nasogástrica. 42% utilizaram corticoides (CEs) e 88%, antibióticos. Há registro de
apenas quatro pacientes em uso de antifúngico: um deles utilizou Fluconazol, devido a
um exame de escarro que evidenciou esporos e leveduras. Os demais usaram Miconazol
em creme para micoses superficiais.
Todos os dados obtidos foram compatíveis com a literatura, que aponta idade
média de 51 anos ( Chen et al. 2013, Giri e Kindo 2012), próxima da encontrada nesta
pesquisa, de 55 anos. Estudos como o de Montagna et al. (2014), mostram maior
incidência no sexo masculino (56%), corroborando nossos achados (Figura 1).
Figura 1. Faixa etária da população com fungemia
Condições imunossupressoras encontradas em nossos pacientes foram DM2

(28%), hepatite crônica (22%), uso de CEs (42%) e doenças malignas (38%). Essas
formas de imunodepressão são fatores de risco significativos para fungemia, pois o
controle da infecção fúngica depende da imunidade celular, principalmente neutrófilica
405
(Chen et al. 2013, Garey et al. 2006). A cirurgia abdominal é também relevante fator de
risco, principalmente se complicada ou repetida (Arendrup et al. 2011, Ye et al. 2013).
Isso foi observado no único caso de perfuração intestinal que apresentou deiscência de
suturas e precisou de reoperação de urgência, sendo estes procedimentos feitos em
tecidos altamente contaminados (Figura 2).
Figura 2. Doenças com base no sexo das pessoas.
Dentre as fontes de infecção exógenas mais comuns estão CVC. O estudo de

Sardi et al. (2013) considera até 78% dos CVC contaminados por biofilme, o que é
relevante ao se considerar que, na américa latina, C. parapsilosis é a espécie não-
albicans mais comum, e mais correlacionada com a formação de biofilme (Marra et al.
2011). A presença de sonda vesical é fator de risco independente para candidemia,
segundo Ye, et al. (2013), sendo utilizadas por 48% dos pacientes estudados.
Antibioticoterapia foi instituída em 88% dos pacientes, e um dos mecanismos
patogênicos das candidíases secundárias ao uso de antibióticos é a proliferação
excessiva de leveduras quando bactérias são eliminadas. Ocorre agressão tecidual por
endotoxinas fúngicas, além de efeito químico do antibiótico, o qual pode ainda leva a
menor produção de globulinas que possuem potencial candidicida, como no uso de
tetraciclinas (Colombo e Guimarães 2003). Infecções fúngicas superficiais foram
observadas em três dos pacientes estudados. Vale ressaltar que a colonização prévia por
Candida é considerada um fator de risco independente para a disseminação por via
hematogênica (Colombo e Guimarães 2003, Marra et al. 2011) (Figura3).
406
Figura 3. Procedimentos invasivos
Conclusão
Confirmamos a presença de fatores de risco bem descritos e discutidos pela

literatura mundial, considerados predisponentes para o desenvolvimento de fungemia
em pacientes de UTI. Desse modo, reafirmamos a necessidade de considerar a hipótese
de fungemia precocemente, nos pacientes expostos às condições pesquisadas.
Referências
ajustar as referências
Não colocar apenas o nome do primeiro autor. Citar todos
Arendrup et al. (2011). Diagnostic Issues, Clinical Characteristics, and Outcomes for
Patients with Fungemia. J Clin Microbiol volume número e páginas?
407
Chen et al. Clinical significance of time to positivity for yeast in candidemia. J of
Microbiol, Im and Infec 2013 volume número e páginas?
COLOMBO, A. L. e GUIMARAES, T. Epidemiologia das infecções hematogênicas
porCandida spp. Rev Soc Bras Med Trop 2003 volume número e páginas?
GAREY, et al. Time to initiation of fluconazole therapy impacts mortality in patients
with candidemia: a multi-institutional study. Clin Infect Dis 2006 volume número e
páginas?
GIRI, S. and KINDO, A.J. A review of Candida species causing blood stream infection.
Ind J of Med Microbiol 2012 volume número e páginas?
MARRA, et al. Brazilian SCOPE Study Group. Nosocomial bloodstream infections in
Brazilian hospitals: analysis of 2,563 cases from a prospective nationwide surveillance
study. J Clin Microbiol 2011 volume número e páginas?
MONTAGNA, et al. Candidemia in intensive care unit: a nationwide prospective
observational survey (GISIA-3 study) and review of the European literature from 2000
through 2013. Eur Rev for Med and Pharmac Sciences 2014
8PINHAT, et al. Fungal colonization in newborn babies of very low birth weight: a
cohort study. J Pediatr. 2012 volume número e páginas?
SARDI, et al. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation,
natural antifungal products and new therapeutic options. J Med Microbiol 2013 volume
número e páginas?
TOWNSEND, et al. SABISTON: Tratado de cirurgia: a base biológica da prática
cirúrgica moderna. 18. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2010. 2 v.
YE, et al. Analysis of clinical characteristics and risk factors associated with prognosis
of patients with candidemia. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2013 volume número e páginas?
Agradecimentos
Agradecemos à agência de fomento FAPEAM (Fundação de Amparo à Pesquisa no
Amazonas).
408
Avaliação das formulações contendo extrato metanólico de Libidibia

ferrea contra infecção causada por Leishmania (Leishmania)
amazonensis
Jensen B.B.1, Comandolli-Wyrepkowski C.D.1,3, Santos P.A.2, Barros A.M.C.1, Soares
F.V.1,3, Pinheiro F.G.1, Domingos P.R.C.1,3, Naiff M.F.1, Franco A.M.R.1
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; 2 Universidade Federal de Goiás;
3
Universidade Federal do Amazonas. Email: [email protected]
Resumo
A Leishmaniose Tegumentar é uma doença infecto-parasitária, mas não contagiosa de

transmissão vetorial, cujo vetor é o Flebotomíneo fêmea que inocula no hospedeiro o
parasita do gênero Leishmania que posteriormente desenvolverá diferentes formas
clínicas de acordo com cada espécie do parasita. O tratamento terapêutico para esta
doença apresentam diferentes problemáticas inerentes da eficácia à via de
administração. O uso de produtos naturais torna-se uma grande alternativa para o
tratamento desta doença, com intuito de extrair um princípio ativo que tenha ação
antileishmania. Uma dessas plantas é a Libidibia ferrea que em trabalhos anteriores
demonstrou atividade leishmanicida contra diferentes espécies de Leishmania in vitro.
Portanto, surge à necessidade da avaliação biológica de sua atividade perante um ensaio
in vivo.
Palavras-chaves: Leishmania amazonensis, Mesocricetus auratus, tratamento tópico,

Libidibia ferrea, atividade antileishmania
Introdução
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença de caráter

zoonótico que acomete o homem e diversas espécies de animais silvestres e domésticos,
podendo apresentar diferentes formas clínicas dependendo da espécie de Leishmania
envolvida e da relação do parasito com seu hospedeiro (Gontijo et al., 2003). A
Leishmaniose Tegumentar (LT) constitui um problema de saúde pública em 98 países,
409
distribuídos nos cinco continentes (África, América, Ásia, Europa e Oceania), com
registro anual de 1 a 1,5 milhões de casos (Alvar, 2012; Brasil, 2010).
Os fármacos utilizados como terapêutica para o tratamento da LT apresenta uma

série de problemas, incluindo resistência do parasito, indução de efeitos colaterais e
abandono dos pacientes por serem medicamentos de administração parenteral (Silva-
López, 2010). A necessidade de tratamentos com maior eficácia e segurança vem
estimulando pesquisas com produtos naturais de plantas com atividade antileishmania,
levando em consideração que os vegetais possuem uma diversidade química de
metabólitos secundários estruturalmente únicos.
Trabalhos anteriores mostraram inibição do crescimento in vitro de Leishmania

(Viannia) guyanensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis (Cortez, 2004; Falcão,
2010). Desta forma, o presente estudo teve por objetivo avaliar em modelo in vivo,
utilizando hamsters (Mesocricetus auratus), a atividade de formulações tópicas
contendo o extrato metanólico de Libidibia ferrea, uma planta nativa da região
Amazônica, no tratamento da forma cutânea da Leishmaniose, a partir dos aspectos da
evolução clínica e o volume da lesão resultante da infecção desses animais
experimentais com Leishmania amazonensis após o tratamento tópico.
Material e Métodos
Animais experimentais - O modelo biológico para o estudo foram 30 hamsters

(Mesocricetus auratus) adultos (acima de 90 dias), machos. Os animais foram
provenientes do Biotério Central do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia-
INPA, e o procedimento para o tratamento dos animais infectados ocorreu nas
dependências do próprio Biotério. O projeto foi aprovado por Comitê de Ética no Uso
de Animais - CEUA/INPA, sob o número 009/2012.
Procedimentos para o tratamento tópico - Foram inoculados 106 cel/mL do

parasito L. amazonensis (MHO/BR/2006/IM5584) no focinho de cada animal para o
desenvolvimento da lesão cutânea. Após a inoculação, os animais foram separados e
agrupados em gaiolas identificadas. Os grupos foram separados para receber os
tratamentos: formulação com extrato MeOH de L. ferrea (EMX 1), formulação placebo
(EMX 2), formulação com extrato de L. ferrea e Glucantime® (EMX 3), tratamento
410
com aplicações parenterais com Glucantime® (controle positivo) e grupo sem
tratamento (controle negativo). As formulações foram aplicadas uma vez ao dia, 50
mg/aplicação/animal, na área e proximidades da lesão. A área total das lesões foi aferida
diariamente com um paquímetro e o aspecto morfológico foi fotodocumentado.
Após a eutanásia dos animais com Euthanyle®, as lesões foram seccionadas no

eixo longitudinal e desinfetadas. Foram transferidos segmentos de tecido para tubos
com meio de cultura NNN (Nicolle, 1908; Novy, McNeal, 1904) e segmento para
impressão em lâmina. Os tubos de cultura com meio NNN foram incubados em estufa a
25ºC durante 7 dias para observação da presença/ausência de parasitas viáveis. As
lâminas foram coradas pelo método de Giemsa, e quantificadas em microscopia óptica
(1000X) quanto aos valores médios de amastigotas extracelulares e interiorizados em
macrófagos.
Estatística - As médias dos volumes das lesões foram analisados por ANOVA e
teste Tukey, a partir do programa GraphPadPrism versão 6. Foram considerados
significativos os valores com p < 0,05.
Formulações - As formulações foram preparadas segundo metodologia

confidencial, acordo Internacional entre o INPA e a Universidade de Helsinki, pelo
programa VAIKUTUS – FP7 – PEOPLE – IRSES – 295262.
Após 30 dias da inoculação dos animais de experimentação, os hamsters

apresentaram lesão característica de leishmaniose na forma cutânea na região do
focinho, mostrando um aumento no volume da região.
Habitualmente são utilizados camundongos ou hamsters jovens e pré-púberes em

ensaios biológicos in vivo para a Leishmaniose, pois estes são mais suscetíveis a
infecção (Lima, 2008). Quanto a inoculação, esta pode ser realizada em diferentes
partes do corpo como, na base da cauda por via intradérmica (Rodrigues, 2012), no
coxim plantar (Eissa et al., 2011) ou até mesmo no focinho, local definido para os
experimentos do presente projeto.
411
Segundo Suman e Nichi (2011), através dos modelos animais é possível analisar
a atividade de drogas em relação à absorção, distribuição, metabolismo e excreção e
para dar uma indicação inicial da toxicidade, embora nenhum reproduza com precisão o
que acontece nos humanos.
Após os vinte e cinco dias de tratamento foi possível avaliar o aspecto
(macroscópico) clínico das lesões dos hamsters de todos os grupos, e determinar uma
comparação entre eles. Todos os animais apresentaram lesão de forma nodular bem
desenvolvida, diferentemente das lesões de animais que são infectados com o parasita
Leishmania braziliensis, com lesões de aspecto nodulares pequenos e pouco aparentes,
compatíveis para início do tratamento (Lainson, 2010).
O grupo EMX 1 durante e após o tratamento desenvolveram uma crosta na área
da lesão e não foi observada uma redução da lesão como se esperava. Os animais do
grupo EMX 2 durante e após o tratamento desenvolveram na lesão uma úlcera de
tamanho relativamente pequeno. Os animais dos grupos EMX 3 e Controle positivo
durante e após o tratamento apresentaram lesões nodulares, mas não obteve-se uma
redução considerável das lesões nos animais, já que o medicamento utilizado no grupo
controle é o mesmo preconizado pelo Ministério da Saúde para o tratamento para
Leishmaniose (Brasil, 2010). Acredita-se que por conta da suscetibilidade dos animais
de experimentação a desenvolver a doença, a concentração do Glucantime® utilizada
foi insuficiente, já que outros trabalhos demonstraram a necessidade de pelo menos 100
mg para a cura dos animais de experimentação (Lima, 2008; Rodrigues, 2012). Os
animais do grupo controle negativo durante e após o tratamento, as lesões se agravaram
e apresentaram características ulcerosas e com infecções secundárias (Figura 1).
Os fragmentos das lesões provenientes dos animais dos grupos que foram
semeados em meio NNN para verificação de parasitos viáveis com grau de
infectividade, todos os tubos apresentaram parasitas na forma promastigotas, com
morfologias fusiformes e viáveis, no entanto somente nos grupos EMX 2, CON+ e
CON- foram observadas rosetas nos cultivos após sete de dias de incubação.
412
Figura 1 - Evolução clínica (observação macroscópica) das lesões em focinho de
Mesocricetus auratus infectados com Leishmania (Leishmania) amazonensis em
diferentes fases do estudo de tratamento tópico. EMX1, EMX2 e EMX3 formulações
utilizadas em sigilo científico; CON+ = tratamento com Glucantime®; CON- = grupo
com ausência de tratamento.
A aferição diária dos volumes dos focinhos, registradas no decorrer do

tratamento dos animais permitiu calcular as médias dos volumes das lesões e
consequente avaliação da significância estatística. Pode-se observar que a partir do 13º
dia o grupo CON+ demonstrou significância estatística. O grupo EMX 3 apresentou
significância estatística a partir do 17º dia. O grupo EMX 2 apresentou significância
estatística a partir do 19º dia. O grupo EMX 1 apresentou significância estatística a
partir do 20º dia, segundo o teste Anova e Tukey com parâmetro de p<0,05 referente ao
grupo CON- (Figura 2).
413
Figura 2 - Evolução clínica do volume da lesão em Mesocricetus auratus infectados
com Leishmania (Leishmania) amazonensis durante o tratamento com as formulações
tópicas e Glucantime®.
Conclusões
Após a análise dos resultados obtidos na avaliação das formulações, pode-se

concluir que houve diferença no aspecto clínico entre os grupos tratados com
formulações tópicas em relação ao controle, onde o grupo EMX1 apresentou um
desempenho semelhante ao grupo com Glucantime, no entanto, a análise parasitológica
demostrou a presença de parasitas viáveis em todos os animais. Estes fatores
demostraram a necessidade da continuidade dos estudos com ajustes de concentrações
nas formulações tópicas contendo princípios ativos do estrato de L. ferrea e um maior
tempo de experimentação, além da inclusão de outros parâmetros farmacológicos a
serem estudados.
Referências
Alvar J, Vélez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, Jannin J, DenBoer M (2012)
WHO Leishmaniasis Control Team. Leishmaniasis World wide and global estimates of
its incidence. PLoSOne, 7: 35671.
414
Brasil (2010) Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana.
Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde. 2. ed. Brasília : Editora do
Ministério da Saúde.
Cortez AC (2004) Avaliação da atividade in vitro dos extratos fitoquímicos de Libidibia

ferrea Martius e Senna reticulata (Willd.) Irwin & Barneby (Fabales – Libidibiaceae)
para Leishmania spp. e Trichophyton spp. Manaus, Brasil, 86p. (Dissertação de
Mestrado em Patologia Tropical, Universidade Federal do Amazonas. UFAM).
Eissa MM, AMER EI, EL SAWY SMF (2011) Leishmania major: Activity of
tamoxifen against experimental cutaneous leishmaniasis. Experimental Parasitology,
128: 382-390.
Falcão NMS (2010) Avaliação da atividade biológica de extratos vegetais contra

Leishmania (Viannia) guyanensis (Kinetoplastida: Trypanosomatideae) e análise de
frações semi-purificadas de Libidibia ferrea Martius (Fabales: Libidibiaceae). Manaus,
Brasil, 83p. (Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde, Universidade Federal da
Amazonas. UFAM).
Gontijo B, Carvalho MLR (2003) Leishmaniose Tegumentar Americana. Revista da

Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 36: 71-80.
Lainson R (2010) The Neotropical Leishmania species: a brief historical review of their
Discovery, ecology and taxonomy. Revista Pan-Amaz Saude, 1(2): 13-32.
Lima LFA (2008) A Influência do Gênero e da Infecção materna na resposta à

Leishmania braziliensis em filhotes de hamster. Fortaleza, Brasil, 52p. (Dissertação de
Mestrado em Patologia, Universidade Federal do Ceará. UFC).
Nicolle GL (1908) Culture du parasite du Bouton d'Orient. C.R. Acad. Sci. 146: 842-
843.
Novy FG, MacNeal WJ, (1904) On the cultivation of Trypanosoma brucei. J. Infect.
Dis. 1: 1-30.
Rodrigues LF (2012) Avaliação da atividade in vivo do antimoniato de meglumina e de

sua associação com o tratamento tópico sobre Leishmania (Viannia) braziliensis
415
isoladas de pacientes portadores de leishmaniose cutânea. Minas Gerais, Brasil, 91p.
(Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde, Fundação Oswaldo Cruz).
Silva-López RE (2010) Proteases de Leishmania: novos alvos para o desenvolvimento

racional de fármacos. Química Nova 33: 1541-1543.
Suman G, Nishi (2011) Visceral leishmaniasis: Experimental models for drug

Discovery. Indian J Med. Res. 133: 27-39.
416
Aspergilose pulmonar em pacientes de tuberculose pulmonar com

baciloscopia negativa. Manaus, Amazonas
Matsuda J.S.1,2,5, Wanke B.3, Assumpção I.A.6, Balieiro A.A.S.2, Santos C.S.S.2,
Cavalcante R.C.S.4, Muniz M.M.3, Torres D.R.6, Martinez-Espinosa F.E.1,2, Souza
J.V.B.6.
1
- Pós-Graduação em Medicina Tropical - Universidade do Estado do Amazonas / Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas; 2- Instituto Leônidas e
Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Manaus, Amazonas; 3- Fundação
Oswaldo Cruz (FIOCRUZ/INI), Rio de Janeiro, Brasil;
4
-Fundação de Vigilância em Saúde do Estado do Amazonas, Manaus, Amazonas; 5- Policlínica
Cardoso Fontes-Secretaria Estadual de Saúde (SUSAM), Amazonas, Brasil;
6
- Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas.
E-mail: [email protected]
Resumo
A aspergilose é a mais frequente das manifestações pulmonares das micoses, o agente
causal são espécies patogênicas do gênero Aspergillus. Considerada doença oportunista,
dependendo da integridade pulmonar e da árvore tráqueo-brônquica e do estado
imunológico do hospedeiro. O Aspergillus ssp. pode comportar-se como agente
sensibilizante, colonizador ou invasor. O objetivo desta pesquisa foi descrever os casos
de aspergilose pulmonar diagnosticados na Policlínica Cardoso Fontes do Estado do
Amazonas-Brasil, e analisar seus aspectos clínicos, laboratoriais e desfecho. Foi
realizado um estudo observacional descritivo de dezembro de 2012 a novembro de
2014. Em pacientes suspeitos de tuberculose pulmonar com exame de baciloscopia
direta do escarro negativo, investigando aspergilose pulmonar. O material coletado por
escarro induzido foi submetido ao exame de microscopia direta, cultivo para fungos.
Adicionalmente, foi coletado soro para imunodiagnóstico de Aspergillus fumigatus.
Trinta e seis pacientes foram diagnosticados com aspergilose pulmonar, sendo 20 (56%)
do sexo masculino, a idade média foi de 48,6 anos. Todos pacientes tiveram tratamento
prévio para tuberculose pulmonar. Os sintomas mais comuns foram tosse (100%, n =
36) e hemoptise (80%, n = 29), 22 (61%) apresentaram aspergiloma simples, enquanto
os restantes 14 (39%) pacientes apresentaram aspergilose pulmonar cavitária crônica.
Quatorze (39%) dos pacientes referiram tabagismo, que apresentou uma associação
(p>0,01) com os pacientes que apresentaram forma mais grave. A presente pesquisa
reforça a criação de um protocolo de acompanhamento clínico e laboratorial, em
parceria com o programa de controle da tuberculose, com o objetivo de identificar a
aspergilose pulmonar crônica precocemente.
Palavras-chave: Aspergilose pulmonar crônica, Aspergiloma pulmonar, Bola fúngica,

TB negativa
417
Introdução
Micoses endêmicas têm emergido como um problema de saúde pública, mas

todas elas têm sido negligenciadas e deveriam ser prioritárias para pesquisa na América
Latina (1).
As manifestações pulmonares das micoses se apresentam com um amplo espectro de
manifestações clínicas, desde infecção subclínica, tosse autolimitada até formas graves e
letais (2).
A aspergilose é a mais frequente das manifestações pulmonares das micoses,
representando um grupo diverso de infecções que em comum tem como agente causal
espécies patogênicas termo tolerantes do gênero Aspergillus. Historicamente,
Aspergillus fumigatus é o agente mais comum das várias formas de manifestações da
aspergilose pulmonar, porém, atualmente observa-se um aumento progressivo de
aspergilose causada por outras espécies, como A. flavus, A. Níger, A. terreus, entre outras
(3). Considerada doença oportunista, dependendo da integridade pulmonar e da árvore
tráqueo-brônquica e do estado imunológico do hospedeiro, espécies de Aspergillus podem
comportar-se como agente: 1-sensibilizante, 2-colonizador ou 3-invasor, causando,
respectivamente, os quadros clínicos de 1-aspergiloses alérgicas como a Aspergilose
Bronco Pulmonar Alérgica (ABPA). 2.1-um simples aspergiloma ou aspergilose pulmonar
intracavitária crônica, 2.2-fibrose pulmonar crônica por aspergilose ou 2.3-nódulo
aspergilar (4), atingindo pessoas com lesões sequelares após uma outra doença pulmonar
como a tuberculose, sarcoidose, pneumotórax etc. 3-Aspergilose invasiva, muitas vezes
fatal, atinge pacientes gravemente imunocomprometidos, como em pessoas com
neoplasias hematológicas (5).
Aspergillus spp. são fungos de distribuição universal na natureza, cuja porta de entrada
é a via aérea, causando infecção humana após o contato direto com o meio ambiente
com microfocos de agentes de micoses, cujos propágulos em suspenção aérea são
inalados podendo atingir hospedeiros suscetíveis (6).
Em Boletim de 2012, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou a carga mundial
da aspergilose pulmonar crônica em pacientes com sequela de tuberculose pulmonar
(TB), especialmente em casos com cavitação pulmonar. Assim, para 7,7 milhões de
casos de tuberculose pulmonar no mundo, foram estimados 372.000 de aspergilose
pulmonar crônica, no período de um ano (7).
418
No Brasil, dos 70.789 casos novos de TB em 2011, a estimativa anual foi de 5.663
casos de aspergilose pulmonar crônica, com a taxa de 9,6 por 100.000 habitantes, com
carga global substancialmente importante que requer uma investigação mais
aprofundada nos países com alta carga de tuberculose. Os casos de aspergilose
pulmonar crônica poderiam ser responsáveis por alguns tratamentos errôneos, como
tuberculose pulmonar com baciloscopia negativa, o que torna necessária e urgente uma
melhor investigação para diagnosticar esta micose oportunista (8).
O objetivo deste estudo foi descrever os casos de aspergilose pulmonar diagnosticados
na Policlínica Cardoso Fontes, referência Estadual em Pneumologia Sanitária no Estado
do Amazonas-Brasil e analisar seus aspectos clínicos, laboratoriais e desfecho.
Material e métodos
Declaração de ética
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética pesquisa da Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) (aprovação no 2081 em
16/12/2011). O consentimento informado foi obtido sistematicamente, todos os
participantes do estudo assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido de
forma voluntária, após ser dada a todas as informações suficientes e necessárias. Todos
os pacientes tiveram seus dados analisados anonimamente.
Foi realizado um estudo observacional descritivo de dezembro de 2012 a
novembro de 2014.
O local do estudo foi na Policlínica Cardoso Fontes, na cidade de Manaus/AM,
que é Referência Estadual em Pneumologia Sanitária, referenciada principalmente pelo
Sistema Único de Saúde (SUS), da rede Básica de Saúde, para tratamento e/ou
esclarecimento diagnóstico de pneumopatias agudas ou crônicas. Anualmente são
atendidos, em média, 8.000 pacientes nos ambulatórios da Policlínica. Este centro de
referência é responsável por 60% dos diagnósticos dos casos novos de tuberculose (TB)
em Manaus. Em 2014 a Policlínica notificou 300 casos novos de tuberculose pulmonar
com baciloscopia negativa (SINAN-AM, acesso em 15/02/2015).
Em pacientes suspeitos de tuberculose pulmonar com exame de baciloscopia
direta do escarro negativo, foi investigado aspergilose pulmonar. Os prontuários de
todos os pacientes foram revisados para coletar as características do paciente. O
material coletado por escarro induzido foi submetido ao exame de microscopia direta e
419
cultivo para fungos. Adicionalmente, foi coletado soro para imunodiagnóstico de
Aspergillus fumigatus, anti-HIV e realizada tomografia computadorizada do tórax.
O exame microscópico direto para pesquisa de fungos foi realizado na amostra
do escarro ao microscópio, entre a lâmina e a lamínula, com KOH a 10% e Tinta
Nanquim (9).
Os meios de cultivo utilizados foi Sabouraud-ágar 2% com cloranfenicol e
actidiona, NSA (Niger Seed Agar), BHI (infusão de cérebro e coração), de 4 a 6 tubos
de cada amostra, em temperatura de 25ºC a 37ºC, por um período de 4 a 6 semanas.
Realizamos sorologia por Imunodifusão Dupla em Gel de Agar (IDD) seguindo o
protocolo descrito por Ouchterlony, 1962 (10). Esta prova se baseia na detecção de
anticorpos específicos contra os agentes fúngicos especificados, com formação de
imunocomplexos que, devido ao seu alto peso molecular, precipitam formando uma
linha visível. Os antígenos utilizados foram antígenos filtrados de cultura de Aspergillus
fumigatus, produzidos "in house" a partir da cepa JJG - seguindo o protocolo descrito
por Coleman e Kaufman em 1972 (11).
A análise descritiva foi expressa como média ± desvio padrão ou percentual,
enquanto que a análise estatística foi realizada utilizando o qui-quadrado ou Fisher, o
nível de significância foi de 5%.
Caso de Aspergilose pulmonar crônica (APC): Paciente com manifestações clínicas
(sintomáticos respiratórios, com ou sem hemoptise), e radiológicas compatíveis, e
exame sorológico positivo (12).
Resultados
De um total de 400 pacientes atendidos, 36 (9%) foram diagnosticados com

aspergilose pulmonar na Policlínica Cardoso Fontes no período de dois anos, sendo 20
(56%) do sexo masculino, a idade média foi de 48,6 anos (variação de 16-80 anos).
Todos tiveram história de tratamento prévio para tuberculose pulmonar.
Os sintomas mais comuns apresentando entre os 36 pacientes foram tosse
(100%, n = 36) e hemoptise (80%, n = 29). Entre os 36 pacientes, 22 (61%)
apresentaram aspergiloma simples ou bola fúngica (Grupo 1), enquanto os demais 14
(39%) apresentaram aspergilose pulmonar cavitária crônica (APCC) ou complexa,
420
Grupo 2 (Tabela 1). O tabagismo apresentou uma associação (p=0,01) com a forma
mais grave, aspergilose complexa (Tabela 1).
Tabela 1 Características dos pacientes com Aspergilose Pulmonar Crônica

diagnosticados na Policlínica Cardoso Fontes - Manaus/AM 2012-2014
GRUPO 1 GRUPO 2 P VALUE
(N=22, 61%) (N=14, 39%) X2, Fisher
Aspergiloma Aspergilose <0,05
Simples Complexa
Idade 47,3 (16-80) 50,6 (19-77) *
Gênero
Masculino 12 8 0,5
Raça/Cor
Branca 11 5 0,3
Tabagismo 5 9 0,01
Hemoptise 16 13 0,1
HIV** 1 1 *
Sorologia Positiva
Aspergillus fumigatus 10 13 0,004
Bola Fúngica 21 9 0,02
Lesão Pulmonar
Bilateral 4 12 >0,01
*Não atende ao pressuposto do teste. **HIV= Vírus da imunodeficiência humana.
Dos 36 pacientes da presente pesquisa, 02 (6%) apresentaram o exame anti-HIV

reativo (Tabela 1). A sorologia por IDD resultou positiva em 23 (64%) dos pacientes,
mais frequente (p=0,004) nos casos com APCC. Dezesseis (44%) pacientes
apresentaram lesão pulmonar bilateral, geralmente em associação (p>0,01) com a
APCC, forma mais grave (Tabela 1).
421
30
25 (24/67%)
20
15
10
(5/14%)
5 (4/11%)
(3/8%)
0
CURA EM TTO ÓBITO ABANDONO
Gráfico 1- Desfecho dos casos de aspergilose pulmonar da Policlínica Cardoso Fontes

Manaus/AM 2012-2014
Todos os pacientes iniciaram tratamento com Itraconazol 400mg/dia (13), sendo

que três pacientes, posteriormente, fizeram a ressecção cirúrgica do aspergiloma, os
demais pacientes não tinham indicação de tratamento cirúrgico ou se recusaram a
realizar cirurgia.
Houve cura em quatro pacientes, três após ressecção cirurgia da bola fúngica
pulmonar e apresentaram negativação da sorologia por IDD, e um paciente após 1 ano
de tratamento clínico. Dos cinco óbitos, um teve co-morbidade com neoplasia de
estômago (Gráfico 1), os outros casos foram a óbito por problemas respiratórios graves
e/ou hemoptise, como foi o caso de uma paciente com 19 anos, do gênero feminino, que
realizou seu primeiro tratamento para TB com 14 anos, e posteriormente mais 3
tratamentos para TB, com diagnóstico de aspergilose pulmonar tardiamente a
tomografia computadorizada do tórax revelou lesão bilateral com cavitação contendo
material com densidade em partes moles (bola fúngica) (Figura 1), não apresentou
outras co-morbidades, como diabetes ou HIV, foi à óbito.
422
Figura 1- Aspergilose pulmonar cavitária crônica: corte tomográfico do pulmão revela
lesão bilateral com cavitação contendo material com densidade em partes moles, bola
fúngica (setas), com ar ao seu redor, formando o sinal do crescente aéreo. Paciente com
19 anos, 4 tratamentos anteriores para TB, óbito.
Discussão
Descrevemos 36 casos de aspergilose pulmonar diagnosticados em pacientes de
tuberculose pulmonar com baciloscopia negativa na Policlínica Cardoso Fontes em
Manaus/AM, no período de dois anos.
A aspergilose pulmonar, independentemente de uma associação com TB, ainda
permanece negligenciada na Amazônia brasileira. Em regiões com alta prevalência de
tuberculose, como o Estado do Amazonas, os casos de aspergilose pulmonar podem
passar despercebidos porque as manifestações pulmonares frequentemente assemelham-
se clínica e radiologicamente à tuberculose pulmonar crônica (14) .
As formas crônicas de aspergilose pulmonar são pouco reconhecidas nos países
em desenvolvimento, não só por causa da presença dominante da tuberculose, mas
também devido à falta de consciência médica e à escassez de recursos laboratoriais para
o seu diagnóstico de rotina. No Estado no Amazonas, a incidência de tuberculose em
2013 foi de 70,6 casos por 100.000 habitantes (SINAN), a maior do Brasil. A partir
destes dados estima-se a ocorrência 192 novos casos de aspergilose por ano no estado
do Amazonas. Infelizmente, a maioria destes pacientes é negligenciada ou são tratados
repetida e empiricamente como TB (7).
423
Em todo o mundo ocorrem anualmente cerca de 9,6 milhões de casos novos e
1,5 milhões de mortes por TB. O tabagismo é um fator de risco independente causando
cerca de um duplo aumento não só na tuberculose ativa, mas também na TB
multirresistente (15, 16). No presente estudo, tabagismo apresentou uma associação de
risco aumentado para (p=0,01) a forma APCC, forma mais grave da aspergilose
pulmonar.
Os diagnósticos por imagem, em especial a radiologia, desempenham um papel
importante no reconhecimento, tratamento e acompanhamento de enfermidades
pulmonares (14). No presente estudo a presença de lesão cavitária bilateral estava
associada aos casos de APCC (aspergilose complexa). Parau et al. (2011) observaram
que, a forma cavitária crônica é encontrada em 55% dos casos de aspergilose e Luo et
al. (2011) demonstraram que imagens de condensação na radiografia do tórax são
encontradas em 76,5% desses pacientes. Imagens de condensação precedem cavitação e
podem ser utilizadas como informação para diagnóstico precoce das infecções fúngicas
pulmonares (17, 18).
A IDD é um teste simples e de fácil execução, de elevada sensibilidade e
especificidade (de 80 a 95%) (19). Porém, o resultado é apenas qualitativo, indicando a
necessidade de investigar mais acuradamente o agente quando a reação for positiva (9,
20). Outra limitação é que este teste é espécie-especifico e indicativo apenas para
Aspergillus fumigatus e atualmente observa-se um aumento progressivo de aspergilose
causada por outras espécies, como A. flavus, A. Níger, A. terreus, entre outras (3).
Importante ressaltar que o teste da IDD mostrou-se muito útil no acompanhamento do
tratamento, negativando em alguns meses após a cura, como foi observado no presente
estudo, tornando-a exame de escolha para esta finalidade (19).
Conclusões / Recomendações
Os resultados obtidos nesta pesquisa reforçam a necessidade de criação e
implementação de um protocolo de acompanhamento clínico e laboratorial, em parceria
com o programa de controle da tuberculose, com o objetivo de identificar a aspergilose
pulmonar crônica precocemente, principalmente nos pacientes de tuberculose pulmonar
prévia, com baciloscopia do escarro negativa, imagem cavitária residual, lesão
pulmonar bilateral, e/ou hemoptise.
424
Sugerimos que todos estes pacientes suspeitos se submetam a investigação
continua, com exames micológicos de secreções respiratórias e a realização de sorologia
IDD para detecção de anticorpos anti-Aspergillus fumigatus.
Agradecimentos
Estudo apresentado como parte da tese de doutorado de JSM do Programa de Pós-
Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas / Fundação
de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.
Gostaríamos de agradecer a todos os funcionários da Policlínica Cardoso
Fontes/AM/Brasil, pela colaboração e assistência na realização deste estudo.
Financiamento: Este trabalho foi apoiado por “Innovative approaches for tuberculosis
control in Brazil”, number 1 U2R TW006883-09, Program ICOHRTA AIDS/TB,
sponsored by Fogarty International Center/National Institutes of Health, USA.
FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas, Edital •
CHAMADA N.001/2013 – PPSUS, Nº Processo: 062.00649/2014. Os financiadores
não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de
publicar ou preparação do manuscrito.
Referências
Tirar números e citar as referências no texto do trabalho
1. Dujardin JC, Herrera S, do Rosario V, Arevalo J, Boelaert M, Carrasco HJ, et al. Research
priorities for neglected infectious diseases in Latin America and the Caribbean region. PLoS
Negl Trop Dis. 2010;4(10):e780.
2. Smith JA, Kauffman CA. Pulmonary fungal infections. Respirology. 2012;17(6):913-26.

3. Zanjani LS, Bakhtiari A, Sabokbar A, Khosravi AR, Bahonar A, Memarnejadian A.
Sensibilisation of asthmatic patients to extracted antigens from strains of Aspergillus
fumigatus, Aspergillus flavus and Aspergillus niger. J Mycol Med. 2012;22(1):58-63.
4. Jhun BW, Jeon K, Eom JS, Lee JH, Suh GY, Kwon OJ, et al. Clinical characteristics and
treatment outcomes of chronic pulmonary aspergillosis. Med Mycol. 2013;51(8):811-7.
5. Desoubeaux G, Bailly E, Chandenier J. Diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis:
Updates and recommendations. Med Mal Infect. 2014.
6. Volz PA. Transmission of fungal spores in space and their conditions for survival: a
review. Microbios. 1997;91(368-369):145-51.
7. Denning DW, Pleuvry A, Cole DC. Global burden of chronic pulmonary aspergillosis as a
sequel to pulmonary tuberculosis. Bulletin of the World Health Organization. 2012;89(12):864-
72.
8. Denning DW, Pleuvry A, Cole DC. Global burden of chronic pulmonary aspergillosis as a
sequel to pulmonary tuberculosis. Bull World Health Organ. 2011;89(12):864-72.
9. Xavier MO, Oliveira Fde M, Severo LC. Chapter 1: laboratory diagnosis of pulmonary
mycoses. J Bras Pneumol. 2009;35(9):907-19.
425
10. Ouchterlony O. Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. II. Prog Allergy.
1962;6:30-154.
11. Coleman RM, Kaufman L. Use of the immunodiffusion test in the serodiagnosis of
aspergillosis. Appl Microbiol. 1972;23(2):301-8.
12. Barnes PD, Marr KA. Aspergillosis: spectrum of disease, diagnosis, and treatment.
Infect Dis Clin North Am. 2006;20(3):545-61, vi.
13. Maturu VN, Agarwal R. Itraconazole in chronic pulmonary aspergillosis: In whom, for
how long, and at what dose? Lung India : official organ of Indian Chest Society. 2015;32(4):309-
14. Ginzburg MA, Krut'ko VS, Rozhkova ER. [X-ray diagnosis of aspergillosis and its
differential diagnosis from pulmonary tuberculosis]. Vestnik rentgenologii i radiologii.
1973;48(1):38-42.
15. Loddenkemper R, Bronnecke M, Castell S, Diel R. [Tuberculosis and Tobacco Smoking].
Pneumologie. 2016;70(1):17-22.
16. Marahatta SB, Adhikari B, Mishra SR, Raut S, Ramasoota P, Malla P, et al. Association of
Previous Smoking Habit and Perceived Social Discrimination with the Risk of Multi-Drug
Resistant Tuberculosis in Central Nepal. Journal of Nepal Health Research Council.
2015;13(29):95-101.
17. Parau A, Homorodean D, Jodal A, Cristina D. [Respiratory features of Aspergillus
infection in eight years of pulmonology practice]. Pneumologia. 2011;59(4):204-7, 9-10.
18. Luo BL, Zhang LM, Hu CP, Xiong Z. Clinical analysis of 68 patients with pulmonary
mycosis in China. Multidiscip Respir Med. 2011;6(5):278-83.
19. de Azevedo PZ, Sylvestre TF, Cavalcante Rde S, de Carvalho LR, Moris DV, de Oliveira
ML, et al. Evaluation of the Double Agar Gel Immunodiffusion Test and of the Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay in the Diagnosis and Follow-Up of Patients with Chronic Pulmonary
Aspergillosis. PLoS One. 2015;10(8):e0134841.
20. Limper AH. The changing spectrum of fungal infections in pulmonary and critical care
practice: clinical approach to diagnosis. Proc Am Thorac Soc. 2010;7(3):163-8.
426
Diversidade Microbiana da Amazônia 2015. Editora INPA
Perfil de citocinas TH1 e TH2 em pacientes com Leishmania (Viannia) guyanensis

no Norte do Brasil
Melo E.D.1, Espir T.T.1,2, Guerreiro T.S.B.2, Figureira L.2, Naiff M.2, Costa A.G.1, Malheiro A.1,
Franco A.M.R.2
1
Universidade Federal do Amazonas; 2 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Email:
[email protected]
Resumo
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecto-parasitária causada por

protozoários do gênero Leishmania. O principal mecanismo de defesa do hospedeiro humano contra esta
infecção é seu sistema imune e a resposta mediada por células que exerce papel fundamental por ser o
microrganismo um agente intracelular obrigatório. O sistema imune atua numa rede de cooperação
envolvendo a participação de muitos componentes estruturais, moleculares e celulares. O IFN-γ é uma
citocina essencial no perfil da resposta TH1 devido a sua capacidade de aumentar o efeito microbicida
dos fagócitos que levam a morte do parasita. A IL-10 é uma citocina que possui como uma de suas
principais funções inibir as células de perfil TH1, já a IL-4 induz a diferenciação das células para um
perfil TH2, direcionando assim para uma resposta imune humoral. Na infecção por Leishmania as
citocinas desempenham importante papel na resolução e controle da doença, assim IFN-γ, IL-4 e IL-10
foram quantificados no soro de 15 indivíduos infectados por Leishmania (Viannia) guyanensis antes e
após o tratamento com antimonial pentavalente (Glucantime®) e este mesmo número amostral de
indivíduos (1:1) não infectados utilizando análise por citometria de fluxo (Kit CBA (BD) - ”Cytometric
Beads Array”). Os resultados demonstram maior produção das citocinas em indivíduos infectados
(p<0,0001) tanto antes quanto após o tratamento, revelando a presença de resposta TH1 e TH2 na
infecção por L. (V.) guyanensis. Ao comparar os níveis séricos das citocinas na infecção por L. (V.)
guyanensis com o de outras espécies de Leishmania observa-se importante variação, o que sugere uma
possível relação entre a espécie do agente etiológico e os mediadores da resposta imune.
Palavras Chaves: Leishmaniose Tegumentar Americana; Leishmania (Viannia) guyanensis; resposta

imune; citocinas.
427
Introdução
A leishmaniose corresponde a um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero

Leishmania que pertencem à ordem Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae (Gontijo e
Carvalho, 2003; Brasil, 2007). O parasita é transmitido ao hospedeiro mamífero quando as fêmeas
hematófagas de insetos conhecidos popularmente como flebotomíneos realizam seu repasto
sanguíneo (Ryan et al., 1987). Nas Américas, o gênero de flebotomíneos de maior importância é
Lutzomyia, o qual possui aproximadamente 30 espécies com comprovada capacidade de transmitir
Leishmania spp. (Arias e Naiff, 1981; Lainson e Shaw, 1998).
Estima-se que 350 milhões de pessoas estejam expostas ao risco de infecção no mundo e que
ocorram cerca de 2 milhões de novos casos de leishmaniose por ano, sendo 200 a 400 mil
leishmaniose visceral e 700 mil a 1,2 milhões leishmaniose tegumentar americana (LTA). Desses 2
milhões de casos estimados, apenas cerca de 600 mil são notificados (Alvar et al., 2012). Segundo o
Ministério da Saúde (Brasil, 2014), no ano de 2012 foram notificados 25.647 casos de LTA no
Brasil e 2.394 no estado do Amazonas.
As doenças pertencentes a esse grupo são consideradas crônicas e possuem apresentação

bastante heterogênea, variando desde lesões de pele com evolução autolimitada até a forma visceral
fatal (Murray et al., 2005).
No Brasil existem sete espécies de Leishmania causadoras de LTA e destas, quatro são
encontradas no estado do Amazonas: L. (Viannia) guyanensis, L. (V.) naiffi, L. (V.) braziliensis e L.
(Leishmania) amazonensis (Brasil, 2007; Teixeira et al., 2013). A LTA possui quatro principais
formas de apresentação clínica: forma cutânea localizada, cutânea disseminada ou cutaneomucosa,
mucosa e difusa, as quais possuem características morfológicas, resposta imune do hospedeiro e
agente etiológico variáveis para cada expressão (Veronesi e Focaccia, 2009).
O período de incubação da doença varia de uma a quatro semanas e inicia com o surgimento
de pápula eritematosa, única ou múltipla, no local de inoculação. As lesões evoluem formando
úlceras com bordos altos, irregulares e infiltrados, com fundo granuloso de coloração vermelho-
vivo, coberta ou não por exsudato seroso ou sero-purulento. Posteriormente, elas podem cicatrizar
espontaneamente ou dar origem a placas vegetantes verrucosas. Segundo Sampaio e Rivitti (2001),
a maioria dos casos de lesões mucosas é secundária a lesões cutâneas por disseminação
hematogênica, tendo como principais sítios as cavidades nasais, faringe, laringe e cavidade oral.
Há três principais fatores que interferem na apresentação dessas lesões: características do

protozoário, do vetor e do hospedeiro. Quanto ao protozoário, sabe-se que a espécie L. (V.)
guyanensis, a de maior incidência no estado do Amazonas, possui alta capacidade de disseminação
428
linfática resultando em lesões cutâneas múltiplas (Azulay, 2008; Veronesi e Focaccia, 2009).
Quanto ao vetor, a saliva representa importante papel na transmissão devido às suas características
de vasodilatação, anti-agregação plaquetária, anti-hemostasia, imunossupressão, exacerbação da
infecção e indução de infecciosidade de Leishmania para o hospedeiro vertebrado (Kamhawi, 2000;
Soares e Turco, 2003; Oliveira, 2008). E quanto ao hospedeiro, o estado do seu sistema imune e o
perfil predominante de resposta são cruciais para o estabelecimento, permanência e resolução da
lesão.
No primeiro momento da infecção formas promastigotas de Leishmania são inoculadas no

hospedeiro, onde serão submetidas a mecanismos de defesa não específicos da resposta imune
natural. Alguns promastigotas possuem a capacidade de evadir tal defesa, possibilitando sua ligação
e entrada em fagócitos, como macrófagos e neutrófilos, mediadas por receptores, onde rapidamente
se transformam em sua forma amastigota (Brittingham, 1996; Teixeira, 2013). Os macrófagos
secretam então citocinas como TNF-α e IL-1, recrutando linfócitos TH1. Estes ativados aumentam a
secreção de citocinas e quimiocinas que atraem leucócitos para a área.
O sistema imune atua numa rede de cooperação, envolvendo a participação de muitos

componentes estruturais, moleculares e celulares. A geração de uma resposta imune adequada
durante o processo infeccioso é o ponto crucial para direcionar a progressão ou cura da doença
(Carvalho et al., 2012).
De acordo com dados da literatura, a imunidade celular representada pelo perfil TH1 seria a
resposta mais eficaz contra Leishmania, uma vez que este é um parasita intracelular obrigatório
(Reis et al., 2006; Owens et al., 2012; Schwarz et al.,2013). O IFN-γ é uma citocina essencial neste
perfil devido a sua capacidade de aumentar o efeito microbicida dos fagócitos que levam a morte do
parasita (Abbas et al., 2008). Entretanto, uma resposta exacerbada com liberação muito elevada de
produtos microbicidas pelos macrófagos seria capaz de lesar o tecido normal. A IL-10 (interleucina-
10) é uma citocina que possui como uma de suas principais funções inibir as células do perfil TH1.
Já a IL-4 induz a diferenciação das células para um perfil TH2, direcionando assim para uma
resposta imune humoral, que é ineficaz para a eliminação de patógenos intracelulares, como no caso
das formas da LTA (Schwarz et al., 2013).
Na infecção por Leishmania as citocinas desempenham importante papel na resolução e

controle da doença (Carvalho et al., 2012), por isso é de suma importância averiguar o nível sérico
destas no curso clínico antes e após o tratamento com o antimonial pentavalente, medicamento de
primeira escolha determinado pelo Ministério da Saúde (Brasil, 2007).
429
Material e Métodos
O estudo foi realizado no laboratório de Leishmaniose e Doença de Chagas do Instituto

Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) com parceria da Fundação de Hematologia e
Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM), submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do INPA sob número 006/2010.
Foi realizado levantamento de dados clínico-epidemiológicos de 15 pacientes atendidos no

município de Rio Preto da Eva/AM no período de 2010 a 2011 e que obtiveram diagnóstico
positivo de LTA na forma cutânea causada por L. (V.) guyanensis. Foi utilizado o soro dos 15
pacientes antes (AT) e após (PT) tratamento com antimonial pentavalente e de 15 indivíduos não
infectados (controle negativo = CN) para determinar os níveis séricos das citocinas IFN- γ, IL-4 e
IL-10. Todos os indivíduos aceitaram participar da Pesquisa assinando Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE). Foram considerados como critérios de inclusão: pacientes acima de 18
anos, com LTA forma cutânea e infectados por L. (V.) guyanensis; e de exclusão: sorologia positiva
para HIV e Doença de Chagas.
Para identificação da espécie de Leishmania foi utilizada previamente a técnica de

eletroforese de isoenzimas em gel de agarose conforme protocolo descrito por Cupolillo et al.
(1994), utilizando oito sistemas enzimáticos: Malato Desidrogenase (MDH, E.C.1.1.1.37),
Isocitrato Desidrogenase (IDH, E.C.1.1.1.42) com substrato NAD e NADP, Enzima Málica (ME,
E.C.1.1.1.40), Glicose-6-fosfato Desidrogenase (G6PDH, E.C.1.1.1.49), 6-Fosfogluconato
Desidrogenase (6PGDH, E.C.1.1.1.44), Aconitato Hidratase (ACON, E.C.4.2.1.3) e Hexoquinase
(HK, E.C.2.7.1.1). A identificação das espécies foi obtida através da comparação dos perfis
isoenzimáticos das amostras com cepas de L. (V.) braziliensis (MHOM⁄BR⁄1975⁄M2903), L. (V.)
guyanensis (MHOM⁄BR⁄1975⁄M4147), L. (V.) naiffi (MDAS⁄BR⁄1979⁄M5533) e L. (L.) amazonensis
(IFLA/BR/1967/PH8).
Para dosagem das citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-10 foi utilizada a técnica de citometria de fluxo
CBA (“Cytometric Bead Array”) com o “Kit BDTM Human TH1/TH2 Cytokine” (Cat. N° 560484,
Lot.: 29132, marca BD® Biosciences, San Diego, CA, USA) seguindo as orientações descritas pelo
fabricante. Para a aquisição das amostras foi utilizado o Citômetro de Fluxo FACSCanto II (Becton,
Dickinson and Company, San Jose, CA, USA) do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD) -
Fiocruz Amazônia. Para o cálculo das concentrações em pg/mL e Intensidade Média de
Fluorescência (MFI) da citocina foi utilizado o software FCAP-ArrayTM (v3.0.1).
A análise estatística foi realizada utilizando o software Graphpad Prism® 6. Quando foram
comparadas duas variáveis utilizou-se o teste de Mann-Whitney, e quando três o teste de Kruskal-
Wallis.
430
Os dados clínico-epidemiológicos dos 15 pacientes do estudo estão relacionados na tabela 1.

Do total de pacientes, nove eram do sexo masculino (60%) e seis do sexo feminino (40%), a média
de idade foi 30 anos (18 a 58 anos), número de lesões 1,7 (um a oito), tempo de evolução das lesões
54 dias (10 a 150 dias) e tamanho das lesões 25 mm (10x08 a 60x60 mm).
Tabela 1. Dados clínico-epidemiológicos dos 15 pacientes procedentes do município de Rio Preto

da Eva/AM com diagnóstico de Leishmaniose Tegumentar Americana na forma cutânea causada
por Leishmania (Viannia) guyanensis nos anos de 2010 e 2011.
Idade Tempo de Número Tamanho da
Código da Amostra Sexo Ocupação
(anos) Infecção (dias) de Lesões Lesão (mm)
MHOM/BR/10/IM5637 F 31 Bióloga 60 1 17x18
MHOM/BR/10/IM5653 M 18 Estudante 90 1 30x20
MHOM/BR/10/IM5690 F 58 Agricultora 60 1 17x18
MHOM/BR/10/IM5692 F 30 Auxiliar administrativo 15 2 60x60
MHOM/BR/10/IM5694 M 29 Caseiro 14 1 20x23
MHOM/BR/11/IM5697 M 19 Estudante 14 1 13x16
MHOM/BR/11/IM5749 M 38 NR 30 1 17x14
MHOM/BR/11/IM5772 M 26 Agricultor, caseiro 120 1 10x08
MHOM/BR/11/IM5773 M 30 Agricultor 10 1 32x21
MHOM/BR/11/IM5775 M 24 Piscicultor 21 4 08x50
MHOM/BR/11/IM5828 F 43 Agricultora 150 1 11x08
MHOM/BR/11/IM5869 M 24 Agricultor, caseiro 60 8 60x60
MHOM/BR/11/IM5874 F 23 Dona de casa 120 1 80x14
MHOM/BR/11/IM5875 M 49 Policial militar 30 1 11x07
MHOM/BR/11/IM5976 F 18 Dona de casa 21 1 17x13
Legenda: Isolados: M mamífero, HOM Homo sapiens, BR país de origem (Brasil)/ano de isolamento/código original
utilizado pelo INPA; Sexo: M masculino, F feminino, NR não relatado. Pacientes que apresentaram mais de uma lesão
foi incluído o valor da lesão de maior tamanho (baseado em Naiff et al., 2009).
Os hábitos dos pacientes foram classificados em dois grupos: (i) atividades na floresta:
biólogo, agricultor, caseiro, piscicultor, policial militar e estudantes que auxiliam na agricultura; (ii)
atividades sem relação com floresta: auxiliar administrativo e dona de casa. As ocupações referentes
ao primeiro grupo corresponderam a 79% dos casos, reafirmando a associação de hábitos em locais
de mata fechada e alto risco de adquirir a infecção (Alvar et al., 2012).
Os níveis de IFN-γ, IL-4 e IL-10 no soro dos 15 pacientes antes (AT) e após (PT) tratamento
foram mais elevados quando comparados ao CN (tabela 2). As diferenças foram estatisticamente
431
significativas, com p<0,0001 em todas as análises (figura 1). Ao comparar AT e PT, não se observa
uma grande variação nos níveis séricos das citocinas, mostrando que estas estão presentes nos
períodos aqui estudados.
Tabela 2. Níveis séricos das citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-10 antes (AT) e após (PT) tratamento com
antimonial pentavalente dos 15 pacientes procedentes do município de Rio Preto da Eva/AM com
diagnóstico de Leishmaniose Tegumentar Americana na forma cutânea causada por Leishmania
(Viannia) guyanensis nos anos de 2010 e 2011.
IFN-γ / TH1 IL-4 / TH2 IL-10
Código da Amostra
AT PT AT PT AT PT
MHOM/BR/10/IM5637 77,22 70,07 181,61 170,17 101,53 101,53
MHOM/BR/10/IM5653 80,08 72,93 164,45 208,78 101,53 110,11
MHOM/BR/10/IM5690 82,94 80,08 195,91 204,49 77,22 87,23
MHOM/BR/10/IM5692 100,1 85,80 193,05 177,32 94,38 90,09
MHOM/BR/10/IM5694 72,93 92,95 193,05 183,04 90,09 75,79
MHOM/BR/11/IM5697 87,23 71,50 187,33 195,91 95,81 87,23
MHOM/BR/11/IM5749 117,26 67,21 185,90 197,34 112,97 95,81
MHOM/BR/11/IM5772 82,94 94,38 205,92 198,77 134,42 132,99
MHOM/BR/11/IM5773 85,8 84,37 187,33 188,76 95,81 97,24
MHOM/BR/11/IM5775 78,65 68,64 195,91 188,76 104,39 95,81
MHOM/BR/11/IM5828 68,64 65,78 187,33 180,18 101,53 82,94
MHOM/BR/11/IM5869 87,23 70,07 204,49 185,90 101,53 102,96
MHOM/BR/11/IM5874 82,94 82,94 185,90 184,47 91,52 88,66
MHOM/BR/11/IM5875 77,22 92,95 210,21 218,79 87,23 111,54
MHOM/BR/11/IM5976 64,35 82,94 175,89 184,47 82,94 92,95
Legenda: Isolados: M mamífero, HOM Homo sapiens, BR país de origem (Brasil)/ano de isolamento/código original
utilizado pelo INPA. Níveis quantificados em pg/mL.
Estudos vêm demonstrando que IFN-γ possui um importante papel na leishmaniose (Reis et
al., 2006; Carvalho, 2012). Kima e Soong (2013) afirmam a importância desta citocina no
desenvolvimento e subsequente controle da infecção por Leishmania. Matta et al. (2009)
demonstraram aumento da produção de IFN-γ em pacientes com L. (V.) guyanensis quando
comparados com o controle negativo, entretanto inferior àqueles com infecção por L. (V.)
braziliensis. Estes autores sugerem uma provável correlação entre os níveis séricos de IFN-γ e as
diferentes manifestações clínicas e resposta ao tratamento.
432
IF N -
IFN -γ IL-4
IL -4
150
240
220
100
p g /m L
200
p g /m L
180
50
160
0 140
CN AT PT CN AT PT
IL-10
IL - 1 0
150
100
p g /m L
50
0
CN AT PT
Figura 1. Níveis séricos das citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-10 em 15 indivíduos sem infecção (CN) e
pacientes procedentes do município de Rio Preto da Eva/AM (1:1), com diagnóstico de
Leishmaniose Tegumentar Americana na forma cutânea causada por Leishmania (Viannia)
guyanensis nos anos de 2010 e 2011 antes (AT) e após (PT) tratamento com antimonial
pentavalente.
O papel da IL-10 como reguladora de linfócitos TH1 vem sendo confirmado na literatura
(Owens et al., 2012; Schwarz et al., 2013). Diversas células podem secretar esta citocina, dentre
elas TH2, T regulatórias (Treg) e TH1. Schwarz et al. (2013) demonstraram recentemente que ao
inibir a secreção de IL-10 por linfócitos T em camundongos BALB/c susceptíveis, estes se tornaram
resistentes à infecção por Leishmania, demonstrando assim, a ação desta citocina no curso da
infecção. Espir et al. (2014) analisaram os níveis séricos de IL-10 em pacientes infectados por
diferentes espécies de Leishmania, evidenciando níveis mais elevados na infecção por L. (V.)
guyanensis em relação a L. (L.) amazonensis, sugerindo um perfil de resposta misto TH1/TH2
durante a infecção por L. (V.) guyanensis.
Em camundongos infectados por L. (L.) major, Kopf et al. (1996) demonstraram correlação
entre IL-4 e a susceptibilidade a infecção. Recentemente, Hurdayal e Brombacher (2014) sugeriram
que esta citocina, dependendo da forma clínica da doença e do modelo de estudo experimental,
pode atuar como mediador de resposta imune TH1, promovendo resistência à infecção. O presente
433
estudo demonstra a persistência de níveis de IL-4 superiores ao CN após a resolução clínica das
lesões (PT).
Conclusões
A associação das atividades florestais com os casos da doença reforça a necessidade de

esclarecimento a respeito da doença para a população sobre o risco de infecção ao adentrar os locais de
floresta e mata fechada. É de suma importância implementar a medicina preventiva na população
estudada, uma vez que a LTA é considerada como um agravo à saúde pública.
Os resultados do presente estudo demonstram que os níveis séricos das citocinas IFN-γ, IL-4 e
IL-10 assim como o quadro clínico dos pacientes infectados por L. (V.) guyanensis diferem do que se
tem na literatura sobre outras espécies de Leishmania, sugerindo uma possível relação entre a espécie do
agente etiológico, os mediadores da resposta imune e as características clínicas das lesões. Conclui-se
que na LTA causada por L. (V.) guyanensis há presença de perfil TH1 e TH2 antes e após o tratamento
com antimonial pentavalente (Glucantime®).
*Endereço para correspondência: Dra. Antonia Maria Ramos Franco, Coordenação de

Sociedade, Ambiente e Saúde. – CSAS, INPA, Av. André Araújo, 2.936, CEP 69060-001, Manaus,
AM, Brasil. [email protected].
Referências
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S (2008) Imunologia celular e molecular. Elsevier, Rio de Janeiro.
Alvar J, Vélez ID, Bern C, Herrero M, Desjeux P, Cano J, Jannin J, Boer M (2012) Leishmaniasis
Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLoS 7(5):e35671.
Arias JR, Naiff RD (1981) The principal reservoir host of cutaneous leishmaniasis in the urban
areas of Manaus, Central Amazon of Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 76: 279-286.
Azulay RD, Azulay DR, Azulay-Abulafia L (2008) Dermatologia. Guanabara Koogan, Rio de
Janeiro.
Brasil. Ministério da Saúde. Departamento de Informática do SUS (2014) Available at:

http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/index.php. Accessed 02 Aug 2014.
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde (2007) Manual de Vigilância da

Leishmaniose Tegumentar Americana. Ministério da Saúde, Brasília.
434
Brittingham A, Mosser DM (1996) Exploitation of the complement system by Leishmania
promastigotes. Parasitol Today 12: 44-47.
Carvalho LP, Passos S, Schriefer A, Carvalho EM (2012) Protective and pathologic immune
responses in human tegumentar leishmaniasis. Front Immunol 3(301): 1-9.
Cupolillo E, Grimaldi Jr G, Momen H (1994) A general classification of New World Leishmania

using numerical zymotaxonomy. Am J Trop Med Hyg 50: 296-311.
Espir TT, Figueira LP, Naiff MF, da Costa AG, Ramalho-Ortigão M, Malheiro A, Franco AMR
(2014) The Role of Inflammatory, Anti-Inflammatory, and Regulatory Cytokines in Patients
Infected with Cutaneous Leishmaniasis in Amazonas State, Brazil. J Immunol Res 2014: 1-10.
Gontijo B, Carvalho MLR (2003) Leishmaniose Tegumentar Americana. Rev Soc Bras Med Trop
36(1): 71-80.
Hurdayal R,Brombacher F (2014) The role of IL-4 and IL-13 in cutaneous Leishmaniasis. Immunol
Lett 161(2):179-183.
Kamhawi S, Belkaid Y, Modi G, Rowton E, Sacks D (2000) Protection against cutaneous

leishmaniasis resulting from bites of uninfected sand flies. Science, 290: 1351-1354.
Kima PE, Soong L (2013) Interferon gama in Leishmaniasis. Front Immunol 4: 1-5.
Kopf M, Brombacher F, Kohler G, Kienzle G, Widmann KH, Lefrang K, Humborg C, Ledermann

B, Solbach W (1996) Il-4-deficient Balb/c mice resist infection with Leishmania major. J Exp Med
184(3): 1127-1136.
Lainson R, Shaw JJ (1998) New World leishmaniasis the neotropical Leishmania species. In: A
Ballows, M Sussman (eds.). Microbiology and microbial infections, L Topley and Wilson's Collier,
London, USA, 241-266.
Matta NE, Nogueira RS, Franco AMR, Souza IS, Mattos MS, Oliveira-Neto MP, Coutinho SG,
Leon LL, Da-Cruz AM (2009) Leishmania (Viannia) guyanensis Induces Low Immunologic
Responsiveness in Leishmaniasis Patients from an Endemic Area of the Brazilian Amazon
Highland. Am J Trop Med Hyg 80(3): 339-344.
Murray HW, Flanders KC, Donaldson DD, Sypek JP, Gotwals PJ, Liu J, Ma X (2005)
Antagonizing Deactivating Cytokines to Enhance Host Defense and Chemotherapy in Experimental
Visceral Leishmaniasis. Infect Immun 73(7): 3903-3911.
435
Oliveira F, Lawyer PG, Kamhawi S, Valenzuela JG (2008) Immunity to distinct sand fly salivary
proteins primes the anti-Leishmania immune response towards protection or exacerbation of
disease. PLoS Negl Trop Dis 16: 226.
Owens BMJ, Beattie L, Moore JWJ, Brown N, Mann JL, Dalton JE, Maroof A, Kaye PM (2012)
IL-10-producing Th1 cells and diasease progression are regulated by distinct CD11c+ cell
population during Visceral Leishmaniasis. PLoS Pathog 8(7): 1-13.
Reis LC, Brito MEF, Souza MA, Pereira VRA (2006) Mecanismos imunológicos na resposta
celular e humoral na Leishmaniose Tegumentar Americana. Rev Patol Trop 35(2): 103-115.
Ryan L, Lainson R, Shaw JJ (1987) Leishmaniasis in Brazil XXIV. Natural flagellate infections of
sandfly (Diptera: Psychodidae) in Pará State, with particular reference to the role of
Psychodopyguswellcomei as the vector of Leishmania (Leishmania) brasiliensis in the Serra dos
Carajás. Trans R Soc Trop Med Hyg 81: 353-359.
Sampaio SAP, Rivitti EA (2001) Dermatologia. Artes Médicas, São Paulo.
Schwarz T, Remer KA, Nahrendorf W, Masic A, Siewe L, Muller W, Roers A, Moll H (2013) T
cell-derived IL-10 determines leishmaniasis disease outcome and is suppressed by a dendritic cell
based vaccine. PLoS Pathog 9(6): 1-11.
Soares RP, Turco SJ (2003) Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae): a

review. An Acad Bras Ciênc 75: 301-330.
Teixeira DE, Benchimol M, Rodrigues JCF, Crepaldi PH, Pimenta PFP, Souza W (2013) Atlas
didático: ciclo de vida da Leishmania. Fundação CECIERJ, Consórcio CEDERJ, Rio de Janeiro.
Veronesi R, Focaccia R (2009) Tratado de infectologia. Atheneu, São Paulo.
436

Document 46328 1

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Document 46328 1

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Document 46328 1

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Diversidade

MINISTRO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, INOVAÇÕES E COMUNICAÇÕES

DIRETOR DO INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

D618 Diversidade microbiana da Amazônia /Editor L. A. Oliveira... [et.al.].--

1. Microbiologia - Amazônia. 2. Diversidade. I. Oliveira, L. A..

Editora do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

O CDMicro - Congresso sobre Diversidade Microbiana da Amazônia – vem se consolidando ao

Couceiro D.M., Jesus M.A. Macrofungos Agaricomycetes (Basidiomycota) não poróides da

Demosthenes L.C.R., Bentes J.L.S. Respostas enzimáticas de defesa à murcha bacteriana.........82 - 87

Moraes J.C.F.B., Rolim L.N., Sales-Campos C. Avaliação produtiva de cogumelos comestíveis

Oliveira D.A.S., Jesus M.A. Identificação e conservação de culturas Penicillium de interesse

Oliveira F.R.; Oliveira L.A. Micro-organismos de solos amazônicos com habilidade em

Brelaz E.C.D.O., Teixeira N.S., Galúcio V.C.A., Nunes A.S., Sales-Campos C.

Ação antibacteriana de ervas aromáticas

Fazio M.L.S1., Sartori N.1, Geromel M.R.1

Muitas vezes oriundos de regiões banhadas pelos oceanos Índico e Pacífico,

Empregou-se o método de difusão em gel de ágar. Foram utilizados extratos

Os resultados obtidos em 48 horas (Tabela 1) demonstraram que a ação

Busatta C. et al (2008) Application of Origanum majorana L. essential oil as an

Chauhan MK et al (2009) Chemical composition of essential oils in Mentha spicata L.

Ernandes FMPG, Garcia-Cruz CH (2008) Atividade Antimicrobiana de Extrato de

Nascimento GGF et al. (2000). Antibacterial activity of plant extracts and

Tyagi AK, Malik A (2011) Antimicrobial potential and chemical composition of

Tabela 2 - Determinação da atividade antibacteriana de extratos aquosos de hortelã e

Ervas aromáticas / (Mentha spicata L.) (Origanum majorana L.)

10-1 10-2 10-3 10-4 10-1 10-2 10-3 10-4

Após 48 horas os resultados se mantiveram.

Qualidade Microbiológica de Sucos de Frutas Naturais

FazioM.L.S.1, Costa A.F.1, Almeida V.S.1, Geromel M.R.1

Palavras-chave: qualidade microbiológica, suco in natura

Na vida atribulada que vivemos atualmente os hábitos alimentares da sociedade

Determinação do NMP de coliformes termotolerantes

Após este período, procedeu-se à identificação por meio de testes bioquímicos:

Para a prova de indol foram pipetados 5 ml de Caldo Triptona 1%, sendo na

Para a prova de Voges-Proskauer foram pipetados 5 ml da cultura, sendo

Pesquisa de Salmonella spp.

As colônias suspeitas em SSA, pequenas, cremes, com ou sem centro negro, e

A leitura foi realizada após dois minutos de movimentos de inclinação e rotação

Nenhuma amostra apresentou coliformes totais e termotolerantes, o que é

Tabela 1. Apresentação dos resultados obtidos após diferentes análises microbiológicas.

Caso houvesse a presença dos mesmos seria um fator preocupante, pois os

Com relação à Salmonella spp. Observou-se uma situação semelhante, obtendo-

A presença de Salmonella nas amostras analisadas constitui-se de riscos a saúde

De acordo com as avaliações realizadas e com base na legislação verificou-se

BRASIL, Ministério da Saúde. RDC nº12, de 2 de janeiro de 2001. Regulamento

Canesqui AM, Garcia RWD (2005) Antropologia e Nutrição: um diálogo possível.

Análise físico-química e microbiológica de resíduos de maracujá (Passiflora

O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e é líder na produção de frutas

Palavras-Chave: aproveitamento de resíduos; frutas amazônicas; coliformes; valor

O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e é líder na produção de frutas

Os resíduos foram coletados na sede da agricultura familiar de Parintins/AM, no

Os resíduos in natura possuíam aroma característico, sendo composto apenas de casca

Tabela 01: Resultado das análises físico-químicas e nutricionais de amostras de resíduos

As análises físico-químicas realizadas demonstraram que importantes características

Os resultados demonstraram a necessidade de maiores cuidados quanto às condições

Os resíduos avaliados neste estudo apresentaram características físico-químicas

Abud, A.K.S.; Narain, N. (2009). Incorporação da farinha de resíduo do processamento de

Brasil. (2001). Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n. 12, de 02 de

Brasil (1999). MAPA. IN nº 12/99, de 13/09/99. Padrões de Identidade e Qualidade para