Roteiros

Toxicologia e Análises Toxicológicas

Manual de Estágio

Disciplina: Toxicologia e Análises

Toxicológicas AULA 1
Tiítulo da Aula: Padronização de
ROTEIRO 1
Instituto de Ciências da Saúde Fármacos por Cromatografia em Camada
Delgada (Ccd)

OBJETIVO: Padronizar o comportamento do fármaco na realização de testes rápidos

utilizados como triagem da exposição do organismo a fármacos ou drogas.

AMOSTRA
Padrões
1. Ácido acetilsalicílico

REAGENTES E SOLUÇÕES
Agentes cromogênicos:
1. Solução de cloreto férrico (FeCl3) 5%

SISTEMA SOLVENTE:
Cuba ácida: clorofórmio: acetona (9:1)

TÉCNICA
1. Aplicar por 40 vezes a solução padrão em uma placa cromatográfica, por meio de
tubos capilares ou micropipetas.
Deve-se atentar que o diâmetro do solvente não deve ultrapassar 5 mm, uma vez que
Serviço Social

manchas muito grandes podem descaracterizar a identificação da substância. Um secador

de cabelo a frio pode ser utilizado para evaporar o solvente mais rapidamente e aplicar a
2,0 cm da borda inferior da placa.
2. Colocar a cromatoplaca em uma cuba de desenvolvimento previamente saturada
contendo o sistema solvente clorofórmio: acetona (9:1).
Após o desenvolvimento das placas (10 cm, a partir do ponto de aplicação), retirá-las das
cubas e deixá-las à temperatura ambiente para a completa evaporação do solvente, sob capela.
3. A seguir, revelar a cromatoplaca com FeCl3 e avaliar o comportamento da mancha.
4. Expressar os resultados segundo a forma da mancha, cor da mancha e hRf.

MATERIAIS QUANTIDADE
Acetona 100 mL
Ácido acético 50 mL
Clorofórmio 500 mL
Éter de petróleo 100 mL
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico nanohidratado 40 g
Iodeto de Potássio 4,0 g
Metanol 100 mL
NaOH 1g
Nitrato de bismuto 2,0 g
Solução de cloreto férrico 10 g
Sulfato de sódio 10 g

EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura) 1
Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 2
Cubas de vidro 1
Nebulizadores 1
Bomba a vácuo 1
Manual de Estágio

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança.

QUESTÕES NORTEADORAS

1. Um paciente foi encontrado com hipertermia, zumbido no ouvido, acidose

metabólica e alcalose respiratória. Em um teste rápido por CCD, o resultado foi
positivo para exposição a salicilatos.

2. Durante a revelação, ao nebulizar o cloreto férrico, observou-se que a mancha

característica dessa revelação não foi formada. Proponha sugestões que possam
justificar e consequentemente, corrigir essa situação.

3. Em uma placa de CCD podem ser aplicados e revelados mais padrões?

4. Fármacos de caráter ácido podem ser aplicados na mesma placa, juntamente

com os de caráter alcalino?
Serviço Social

Disciplina: Toxicologia e Análises

Toxicológicas
Tiítulo da aula: triagem em urina por AULA 2
cromatografia em camada delgada (ccd).
ROTEIRO 1
Instituto de Ciências da Saúde
Extração líquido/líquido e identificação
de fármacos por ccd.

OBJETIVO: Teste rápido para triagem da exposição do organismo a fármacos ou drogas

de abuso e extração de substâncias em material biológico.

AMOSTRA
Padrões
1. Ácido acetilsalicílico
REAGENTES E SOLUÇÕES
Agentes cromogênicos:
Solução de cloreto férrico (FeCl3) 5%

Sistema solvente:
Cuba ácida: clorofórmio: acetona (9:1)
Manual de Estágio

TÉCNICA
EXTRAÇÃO
Extração de substâncias de caráter ácido e neutro
1. Colocar 10 mL da amostra em funil de separação (125 mL) e ler o pH;
2. Ajustar o pH entre 4,0 e 5,0 por meio de solução de H2SO4 1%;
3. Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio: éter (3:1), agitando vigorosamente o funil
por 1 minuto;
4. Deixar o funil em repouso por 5 minutos para a separação das fases;
5. Filtrar a camada orgânica sobre Na2SO4 1% anidro, previamente umedecido com a
mistura clorofórmio: éter. Recolher o extrato em béquer;
6. Repetir os itens 3 e 4 recolhendo o filtrado no mesmo béquer;
7. Evaporar o solvente à secura e reservar o resíduo (Ra= ácido);
8. Desprezar o remanescente aquoso, que ficou no funil de separação.

TÉCNICA DE IDENTIFICAÇÃO
Proceder a análise do resíduo Ra por cromatografia em camada delgada (CCD) nas
condições previamente padronizadas.
Serviço Social

MATERIAIS QUANTIDADE
Acetona 100 mL
Ácido acético 50 mL
Clorofórmio 500 mL
Éter de petróleo 100 mL
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico nonahidratado 40 g
Iodeto de Potássio 4,0 g
Metanol 100 mL
NaOH 1g
Nitrato de bismuto 2,0 g
Solução de cloreto férrico 10 g
Sulfato de sódio 10 g

EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Funil de separação (125 mL) 2
Bastão de vidro 1
Funil de vidro capacidade 100 mL 01
Béquer 100 mL 02
Bastão de vidro 01
Papel Universal pH 02 fitas
Béqueres 100 mL 03
Placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura) 02
Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 10
Cubas de vidro 2
Nebulizadores 1

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança.

Manual de Estágio

QUESTÕES NORTEADORAS

QUESTÃO 1. No procedimento “Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio: éter

(3:1),” qual é o objetivo do clorofórmio? Explique, levando em consideração a
dissociação do fármaco.

QUESTÃO 2. Quais são as características que destacam a urina, o conteúdo

gástrico e o sangue (plasma ou soro), como amostras biológicas, na toxicologia de
urgência?

QUESTÃO 3. Caso haja na amostra um analito de carácter ácido, um de caráter

anfótero e outro de caráter alcalino, em qual fase do sistema heterogêneo líquido/
líquido estarão cada uma das substâncias.

QUESTÃO 4. Faça um fluxograma expondo a dinâmica de extração líquido/líquido

de fármacos de caráter ácido, anfótero e alcalinos.
Serviço Social

Disciplina: Toxicologia e Análises

Toxicológicas AULA 3
Título da aula: identificação de
ROTEIRO 1
Instituto de Ciências da Saúde aflatoxina por cromatografia em camada
delgada (ccd)

OBJETIVO: Identificação de micotoxinas (aflatoxinas B1, B2, G1 e G2) presentes

em alimentos, sementes, grãos ou rações, com extração por solventes orgânicos e
Cromatografia em Camada Delgada (CCD).
Preparação da amostra – Triture ou moa, de acordo com a natureza da amostra, a fim
de que se obtenha massa homogênea, podendo utilizar liquidificador, moinho ou moedor
de carne. Passe a amostra pela peneira de 20 mesh. Homogeneize novamente e retire uma
subamostra de 30 g.
Extração e purificação – Pese 30 g da amostra previamente homogeneizada e transfira
para um frasco Erlenmeyer. Adicione cerca de 10 mL de água aquecida a 60 ºC para facilitar
a penetração do solvente orgânico nos tecidos hidrofílicos. Homogeneize com bastão de
vidro. Adicione 100 mL de clorofórmio, tampe o frasco com algodão e agite manualmente
por 30 segundos. Prossiga esta operação com agitador mecânico por mais 30 minutos.
Filtre o extrato clorofórmico em funil de vidro com papel de filtro qualitativo.
No caso de amostra de amendoim ou derivados, adicione pequena quantidade de celite
ao funil para acelerar a filtração. Colete 50 mL do extrato em outro frasco Erlenmeyer
e evapore em banho-maria a 80 ºC até que todo o clorofórmio tenha sido eliminado.
Ressuspenda o resíduo com 50 mL de metanol, transfira quantitativamente para o funil de
separação, adicione 50 mL da solução de NaCl a 4% e agite lentamente. Extraia as gorduras
e os demais interferentes com três porções de 50 mL de hexano. Descarte a fração com
hexano (superior). Recolha o extrato metanólico em bequer ou frasco Erlenmeyer.
Manual de Estágio

Transfira quantitativamente o extrato metanólico para um funil de separação limpo e

extraia as aflatoxinas com 50 mL de clorofórmio, agitando o funil de separação suavemente
por três minutos. Deixe as fases se separarem e recolha a inferior (clorofórmio) em frasco
Erlenmeyer de 250 mL. Repita a operação com mais 50 mL de clorofórmio. Recolha o
total de clorofórmio juntamente com o extrato da primeira partição e evapore em banho-
maria a 80 °C ou rotavapor a (50-60) °C. O resíduo deve ser transferido quantitativamente
com clorofórmio para um frasco Erlenmeyer de 25 ou 50 mL e evaporado sob corrente
de nitrogênio. Para efetuar a cromatografia em camada delgada, dissolva o resíduo em
clorofórmio em quantidade adequada, normalmente entre 200 a 500 μL e utilize banho de
ultrassom por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução das aflatoxinas.
Triagem das micotoxinas por cromatografia em camada delgada – Aplique em placa de
sílica gel, 5 a 10 μL da amostra e alguns pontos de cada padrão, separadamente, fazendo
sobrepor no segundo ponto do padrão 5 μL da amostra. Desenvolva o cromatograma em
cuba previamente preparada para garantir a saturação com tolueno-acetato de etila-ácido
fórmico (50:40:10). Remova a placa depois de 12 cm de desenvolvimento do solvente e
seque. Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo.
Excepcionalmente, na ausência do ácido fórmico, utilizará clorofórmio-acetona (90:10).

MATERIAIS QUANTIDADE
Celite
Clorofórmio 100 mL
Metanol 300 mL
Cloreto de sódio
Cloreto de potássio 2g
Hexano
Serviço Social

EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Algodão 1
Agitador mecânico 1
Balão volumétrico 25 mL 1
Banho-maria ou rotavapor 1
Bastão de vidro 2
Béquer 500 mL 1
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 2
Erlenmeyer de 25 ou 50 mL 1
Funil de separação 1
Lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo 1
Liquidificador, moinho ou moedor de carne 1
Papel de filtro qualitativo 2
Peneira de 20 mesh 1
Placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura) 1
Rotavapor 1
Tubo de ensaio 2
Papel alumínio 1

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança.

REFERÊNCIAS

ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of

the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990,
chapter 49. p. 1184-1199.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1, Métodos
químicos e físicos para análise de alimentos. 2a ed. São Paulo: IMESP, 1976. p. 323-325.
Manual de Estágio

PRZYBYLSKI, W. Formation of aflatoxin derivatives on thin-layer chromatographic

plates. J. Assoc. Off. Analyt. Chem., v. 58, p. 163-164, 1975.
STACK, M.E.; POHLAND, A.E. Colaborative study of a method for chemical confirmation
of the identity of aflatoxin. J. Assoc. Off. Analy. Chem. v. 58, p. 110-113, 1975.
VELASCO, J. Replacement of benzene as a solvent for aflatoxin standards. J. Am. Oil
Chem. Soc. p. 938A-940A, 1981.

QUESTÕES NORTEADORAS

QUESTÃO 1. Durante o método de extração das aflatoxinas, em um dos momentos,

se orienta: “adicione 100 mL de clorofórmio”. Explique por que esse solvente
orgânico é utilizado para essa extração e se a água fervente seria suficiente para
essa extração.
Sugestão: solicitar que o(a) Aluno(a) analise a estrutura química das aflatoxinas.

QUESTÃO 2. Observe parte do procedimento analítico: “Observe o cromatograma

sob lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo”. Explique por que o método
solicita que a análise seja realizada nesse espectro, ou seja, no UV.
Sugestão: solicitar que o(a) Aluno(a) analise a estrutura química das aflatoxinas.

QUESTÃO 3. No procedimento “Recolha o total de clorofórmio juntamente com o

extrato da primeira partição e evapore em banho-maria a 80 ºC”, há risco de perda
do analito por degradação, por conta dessa elevada temperatura? Justifique sua
resposta.
Serviço Social

Disciplina: Toxicologia e Análises

Toxicológicas AULA 3
Título da aula: determinação da ROTEIRO 2
Instituto de Ciências da Saúde carboxihemoglobinemia

OBJETIVO: Determinar os níveis de carboxihemoglobina de amostras biológicas

para verificar se estão dentro dos limites máximos permitidos.

AMOSTRA
Sangue. Deve ser colhido no final da jornada de trabalho em vacutainer heparinizado e
conservado a 4 ºC por no máximo, uma semana. Para os fumantes, devem ser colhidas duas
amostras, antes e após a jornada de trabalho.

REAGENTES E SOLUÇÕES
ƒƒ Sol. Tampão pH= 6,85: KH2PO4 (fosfato monobásico de potássio)/K2HPO4 (fostato
dibásico de potássio) 0,1M.
ƒƒ Sol. Hemolisante: diluir o tampão com água de 1:10. Preparar semanalmente.
ƒƒ Sol Diluente: dissolver 25 mg de hidrossulfito de sódio em 20 mL de sol. Tampão.
Preparar antes do uso.

TÉCNICA
1. Em tubo de ensaio com tampa, colocar 0,1 mL de sangue (amostra) e 12 mL de
solução hemolisante. Agitar; deixar em repouso por 10 minutos.
2. Diluir 0,2 mL do hemolizado com 2,3 mL de solução diluente. Tampar.
Manual de Estágio

3. Deixar à temperatura ambiente por 10 minutos. Ler a absorvâncias a 420 e 432 nm,
usando como branco a solução diluente.

CÁLCULO DA CARBOXIEMOGLOBINA

EM QUE:

AR= A 420/ A 432

F1= A Hb red 432 / A Hbred 420 (1,3330)

F2= A HbCO 432 / A Hb red 420 (0,4787)

F3= A HbCO 420 / A Hb red 432 (1,9939)

Serviço Social

INTERPRETAÇÃO
O Índice Biológico Permitido (IBMP) é de 3,5% e o Valor de Referência (VR) é < 1%,
ambos para não fumantes.

MATERIAIS QUANTIDADE
Amostra de Sangue 2 mL
KH2PO4 3g
K2HPO4 3g
Hidrossulfito de sódio 25 mg
Água destilada 1L

EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro 01
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 01
Tubo de Ensaio com tampa Capacidade 10 mL 03
Pipeta Capacidade 5 mL 02
Vórtex para Agitação 01

REFERÊNCIAS

BEUTLER, E & WEST. C. Simplified determination of carboxihemoglobin. Clin. Chem,

30(6):871-4. 1984.

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança.

Manual de Estágio

QUESTÕES NORTEADORAS

QUESTÃO 1. Equívocos pré-analíticos, ou seja, os equívocos cometidos antes

da análise toxicológica, não são incomuns. Para evitar esses equívocos prioriza-se
trabalhar com profissionais experientes e manter a equipe de analistas informada.
Imaginemos que um laboratório de análise toxicológica coletasse o sangue do
trabalhador, para análise de HbCO, no início da jornada. O que você espera desse
resultado analítico? Justifique sua resposta.

QUESTÃO 2. Imagine que a solução diluente utilizada na técnica tenha tido

algum problema de qualidade. Que tipo de interferência analítica haveria, caso você
identificasse essa situação? Explique.

QUESTÃO 3. Discorra sobre o risco de intoxicação de um trabalhador que apresenta

como nível de HbCO igual a 3,0%. Ele apresenta risco de intoxicação?

QUESTÃO 4. Discorra sobre o risco de intoxicação de uma pessoa não exposta

ocupacionalmente ao CO e que apresenta como nível de HbCO igual a 3,0%. Ele
apresenta risco de intoxicação?
Serviço Social

Disciplina: Toxicologia e Análises

Toxicológicas AULA 4
Título da aula: determinação de nitrito ROTEIRO 1
Instituto de Ciências da Saúde em alimento

OBJETIVO: Determinar os teores de nitrito como conservante em amostra de

salsicha para verificar se estão dentro dos Limites Máximos Permitidos, segundo a
Legislação Brasileira, preconizados pelo Ministério da Agricultura.

AMOSTRA
Salsichas.

REAGENTES E SOLUÇÕES
Solução I
Tetraborato de sódio decahidratado
(Na2B4O7. 10 H2O)...............................................................50 g
Água destilada até completar 1L

Solução II
Ferrocianeto de potássio trihidratado
K4Fe(CN)6 . 3H2O..................................................................106 g
Água destilada até completar 1L.
Manual de Estágio

Solução III
Acetato de zinco dihidratado
Zn(CH3COO)2........................................................................220 g
Ácido acetico glacial.........................................................30 ml
Água destilada ate completar 1L.

Reagente Cromogênico.
Solução de alfa-naftol: aquecer 360 ml de água destilada e 50 ml de ácido acético a
50*C. Transferir esta solução para um frasco escuro contendo 0,25 g de ácido sulfanílico.
Agitar até dissolver, adicionar 0,20 g de alfa naftol, agitando bem. Esfriar à temperatura
ambiente e adicionar 90 ml de solução de NH4OH a 10%. O pH desta solução deverá ser
4,0* 0,5.
Solução tampão: em 500 ml de H2O destilada adicionar 20 ml de HCl concentrado.
Agitar e adicionar 50 ml de NH4OH concentrado e diluir com água destilada até 1000 ml.
O pH obtido é de 9,6 - 9,7.
Solução padrão de nitrito: 0,25g NaNO2 em 500 ml H2O.

PROCEDIMENTO:
Padronização
(1) Transferir alíquotas de 1, 2, 4, 8 e 16 ml da solução padrão de nitrito de sódio em 5
diferentes balões volumétricos de 100 mL; adicionar 5 ml do tampão e completar com H2O
destilada, q.s.p. 100 mL, a cada um dos balões.
(2) Transferir 10 ml de cada alíquota da solução (1) para 5 diferentes balões volumétricos
de 100 mL e completar com H2O destilada, q.s.p. 100 mL, a cada um dos balões.
Serviço Social

(3) Transferir 5 ml de cada uma das soluções (2) em tubos de vidro e acrescentar 10 ml
de reagente cromogênico, 5 ml de água destilada e 5 ml da solução tampão a cada um dos
diferentes tubos.
(4) Deixar em banho de H2O a 30 ºC por 30 minutos.
(5) Leitura espectrofotométrica em 474 nm, contra um branco.
Obs.: o branco se constituirá de 10 ml do reagente cromogênico em 10 ml de água e 5
ml tampão (deixar em banho de água a 30 ºC por 30 minutos).

Desproteinização
Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 ml. Adicionar 5 mL da
solução I (bórax) e cerca de 40 ml de água destilada, à temperatura acima de 70 C. Aquecer
em banho de água fervente por 15 minutos, agitando frequentemente. Deixar esfriar a
temperatura ambiente. Adicionar 2 ml da solução II (ferrocianeto de potássio) e 2 ml da
solução III (acetato de zinco). Agitar vigorosamente após cada adição.
Transferir a amostra para um balão volumétrico de 100 ml. Deixar o balão em repouso
por 30 minutos à temperatura ambiente.
Completar o volume com água destilada, q.s.p. 100 mL. Agitar o conteúdo do balão
vigorosamente e filtrar em papel livre de nitritos. Determinar a concentração de nitrito
presente nesta solução.

Determinação de nitrito
Pipetar 10 ml da solução desproteinizada da amostra de alimento para um tubo de
ensaio. Adicionar 5 ml da solução tampão e 10 ml da solução de alfa-naftol.
Deixar em banho de água a 30 ºC, durante 30 minutos, esfriar à temperatura ambiente:
ler em 474 nm.
Manual de Estágio

Calcular o valor de nitrito presente na amostra, usando a curva padrão previamente

estabelecida.

INTERPRETAÇÃO
Segundo a Portaria nº 1.004 de 11 de dezembro de 1998 da Secretaria de Vigilância
Sanitária do Ministério da Saúde, a quantidade residual máxima de nitritos e nitratos
em produtos cárneos, excetuando-se o charque brasileiro, é de 150 mg/Kg e 300 mg/Kg,
respectivamente, expressos como sal de sódio.

MATERIAIS QUANTIDADE
Acetato de zinco dihidratado Zn(CH3COO)2 220 g
Ácido acético 50 mL
Ácido sulfanílico 0,25 g
Ácido acético glacial 30 mL
Água Destilada 2L
Alfa naftol 0,20 g
Amostra de salsicha 10 g
Ferrocianeto de potássio trihidratado (K4Fe(CN)6 . 3H2O 106 g
HCl 20 mL
NaNO2 0,25 g
NH4OH 50 mL
NH4OH a 10%. 90 mL
Tetraborato de sódio decahidratado (Na2B4O7. 10 H2O) 50 g
Serviço Social

EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Bageta de vidro 01
Banho de Água fervente 01
Béqueres 100 mL 03
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 01
Espectrofotômetro 01
Funil de vidro capacidade 100 mL 01
Papel de Filtro 02
Papel Universal PH 02 fitas
Pipeta Capacidade 1 mL 02
Pipeta Capacidade 10 mL 02

REFERÊNCIAS

ARAUJO, A.C.P. Determinação de nitratos e nitritos em alimentos destinados a

população infantil. (Dissertação de Mestrado) apresentada a Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, 1988.
LARA, W.H.; TAKAHASHI, M.Y.; SILVEIRA, N. Determinação de nitritos e nitratos em
conservas de carne. Rev. Inst.Adolfo Lutz. 38(2):161-166, 1978.
MORIE, G.P. et al. Determination of Nitrate and Nitrite in Mixture with Nitrate ion
eletrode. Ana. Clin. Acta. 60:397-403, 1972.

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança.

Manual de Estágio

QUESTÕES NORTEADORAS

QUESTÃO 1. Os nitritos e nitratos são substâncias químicas adicionadas

intencionalmente nos alimentos, com alguns fins, como o de realçar as propriedades
organolépticas do alimento e inibir a proliferação bacteriana.
Sob a óptica toxicológica, qual é o significado de determinar os níveis desses
sais, nos alimentos industrializados?

QUESTÃO 2. Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 ml.

Adicionar 5 mL da solução I (bórax) e cerca de 40 ml de água destilada, à temperatura
acima de 70 ºC.

QUESTÃO 3. Transferir alíquotas de 1, 2, 4, 8 e 16 ml da solução padrão de nitrito

de sódio. Qual é a concentração de nitritos em cada um desses volumes?