CEFET-QUMICA Unidade Rio de Janeiro ANLISE INSTRUMENTAL CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA RESOLUO

1- INTRODUO Nenhum registro das tcnicas cromatogrficas contemporneas fica completo se no incluir a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). um tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sobre altas presses. Ela tem a capacidade de realizar separaes e anlises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade. Somente a partir dos anos 70 se conseguiu um avano considervel da cromatografia lquida moderna que at ento era essencialmente subdesenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos sobre cromatografia, no inicio do sculo, foi o tipo que hoje chamado cromatografia lquida clssica. O avano foi gradual e atingiu o atual nvel de sofisticao que a CLAE apresenta, devido ao revolucionrio desenvolvimento tecnolgico da prtica deste tipo de cromatografia. Desde 1968 tornou-se possvel rechear colunas com partculas de pequeno tamanho, necessrias para alta resoluo e, tambm, adquirir equipamentos que funcionam nas altas presses necessrias para obter uma boa velocidade de eluio. Nos ltimos dez anos ocorreu o desenvolvimento de vrios detectores espectrofotomtricos que operam em comprimentos de onda varivel at 190 nm, e houve um aumento na utilizao dos detectores por fluorescncia, eletroqumicos, e por fluorescncia induzida por laser, bem como acoplamento com o espectrmetro de massas. Com estes, tornou-se possvel a deteco da maioria dos compostos e a anlise de traos em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos, petrleo, etc. Hoje em dia so comuns estudos com partculas pequenas, a execuo da CLAE com fase reversa e, particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluio com gradiente, bem como de mtodos especiais, tais como a formao de pares inicos. Como resultado, dificuldades anteriores ou separaes difceis de compostos como corantes polares, ismeros, drogas bsicas e seus metablitos so agora rotina. 2- O PROCESSO CROMATOGRFICO 0 processo cromatogrfico consiste na partio dos componentes de uma mistura entre a fase mvel e a fase estacionria. No caso da cromatografia gasosa o fluido um gs e na cromatografia lquida o fluido um solvente. Na cromatografia lquida a fase estacionria constituda de partculas slidas empacotadas em uma coluna, a qual atravessada pela fase mvel. So as foras fsicas e qumicas que atuam entre os solutos e as duas fases so responsveis pela reteno dos solutos sobre a coluna cromatogrfica. A diferena na magnitude dessas foras que determina a resoluo e portanto a separao dos solutos individuais. As foras elementares que agem sobre as molculas so de cinco tipos: 1) Foras de disperso de London ou foras de Van der Waals; 2) Interaes de dipolo induzido; 3) Ligaes de hidrognio; 4) Interaes dieltricas; 5) Interaes eletrostticas e coulombianas.

As variveis que afetarem essas foras intermoleculares iram influenciar o grau de separao obtido pela passagem dos solutos atravs da coluna cromatogrfica. 2.1 - CROMATOGRAFIA LQUIDA CLSSICA X CLAE Na cromatografia lquida clssica (CLC) o recheio da coluna utilizado geralmente uma s vez, porque parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversvel. O enchimento da coluna deve ser repetido para cada separao. A aplicao da amostra, para ser feita corretamente, requer alguma habilidade, fatos que representam um desperdcio de material e tempo. A vazo de eluente na CLC promovida pela ao da gravidade e as fraes individuais da amostra so coletadas manualmente ou atravs de um coletor de fraes. As separaes requerem, geralmente, vrias horas e a deteco e a quantificao das fraes so realizadas por anlise manual. Na CLAE emprega-se um coluna fechada, reaproveitvel; portanto, at centenas de separaes individuais podem ser realizadas com a mesma coluna. Essas colunas so muito eficazes, mas oferecem uma grande resistncia vazo da fase mvel, ou seja, ela sofre uma perda de carga. Por esta razo necessrio empregar sistemas de bomba de alta presso (at 400 bars) que fazem a fase mvel migrar a uma velocidade razovel atravs da coluna. A vazo da fase mvel controlada facilmente, resultando em operaes mais reprodutveis, que tornam as anlises executadas por CLAE mais precisas. Vrios tipos de detectores, que podem ser colocados na sada da coluna, proporcionam uma identificao e quantificao continua dos componentes da amostra. A anlise quantitativa pela CLAE pode atingir uma preciso superior a + 0.5%. Finalmente, separaes em escala preparativa de miligramas de amostras so relativamente fceis. 2.2 - CROMATOGRAFIA GASOSA X CLAE Na cromatografia gasosa (CG) necessrio que a amostra seja suficientemente voltil, a fim de que possa passar atravs da coluna na forma de vapor, e estvel termicamente para no se decompor nas condies de separao. Os mtodos de deteco utilizados em CG so mais rpidos e sensveis, a aparelhagem mais fcil de ser manipulada e em geral mais barata. A CLAE requer somente que a amostra seja solvel na fase mvel. Assim, a CLAE um mtodo ideal para a separao de espcies inicas ou macromolculas de interesse biolgico e produtos naturais lbeis, bem como uma imensa variedade de outros compostos de alta massa molecular e/ou baixa estabilidade trmica. A CLAE possui como vantagens adicionais: duas fases cromatogrficas de interao seletiva com as molculas da amostra, versus somente uma na CG e maior variedade de possveis mecanismos de separao. As principais caractersticas de ambas as tcnicas esto resumidas na Tabela 1. E a concluso que pode ser tirada sobre elas e que se complementam na anlise de diferentes tipos de amostras.

Tabela 1- Caractersticas da CG e da CLAE

Quesito Amostra Tipos de amostra Quant. mnima detectvel Capacidade preparativa Capacidade analtica Pratos tericos por coluna Excelente, com separao de amostras com cerca de 200 componentes 2000 300.000 Baixa e trabalhosa Boa, com fcil coleta e possibilidade de automao Excelente, com separao de amostras com at 50 componentes 500 25.000 10-12 g CG Amostra ou derivado voltil; termicamente estvel nas condies de operao Gases, lquidos e slidos: MM de 2 at 1200 Lquidos e slidos: MM de 32 at 4 x 106 10-9 g HPLC Amostra solvel na fase mvel

A Tabela 2, cita algumas vantagens e limitaes da CLAE; Tabela 2- Vantagens e limitaes da CLAE
Vantagens Menor tempo de anlise Alta resoluo Resultados quantitativos Boa sensibilidade Versatilidade Automao Limitaes Alto custo da instrumentao Alto custo de operao Pouco usada para anlises qualitativas Falta de detector universal sensvel Necessidade de experincia no seu manuseio

3- CARACTERSTICAS DAS FASES ESTACIONRIAS EM CLAE Considerando as suas propriedades fsicas, os recheios para CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos: a) Slidos rgidos, semi-rgidos ou no rgidos; b) Partculas porosas ou peliculares; c) Partculas esfricas ou irregulares; d) Partculas com diferentes dimetros.

Slidos rgidos a base de slica so os recheios mais usados atualmente. Esses recheios podem resistir a presses relativamente altas, resultando em enchimento estvel e colunas eficientes de partculas pequenas. Slidos semi-rgidos so geralmente constitudos de partculas porosas de poliestireno entrecruzadas com divinilbenzeno. 0 semi-rgido tem sido usado para presses at 350 bars. O maior interesse no semi-rgido atualmente para aplicaes na CLAE por excluso com fase mvel orgnica; contudo eles tambm so usados na troca inica.

Slidos no rgidos, tais como agarose ou dextrose, usados em cromatografia por excluso, so aplicados exclusivamente para a separao de molculas grandes, solveis em gua, como as protenas. Contudo, estes slidos no rgidos no podem resistir as presses usadas na CLAE. Os dois tipos de materiais, peliculares e porosos, diferem em algumas de suas propriedades e tm muitas outras em comum. Ambos podem ser introduzidos na coluna com certa facilidade, obtendo-se colunas muito eficazes. Elas podem ser utilizadas em cromatografia lquido-slido, dependendo da atividade da sua superfcie ou pode ser recoberto com alguma fase lquida e obter-se uma coluna para CLAE com fase quimicamente ligada. Alm destes tem-se os materiais de recheio do tipo pelicular ou poroso para cromatografia por troca inica. A Figura 1 apresenta esquematicamente algumas formas mais comuns de partculas para cromatografia de lquidos. Os adsorventes peliculares, com dimetro de partcula entre 30 e 45 m, apresentam eficincia, rapidez, reprodutibilidade e custo similar aos adsorventes porosos (5 - 10 m), mas tm menor capacidade e, por isto, o seu emprego tem diminudo notavelmente nos ltimos anos (Figura 2).

Figura 1- Formas mais comuns de partculas para cromatografia de lquidos.

Figura 2- Diferentes formas e tamanhos dos materiais para empacotamento de colunas. Para obter distribuio homognea do recheio em toda extenso da coluna, o que aumenta a eficincia da separao, as partculas devem ter a menor variao de dimetro possvel. As partculas esfricas so melhores do que as irregulares, mas estas tm menor custo. 4

O tamanho da partcula controla o processo de difuso das molculas da amostra ao penetrar e sair dos poros da partcula. Quanto maior o tamanho da partcula porosa, mais lento o processo de difuso e, como conseqncia, mais lenta a transferncia de massa entre a fase estacionria e a fase mvel. Isto acontece porque, medida que aumenta o tamanho da partcula, aumenta tambm a profundidade dos poros e conseqentemente a amostra demora mais tempo para sair destes poros profundos. Ao mesmo tempo deve-se considerar que um aumento da vazo da fase mvel, para obter-se anlises rpidas, faz com que as molculas da amostra nesta fase migrem rapidamente, em comparao com as da fase estacionria (independente dos poros). Isto resulta no alargamento dos picos. Conforme diminui o tamanho da partcula, a profundidade dos poros diminui e a sada dos poros acontece mais rapidamente, permitindo obter anlises rpidas, sem perda na eficincia. Estas explicaes justificam porque na CLAE utilizam-se somente materiais porosos cujas partculas tem tamanho menor do que 30 m, com exceo da troca inica. Outros tipos de materiais utilizados so partculas esfricas, geralmente vtreas, no porosas, recobertas por uma camada muito fina de um adsorvente poroso. Este tipo de material e denominado de pelcula de camada porosa, de porosidade superficial ou de centro no poroso. A Tabela 3, apresenta um resumo das propriedades gerais dos recheios peliculares e porosos em funo dos tamanhos de suas partculas. Tabela 3- Caractersticas de diferentes recheios para CLAE.
Propriedade Irregulares ( > 30 m) Porosos Esfricos ( > 30 m) Esfricos ou Irregulares (5 ou 10m) Eficincia Velocidade de anlise Baixa a moderada Moderada Baixa a moderada Moderada Boa Grande Alta Alta Moderado Alta Rpida Razovel Grande Baixa Alta Alto Peliculares esfricos ( > 30 m) Moderada a alta Rpida Excelente Pequena Muito alta Baixa Moderado a alto

Facilidade de enchimento Razovel Quantidade de amostra Grande

Permeabilidade da coluna Alta Capacidade Custo Alta Baixo

4- AS TCNICAS DA CLAE H cinco tipos de fases estacionrias com diferentes mecanismos que regem as separaes cromatogrficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase mvel possvel utilizar um deles.

4.1- CROMATOGRAFIA LQUIDO-SLIDO OU POR ADSORO O mecanismo de separao da cromatografia lquido slido (CLS), ou adsoro, se baseia na competio que existe entre molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um slido (fase estacionria). O equilbrio estabelecido :

Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionria, primeiro uma molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. Se assumir que o adsorvente possui uma superfcie polar (por exemplo: slica ou alumina), grupos apolares (por ex.; hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por essa superfcie e no iro deslocar a molcula da fase mvel; por isso, no sero retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrognio tero fortes afinidades pela superfcie e sero fortemente retidos. Molculas polarizveis (por ex.: molculas aromticas) iro apresentar interao dipolo induzido-dipolo com a superfcie do adsorvente e, portanto, tambm sero retidas; o grau de reteno depende da polarizao de cada molcula ou grupo funcional. importante que as partculas da fase estacionria apresentem uma grande rea de superfcie, isto , um grande nmero de stios ativos. A atividade da superfcie de muitos slidos (incluindo a slica e alumina) se encontra com freqncia afetada pela reteno de certas molculas de alta polaridade como lcoois, fenis, gua, etc., e, devido a eles, em determinadas ocasies, difcil reproduzir os resultados obtidos nas anlises, porque as propriedades da superfcie sofrem mudanas. Em conseqncia, a superfcie da slica empregada na CLAE habitualmente submetida a determinados processos de desativao com o propsito de diminuir a reteno de molculas muito polares e, assim, se mantm a superfcie em condies uniformes, o que contribuir para melhorar a reprodutibilidade das anlises. Muitas vezes, devido a uma forte adsoro ou reteno de alguns componentes da amostra no slido ativo, necessrio aumentar a polaridade da fase mvel de uma maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade dos componentes da amostra na fase mvel. A essa variao d-se o nome de eluio por gradiente ou programao da fase mvel. Para a maioria das separaes realizadas por adsoro (CLS) usa-se partculas porosas, na faixa de 5-10 m, alem de se empregar, s vezes, os materiais maiores (30-40 m), como pelcula porosa. Quase todas estas separaes so limitadas a alguns tipos de adsorventes: slica e alumina. A reteno e a separao nestes adsorventes so geralmente similares, os componentes mais polares da amostra sero retido preferencialmente. Na modalidade de cromatografia por partio com fase lquida, prefervel usar suportes que sejam inertes; mas no existem suportes inertes com rigidez e uniformidade requeridas pela CLAE. Usa-se a slica, sabendo-se que tem pontos adsorventes que necessitam ser completamente cobertos ou inativados, como em CG. Os poros devero ser suficientemente 6

grandes para permitir total acesso das molculas do soluto fase estacionria contida dentro da estrutura dos poros, mas suficientemente pequeno para resistir a remoo do lquido estacionrio pelo arraste mecnico da fase mvel. A Tabela 4 apresenta uma lista de slidos microporosos usados em cromatografia lquido slido (CLS) e como suporte para cromatografia lquido-lquido (CLL). Tabela 4- Lista de slidos microporosos para CLAE (CLS) e como suporte para CLAE (CLL)
Tipo Slica (esfrica) Nome ADSORBOSPHERE HS-Si BAKERBOND-Si CHROMSPHERE LICHROSPHERE-Si Slica (irregular) Alumina (irregular) Carbono grafitizado Polmero de estirenodivinilbenzeno LICHROSORB-Si LICHROSORB ALOX-T HYPERCARB POLYSPHERE Fornecedor Alltech J. T. Baker ChromPack E. Merck E. Merck E. Merck Shandon E. Merck Dimetro da partcula (m) 3,5,10 3,5 5 3,5,10 5,7,10 5,10 7 10

4.2- CROMATOGRAFIA LQUIDO-LQUIDO OU POR PARTIO A cromatografia lquido-lquido (CLL) foi desenvolvida por Martin e Synge em 1941 para separao de vrios aminocidos, usando fase estacionria de gua em slica e clorofrmio como fase mvel. 0 mecanismo de separao neste tipo de cromatografia, ou mecanismo de distribuio como tambm chamado, baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase mvel e na fase estacionria. Ento, os componentes mais solveis na fase estacionria so seletivamente retidos por ela, enquanto os menos solveis so transportados mais rapidamente pela fase mvel. 0 maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase estacionria na fase mvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a no reprodutibilidade nas separaes repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras. A primeira saturando a fase mvel com a fase estacionria por meio de uma pr-coluna, colocada antes do injetor, que contenha uma alta percentagem de fase estacionaria. A segunda utilizando materiais que contenham a fase estacionria, quimicamente ligada a um suporte slido. 4.3- CROMATOGRAFIA LQUIDA COM FASE LIGADA A fase estacionria para a cromatografia lquida com fase ligada (CLFL) surgiu como resposta aos problemas com a CLL. Como a fase estacionria quimicamente ligada superfcie do suporte, no h mais solubilidade da fase estacionria na fase mvel. O mecanismo principal desta tcnica baseia-se na partio. Por outro lado, como esta fase estacionria tambm apresenta influncia de grupos ativos (polares) da superfcie (isto , tambm ocorre o mecanismo de

adsoro), a maioria dos pesquisadores considera esta tcnica um mtodo separado. Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionria possvel obter diferentes tipos de seletividade. Estes grupos podem ser polares, como o grupo amino (-NH2) e o grupo nitrilo (-CN), que funcionam similarmente s fases polares da CLS, sendo chamados de fase normal. E h os de natureza apolar, como os grupos octil (-C8H17), octadecil (-C18H37), fenil (C6H5), etc., que so chamados de fase reversa. Na Tabela 5 encontram-se listadas fases estacionrias microporosas para CLFL e na Tabela 6 fases estacionrias peliculares para CLFL. Este tipo de cromatografia muito til e se aplica a molculas de baixa ou mdia polaridade, no inicas, de massa molecular inferior a 2000 e solveis em solvente orgnico. A superfcie de slica, que o suporte mais popular, pode ser modificada por um destes caminhos, entre outros: a) Formao do ster silicato (Si-O-R) por reao do grupo silanol com um lcool: Si-OH + ROH Si-O-R + H2O

b) Formao de ligao siloxano (Si-O-SiR3) por reao do grupo silanol com um organoclorosilano: Si-OH + R3SiCl Si-O-SiR3 + HCl

c) Formao da ligao slicio-carbono pelo tratamento do grupo silanol com cloreto de tionila, para produzir o cloreto, que, em seguida, reage com um composto organometlico para produzir um grupo orgnico ligado diretamente superfcie da slica: Si-OH + SOCl Si-Cl + RLi Si-Cl + SO2 + HCl Si-R + LiCl

Estes materiais, quando preparados pelos mtodos b e c tm, relativamente, uma grande estabilidade (at pH 8) . O tipo ster, preparado pelo mtodo a no to estvel. Tabela 5- Fases estacionrias microporosas para CLAE com fase ligada (CLFL).
Tipo Apolar Nome ADSOBOSPHERE C18 ou C8 BONDAPAK C18 PARTISIL ODS Polaridade mdia LICHROSORB CN HYPERSIL PHENYL ZORBAX - CN Polaridade alta BAKERBOND-NH2 PARTISIL PAC LICHROSORB-DIOL Fornecedor Alltech Waters Whatman E. Merck Shandon DuPont J.T. Baker Whatman E. Merck Grupo ligado Octadecil ou octil octadecil octadecil cianopropil fenil cianopropil alquilamina ciano + diamina alquildiol

Tabela 6- Fases estacionrias peliculares para CLAE com fase ligada (CLFL).
Tipo Apolar Polaridade mdia Polaridade alta Nome BONDAPAK C18 ZIPAC ANH ZIPAC PAM Fornecedor Waters DuPont DuPont Grupo ligado octadecil alquilnitrila poliamida

Quando no fcil manter todas as molculas na forma no ionizadas, a cromatografia lquida por pares de ons (CLPI), uma forma especial de CLFL, pode ser usada. Nela, a amostra inica ou ionizvel forma um par de ons por associao com um contra-on orgnico adequado e presente na fase mvel. O par de ons ento distribudo entre a fase estacionria, normalmente uma de fase reversa, onde o par de ons solvel, e a fase mvel, normalmente aquosa-orgnica, que solubiliza as espcies ionizadas. 0 equilbrio envolvido confere um alto grau de solubilidade. A seletividade pode ser introduzida na separao pelo ajuste dos parmetros de polaridade da fase mvel, pelo pH, pela natureza e concentrao do contra-on, e, em menor extenso, pela natureza da fase estacionria. A CLPI uma alternativa cromatografia por troca inica e tem a vantagem de usar colunas de longa vida e maior reprodutividade. Alm disso, a CLPI permite a determinao simultnea de compostos cidos, bsicos e neutros. 4.4- CROMATOGRAFIA LQUIDA POR TROCA INICA Na cromatografia por troca inica (CTI), a fase estacionria possui grupamentos inicos quimicamente ligados que podem ser trocadores de ctions ou de nions. Esses grupamentos apresentam contra-ons que so deslocados pelos ons da amostra. Por exemplo, admitindo uma amostra com um ction M+, tem-se: M+ + R-SO-3 Na+ Na+ + R-SO-3M+ Grupos quimicamente ligados, utilizados para troca inica, so: -SO3-CO2-trocadores fortes de ctions -trocadores fracos de ctions -NR3+ -trocadores fortes de nions

-NH2R+ - trocadores fracos de nions

As catinicas so adquiridas comercialmente na forma de sais de sdio (Na+) ou de on hidrognio e as aninicas na forma de cloreto (Cl -). Os materiais usados como recheio para CLAE por troca inica tem grupos (ctions ou nions) quimicamente ligados a partculas porosas de resinas polimricas, a slica com camada pelicular, as micropartculas porosas de slica e as micropartculas porosas de resinas polimricas. Tradicionalmente, as partculas porosas de resina polimrica so usadas na separao de aminocidos, peptdeos e carboidratos. Este material consiste em partculas rgidas do copolmero de poliestireno-divinilbenzeno, cuja superfcie e poros contm os grupos trocadores de ons. Estes materiais so de capacidade elevada, geralmente da ordem de miliequivalentes por grama de material e so encontrados com dimetros maiores (30 - 40 m) ou menores (5 m, 10 m).

As slicas com camadas peliculares consistem de uma partcula vtrea de forma esfrica recoberta com uma camada fina do copolmero poliestireno-divinilbenzeno que contm os grupos ativos trocadores de ons. Estes materiais so de capacidade reduzida, da ordem de 10 g/g, mas muito eficazes e podem ser utilizados com solventes orgnicos. Existem tambm materiais que tm a vantagem de resistir a presses elevadas e possuir uma capacidade de troca superior dos materiais peliculares; so as micropartculas porosas de slica com grupos trocadores quimicamente ligados. Na Tabela 7 destacam-se caractersticas de alguns materiais empregados como fase estacionria na CLAE por troca inica. Os processos de troca inica dependem muito da temperatura, conveniente ter algum sistema de controle trmico quando for empregado este tipo de fase estacionria, pois mudanas normais na temperatura ambiente podem afetar os resultados. Tabela 7- Fases estacionrias para CLAE por troca inica (CTI).
Tipo Aninico Nome ADSORBOSPHERE SAX AMINEX PARTISIL SAX Catinico AMINEX AQUAPORE CX PARTISIL SCX Fornecedor Alltech Bio-Rad Whatman Bio-Rad Brownlee Whatman Suporte slica es-dvb* slica es-dvb slica slica Grupo funcional -NH+3 -NH+3 -NH+3 -SO-3 -SO-3 -SO-3

* copolmero de estireno e polidivinilbenzeno 4.5- CROMATOGRAFIA LQUIDA POR EXCLUSO A cromatografia por excluso tem sua resoluo baseada no tamanho efetivo das molculas dos componentes da amostra em soluo. E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos em que um material til. O primeiro o inferior, chamado de limite de permeao, abaixo do qual todas as molculas de menor tamanho so igualmente difundidas dentro dos poros do material e o segundo o superior, chamado limite de excluso, acima do qual todas as molculas so muito grandes para penetrar nos poros. Molculas de tamanho intermedirio entre ambos os limites sero separadas totalmente ou parcialmente de acordo com a seletividade caracterstica de cada material. Ento, sero eludas sem resoluo as molculas menores que o limite de permeao e as maiores do que o limite de excluso, separando somente as que se encontram dentro destes limites. Atualmente dispe-se de um grande nmero de materiais para cromatografia por excluso. Eles variam de acordo com a sua rigidez e com o intervalo de tamanho dentro do qual so teis, isto , o material a ser utilizado na coluna depender do tamanho efetivo das molculas que devem ser separadas. Quanto rigidez existem trs tipos de materiais. Os primeiros so os materiais fracos

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(no rgidos), constitudos de gis de polidextrano (Sephadex), poliacrilamidas (Bio-Gel P ) e poliagaroses (Sepharose e Bio Gel A), usados quase sempre com fases mveis aquosas. Sua capacidade elevada mas eles no resistem a presses superiores a 3 bars; ento, so usados somente na CE clssica. Os segundos so os materiais semi-rgidos que normalmente resistem a presses da ordem de 100 a 150 bars. Estes materiais so constitudos de microesferas de algum copolmero, como o poliestireno-divinilbenzeno. Podem ser empregados com fases mveis aquosas ou no aquosas e existem em uma grande variedade de porosidade. So usados em CLAE e tambm em CE clssica. Os terceiros so os materiais rgidos que resistem a qualquer presso e so geralmente constitudos de partculas de slica porosa ou de vidro poroso. Devido a sua rigidez podem-se obter separaes muito rpidas com fluxo de fase mvel muito alto, o que produz presses elevadas, para o uso de CLAE. Os materiais base de slica ou vidro podem ter a superfcie muito ativa e apresentar adsoro ou degradao de certos materiais (por exemplo, desnaturao de protenas). Existem tratamentos para eliminar estes efeitos mediante processos de desativao qumica, tais como silanizar a sua superfcie de modo muito similar ao tratamento qumico dos suportes em cromatografia gasosa. Na Tabela 8 so citados alguns desses materiais de recheio para colunas de CLAE. Tabela 8- Fases estacionrias microporosas para CLAE por excluso (CE)
Nome Fornecedor Material Partcula ( em m) BIOSIL SEC -BONDAGEL MICROGEL SHODEX A ULTRAHYDRAGEL Bio-Rad Waters ChromPack Showa Denko Waters slica slica es-dvb* es-dvb polimetacrilato 10 10 5,10 10 10 500 - 106 2 x 103 - 7 x 106 102 - 4 x 107 102 - 2 x 108 2 x 103 - 7 x 106 aq/org** aq/org org org aq. Massa Molar Fase mvel

* copolmero de estireno e polidivinilbenzeno **aq = solues aquosas tamponadas; org = solues no aquosas 5- CARACTERSTICAS DAS COLUNAS USADAS EM CLAE As colunas so constitudas de um pedao de tubo de algum material inerte, de dimetro interno uniforme e capaz de resistir as presses em que ser usado. 0 ao inoxidvel o mais usado entre todos os materiais. Existem tambm algumas feitas com vidro de paredes grossas, mas apresentam o inconveniente de no se conseguir conexes adequadas, entre o vidro e o metal, que resistam a altas presses sem vazamento. Geralmente, o dimetro interno das colunas para fias analticos ao redor de 3 a 5 mm e

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para colunas preparativas igual ou maior do que 10 mm. As colunas com microdimetro apresentam dimetros internos entre 0.05 e 2 mm. O comprimento na maioria dos casos, fica entre 10 e 50 cm, com exceo da cromatografia por excluso onde, s vezes, usam-se colunas de comprimento maior ou vrias colunas conectadas uma na outra. A capacidade da coluna e determinada pelo seu comprimento, dimetro e material de recheio. As colunas so normalmente retas porque apresentam uma perda de eficincia quando so dobradas. Nos extremos da coluna coloca-se um disco de teflon ou metal poroso para evitar a perda do recheio ou mudanas na sua compactao. importante que este disco retenha as partculas do recheio sem produzir um aumento muito grande na presso. Nas colunas atuais comum obter-se eficincia da ordem de 50.000 pratos tericos por metro de coluna, que superior as eficincias normalmente obtidas em cromatografia gasosa com colunas recheadas. 5.1- TCNICAS DE ENCHIMENTO DAS COLUNAS O enchimento de colunas para CLAE pode ser feito a seco ou usando uma suspenso da fase estacionria em um solvente apropriado. Sendo que as pequenas partculas, durante o enchimento a seco com vibrao, tendem a formar aglomerados, produzindo um acumulo das partculas maiores perto da parede e das menores no centro da coluna, o mtodo de enchimento por suspenso com alta presso e preferido para rechear colunas com partculas de dimetro menor do que 25 m. 5.2- CUIDADOS COM AS COLUNAS DA CLAE No emprego das colunas de partculas microporosas so necessrias algumas precaues. Em amostras muito sujas convm utilizar uma pr-coluna. A pr-coluna uma coluna pequena com o mesmo recheio ou similar da camada porosa usada na coluna. Coloca-se entre o injetor e a coluna. As pr-colunas com esta finalidade geralmente so de 2 - 5 cm de comprimento com o mesmo dimetro interno da prpria coluna, para que apresentem as mesmas caractersticas de separao. Os solventes devem ter um alto grau de pureza para evitar a contaminao da coluna. Um outro cuidado importante e que os solventes devem ser filtrados, em filtros de 0.2 m, para retirar partculas slidas, que podem riscar o pisto ou a vlvula injetora ou mesmo entupir os tubos do sistema. Solventes halogenados podem conter traos de HCl, HBr, etc., que podem reagir com o ao inoxidvel da coluna e outras partes do sistema. Dependendo da natureza potencialmente corrosiva de cada solvente, eles podem tambm trazer problemas para a coluna, com a solubilizao de ons metlicos. 5.3- ALARGAMENTO DA BANDA CROMATOGRFICA Uma caracterstica indesejvel na cromatografia lquida o alargamento da banda cromatogrfica. Os fatores que provocam este alargamento podem ser: colunares e mecnicos. 5.3.1- FATORES COLUNARES Difuso por turbilhonamento: conseqncia dos diversos caminhos que as molculas da amostra podem ter atravs da coluna devido a no homogeneidade do suporte. Pode ser 12

diminuda utilizando-se partculas esfricas de tamanho uniforme e melhorando-se o empacotamento. a) Difuso axial: A amostra difunde-se axialmente na coluna provocando o alargamento da banda. Se a velocidade for relativamente alta a tendncia da banda aumentar. Hoje, as colunas apresentam disco de distribuio no topo da coluna, para evitar a difuso axial.

b) Difuso longitudinal: Ocorre o fenmeno de disperso medida que a amostra caminha ao longo da coluna, aumentando a largura da faixa. Se o fluxo for muito elevado a difuso tende a ser zero. Entretanto, se o fluxo muito lento a difuso relativamente alta. c) Canais diferenciais: Os canais diferenciais podem ser provocados durante os processos de empacotamento da coluna, devido a quedas que, provocam rachaduras microscpicas, ou mudanas bruscas de solventes. d) Porosidade do suporte 5.3.2- FATORES MECNICOS a) Volume morto das conexes; b) Volume morto das tubulaes; c) Volume morto do injetor (loop); d) Volume morto dos detectores; e) Tubo de sada (no deve apresentar dimetro superior ao das conexes utilizadas) 6- CARACTERSTICAS DAS FASES MVEIS EM CLAE 6.1-VISCOSIDADE A viscosidade do solvente, ou misturas de solventes, empregados em cromatografia a lquido tm importncia fundamental durante o bombeamento isocrtico ou por gradiente. Muitos solventes so descartados como fase mvel, devido sua grande viscosidade, que vai acarretar dificuldades no bombeamento. lcool, metanol, e todos os compostos que tm viscosidade inferior a um, so considerados timos quanto viscosidade e portanto aumentam a facilidade de bombeamento. Os hidrocarbonetos, nesse aspecto, so timos mesmo para homlogos com 8 ou mais tomos de carbono. Em uma mistura de solventes, a viscosidade geralmente no varia linearmente com a composio, mas sim com suas caractersticas de polaridade ou de possibilidade de formao de pontes de hidrognio. Esse fato extremamente importante quando se trabalha com variao da composio da mistura durante uma anlise. A viscosidade uma propriedade que afeta a queda de presso dentro da coluna (a queda de presso proporcional viscosidade), porm, afeta tambm a sua eficincia, pois a fase quanto mais viscosa for, mais afetar o coeficiente de difuso da substncia analisada, acarretando uma perda considervel na eficincia de separao.

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6.2-COMPATIBILIDADE COM TIPO DE DETECTOR UTILIZADO O ndice de refrao um parmetro importante para a escolha da fase mvel, quando se trabalha com os detectores que utilizam esta propriedade para deteco. A maioria dos compostos alifticos simples tem um ndice de refrao entre 1,3 e 1,4; compostos de maior peso molecular ou clorados entre 1,3 e 1,5 e a maioria dos compostos aromticos entre 1,5 e 1,55. Ao se trabalhar com gradiente recomendado que o ndice de refrao dos componentes da fase tenham valores bem prximos, apresentando nesse caso uma menor variao da linha de base. Dos solventes miscveis, a gua, acetonitrila e o metanol possuem ndices de refrao satisfatrios para operao com misturas. Verifica-se que, quanto maior a diferena entre o ndice de refrao da substncia a ser analisada e o da fase mvel, menor ser o valor da quantidade mnima detectada, QMD, isto , maior a sensibilidade. Trabalhando-se com detectores espectrofotomtricos (UV-VIS), deve-se conhecer as regies de absoro da fase mvel utilizada. Uma indicao melhor obtida pela anlise do espectro do solvente; em caso de presena de impurezas, as regies em que o mesmo absorve podem ser alteradas. Denomina-se de cutoff o comprimento de onda abaixo do qual o solvente absorve mais de 1,0 unidade de absorbncia numa clula de 1 cm de comprimento. Tabelas apresentando os valores de cutoff podem ser teis para a escolha da fase mvel adequada. Esses dados so importantes, uma vez que a resposta do detector depende da diferena entre a absorbncia do solvente e a do composto analisado. 6.3-POLARIDADE DA FASE MVEL Quatro tipos de interaes entre molculas do solvente e analito devem ser consideradas: a)Disperso: As interaes de disperso ocorrem porque os eltrons esto em movimento catico e em certos momentos podem assumir uma configurao assimtrica. Em um determinado instante pode-se criar um momento dipolar temporrio numa molcula, polarizando os eltrons de um lado de uma molcula adjacente, repelindo-os conseqentemente. Esse dipolo resultante acarretar numa atrao eletrosttica dessas molculas. As interaes de disperso so maiores para as molculas mais fceis de polarizar. b)Interao dieltrica: a interao dos ons da amostra com os lquidos de alta constante dieltrica. A carga polariza as molculas do solvente que as rodeia, resultando numa atrao eletrosttica da substncia com o solvente. Ela facilita a dissoluo de substncias inicas e ionizveis da amostra em fases polares como a gua, metanol, etc. c)Dipolos: Ocorrem quando existem molculas de solventes e analitos que tm dipolos permanentes. Ocorrem geralmente entre grupos funcionais das prprias molculas.

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Os momentos dipolares de alguns grupos funcionais esto mostrados na Tabela 9, abaixo: Tabela 9- Momento dipolar em unidade debyes
Grupo amina ter sulfeto carboxila -COOH aldedo -CHO nitro -NO2 unidade 0,8 1,2 1,4 1,7 2,3 3,2 Grupo halognios ster tiol hidroxila cetona nitrila -CN unidade 1,6 1,8 1,4 1,7 2,7 3,5

d)Pontes de hidrognio: Pontes de hidrognio entre doadores e aceptores de hidrognio so encontrados comumente na qumica. O par clorofrmio/trimetilamina um bom exemplo de um doador de prtons (clorofrmio) e um aceptor (trimetilamina). Cl3H : N(CH3)3 A polaridade ento a habilidade que tem um solvente de atuar em combinao com os quatro tipos de interaes citadas. A fora do solvente aumenta com a polaridade na partio com fases normais e em adsoro enquanto que, em fase reversa, a fora do solvente diminui com o aumento da polaridade. 6.4-MISCIBILIDADE A necessidade de se efetuar anlises por gradiente ou empregando misturas de solventes, requer que eles sejam miscveis entre si. Insolubilidade leva formao de gotculas de solventes suspensas na sada da coluna, produzindo rudo nos detectores. A substituio de solventes requer que eles sejam miscveis entre si, a fim de se poder lavar a bomba, a tubulao, a coluna e o detector. A Tabela 10 mostra um diagrama de solubilidade entre os solventes mais empregados em CLAE. Tabela 10- Diagrama de solubilidade entre os solventes mais empregados em CLAE
1 hexano (1) tetracloreto de carbono (2) clorofrmio (3) cloreto de metileno (4) ter etlico (5) acetato de etila (6) acetona (7) acetonitrila (8) isopropanol (9) metanol (10) gua (11) cido actico (12) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

indica imiscibilidade

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6.5-DICAS E CUIDADOS COM AS FASES MVEIS A fase mvel deve ser de alta pureza, como um solvente de grau cromatogrfico, permitindo realizar anlises de alta sensibilidade com detectores por fluorescncia ou por absorbncia no ultravioleta, onde as impurezas da fase mvel podem absorver e diminuir a sensibilidade do detector para os componentes da amostra. Quando se utilizar cromatografia lquido-lquido, a fase mvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto, satura-se a fase mvel com a fase estacionaria utilizando-se para isso uma pr-coluna contendo uma alta concentrado da mesma fase estacionaria. No preparo da fase mvel deve-se filtrar o solvente (trabalhar com filtro Millipore) e desgaseific-lo. Deixar o solvente no frasco dentro de banho ultra-som por, no mnimo, 15 minutos. Esse tempo varia conforme a soluo a ser preparada. No caso de solvente orgnico com gua, esse tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de gua e lcool, que exotrmica, deve-se efetuar a mistura e depois desgaseific-la. Em mistura de acetonitrila e gua a desgaseificao deve ser feita em temperatura baixa devido grande volatilidade da acetonotrila. Ao se trabalhar com gua, tomar todos os cuidados para que no se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre o sistema abundantemente e passar um agente de esterilizao (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para anlise de acares utilizar gua ligeiramente acidificada. O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com soluo tampo. Nesse caso uma ateno a mais deve ser dada. No deixar o sistema parado quando se trabalha com tampo, pois pode cristalizar sal na regio do pisto da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pisto. 7- EQUIPAMENTOS PARA CLAE As principais caractersticas que devem ser levadas em considerao na escolha de um equipamento para CLAE so: a) Versatilidade: o equipamento deve resolver amostras de diferentes tipos, servir a distintas tcnicas cromatogrficas e realizar o mximo de operaes, tais como, gradiente de fase mvel, coleta das fraes, reciclagem de fraes, etc., necessrias s anlises sofisticadas. b) Rapidez: Para se conseguir anlises rpidas, deve-se obter as melhores condies de CLAE, isto , fase mvel de baixa viscosidade, bomba de alta presso e colunas com partculas de pequeno dimetro (grande rea de superfcie, que ajuda os processos de separao). c) Reprodutibilidade e Estabilidade: caractersticas essenciais para obter do equipamento um bom funcionamento em longo prazo. O equipamento deve ter controle adequado sobre os parmetros de operao, como vazo, temperatura, presso e composio da fase mvel. d) Sensibilidade: Um bom equipamento, mesmo trabalhando com pequenas quantidades de amostra, deve gerar sinais de intensidade aprecivel.

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A Figura 3 mostra O esquema de um cromatgrafo bsico para CLAE cujos componentes, bem como outros no ilustrados, so descritos a seguir.

Figura 3- Esquema bsico de um cromatgrafo para CLAE 7.1- RESERVATRIO DA FASE MVEL O reservatrio pode ser uma garrafa de solvente bem limpa. Para anlise de ons no se utiliza reservatrio de vidro comum, para evitar que a soluo tenha ons provenientes da parede do reservatrio. Pode-se trabalhar com frasco de polietileno. Utiliza-se esse tipo de frasco quando se trabalha com solues tampo, solues contendo ons F- ou solues levemente alcalinas. No se lava o reservatrio com soluo sulfocrmica, nem muito alcalina, pois estas corroem as paredes internas, favorecendo a transferncia de ons para a soluo. O volume desses frascos varia de 1 a 3 litros de capacidade, o que normalmente suficiente para um dia de trabalho. A captao da fase mvel feita atravs de filtro, para remover partculas que possam obstruir e estragar o sistema de bombeamento e a coluna. Este filtro deve ter a capacidade de reter partculas sem produzir queda excessiva de presso. As fases mveis polares tm tendncia a dissolver oxignio e outros gases. Se esses gases so liberados dentro do equipamento, formam bolhas e podem afetar o funcionamento do detector e a eficincia da coluna. Por esse motivo necessrio remover os gases dissolvidos na fase mvel. Em muitos equipamentos, o prprio reservatrio est condicionado a efetuar a remoo, por exemplo, pela aplicao de vcuo no reservatrio e agitao da fase mvel sob ao de ultra-som e/ou aquecimento. O problema da formao de bolhas tem sido reduzido pela adio de um filtro na sada do detector, o que restringe um pouco a vazo e produz uma pequena presso na cela do detector, impedindo a formao de bolhas.

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7.2- SISTEMA DE BOMBEAMENTO O desenvolvimento do sistema de bombeamento adequado foi o fator mais importante para o desenvolvimento da CLAE. A bomba tem que proporcionar uma vazo razovel atravs da coluna, para que a anlise no seja lenta, e uma vazo constante, para no atrapalhar o sistema de deteco. Os aspectos mais importantes para o sistema de bombeamento so: a) Presso mxima de operao na faixa de 600 bars. b) Vazo contnua, sem pulsos (usando, por exemplo, amortecedor de pulsos). c) Intervalo de vazes entre 0.01 e 10 mL/min, para aplicaes analticas, e at 100 mL/min, para aplicaes preparativas. d) Reprodutibilidade e constncia da vazo de 1 %. e) Inrcia qumica a solventes comuns. f) Pequeno volume bombeado (mximo de 0,5 mL) nos sistemas com bomba de pisto, para uso em eluio com gradiente e reciclagem. g) Volume interno pequeno. Podem ser considerados basicamente dois tipos de bombas, as mecnicas e as pneumticas. Entre as bombas mecnicas existem dois tipos diferentes, recprocas (pisto ou diafragma) e do tipo seringa. 7.2.1- BOMBAS DE SERINGAS COM VOLUME CONSTANTE Chamadas tambm de mbolo ou de deslocamento contnuo, estas bombas possuem um mbolo ou pisto que deslocado de forma contnua e uniforme por um motor de preciso, comprimindo o lquido contido em uma cmara de volume constante. As vantagens apresentadas por essas bombas so no apresentarem pulsao e terem fluxo constante da fase mvel. A desvantagem um reservatrio de solvente limitado, o que dificulta o reenchimento e a mudana da fase mvel, pois implica parar o sistema e despressurizar. 7.2.2- BOMBAS DE SERINGAS COM PRESSO CONSTANTE Esta bomba tem um pisto que se movimenta pela ao de agente pneumtico. O reservatrio da bomba cheio pela fora do ar comprimido, que desloca o pisto ou diafragma. As vazes obtidas so livres de pulsaes e de presso constante, mas isso significa que, se a resistncia presso da coluna muda, a vazo tambm muda. As desvantagens deste sistema so: Instabilidade na velocidade do fluxo; Mudanas no tempo de reteno, dificultando a interpretao dos resultados; Capacidade limitada do volume total que pode ser bombeado; 7.2.3- BOMBAS RECIPROCADORAS So bombas que escoam volumes constantes de forma no contnua, isto , pulsante. Essas bombas operam mediante o movimento de um pisto (movimentado por via de um eixo 18

excntrico) e atravs de um sistema de vlvulas que alternadamente se abrem e fecham, onde se enche e esvazia, de modo alternativo, uma pequena cmara. Estas bombas apresentam um volume interno de 100-200 L (Figura 4).

Figura 4- Desenho esquemtico de bomba reciprocadora. O selo do pisto um disco de teflon fixo no interior do corpo da bomba, feito de ao inoxidvel quimicamente resistente. Os pistes so de safira, que confere resistncia ao ataque da maioria dos solventes utilizados em CLAE. Uma vlvula (check-valve) tpica consiste em uma esfera de rubi aparada em base de safira, formando um selo. A presso dentro do reservatrio da bomba a responsvel pela abertura e o fechamento do selo. Estes movimentos dependem da localizao da esfera (na entrada ou na sada da vlvula). Existem dois tipos de vlvula (checkvalve). Na primeira a esfera funciona atravs da fora da gravidade. E na segunda a vlvula tem uma mola metlica (ao inoxidvel apoiada sobre a esfera de rubi). A mola mantm a vlvula fechada at que a presso desenvolvida pela bomba force a contrao da mola, possibilitando a passagem do solvente. Alm disso, a mola impede que a vlvula abra em baixas presses. As principais vantagens deste tipo de bomba so uma vazo com volume constante, capacidade de alimentao contnua do sistema, facilidade na mudana da fase mvel e o trabalho com pequenos volumes. Uma das desvantagens deste tipo de bomba que se obtm uma vazo pulsante e no uniforme e contnua. Isto pode causar perda de eficincia na coluna e instabilidade no detector. Sistemas de amortizao hidro-pneumticos, localizados entre a bomba e a coluna, tm sido utilizados para solucionar esse problema. A forma mais simples de amortecedor utilizada consiste de uma seco normalmente espiralada de espessura reduzida de ao inoxidvel ou tubo de teflon (6 m x 1 mm). Este tubo capilar se deixa fluir livremente e assim absorve as pulsaes produzidas pela bomba. A grande desvantagem desse tipo de amortecedor seu grande volume morto, que pode provocar alargamento da banda cromatogrfica, alm de tornar o processo de mudana da fase mvel lento e dispendioso.

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7.2.4- BOMBAS RECIPROCADORAS DE DUPLO-PISTO Neste tipo de bomba, dois pistes so acionados por um mesmo eixo excntrico, de forma que, quando um pisto succiona a fase mvel, o outro expulsa o lquido para fora da bomba. A vazo de ambos os pistes, j quase livre de pulsao, encaminhada coluna por uma via comum. Assim o sistema de duplo pisto tem todas as vantagens da reciprocadora de pisto simples, alm da vantagem adicional da grande diminuio do problema de pulsao.

Figura 5- Desenho esquemtico de bomba reciprocadora de duplo pisto. 7.3- VLVULAS PARA AMOSTRAGEM Anteriormente, a introduo da amostra era efetuada de forma similar realizada na cromatografia gasosa, ou seja, mediante micro-seringa que injeta a amostra dentro de uma pequena cmara, de onde eluda pela fase mvel. Os equipamentos modernos empregam vlvulas para amostragem, como a ilustrada esquematicamente na Figura 6. A amostra, introduzida na vlvula mediante seringa, deve encher o espao interno da poro do tubo capilar de ao, a ala de amostragem (carga). Normalmente o volume contido na ala de 1 a 100 L. A amostra injetada na coluna, ao girar a vlvula para que a posio de entrada e sada mude (injeo na coluna). Desta forma pode injetar-se na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de amostra, dependendo do tubo capilar (ala de amostragem) utilizado, com um alto grau de reprodutibilidade. As vlvulas para amostragem so fabricadas somente de material inerte, como teflon e ao inoxidvel, e seu desenho tal que resistem a presses muito elevadas.

Figura 6: Vlvula de amostragem para CLAE. Posio de carregar e posio de injeo.

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7.4- DETETORES USADOS EM CLAE Uma instrumentao melhor requerida para a CLAE, em relao sensibilidade dos detectores, para monitorizao do efluente que sai da coluna. Infelizmente as propriedades fsicas ou fsico-qumicas da amostra e fase mvel so, muitas vezes, similares. Algumas solues para o problema de deteco tem sido procuradas no desenvolvimento da CLAE: Medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas: amostras e fase mvel Medidas de uma propriedade da amostra que no apresentada pela fase mvel. Deteco aps a eliminao da fase mvel.

Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em uma destas solues. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes caractersticas: a) Alta sensibilidade e baixo limite de deteco b) Resposta rpida a todos os solutos c) Insensibilidade a mudanas nas temperatura e na vazo da fase mvel. d) Resposta independente da fase mvel e) Pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector. f) Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto g) No destruio do soluto. h) Segurana e convenincia de uso. i) Informao qualitativa do pico desejado. Infelizmente, no existe um detector que apresente todas estas propriedades, a no ser que ele seja desenvolvido. A Tabela 11 resume algumas das propriedades dos detectores. Tabela 11- Propriedades de alguns detectores usados em CLAE
Item Princpio de operao Tipo Quantidade mn. detectvel (g/mL) Sensibilidade temperatura Sensvel vazo da fase mvel til com gradientes Aplicaes Detector espectrofotomtrico (UV-VIS) absorbncia de luz na faixa do UV-VIS seletivo Fixo: 10-10 Var: 10-9 baixa no sim compostos que absorvem na regio de trabalho Detector por ndice de refrao mudanas no ndice de refrao da fase mvel universal 10-7 alta no no compostos em geral Detector por fluorescncia emisso fluorescente aps excitao com luz altamente seletivo de 10-9 at 10-12 baixa no sim compostos ou derivados que fluorescem Detector eletroqumico oxidao ou reduo em potencial fixo seletivo 10-12 mdia sim no Espcies que se oxidam ou se reduzam

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7.4.1- DETECTORES POR ABSOBNCIA NO ULTRAVIOLETA E NO VISVEL Nos detectores espectrofotomtricos o seu funcionamento baseia-se na absorbncia de luz por parte da amostra ao passar atravs dela qualquer radiao eletromagntica; normalmente isto ocorre no ultravioleta at o infravermelho, em um dado comprimento de onda. Existem dois tipos de detectores de luz ultravioleta: o de comprimento de onda varivel (espectrofotmetros), que no s de aplicao mais variada e sensvel, mas tambm mais caro, e o chamado fotomtrico que funciona com um ou dois comprimentos de onda fixos. Este ltimo sensvel, econmico e mais que suficiente para se conseguir bons resultados com todos os compostos que absorvem luz no comprimento de onda em que ele funciona. Este tipo de detector normalmente insensvel a variaes de vazo e temperatura. A maioria dos detectores de comprimento de onda fixo, oferecidos no mercado, operam em um comprimento de onda de 254 nm e um de 280 nm, resultado da absorbncia de luz em 254 nm e da emisso de luz em 280 nm por uma substncia fosforescente. Em timas condies, pode-se atingir sensibilidades de at 0,001 unidades de absorbncia e, se o composto absorve intensamente na faixa de UV, possvel detectar quantidades de amostras da ordem de nanogramas (10-9 g). Quando se aplica gradiente na fase mvel e ela apresenta variao significativa de absorbncia para o UV, necessrio utilizar a cela de referncia para compensar esta variao. Se a fase mvel no absorve ou se a absorbncia constante, pode-se deixar a cela de referncia vazia ou cheia com um dos componentes da fase mvel. A Figura 7 mostra o desenho de uma clula para CLAE.

Figura 7- Clula do detector de ultravioleta para CLAE. Espectrofotmetros de comprimentos de onda varivel UV-VIS, cobrindo a faixa de 190-800 nm, atravs de monocromador que seleciona o comprimento de onda desejado do feixe de luz emitido pelas lmpadas de deutrio (UV) ou tungstnio (VIS), oferecem vrias vantagens sobre os instrumentos de comprimento de onda fixo: a) Apresenta alta absorbncia para vrios componentes devido escolha de comprimento de onda e, conseqentemente, tem maior sensibilidade. b) Permite maior seletividade, desde que um determinado comprimento de onda pode ser escolhido, onde o soluto de interesse absorve bastante e outros no. 22

c) Promove eficincia em eluio por gradiente atravs da habilidade de selecionar um comprimento de onda onde os componentes da fase mvel no apresentam uma variao de absorbncia para diferentes concentraes. d) Permitir obter o espectro de absorbncia de cada componente em separado aps parar a vazo da fase mvel. Anlises em diferentes comprimentos de onda tambm so possveis com os detectores espectrofotomtricos atravs de um conjunto de fotodiodos. Esses fotodiodos, seletivos a determinados comprimentos de onda, em grande nmero, cerca de 250, permitem levantar o espectro da substncia durante a eluio. Este detector denominado detector de rede de diodos (diode array detector), cujo esquema se encontra na figura 8. Os detectores de rede de diodos eram, at a alguns anos, pouco sensveis, mas na atualidade, com a melhora dos computadores com programas dedicados para este fim, com o aumento da sensibilidade dos diodos e com correes da aberrao da rede de difrao, eles aumentaram sua sensibilidade e aplicabilidade.

Figura 8- Esquema de um detector de rede de diodos.

Na figura 9 pode-se observar um espectro de absoro, obtido em trs dimenses por microcomputador acoplado ao detector de rede de diodos, da eluio de uma mistura de trs esteris, obtido em intervalos de 5 segundos.

Figura 9 - Espectro de absoro da eluio de uma mistura de trs esterides, varreduras em intervalos de 5 segundos. 7.4.2- DETECTORES POR NDICE DE REFRAO o segundo detector mais usado na CLAE. Este detector acompanha continuamente a diferena de ndice de refrao entre a fase mvel pura e o efluente que sai da coluna contendo 23

os componentes da amostra. Para solutos que no absorvem no UV ou visvel e, conseqentemente, no so detectados por detectores fotomtricos, a melhor escolha o detector por ndice de refrao. A resposta deste detector universal e sua sensibilidade moderada, geralmente da ordem de micrograma (10-6 g). Este nvel de concentrao corresponde a uma diferena no ndice de refrao entre a amostra e a fase mvel de aproximadamente 10-7 unidades de ndice de refrao. Para observar esta diferena necessrio um controle de temperatura de aproximadamente 0,001 oC, o que normalmente conseguido por circulao de gua, de uma boa fonte termostatizada, atravs do refratmetro ou um bom controle da temperatura ambiente. Alm deste problema com a temperatura, existem ainda outros: a sensibilidade s variaes de vazo e mudanas na composio da fase mvel, que impedem o uso de gradiente por ser difcil encontrar um par de solventes com ndices de refrao idnticos. Qualquer mudana na composio da mistura mudar o ndice de refrao da fase mvel, ento, o lado da referncia ter que mudar, o que quase impossvel. A figura 10 apresenta o esquema de um tipo de detector por ndice de refrao.

Figura 10- Esquema de um detector refratomtrico por deflexo. 7.4.3- DETECTORES POR FLUORESCNCIA A espectroscopia de fluorescncia um mtodo de deteco dos mais sensveis da atualidade, especfico para compostos que fluorescem. Em boas condies possvel detectar quantidades da ordem de picogramas (10-12 g), o que comparvel aos detectores por captura de eltrons em CG. Uma alta intensidade de fluorescncia esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que no podem produzir estruturas fortemente inicas. A fase mvel empregada nos detectores de fluorescncia deve ser cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emisso depende do meio em que se encontra a amostra. Isto dificulta algumas de suas aplicaes, tais como anlise quantitativa e eluio por gradiente, nas quais deve-se selecionar os componentes da fase mvel para no atrapalhar a fluorescncia. Os detectores para fluorescncia tambm podem proporcionar espectros de emisso das amostras retidas momentaneamente na sua cela. Desde que uma fonte de UV necessria em ambos os detectores, por absorbncia no UV e por fluorescncia, eles podem ser combinados em um s detector.

Figura 11- Esquema de um detector por fluorescncia

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7.4.4- DETECTORES ELETROQUMICOS Mtodos eletroqumicos de deteco oferecem a mais promissora soluo para o problema de desenvolvimento de um detector para CLAE suficientemente sensvel e no baseado em absorbncia de luz. Eles oferecem vantagens de alta seletividade, alta sensibilidade e serem muito bons para as anlises de traos. importante destacar que, neste tipo de deteco, a amostra tem que ser constituda de ons ou compostos que sofram ou oxidao ou reduo (detectores polarogrficos). Este detector seletivo, porque detecta somente as espcies que se oxidam (ou reduzem) em um potencial inferior ou igua1 ao fixado. Os detectores eletroqumicos so bons para as modalidades de cromatografia que usam fases mveis aquosas, tais como a cromatografia por troca inica, por excluso ou com fase reversa por pares de ons ou ate com fase reversa com compostos oxidveis na fase gua-lcool. 7.4.5- DETETORES POR ABSORBNCIA NO INFRAVERMELHO A absorbncia no infravermelho pode ser usada como detector universal ou especfico. A sensibilidade destes detectores, oferecidos no comrcio, muito pequena para as quantidade de amostra normalmente usadas, mas eles so usados com sistemas de CLAE por excluso. Usando a tcnica de parar a vazo com a amostra na cela e tirar o espectro de infravermelho, dar uma imagem analtica completa da amostra. Este tipo de detector limitado pela fase mvel que deve ser transparente no comprimento de onda utilizado. 7.4.6- DETECTORES DE RADIOATIVIDADE Os detectores de radioatividade so projetados especificamente para detectar solutos radiomarcados conforme so eludos da coluna. Quase todos detectores deste tipo no so encontrados comercialmente, com exceo dos que detectam as partculas - do
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P e do

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C.

Para o segundo, que funciona atravs de cintilao lquida, h necessidade da adio de um coquetel de cintilao. Detectores radioqumicos tm uma grande faixa de resposta, so insensveis a troca de fases mveis, podendo ser usados com eluio por gradiente. Aplicaes cromatogrficas com emissores de e de - forte (tais como 131I, 210Po e 125Sb), usando sistemas de cintilao ou mesmo contador Geiger, tm sido publicadas. 7.4.7- DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS Os espectrmetros de massas so um tipo de detector para CLAE que pode combinar sensibilidade, versatilidade e universalidade e seu potencial de utilizao muito grande. A maior dificuldade na utilizao destes detectores o interfaceamento com o sistema de CLAE e o seu alto custo quando comparado aos outros detectores mais usados. 7.4.8- OUTROS DETECTORES Detectores baseados em outras propriedades do soluto (como, constante dieltrica, densidade, presso de vapor, viscosidade etc.) tm sido apresentados para serem usados na CLAE. Vrios destes detectores so baseados em propriedades que dependem da temperatura, fazendo sua resposta depender da variao trmica. 25

8- APLICAES

Figura 12 - Os cromatogramas acima so uma mistura de seis esterides: (1) predinisona, (2) cortisona, (3) hidrocortisona, (4) dexametasona, (5) corticosterona, (6) cortoexolona. A coluna de 150 mm por 4 mm de dimetro interno, recheada com fase reversa C8.

Figura 13 - Aplicao de cromatografia de excluso. (a) Separao de cidos graxos. Coluna a base de poliestireno, 7,5 cm x 600 nm, com limite de excluso de 103. Tetrahidrofurano como fase mvel, numa vazo de 1,2 mL/min. Detector de ndice de refrao. (b) Anlise de resina epxi comercial (n = n de unidades monomricas no polmero). Coluna de slica porosa 6,2 x 250 mm. Fase mvel de tetrahidrofurano, numa vazo de 1,3 mL/min. Detector de UV.

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Figura 14 - Os cromatogramas so de uma mistura de benzeno e clorobenzenos. No primeiro caso, a eluio foi de modo isocrtico, com uma mistura de metanol/gua 50/50. No segundo caso, a eluio foi por gradiente, partindo de metanol/gua 40/60 e aumentando o teor de metanol em 8%/minuto. A coluna foi de 25 cm 4,1 mm de dimetro interno, com fase reversa C18. Sabe-se que os compostos analisados so (1) benzeno, (2) clorobenzeno, (3) odiclorobenzeno, (4) 1,2,3-triclorobenzeno, (5) 1,3,5-triclorobenzeno, (6) 1,2,4-triclorobenzeno, (7) 1,2,3,4-tetraclorobenzeno, (8) 1,2,3,5-tetraclorobenzeno, (9) pentaclorobenzeno e (10) hexaclorobenzeno.

Figura 15 - Separao de aminocidos em coluna de troca inica. Empacotamento: troca catinica com partculas de 8 m de dimetro.

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Figura 16 - Uma aplicao tpica de cromatografia de adsoro: separao de cis- e transpirazolina. Coluna 10 x 0,3 cm de slica pelicular. Fase mvel 50/50 diclorometano/isoctano, temperatura ambiente e vazo de 0,25 mL/min. Detector UV 254 nm. 9- BIBLIOGRAFIA COLLINS, C. H. & GUIMARES, L. F. L., Cromatografia lquida de alta eficincia. In: Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introduo a Mtodos Cromatogrficos, 3. ed., Ed. UNICAMP, So Paulo, 1988, p 179 - 243. MACRAE, R.; HPLC in Food Analysis, , Academic Press Inc., London, 1982, 341p. FALLON, A.; BOOTH, R. F. G. & BELL, L D., Aplications of HPLC in biochemistry, 3. ed, Elsevier Science Publishers, London, 1993, 338p. CIOLA, R., Fundamentos da Cromatografia a Lquido de Alto Desempenho, , ed. Edgard Blcher Ltda., So Paulo, 1998 LEON, R., El Libro Basico para Cromatografia de Lquidos, ed. Milton Roy Company, Flrida, 1982. SKOOG, D. A. & LEARY, J. J., High-Performance liquid Chromatography In: Principles of Instrumental Analysis, 4 ed., Harcourt Brace College Publishers, Flrida, 1992, p 628 - 669. SNYDER, L. R. & KIRKLAND, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2 ed., John Wiley & Sons, New York, 1979.

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