Western Blotting

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos

Departamento de Cincias Bsicas
BIOQUMICA FUNDAMENTAL
PROF. DR. MARCELO DE CERQUEIRA CESAR
ENGENHARIA DE ALIMENTOS XIV - DIURNO
IDENTIFICAO DE MIOSINA NOS PESCADOS

SARDINHA E ARUN PELO MTODO WESTERN
BLOTTING
CAROLINE OLIVEIRA AGOSTINI 9006913
Pirassununga
2015
SUMRIO
RESUMO......................................................................................................... 3
1.
INTRODUO........................................................................................... 4
2.
OBJETIVO............................................................................................... 10
3.
MTODO................................................................................................. 11
4.
RESULTADOS E DISCUSSO...................................................................13
5.
CONCLUSO.......................................................................................... 14
6.
BIBLIOGRAFIA........................................................................................ 15
RESUMO
Um mtodo muito utilizado para identificar protenas especficas em uma
amostra o Western Blotting, a tcnica consiste em, primeiramente, separar
protenas de uma amostra a partir de eletroforese, em seguida, as protenas do
gel de poliacrilamida so transferidas para uma membrana, nesse experimento
de nitrocelulose. A membrana passa por uma soluo de bloqueio para evitar
ligaes indesejadas e ento imersa em um anticorpo primrio, especfico
para a protena de interesse (nesse experimento: miosina de cadeia leve),
depois de lavada a membrana imersa em outro anticorpo, o secundrio, que
se liga ao primrio, por fim a membrana corada, de modo que o corante se
liga somente ao anticorpo secundrio, mostrando somente a protena desejada.
No experimento desse relatrio foi identificada a miosina de cadeia leve nos
pescados Sardinha e Aruan
Palavras chave: protena, Western Blotting, eletroforese, eletroblotting,
miosina, anticorpo
1. INTRODUO
Devido a grande importncia das protenas, interessante detectar,
caracterizar e quantificar mltiplas protenas, para isso um mtodo muito
utilizado o de Western Blotting, aplicado principalmente quelas que esto
em baixas quantidades em determinada amostra (MIGUEL, MENEZES,
ARAJO,
2012).
A caracterstica
principal
desse
procedimento
transferncia de um extrato proteico para uma membrana, geralmente de

nitrocelulose. H tambm o immuno blot, que um tipo de o western blot
aonde, aps a transferncia para a membrana, as protenas so identificadas
com anticorpos especficos. Atualmente, utiliza-se o termo western blot como
sinnimo de immuno blot (MORAES et al., 2013).
A utilizao dessa tcnica consiste em basicamente 3 passos: (1)
separao por dimenses, (2) transferncia para um suporte slido, e (3)
marcao de protenas alvo, utilizando um anticorpo primrio e secundrio
adequado para visualizao (MAHMOOD, YANG, 2012).
Primeiramente so preparadas amostras contendo vrias protenas,
ento uma corrida eletrofortica ser feita para que, atravs dos gis de
poliacrilamida, as protenas sejam separadas. Aps a eletroforese, os
resultados devem ser transferidos para uma membrana adsorvente, para isso
feito o que se denomina "sanduche" blotting (Figura 1) da seguinte maneira:
Mergulhe o cassete de plstico em tampo de transferncia com o lado
preto (negativo) para baixo, dentro de um recipiente;

Coloque uma esponja de fibra molhada no lado negro (negativo) do
cassete;
Coloque um papel de filtro molhado sobre a esponja e elimine as bolhas
de ar;
Coloque o gel diretamente sobre papel de filtro e elimine as bolhas de
ar;
Coloque a membrana molhada no gel e elimine as bolhas de ar;

4
Coloque outro papel de filtro molhado sobre a membrana e elimine as
bolhas de ar;
Coloque uma esponja de fibra molhada em cima do papel de filtro.
Figura 1 Sanduche blotting
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Electroblotting
O sanduche ento fechado e colocado em um campo eltrico

(eletroblotting), os eltrons vo do nodo para o ctodo, portanto, como o gel
est do lado do nodo e a membrana do lado do ctodo, as protenas
carregadas negativamente pelo SDS-PAGE iro do gel para a membrana, esse
tipo de transferncia chamada de transferncia eletrofortica.
A membrana pode ser base de nitrocelulose, polivinildina difluorada
(PVDF), papel ativado ou nylon, a de nitrocelulose a mais utilizada devido ao
seu baixo custo e por apresentar melhor eficincia na ligao com diferentes
tipos de protenas, mas por outro lado menos eficiente para com protenas
que fazem ligaes no covalentes e frgeis ao manuseio antes da hidratao.
Figura 2 Mtodo de Western Blotting para identificar protenas de interesse

Fonte: http://www.leinco.com/general_wb
Por fim, a protena de interesse da amostra ter de ser marcada (Figura

2) para sua visualizao, para isso os seguintes passos devem ser feitos:
Mergulhe a membrana em soluo de bloqueio durante 15 minutos

temperatura ambiente em uma plataforma de agitao com velocidade
alta;
Eliminar a soluo de bloqueio;
Incubar a membrana com anticorpo primrio por 15 minutos em
plataforma de agitao para assegurar a constante cobertura da
membrana;
Rapidamente enxaguar a membrana em tampo de lavagem, em
seguida, descartar o mesmo;

Adicionar tampo de lavagem membrana durante 3 minutos em
plataforma com velocidade mdia.

Descartar a lavagem e incubar com anticorpo secundrio durante 15
minutos na plataforma oscilante definida para um ajuste rpido.

Rapidamente enxaguar a membrana em tampo de lavagem e descartar
o mesmo.
Adicionar tampo de lavagem e lavar a membrana, durante 3 minutos
em plataforma com velocidade mdia.
importante prevenir interaes entre a membrana e o anticorpo
escolhido para detectar a protena. Para bloquear a ligao no especfica, a

6
membrana colocada numa soluo (bloqueio) diluda de protena tais como

soro de albumina bovina e leite em p desnatado. tambm importante
garantir que o tampo de bloqueio seja tambm adequado para o tipo de
membrana. O bloqueio ajuda mascarar quaisquer ligaes no especficas
sobre a membrana, reduzindo assim qualquer '' rudo '' no o produto final de
western blot, eliminando falsos positivos e proporcionando um resultado claro
(JENSEN, 2012).
O anticorpo primrio escolhido de acordo com a protena de interesse,
ele ento se liga a ela e em seguida realizada uma lavagem para que o
anticorpo seja removido do resto da membrana. O anticorpo secundrio est
complexado a uma enzima reveladora, a qual, na medida em que for incubada
com seu substrato especfico, emitir um sinal escolhido, por isso o anticorpo
secundrio deve ser escolhido de acordo com o primrio. A Figura 3 mostra um
exemplo de como a protena marcada.
Figura 3 Exemplo de ligao do anticorpo primrio protena de interesse, seguido de

ligao do anticorpo secundrio ao primrio.
Fonte: http://www.fiocruz.br/ioc/media/apostila_volume_1.pdf
Aps a remoo do anticorpo secundrio, a membrana ser corada com

corantes orgnicos ou marcadores fluorescentes, existem tambm vrios
mtodos com colorao de prata e partculas coloidais como ouro, prata, cobre,
ferro ou Indian ink. O tipo de colorao a ser utilizado deve ser compatvel com
a membrana usada para a transferncia de protenas (KURIEN & SCOLFIED,
2003). Aps a colorao poder ser visualizada a protena de interesse (Figura
4), caso ela estivesse na amostra.
Figura 4 Exemplo de membrana marcada com a protena de interesse aps a realizao do

mtodo Western Blotting
Fonte: http://www.scbt.com/pt/datasheet-3724-nitrocellulose-0-45-microm.html
Pode-se ver que essa tcnica bastante vantajosa, pois membranas

midas so maleveis e de fcil manuseio; as protenas imobilizadas na
membrana so rapidamente e uniformemente acessveis a diferentes ligantes;
somente uma pequena quantidade de reagentes necessria para a anlise
de transferncia; possvel fazer mltiplas rplicas do gel; o armazenamento
da amostra transferida pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma
protena transferida pode ser usada para mltiplas anlises sucessivas
(KURIEN & SCOFIELD, 2006).
2. OBJETIVO
Identificar a protena miosina de cadeia leve nos pescados Sardinha e
Aruan pelo mtodo de Western Blotting.
3. MTODO
Primeiramente, cortou-se um pedao do msculo de Sardinha e de
Aruan, ambos com dimenses aproximadas de 0,25 x 0,25 x 0,25 cm 3. Os
msculos foram colocados nos seus respectivos tubos, previamente rotulados
e contendo 200
L do tampo Laemmli e agitou-se intensamente por 15
vezes, em seguida os micro tubos foram incubados por 5 minutos a

temperatura ambiente.
Feito isso, apenas o tampo homogeneizado do msculo foi transferido
para outro microtubo com tampa e rotulado, ento os micro tubos foram
incubados durante 5 minutos a 95C em banho maria.
Foi ento realizada uma corrida eletrofortica. Logo aps a corrida, o gel
retirado e cortou-se a parte superior. Durante 15 minutos, o gel ficou em
tampo de transferncia em uma plataforma de agitao. Enquanto isso,
esponjas de fibra e papis de filtro ficaram completamente mergulhados em
tampo de transferncia dentro de uma bandeja, em outra bandeja, foi
mergulhada uma membrana de nitrocelulose em tampo de transferncia.
Foi feito ento o sanduche blotting da seguinte maneira: um cassete de
plstico foi mergulhado em tampo de transferncia com o lado preto para
baixo, dentro do recipiente; foi colocada uma esponja de fibra molhada no lado
preto; em cima da esponja, colocou-se um papel de filtro molhado e foram
eliminadas quaisquer bolhas de ar; o gel foi colocado diretamente sobre o
papel absorvente e foram eliminadas quaisquer bolhas de ar; a membrana de
nitrocelulose foi colocada acima do gel e foram eliminadas quaisquer bolhas de
ar; por cima da membrana foi colocado outro papel filtro molhado e foram
eliminadas quaisquer bolhas de ar e por fim, colocou-se uma esponja de fibra
molhada por cima do papel filtro. O sanduche foi fechado e grampeado com o
clipe branco.
O mdulo Mini Trans-Blot foi configurado com o lado preto do cassete de
frente do lado negro do mdulo Trans-Blot Mini. Transferiu-se o mdulo para a
cuba previamente contendo o im agitador no fundo, preencheu-se com
10
tampo de transferncia gelado at o cassete ficar totalmente mergulhado.

Colocou-se a tampa da cuba, combinando os cabos vermelho x vermelho e
preto x preto, ento foi feita a transferncia a 100 V durante 30 minutos.
Passado o tempo, a membrana foi mergulhada em 25 mL de soluo de
bloqueio por 15 minutos temperatura ambiente em uma plataforma de
agitao com velocidade alta. Eliminou-se a soluo de bloqueio e a membrana
foi incubada com 10 mL de anticorpo primrio por 15 minutos em plataforma de
agitao para assegurar a constante cobertura da membrana. Logo aps, a
membrana foi rapidamente enxaguada em 50 mL de tampo de lavagem, em
seguida, descartou-se o mesmo. Adicionou-se 50 mL de tampo de lavagem
membrana durante 3 minutos em plataforma de agitao com velocidade
mdia, descartou-se a lavagem e a membrana foi incubada com 10 mL de
anticorpo secundrio durante 15 minutos na plataforma oscilante definida para
um ajuste rpido. Logo aps, a membrana foi rapidamente enxaguada em 50
mL de tampo de lavagem, em seguida, descartou-se o mesmo. Adicionou-se
50 mL de tampo de lavagem membrana durante 3 minutos em plataforma
de agitao com velocidade mdia, descartou-se a lavagem e adicionou-se 10
mL de HRP, reagente de deteco de cor, incubou-se durante 10 minutos com
agitao media e assistiu-se o desenvolvimento da cor. A membrana foi lavada
duas vezes com gua destilada e seca com papel absorvente.
11
4. RESULTADOS E DISCUSSO
Aps a corar a membrana pode-se observar a protena miosina de
cadeia leve que estava nas amostras de Sardinha e Aruan, como mostra a
Figura 5.
Figura 5 Membrana de nitrocelulose mostrando a protena miosina nos peixes Sardinha e

Aruan
12
5. CONCLUSO
A partir do experimento pode-se concluir que a tcnica Western Blotting
eficiente e pode-se observar a protena miosina de cadeia leve nos pescados
Sardinha e Aruan.
13
6. BIBLIOGRAFIA
Jensen, E. C. (3 de fevereiro de 2012). The Basics of Western Blotting. The

Anatomical Record, 369-371.
KURIEN, B. T., & SCOFIELD, R. H. (2006). Western blotting methods (Vol. 38).
San Diego.
Mahmoode, T., & Yang, P.-C. (4 de setembro de 2012). Western Blot:
Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of
Medical Sciences, 429-434.
Miguel, M. P., Menezes, L. B., & Arajo, E. G. (30 de novembro de 2012).
WESTERN BLOTTING: A TCNICA E APLICAES NA PESQUISA E
ROTINA DIAGNSTICA EM MEDICINA VETERINRIA. Enciclopdia
Biosfera, 1704-1719.
Moraes, C. d., Junior, F. O., Masson, G., Rebello, K. M., Santos, L. d., Bastos,
N. F., & Faria, R. C.-R. (2013). Srie em biologia celular e molecular Mtodos experimentais no estudo de protenas (1 ed.). Rio de
Janeiro.
14

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transferncia de um extrato proteico para uma membrana, geralmente de

Mergulhe o cassete de plstico em tampo de transferncia com o lado

preto (negativo) para baixo, dentro de um recipiente;

Coloque a membrana molhada no gel e elimine as bolhas de ar;

Coloque outro papel de filtro molhado sobre a membrana e elimine as

Figura 1 Sanduche blotting

O sanduche ento fechado e colocado em um campo eltrico

Figura 2 Mtodo de Western Blotting para identificar protenas de interesse

Por fim, a protena de interesse da amostra ter de ser marcada (Figura

Mergulhe a membrana em soluo de bloqueio durante 15 minutos

seguida, descartar o mesmo;

plataforma com velocidade mdia.

minutos na plataforma oscilante definida para um ajuste rpido.

escolhido para detectar a protena. Para bloquear a ligao no especfica, a

membrana colocada numa soluo (bloqueio) diluda de protena tais como

Figura 3 Exemplo de ligao do anticorpo primrio protena de interesse, seguido de

Aps a remoo do anticorpo secundrio, a membrana ser corada com

Figura 4 Exemplo de membrana marcada com a protena de interesse aps a realizao do

Pode-se ver que essa tcnica bastante vantajosa, pois membranas

L do tampo Laemmli e agitou-se intensamente por 15

vezes, em seguida os micro tubos foram incubados por 5 minutos a

tampo de transferncia gelado at o cassete ficar totalmente mergulhado.

Figura 5 Membrana de nitrocelulose mostrando a protena miosina nos peixes Sardinha e

Jensen, E. C. (3 de fevereiro de 2012). The Basics of Western Blotting. The

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