En g e n ha r i a G e n ti c a em P l a n ta s

PARA QUE USAMOS A ENGENHARIA GENTICA DE PLANTAS?

- transferncia gentica e allica entre organismos para gerar novas caractersticas
- modificar expresso autloga de genes existentes nas plantas
- testar a funo de elementos genticos
- engenharia metablica (alterao de vias metablicas ou produo de enzimas exgenas)
- produo de protenas recombinantes de outros organismos em plantas

PORQUE SE PRODUZEM PLANTAS TRANSGNICAS?

As plantas transgnicas produzem-se porque se descobriu uma metodologia que permite a
alterao do cdigo gentico de uma forma precisa e controlada.
Esta metodologia permite utilizar genes de qualquer organismo e no s de plantas que se podem
cruzar entre si, trazendo um novo mundo de possibilidades aos programas de melhoramento de plantas.
Esta metodologia foi primeiro desenvolvida em organismos mais simples do que as plantas em
bactrias e denomina-se de Tecnologia do DNA Recombinante.
Baseia-se no pressuposto de que a forma como o cdigo gentico se encontra organizado e
traduzido semelhante em todos os organismos. Mesmo tendo em conta os novos conhecimentos.

Resistncia a herbicidas
Para matar as plantas os herbicidas tm de ser transportados para o local onde interagem com a
protena alvo.
Para tornar as plantas resistentes a herbicidas podemos inserir protenas alvo deficientes ou inserir
genes para enzimas que degradam o enzima antes que atinja o alvo.
A actuao dos herbicidas depende da sua capacidade de ser absorvido pela planta, do transporte,
dos sistemas de desintoxicao e do alvo.
Por exemplo: a enzima 5EPPS essencial para a produo dos a.a. fenlicos e inibida
competitivamente pelo glifosato. A estratgia usada neste caso encontrar uma variante do enzima que
no seja inibida, e esta variante foi encontrada em A. Tumefaciens. Construiu-se um plasmdeo com 2
variantes desta enzima resistente.

Resistncia ao stress
As plantas esto sujeitas seca, temperaturas elevadas e condies de salinidade e estes factores
so agravados pelas alteraes climticas.
Uma estratgia a usar procurar genes de tolerncia que sejam transferveis para as plantas de
interesse. Existem certos TF que so expressos sob stress, coordenando genes que conferem resistncia s
plantas.

Melhoramento da qualidade nutricional das colheitas

Problema: deficincia em a.a. e vitaminas em cereais
Soluo: aumentar a sntese destes dois ao alterar vias metablicas
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Exemplo: arroz dourado: introduziram-se 3 genes que codificam para enzimas que completam a via
deficiente de vitamina A, ultrapassando o GGPP e produzindo B-caroteno.

Amadurecimento dos frutos

O amadurecimento resulta da aco de enzimas que esto nos polissacridos, paredes e pigmentos,
reduzindo o seu tempo de prateleira.
A poligalacturonase actua nas paredes, tornando o fruto mais mole. Arranjaram sequncias antisense do mRNA do enzima, originando dsRNA que suprimido pelo mecanismo do RNAi. Isto permite
aumentar o tempo de prateleira e a qualidade dos frutos.
A primeira planta transgnica foi o tomate.

Resistncia a pragas
A larva da borboleta causa danos nas plantas, o que leva a infeces fngicas. Tornaram estas
plantas resistentes ao adicionar um gene que codifica para uma toxina BT que interage com o epitlio
intestinal das larvas, criando canais que alteram o equilbrio osmtico, causando a sua morte. Estas toxinas
no tm receptores no tracto intestinal do mamferos sendo desactivadas pela nossa digesto graas ao pH
cido.

O QUE SO AFINAL PLANTAS TRANSGNICAS?

So variedades vegetais cujo processo de melhoramento recorre tecnologia do DNA
recombinante no caso do milho so comercializadas sementes hbridas. Na fase inicial do processo inserese no genoma de uma planta, uma sequncia de DNA codificante (que permite s clulas sintetizar uma
protena especfica) e expressvel (que efectivamente transcrita e traduzida). Essa sequncia tem que ser
transferida para, e expressa estavelmente na descendncia.

TCNICAS DE MELHORAMENTO
Seleco Clssica usamos as plantas mais interessantes sem cruzamentos
Hibridao Clssica com cruzamentos (abertos ou controlados)
Hibridao Inteligente marcadores moleculares para verificar a qualidade do fentipo
Melhoramento por mutao raios X, qumicos; depois encontrar variantes com caractersticas
interessantes
Di-haploidizao diferenciao in vitro de plantas obtidas por plen ou vulos; tem interesse pois
podemos ter 2 alelos para o mesmo locus, com diferentes relaes de dominncia, revelando
caractersticas de alelos recessivos normalmente silenciados
Salvamento de embries in vitro
Variao somaclonal in vitro
Engenharia gentica - transferncia horizontal entre reinos
A engenharia s aplicada quando no existem outras opes. Para o melhoramento podemos
pensar em vrios pools gentics. O pool gentico primrio aquele em que h uma completa
compatibilidade entre as plantas que so cruzadas. Os pools secundrios so aqueles em que no h
compatibilidade completa.
A engenharia gentica permite-nos ir buscar o gene de interesse a qualquer pool.
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Possibilidades de melhoramento pela engenharia genetica:

- Modificao transgnica: de um organismo para qualquer para a nossa planta
- Modificao xenognica: de um organismo qualquer, mas h alterao do gene, utilizando por exemplo
mutagnese ou fazendo modificao de codes. Isto foi utilizado para induzir resistncia a insectos.
- Modificaes intragnicas: possvel encontrar dentro da espcie uma variante allica mais interessante
e mais fcil fazer logo a transformao do que fazer plant breeding. Este processo ser mais rpido e
como vem de espcies afins mais aceite pelo pblico.

O QUE NECESSRIO PARA FAZER UMA PLANTA TRANSGNICA?

Identificar a caracterstica a alterar
Identificar a sequencia codificante capaz de alterar/fornecer a caracterstica desejada
Conhecer a funcionalidade do produto da codificao
Isolar/desenhar/construir as sequncias
Escolher promotores/outros elementos reguladores
Realizar a construo a inserir
Escolher o vector para transformao
Ter um mtodo de transferncia
Ter uma insero
Ter um mtodo de seleco
Ter um sistema de regenerao
Obter plantas homozigticas
Garantir uma expresso estvel
Garantir um fentipo relevante
Transferir para cultivar agronomicamente relevante
Garantir a segurana

Realizar uma construo

Aps seleco de uma sequncia codificante de interesse necessrio uma srie de modificaes
antes da efectiva insero na planta.
Isolar e clonar as sequncias
Escolher um promotor
Possibilidade de alterar o gene clonado - ajustar os codes para serem mais facilmente
reconhecidos (codon usage) ou site direct mutagenesis (ex: no gene Bt, nucletidos A-T foram
substitudos por G-C, aumentando a produo da protena em plantas)
Incluir uma sequncia terminadora (outras p.ex. MARs)
Adicionar um gene marcador e/ou de seleco.
Promotores constitutivos:
CaMV 35S: adequado para expresso de genes estranhos em dicots
Promotor ubiquitina de milho: expresso forte em monocots
Promotores especficos de tecidos:
- da vicilina e da glutenina: expresso em sementes
- da a-amilase para a expresso da aleurona nos gros
- da patatina para expresso em batatas
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- da RuBisCO para expresso na parte area das plantas

Promotores indutveis:
O promotor da lcool desidrogenase induzido pelo etanol
Tambm temos promotores indutveis a stress hdrico como os ABA responsive elements. A anlise
destes promotores permite verificar que existem elementos nos promotores (sequncias) que respondem
presena do ABA. Foram identificados estes elementos e os promotores foram postos numa construo
com GUS para verificar qual deles era mais forte em funo de uma planta transgnica em stress hdrico
que mais tarde ir controlar a expresso de um gene que s se ir expressar efectivamente quando a planta
for exposta a um stress hdrico.
Os genes reprter analisam a actividade dos promotores e verificam a eficincia dos processos de
transformao.

Mtodos de transferncia
- Bombardeamento com micropartculas
Este processo usado especialmente para transformar monocots, como os cereais, que no so
susceptveis a infeco com Agrobacterium, pois no produzem substncias quimioatraentes de bactrias
quando so feridas.
So disparadas partculas de ouro ou tungstnio revestidas com as construes.
O nmero de cpias que so integradas no genoma das plantas transformadas maior do que no
caso de Agrobacterium, sendo cerca de uma dezena. Tambm no precisamos de ter vectores circulares
para fazer esta transformao, desde que a construo aberta tenha tDNA nas extremidades para que se
d a transformao.
Esta tcnica realizada em cmaras de fluxo laminar, em condies de assepsia, uma vez que se
trata de culturas in vitro. Tambm se usam meios selectivos para escolher apenas as clulas modificadas.

- Electroporao
Consiste na criao de poros transientes na membrana permitindo a entrada de DNA. Contudo no
caso das clulas vegetais, necessrio remover a parede com celulases e pectinases, ou seja, necessrio
produzir protoplastos. Esta tcnica no muito utilizada porque difcil obter plantas a partir de
protoplastos, nomeadamente pela dificuldade em regenerar a parede. eficiente para um pequeno
nmero de plantas, mas dispendioso e demorado.

- Transformao mediada por vrus

Podemos integrar no genoma viral de plantas a nossa sequncia em estudo e tentar utilizar o
mecanismo de integrao dos vrus para integrar as construes no genoma vegetal.
Mais difcil introduzir a construo no genoma viral
Transformao directa
Quimerismos: no h garantia de que todas as clulas das plantas fiquem geneticamente modificadas
Utilizvel na produo transiente de vacinas animais
Utilizvel para estudar a funcionalidade de uma determinada protena em folhas (reverse genetic tools)
Utilizvel para silenciar a expresso de um gene.
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- Agrobacterium tumefaciens
uma bactria do solo, gram-negativa da famlia Rhizobiaceae. Causa tumores no colo de certas
dicots, aps ferimentos ao nvel do solo, devido presena do plasmdeo Ti (tumor inducing). Uma regio
desse plasmdeo, o T-DNA (transferred DNA) transferida e integrada no genoma da planta por
recombinao no-homloga, durante o processo de infeco.
Estes tumores tm a particularidade de poderem ser retirados das plantas e cultivados in vitro sem
adio de fitorreguladores (porque existe uma transferncia gentica da bactria para a planta- plasmideo
tDNA que contem sequencias que codificam para compostos que fazem parte da via de sntese das auxinas
e citocininas).
Para alm dos genes que codificam para estas enzimas, existem tambm sequncias de genes que
codificam enzimas que utilizam aminocidos das plantas para fabricar opinas (servem como substrato para
a bactria crescer, como fonte de energia e azoto).
Existem cerca de 30 opinas diferentes e as diversas estirpes de Agrobacterium podem ser
caracterizadas consoante o tipo de opinas que utilizam como substrato. As duas opinas mais comuns so a
octopina e a nopalina.
As bactrias so atradas pelas clulas vegetais quando os tecidos so sujeitos a danos fsicos. Na
sequncia desses danos fsicos, as clulas vegetais libertam para o meio ambiente substncias do tipo
flavonlico (ex acetoseringona) que induzem genes de virulncia. Estes genes encontram-se numa regio
do plasmideo Ti (diferente da regio T-DNA) e alguns deles tem como funo excisar uma cadeia simples do
T-DNA, outros recobrir esta cadeia e transport-la atravs da interface bactria-planta e lev-la at ao
ncleo da planta.
Esta integrao depende das extremidades left and right (25pb) que de alguma forma so capazes
atravs daquilo que se chama recombinao ilegtima fazer integrao do T-DNA no genoma das plantas.
Esta recombinao diz-se ilegtima, porque no obriga a uma complementaridade entre estas sequncias e
as sequncias das clulas vegetais (o que pode no ser verdade, uma vez que j se encontraram sequencias
homologas as estas extremidades).
Uma das coisas que ainda no se sabe os detalhes da transferncia do T-DNA para a clula
vegetal.
Existem vrias linhas selagens de agrobacterium. Originalmente eram estas linhas selvagens as
utilizadas, actualmente utilizam-se linhas manipuladas em laboratrio.
Dependendo das plantas utilizadas e condies de cultura, utilizam-se linhas diferentes.
Nestas diferentes linhas foram desenvolvidos diferentes tipos de vectores com diferentes
funcionalidades:
- para anlise funcional de genes
- para RNAi (silenciamento ps-transcricional)
- para anlise funcional de promotores
- para exciso de marca de resistncia (sistema de recombinao indutvel)
- para transformao de DNA cloroplastidial (recombinao legtima sequncias
conhecidas)
Os vectores que se utilizam para transformar plantas com auxlio ao Agrobacterium dizem-se
binrios: transferem o T-DNA para um plasmdeo pequeno separado, removem os genes aux e cyt, inserem
uma marca de seleco no T-DNA em E. coli. Os genes vir ficam retidos num plasmdeo de suporte em
Agrobacterium. A transformao de Agrobacterium com o plasmdeo de E.coli pode ser feito por
aquecimento/arrefecimento rpido ou por electroporao.

Neste tipo de processo precisamos de ter um gentipo que partida sabemos que por clonagem
vai dar origem a plantas intactas. Agarramos em pores de tecido desse gentipo e pomos num meio de
cultura que induza a regenerao de plantas e que possibilite o contacto com agrobacterium (processo de
co-cultura, s escuras que permite a transmisso das sequencias para a planta). Passados 3 dias o explante
transferido para um meio de cultura diferente, no qual introduzimos um agente de seleco e um
bactericida para matar o agrobacterium.
Dependendo do processo de regenerao podemos ter de transferir vrias vezes o explante para
meios diferentes( manter a presso de seleco, uma vez que os antibiticos vo se gastando- evitar a
formao de escapes que so plantas regeneradas mas que no esto geneticamente modificadas).
Existem vrias marcas de seleco: a maior parte so genes de resistncia a antibiticos (neomicina
fosfotransferase inactiva neomicina e canamicina), ou a herbicidas ou podemos utilizar um gene que
codifique para um enzima que degrada acares que normalmente no assimilado pelas plantas.
Para alm da eficiente escolha da marca de seleco e das concentraes utilizadas (diferentes
plantas apresentam sensibilidades distintas a diferentes antibiticos), temos de escolher ou desenvolver
mtodos de regenerao que sejam eficientes (que permita a partir de quantidades de tecido
relativamente pequenas obter um nmero elevado de plantas).
Vias de regenerao de plantas in vivo:
- via que recorre a estruturas pr-existentes na planta meristemas axilares: pode originar quimeras (parte
est geneticamente modificada, e outra parte no)
- via que recorre diferenciao de clulas somticas de meristemas caulinares adventcios
- embriognese somtica: embries provm de uma s clula
Temos plantas mantidas in vitro e num meio com dois fitorreguladores. Depois observa-se a
proliferao das clulas, originando callus (uma massa desorganizada). De seguida surgem estruturas
verdes muito lisas que reflectem a luz e que correspondem a massas pr-embriognicas. Passados 15 dias
comeam a ficar mais pontiagudas embrio -> globular -> corao -> torpedo. Depois muda-se para outro
meio de cultura, onde germinam (converso) originam plantas crescidas, com razes e caules opostos.
O nmero de embries obtido maior dos trs tipos de regenerao.

ANLISE DOS TRANSFORMANTES

A anlise fenotipica das plantas transformadas sobretudo importante quando estamos a falar de
espcies agronmicas (quando queremos por exemplo aumentar a produo de sementes ou avaliar a
qualidade de um determinado produto final).
Do ponto de vista da investigao, existem mtodos cuja finalidade apenas induzir mutaes que
permitem aps a verificao da localizao da mutao obter fentipos que permitem ver qual a funo do
gene que est a ser mutado.
Assim que aparecem as primeiras plantas e que temos a oportunidade de retirar uma pequena
poro do material sem danificar a planta em si, o que se faz uma amplificao da zona de construo
que inserimos (que contem a sequncia de interesse).
Exemplo:
1: PCR - permite deitar fora todos os escapes, e significa que a sequncia est integrada, no garante a sua
expresso.
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2: Southern blot: digerimos o DNA total da planta e construmos uma sonda para a protena de interesse e
fazemos uma hibridao com o material que est no gel.
Esta tcnica permite-nos confirmar a insero, verificar o nmero de cpias que foi inserido no
genoma da planta.
3: A anlise da actividade da -glucuronidase serve muitas vezes para verificar a eficincia do processo de
transformao em plantas.
4: Verificar se existe acumulao dos transcritos atravs de Northen blot, que nos d a quantidade de
mRNA, ou ento podemos fazer RT-PCR.
5: Verificar a acumulao da protena atravs de um Western blot (temos de ter um anticorpo especfico).
Quando temos uma integrao no genoma da planta, temos apenas 1 locus, ou seja, as plantas T0
so hemizigticas. Assim, queremos obter plantas homozigticas atravs de auto-polinizaes, e depois
temos de verificar a qualidade da descendncia utilizando marcas de seleco.
necessrio avaliar:
- a actividade e estabilidade do gene introduzido (transmisso e expresso na descendncia)
- a inexistncia de efeitos indesejveis no crescimento, qualidade e produtividade
- o impacto ambiental e segurana alimentar
Por que que temos de fazer testes com espcies agronomicamente relevantes? A principal razo
tem a ver com o facto de no laboratrio nos fazermos ensaios com plantas que contem gentipos que
normalmente so maus do ponto de vista agronmico (o que bom no campo agrcola, no assim to
bom para fazer cultura in vitro).

TCNICAS DE TRANSFORMAO DE PLANTAS

RNAi
Baseia-se na produo de dsRNA que induz processos de silenciamento ps-transcricional (PTGS).
Escolhemos um gene cuja expresso queremos ver reduzida. Arranjamos um DNA que seja
transcrito em dsRNA e fazemos um vector, para que v silenciar o gene em estudo. Adicionamos planta
escolhida, fazemos screening e avaliamos os resultados.
Em plantas, mais comum ocorrer a clivagem do mRNA alvo do que o bloqueio da traduo.

Transformao plastidial
Cloroplastos tm DNA circular policistrnico e provm dos ocitos (herana materna). As plantas
transgnicas expressam o seu transgene mas este no transmitido pelos gametas masculinos.
Vantagens: elevados nveis de expresso do transgene devido ao elevado nmero de cpias dos
plastos; No ocorre silenciamento de genes devido eficiente integrao do transgene por recombinao
homloga.
Este tipo de transformao requer:
- um vector de expresso especfico: promotores especficos de cloroplastos, marcas de seleco
- um mtodo de entrada de DNA pela dupla membrana do cloroplasto: bombardeamento de
micropartculas
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- uma seleco eficiente do transplastoma: sistema de enriquecimento das clulas, seleccionando

negativamente os cloroplastos que no receberam transgene por, meio de antibitico ficando apenas
aqueles que so viveis
Precisamos de um processo de regenerao para recuperar as plantas transgnicas.

Molecular farming
Produo de protenas recombinantes em larga escala em plantas.
- medicamentos, anlises clnicas, produo de anticorpos e antignios
- plantas como biorreactores
Porque que as plantas podem ser um sistema de expresso alternativo?
- benefcios econmicos (mais baratos que sistemas de fermentao)
- benefcios qualitativos (baixos riscos para a sade por contaminao patognica)
- elevado rendimento (produtividade industrial)
- produo em sementes como rgos de armazenamento (til no transporte)
- processos de purificao so evitados
- no existem muitas diferenas entre processos ps-traducionais entre plantas e animais
A escolha das espcies de colheita tem muito a ver com custos de produo, processamento,
rendimento, valor no mercado, aplicao, segurana, etc.
A produo deve ser feita em larga escala, no campo.
Vacinas comestveis: alimentos geneticamente modificados contra doenas infecciosas.
Vantagens:
- as plantas so produzidas no local onde so necessrias as vacinas -> distribuio facilitada
- no so necessrias seringas -> menor contaminao
Exemplos: banana com toxina B contra a clera, tabado e alface contra hepatite B, tomate e bata contra as
trs principais causas de diarreia.