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IL DESTINO

DEGLI INQUINANTI ORGANICI


NEGLI ORGANISMI
EFFETTI
DELL’INQUINAMENTO SUGLI
ORGANISMI
Livelli di azione dell’ inquinamento

Gli effetti di una sostanza tossica possono rivelarsi a vari livelli di scala

Livello organismico
modificazione di elementi strutturali e/o funzionali
(membrane, sistemi enzimatici, ormoni, acidi nucleici)
funzionalità nervosa, muscolare, endocrina, metabolica
probabilità di sopravvivenza, efficienza riproduttiva

Livello di popolazione
modificazione della struttura in classi di età
modificazione dei parametri demografici (natalità, mortalità)
incremento delle probabilità di estinzione

Livello di comunità
biodiversità
stabilità
PROPAGAZIONE DEGLI
EFFETTI DELL’INQUINAMENTO
Il singolo organismo è il bersaglio primo dell’ azione degli inquinanti

Se la funzione interessata è rilevante in termini di idoneità e se il danno interessa


un numero sufficientemente ampio di organismi, si verifica un effetto sulla
funzionalità dell’intera popolazione

Se le popolazioni interessate dal danno sono diverse oppure se anche una sola
popolazione è interessata, ma questa occupa un ruolo chiave nella comunità (key
stone species), il danno si trasferisce all’ intera comunità
Insetticidi
organofosforici

Acetilcolinaesterasi
VIE DI INGRESSO DEGLI INQUINANTI
NELLA COMPONENTE BIOTICA
• dall’ aria respirazione in piante e animali
• dall’ acqua traspirazione, bilancio idrico nelle piante
• dai sedimenti alimentazione nei detritivori
• da altri organismi alimentazione nei consumatori

Indipendentemente dalla rotta di ingresso, gli inquinanti devono


superare la barriera costituita dalla membrana plasmatica o dalla
parete cellulare
LE VIE DI ESPOSIZIONE DEGLI ORGANISMI

Sistema
Acquatico
Vapori
Animali
Sistema
Acquatico

Vegetali,alghe,
batteri
Acqua

Ambiente
Terrestre
Animali
Destino di
una sostanza
tossica in un
organismo
Circolazione
all’interno degli
organismi e
destino
Siti di stoccaggio
organi, tessuti, comparti
cellulari in cui la sostanza
viene accumulata ma non c’è
interazione chimica con le
macromolecole dell’organismo.

Non c’è azione della sostanza


sull’organismo né viceversa

Siti di azione
la sostanza interagisce con macromolecole (proteine, acidi nucleici) o
strutture (es. membrane) dell’organismo interferendo sulla loro funzione
(danno che si ripercuote a livello dell’intero organismo)

Siti di metabolismo
enzimi che modificano la sostanza xenobiotica (la sostanza modificata è di
solito meno tossica, ma può succedere il contrario)
Possono esserci più tipi di sito per ogni categoria

(es.: una sostanza lipofila può avere come sito di stoccaggio sia i depositi
di grasso che lo strato lipidico delle membrane cellulari)

Possono esserci più parti del corpo in cui è presente lo stesso tipo
di sito di azione

(es.: una neurotossina agisce sia sui neuroni del sistema nervoso
centrale che su quelli del sistema nervoso periferico)
TOSSICOCINETICA E
TOSSICODINAMICA
Tossicocinetica
-assorbimento + distribuzione + accumulo +metabolismo + escrezione

determina la quantità di sostanza attiva (sostanza originale o


prodotto del suo metabolismo) che entra in contatto con i siti di
azione

Tossicodinamica
- azione tossica propria

l’effetto tossico di una sostanza è determinato da entrambe le


componenti
A)
ASSORBIMENTO
- diffusione attraverso membrane biologiche
- assorbimento intestinale in associazione con i lipidi alimentari

Caratteristiche che influenzano la velocità

1) dimensioni della molecola (peso molecolare)

sono favorite molecole più piccole

2) idrofobicità (Ko,w)

sono favorite molecole con Ko,w intermedi

3) carica elettrica

sono favorite molecole non cariche

4) influenza del pH
LE VIE DI
ASSORBIMENTO
In questo caso le
molecole trasportate non
sono in grado di
oltrepassare la
membrana in quanto non
sono liposolubili e hanno
quindi bisogno di mezzi
che colleghino l’interno
della cellula con
l’esterno. Questi mezzi
sono detti proteine
canale o trasportatori e
 diffusione passiva trasporto
fungono da attivo (sopratt.
“canali” nella
 diffusione facilitata (canali) escrezione/eliminazione…..contro
membrana cellulare
gradiente! Ad es. pompe così
permettendo Na+-Caun2+
)
passaggio di materiale
 pinocitosi
che (l'assunzione
altrimenti di non piccole
quantitàsarebbe
liquide potuto
e delle sostanze
avvenire
sciolte al loro interno dal liquido
infracellulare di una cellula verso il
suo interno)
MECCANISMI MOLECOLARI ATTRAVERSO CUI PUO’ AVVENIRE
IL PASSAGGIO ATTRAVERSO LA MEMBRANA PLASMATICA

A B C D E

A: diffusione passiva: il passaggio è regolato dal grado di lipofilia


B: diffusione attraverso canale
C: diffusione mediata da trasportatore
D: endocitosi in fase fluida (pinocitosi)
E: endocitosi mediata da recettore
Diffusione Trasporto Pinocitosi
passiva attivo

ATP ATP
Molecole <0.4 nm Molec.polari Grandi molecole
HCN, N2O, CO Organoclorurati
nei polmoni Metalli
FAGOCITOSI, PINOCITOSI, ENDOCITOSI

Indicano i processi di internalizzazione di materiale (di varia grandezza)


dall’esterno all’interno della cellula o viceversa (esocitosi).

Per internalizzare una particella di una certa dimensione e’ necessario


che, con l’aiuto del citoscheletro si formi un’estroflessione della
membrana che circondi il materiale da fagocitare fino a formare una
vescicola o fagosoma.
Un particolare tipo di endocitosi e’
l’endocitosi mediata da recettore: un
ligando puo’ essere internalizzato dalla cellula
solo se e’ preventivamente riconosciuto e legato
da un recettore. I recettori sono situati in
particolari aree specializzate della membrana,
dove si formeranno (una volta che si legano con
il ligando) delle“fossette rivestite” che si
evolveranno in “vescicole rivestite”.
Il rivestimento presente sul versante citoplasmatico e’ costituito
da clatrina.

La clatrina è una molecola costituita da un triskelion (3 proteine a


forma di S tenute insieme da una quarta proteina) che forma un
canestro che riveste completamente prima la fossetta e poi la
vescicola di endocitosi. La clatrina è collegata al citoscheletro per
permettere il movimento dell’endosoma all’interno del
citoplasma.
Trasferimento alla prole

Può essere considerato come un caso particolare di assorbimento

Mammiferi
- placenta, cordone ombelicale
- latte

Altri organismi
- rettili, uccelli: depositi di riserva delle uova

Piante: depositi di riserva dei semi


B)
ITRASPORTO
liquidi circolanti (sangue, linfa, emolinfa) hanno un ruolo fondamentale

Vertebrati:
-le sostanze assorbite attraverso il tratto digerente
entrano nel sistema portale e arrivano prima di tutto al fegato

Insetti:
Trachee

Piante vascolari:
simplastica se assorbimento è stato a livello fotosintetico: trasporto xilematico;
via apoplastica se a livello radicale: trasporto floematico

Le esatte modalità dipendono dalle caratteristiche della sostanza (peso


molecolare, idrofobicità)

- le sostanze più idrofile sono trasportate in soluzione nei liquidi circolanti

- le sostanze con Ko,w intermedio e PM < 800 Da si muovono per diffusione


attraverso le membrane biologiche o associate alle cellule circolanti
-le sostanze con Ko,w e PM elevati sono trasportate dalle lipoproteine
composti di biomolecole idrofobe deputate al raccoglimento ed al trasporto di lipidi (trigliceridi, colesterolo etc)
C) ACCUMULO
Molti inquinanti presentano affinità specifiche per certi tessuti o
organi, che quindi vengono detti organi bersaglio, dove vengono
accumulati ed esercitano la loro tossicità

Hg: rene; fegato; milza; intestino; cuore; musc. schel.; ossa;

Pb: SNC e scheletro

Cd: rene e ossa

MOS: tessuto adiposo

pesticidi organofosforici: SNC

asbesto: polmoni

cloruro di vinile: fegato


In generale, l’accumulo avviene preferenzialmente:

-grassi di deposito (possibile tossicità ritardata)

-bi-strato lipidico delle membrane biologiche


(una membrana che funge da sito di accumulo per una
determinata sostanza, può comportarsi come sito di
metabolismo o di azione per un’altra)

Un esempio di tossicità ritardata: Somateria mollissima (Edredone) in


Olanda negli anni ‘60
- moria di femmine durante la stagione riproduttiva; nei maschi non si
osservava alcun effetto
Animali caratterizzati da considerevoli depositi di grasso

L’insetticida dieldrin vi si concentrava con efficacia 10-20 volte


maggiore che nel fegato o cervello. Quando i grassi erano utilizzati
per la produzione delle uova la concentrazione nel sangue
passava da 0.02 μg ml-1 0.5 μg ml-1
BIOTRASFORMAZIONE E
DEGRADAZIONE DEGLI INQUINANTI
Le sostanze chimiche rilasciate nell’ ambiente possono essere
trasformate

in altre sostanze simili


degradate in molecole di minor peso molecolare

La trasformazione è il risultato di processi di


ossidazione
idrolisi metabolismo

attraverso i quali il composto originario acquisisce gruppi polari


(idrossilici, carbossilici ecc.) che ne aumentano la solubilità in acqua
1) L’organismo ha sviluppato dei meccanismi (Biotrasformazioni) per
processare questi composti facilitandone l’escrezione

2) La biotrasformazione degli agenti esogeni (xenobiotici) penetrati


nell’organismo gioca un ruolo fondamentale nel determinarne la tossicità

3) Nella maggioranza dei casi le reazioni di biotrasformazione


(genericamente “metabolismo”) esercitano un’azione detossificante. I
metaboliti sono caratterizzati dall’avere una minore attività biologica e
sono più facilmente eliminabili

4) In alcuni casi, però, le reazioni di biotrasformazione esercitano


un’azione tossificante. I metaboliti sono responsabili della tossicità
dello xenobiotico. In questo caso si parla di attivazione metabolica, o
bioattivazione, del composto.
Intossicazione: la sostanza estranea è assunta dall’esterno in forma attiva

Tossificazione: la sostanza lesiva è generata all’interno dell’organismo a


partire da un precursore non tossico o meno tossico
ESEMPI
paracetamolo
metabolita solfoconiugato
SO3H La velocità alla quale sostanze
diverse vengono allontanate dal
plasma fornisce un’indicazione
utile per la valutazione
quantitativa dell’efficienza
dell’escrezione renale

clearance renale clearance renale


definita come il volume di
plasma che viene depurato di
12ml/min 170ml/min quella sostanza nel suo
passaggio attraverso il rene,
nell’unità di tempo

sulfamidico metabolita acetilato


CH3CONH

La solubilità in H2O del metabolita acetilato è diminuita. Ciò può


provocare la precipitazione del composto nei tubuli renali e causare
tossicità.
Principali conseguenze della biotrasformazione
- diminuzione dell’emivita dello xenobiotico
- riduzione della durata di esposizione dell’organismo allo xenobiotico
- riduzione della possibilità di accumulo dello xenobiotico nell’organismo
- modificazione dell’attività biologica dello xenobiotico

Un ulteriore esempio, da parte di batteri (Pseudomonas stutzeri)

Applicazioni: BIODEGRADAZIONE, BIORISANAMENTO


METABOLISM
O volta assunte le sostanze
Una tossiche l’organismo le tratta in vari
modi, per eliminarle più rapidamente possibile e comunque per ridurre
il tempo di esposizione

I processi di detossificazione richiedono enzimi evolutisi per far


fronte a stress ambientale naturale o inquinamento antropogenico

La trasformazione delle sostanze tossiche avviene in due fasi:

Fase I: polarizzazione
Fase II: coniugazione
+

=
-
Fase I
- ossidazione, idrolisi, riduzione, dealogenazione polarizzazione
- enzimi associati alle membrane (reticolo endoplasmatico)

Fase II
- Reazioni di coniugazione con un composto endogeno
detossificazione
(ione glucuronico e ione solfato)
- enzimi associati al citosol
LA FASE I

Le reazioni di fase 1 hanno lo scopo di alterare la struttura della molecola,


introducendo gruppi funzionali del tipo

-OH (idrossilico)
-SH (tiolico)
-NH2 (aminico)
-COOH (carbossilico)

che possano poi essere coniugati con gruppi endogeni polari (reazioni di
fase 2), in modo da rendere l’intera molecola idrosolubile e riconoscibile
dai sistemi di trasporto attivo

Se il prodotto esogeno possiede già un gruppo funzionale disponibile per


una reazione di fase 2, può saltare la fase 1 ed essere direttamente
coniugato
OH O-SO3H
fase 1 fase 2

benzene fenolo fenil solfato

OH O-SO3H

fenolo fenil solfato


fase 2

NH-SO3H
NH2

anilina fenil sulfamato


Tutti gli enzimi biotrasformativi delle sostanze esogene sono
caratterizzati da una bassa specificità di substrato in quanto essi devono
essere attivi su una grande varietà di substrati

Localizzati principalmente nel fegato (la maggior parte degli agenti


chimici entra nell’organismo attraverso il tratto gastrointestinale e
tramite la vena porta arriva direttamente al fegato)
Oltre al fegato, altri tessuti, organi e fluidi come rene, intestino,
polmone, gonadi, plasma hanno capacità metabolizzanti

Anche la flora batterica intestinale possiede enzimi importanti per la


biotrasformazione degli xenobiotici

La grande maggioranza degli enzimi


della fase 1 sono microsomiali
(presenti cioè nel reticolo
endoplasmatico), mentre molti enzimi
della fase 2 sono citosolici

enzimi di membrana
Enzimi della fase 1

A) ossidasi a funzione mista contenenti citocromo P-450 (microsomiali)

B) ossidasi a funzione mista flaviniche (microsomiali)

C) ossidasi e deidrogenasi varie (citosoliche o non microsomiali)

D) riduttasi contenenti citocromo P-450 (microsomiali)

E) riduttasi varie (citosoliche o proprie della flora batterica intestinale)

F) idrolasi varie (citosoliche e/o microsomiali)


A) Reazioni di ossidazione catalizzate dalle ossidasi a
funzione mista contenenti il sistema del citocromo P-450

1) idrossilazione dei composti aromatici


2) idrossilazione dei composti alifatici ed aliciclici
3) epossidazione
4) N-, O-, e S-dealchilazione
5) N-idrossilazione
6) deaminazione ossidativa
7) N- e S-ossidazione (desolforazione)
8) dealogenazione ossidativa
9) ossidazione dell’etanolo (da parte del sistema microsomiale ossidativo
dell’etanolo, MEOS)
10) desaturazione di gruppi alchilici
C-idrossilazione dei composti aromatici
e dei composti alifatici ed aliciclici reazioni catalizzate
epossidazione specificamente
da P-450
N-, O-dealchilazione
dealogenazione ossidativa
P-450

S-dealchilazione
N-idrossilazione reazioni catalizzate
anche dalle ossidasi
N- e S-ossidazione (desolforazione)
flaviniche microsomiali
deaminazione ossidativa

reazioni catalizzate
da enzimi specifici non
microsomiali (monoamino
ossidasi o diamino ossidasi
mitocondriali)
Fase I LE MONOOSSIGENASI A FUNZIONE MISTA

Ossidazione catalizzata dalle monoossigenasi microsomiali (del reticolo


endoplasmatico liscio)

enzimi Mixed Function Oxidase (ossidasi a funzione mista)

è il meccanismo più diffuso e conservativo; interessa la maggior parte


dei composti xenobiotici lipofili a PM < 800
utilizza ossigeno legato al citocromo P450 (emoproteina)
Il MFO (mixed function oxidase) è un complesso multi enzimatico ad
ampio spettro d’azione coinvolto

-nei processi di detossificazione da composti xenobiotici (farmaci,


pesticidi, composti aromatici e clorurati, sostanze cancerogene)

-nel normale metabolismo di molecole endogene come acidi grassi e


ormoni steroidei

La reazione richiede la partecipazione del cofattore NADPH, secondo lo


schema generale

R-H+NADPH+ + H + O2 ROH + H2O + NADP+

Nicotinammìdeadenìndinucleotìdefosfato; una macromolecola


organica il cui ruolo biologico consiste nel trasferire gli e-, quindi
nel permettere le ossidoriduzioni;svolge il suo importante ruolo
tramite lo spostamento di atomi di idrogeno.
Tre sono le reazioni fondamentali:
-ossidazione
-riduzione
-idrolisi

L’andamento generale prevede l’aggiunta di gruppi funzionali polari:


-NH2
-COOH
-OH
-SH
ect.....
Il sistema è costituito da tre componenti fondamentali
due di natura proteica NADPH-citocromo P-450 riduttasi / citocromo P-450

una di natura lipidica Fosfolipide (principio attivo:fosfatidilcolina)

Il citocromo P-450 rappresenta il nucleo fondamentale del complesso


multienzimatico

E’ una emoproteina, svolge un ruolo fondamentale nell’attivazione dell’O2


e nella sua cessione al substrato

Con la porzione proteica stabilisce contatto con le componenti della


membrana microsomiale e la sostanza esogena

Il gruppo eme è dato dal complesso di una protoporfirina al Fe, che,come


tipico di tutti i citocromi, oscilla tra lo stato trivalente e bivalente
all’interno del ciclo di attività

Agisce da veicolo di e- dal gruppo NADPH riduttasi all’O2 molecolare


Con la porzione prostetica (eme) stabilisce quindi un legame con
l’ossigeno utilizzato per il processo di ossidazione dello xenobiotico

La NADPH riduttasi, una flavoproteina funziona da trasportatore di


e- dal NADPH al citocromo P-450 svolgendo quindi attività
rigeneranti nei confronti dell’emoproteina in seguito ai processi
ossidativi

La componente lipidica (fosfatidilcolina) ha il compito di facilitare


il trasporto di e- da NADPH riduttasi al citocromo P-450. Non
sembra svolgere direttamente il ruolo di carrier, ma piuttosto
sembra facilitare il passaggio degli e- dalla flavoproteina al
citocromo

Altre proteine svolgono ruoli secondari non del tutto chiariti


(citocromo b5, citocromo b5 riduttasi)!
1) Il citocromo P-450 si lega al substrato da ossidare

in questa fase l’emoproteina presenta il ferro in forma ferrica

2) Il sistema rigenerante NADPH-rid converte il ferro nella forma


ferrosa utilizzando una molecola di NADPH per il trasferimento
degli e-

3) Il citocromo a questo punto può catturare una molecola di O2

Questo O2 sfrutterà un atomo per l’ox del substrato ed un altro per


la formazione della molecola di acqua, ritornando nella sua fase
ossidata

4) Il composto xenobiotico esce in linea generale nella sua


forma inattivata
Citocromo P-450
NADPH-riduttasi

RH + O2 ROH + H2O

NADPH Un solo atomo di O2 viene incorporato nel


substrato

+ e-
FeIII R-H FeIII -RH FeII - RH

+ O2
H2O + 2H+ + e-
[RH - FeIII - O22-] O2 - FeII - RH

R-OH
Il citocromo P-450 è così chiamato per la lunghezza d’onda
d’assorbimento massimo del suo spettro (450 nm)
450 nm

Emoproteina caratterizzata da una forte


molteplicità
400 450 500nm

Elevato numero di isoforme del citocromo P-450, diverse tra loro per
spettro di assorbimento, mobilità elettroforetica (indice di diverso pm),
composizione aminoacidica, gene di origine e soprattutto specificità di
substrato e di tipo di induttore

Almeno 8 forme distinte di citocromo P-450 sono state separate


ad oggi

L’esistenza di una molteplicità di citocromi, ognuna con elevata


specificità per substrati diversi fa di questo sistema uno dei più
complessi e versatili meccanismi enzimatici conosciuti
INDUCIBILITÀ DEL SISTEMA
MFO
Il sistema è caratterizzato da una substrato-inducibilità

Molti composti possono quindi accellerare la biosintesi dei citocromi


microsomiali, secondo processi induttivi specie-specifici

Alcune classi molecolari infatti inducono solo certe famiglie di


citocromi e non altre, le quali possono a loro volta esser indotte da
altre classi altrettanto specifiche di composti

Induttori citocromo P-450 Induttori citocromo P-448


B-type inducers 3MC-type inducers
-barbiturici -3 meticolantrene
-insetticidi clorurati (DDT, Lindano, - IPA e PCB
Dieldrina...)
- diossine
Il sistema MFO può essere definito come un complesso enzimatico a
doppia faccia, nel senso che in alcuni casi incrementa o innesca del
tutto l’effetto tossico

L’effetto detossificante o tossificante dipende in realtà da:


-la configurazione sterica dello xenobiotico
- sito attivo del citocromo

Il sito attivo del P-450 è ad es. conformato per reagire con molecole di
carattere globulare e non planare (P-448)

Mentre il P-450 reagisce inserendo l’O2 in una posizione


“conformazionale non ostacolata”, il P-448 nella cosidetta “bay region”,
“conformazionale ostacolata”, bloccando il possibile attacco del
coniugante e la successiva detossificazione
Il SISTEMA MFO: STIMOLAZIONE
-INIBIZIONE
Molti fattori di natura chimico-fisica possono modificare l’attività del
sistema MFO, causando fenomeni opposti di stimolazione e inibizione

Temperatura, salinità, situazioni di malnutrizione e modificazioni


fisiologiche ormonali, presenza di xenobiotici
Stimolatori Inibitori
Erbicidi, insetticidi, idrocarburi Tra i più importanti depressori
aromatici e clorurati, additivi sopratutto i metalli pesanti e
alimentari, tantissimi farmaci farmaci

La presenza di un induttore provoca, a poche ore dalla somministrazione,


una enorme proliferazione del Reticolo Endoplasmatico accompagnata da
forte concentrazione di proteine microsomiali

Indice di stress....biomarker!!!
A) Reazioni di ossidazione catalizzate dalle ossidasi a
funzione mista contenenti il sistema del citocromo P-450

1) idrossilazione dei composti aromatici


2) idrossilazione dei composti alifatici ed aliciclici
3) epossidazione
4) N-, O-, e S-dealchilazione
5) N-idrossilazione
6) deaminazione ossidativa
7) N- e S-ossidazione (desolforazione)
8) dealogenazione ossidativa
9) ossidazione dell’etanolo (da parte del sistema microsomiale ossidativo
dell’etanolo, MEOS)
10) desaturazione di gruppi alchilici
1) Idrossilazione dei composti aromatici

S HO S

N N

R R
Fenotiazine

Le fenotiazine sono un gruppo di farmaci neurolettici, utilizzati nel


trattamento della nausea o del vomito
2) Idrossilazione dei composti alifatici o aliciclici

H O
Idrossilazione alifatica H O
N CH 3
N CH 3
O O

N CH (CH 2) 2 CH 3 N CH CH2 CH CH3

H O CH 3 H O CH 3 OH

Pentobarbitale (barbiturico, sostanza anestetica, depressivo del SNC)

Idrossilazione aliciclica

N
N
OH

Fenciclidina (chiamata anche PCP, El Diablito, Polvere d’angelo, Pillola della


Pace, Rocket Fuel, può essere inalata, fumata o ingerita)
Il PCP (Fenciclidina) è una sostanza di origine farmaceutica,
sintetizzata per la prima volta verso la fine degli anni '50, e introdotta
sul mercato Nord-Americano a partire dal 1963, con il nome di
SERENYL.

Utilizzato primariamente come anestetico in chirurgia, anche se i suoi


effetti non risultano nella narcosi totale (come per l'Etere, per
esempio), bensì favoriscono la dissociazione fra mente e corpo e quindi
eliminano il dolore fisico lasciando al paziente un certo grado di
coscienza

L'entusiasmo iniziale nel mondo medico però si affievolì ben presto,


quando cominciarono ad essere osservati e registrati diversi effetti
collaterali sui pazienti trattati con PCP

Gli effetti cominciano a manifestarsi a partire da pochi secondi, fino a


mezz'ora dopo l'assunzione (a seconda della quantità/concentrazione
assunta).
Il PCP provoca diverse alterazioni fisiche e psicologiche, agendo
pesantemente sulle percezioni e sullo stato di coscienza: alcuni
consumatori hanno descritto l'effetto come quello di amfetamina,
LSD e alcol tutti insieme
Il PCP agisce come un potente stimolante, alza la temperatura corporea,
causa palpitazioni e induce sensazioni di forza e confidenza in se stessi;
le sue proprietà anestetiche contemporaneamente provocano sonnolenza,
difficoltà nel parlare, rigidezza muscolare e una progressiva perdita di
coordinazione dei movimenti;
Gli effetti del PCP comprendono anche una distorsione delle percezioni:
non è raro che sopravvenga la sensazione di sentirsi 'fuori dal proprio
corpo';
Il PCP 'pompa' molta adrenalina, mentre abbassa la sensibilità al dolore;
questo può spingere a comportamenti aggressivi e violenti.
Il PCP può causare distorsioni visive, incapacità di verbalizzare, paralisi
muscolare, nausea e vomito, perdita temporanea della memoria e
allucinazioni vere e proprie, spasmi muscolari e convulsioni prolungate
fino allo stato di coma; oltretutto concorre a disidratare il corpo; casi di
morte causati da attacchi cardiaci o da rotture dei vasi sanguigni nel
cervello
Il down del PCP è uno dei peggiori: può prolungarsi anche per diversi
giorni provocando forte affaticamento fisico, disfunzioni del ritmo
veglia-sonno, attacchi di panico, paranoia e depressione;
Il PCP tende ad accumularsi nelle membrane grasse del cervello, per cui la
sua eliminazione da parte del corpo è molto lenta nel tempo.
3) Epossidazione

benz[a]pirene benz[a]pirene-4,5-epossido

Benz[a]pirene: inquinante atmosferico, carcinogeno. Prodotto dalla


combustione del carbone, delle piante di tabacco, dal cibo cotto sul
barbecue con carbonella, ed è un sottoprodotto industriale)
Meccanismo di epossidazione degli alcheni

HO O HO O

O O
O O

H3C H3C
H3C H H3C H
CH3 CH3

H3C H3C
O

Lovastatina (molecola lipofila, ipocolesterolemizzante)


4) N-, O-, e S-dealchilazione

metile
CH 3 O H O
N N-dealchilazione N

+ H2CO
Formaldeide
Cl N Cl N

Diazepam (nome commerciale Valium, benzodiazepina, ansiolitico,


antiepilettico, miorilassante; utilizzato per il controllo di
attacchi di panico)
La formaldeide è un potente battericida (imbalsamazioni

Tra gli additivi alimentari è identificata dalla sigla E 240, ed è usata


come conservante

A concentrazioni nell'aria superiori a 0,1 ppm può irritare per


inalazione le mucose e gli occhi

L'ingestione o l'esposizione a quantità consistenti sono potenzialmente


letali

La cancerogenicità è stata accertata sui roditori (quindi per la specie


umana non ci sono dati), dove la formaldeide provoca un tasso di
incidenza di cancro al naso ed alla gola superiori al normale; la
formaldeide è in grado di interferire con i legami tra DNA e
proteine
Meccanismo di N-dealchilazione

H H 1 2 3
H

1. Radicale cationico trasferisce


un elettrone per formare un
radicale α-carbon 4

2. Deprotonazione a imina
3. Idrolisi a carbinolamina
4. Dealchilazione ossidativa

La N-dealchilazione comincia con un’idrossilazione poi si ha


una deaminazione ossidativa

O- e S-dealchilazione seguono un meccanismo simile


O-dealchilazione

NH-COCH3 NH-COCH3

+ CH3CHO

O-CH2-CH3 etile OH
Acetofenetidina Paracetamolo Acetaldeide

S-dealchilazione

R-S-CH3 R-S-CH2OH R-SH + H2CO

Formaldeide
5) N-idrossilazione

CH3 CH3
CH3
NH2 CH3
NH
HO

Fentermina farmaco anoressante, simile alle amfetamine, riduce la


fame stimolando il rilascio di norepinefrina e dopamina (ormoni
neuronali) dalle terminazioni nervose ipotalamiche, riducendo la
secrezione gastrica e aumentando il consumo energetico

Rischio di anomalie alle valvole cardiache associato all'uso di anoressanti è


del 30%.
6) Deaminazione ossidativa

Formaldeide Ammoniaca
O
HCH NH3
CH2 CH3 CH2 CH3 CH2 CH3
CH CH C

HN O
CH3 NH2

Metamfetamina Amfetamina Fenilacetone

N-dealchilazione Deaminazione ossidativa

Amfetamina (intensa azione eccitante sul SNC)


7) N- e S-ossidazione

Desolforazione

Parathion Paraoxone
(pesticida organofosforico)
8) Dealogenazione ossidativa

F Cl F Cl

F C C H F C C O + HBr

F Br F

Clorotrifluoroacetile +
Alotano
(anestetico liquido volatile) Acido bromidrico
9) Ossidazione dell’etanolo da parte del sistema
microsomiale ossidativo dell’etanolo (MEOS)

H H H
O
H C C OH H C C
H
H H H

Etanolo Acetaldeide
10) Desaturazione dei gruppi alchilici

Deidrogenazione degli alcani

radical
Alkane
e- abstraction
Abstraction of H atom
Alkene

cation
Enzimi della fase 1 NO
A) ossidasi a funzione mista contenenti citocromo P-450 (microsomiali)

B) ossidasi a funzione mista flaviniche (microsomiali)

C) ossidasi e deidrogenasi varie (citosoliche o non microsomiali)

D) riduttasi contenenti citocromo P-450 (microsomiali)

E) riduttasi varie (citosoliche o proprie della flora batterica intestinale)

F) idrolasi varie (citosoliche e/o microsomiali)


B) Ossidasi a funzione mista flaviniche

•enzimi molto versatili

•collezione di isoenzimi che presentano differenze nella distribuzione


tissutale e nelle preferenze di substrato

•richiedono NADPH (o NADH) come donatore di elettroni ed O2


molecolare

•questo sistema enzimatico non è in grado di introdurre l’O sul C

•catalizza l’ossidazione di vari composti contenenti azoto (N), zolfo


(S) e fosforo (P)

Enzimi localizzati nel reticolo endoplasmatico di vari tessuti ma in


particolare del fegato
Substrati delle ossidasi a funzione mista flaviniche

•Amine secondarie e terziarie

•Imine

•Idrossilamine

•Idrazine

•Tioamidi

•Tiourea

•Tioli

•Disolfuri
Reazioni catalizzate da ossidasi a funzione mista flaviniche

Trimetilamina Trimetilamina-N-ossido
(composto dal tipico odore di pesce marcio) (inodore)

Tioacetamide
Tioacetamide-S-ossido
Sostituto dell'acido cianidrico
(Usato in: industrie dei prodotti chimici inorganici
ed organici, dei prodotti tossici e corrosivi e in
laboratori di analisi. Non è più utilizzato come
ipnotico in medicina e veterinaria, solvente,
stabilizzante per carburanti)

Difenilmetilfosfina Difenilmetilfosfina-P-ossido
C) ossidasi e deidrogenasi varie

•enzimi metabolici (substrati endogeni e xenobiotici)


•più specifici
•distribuzione più localizzata

Queste caratteristiche implicano una capacità detossificante rivolta a


limitate categorie di xenobiotici

ENZIMI PIU’ RILEVANTI

alcool e aldeide deidrogenasi


aldeide e xantino ossidasi
amino ossidasi
perossidasi

Alcool deidrogenasi: enzima più importante di questo gruppo


a) alcool e aldeide deidrogenasi
• ossidano rispettivamente alcoli e aldeidi esogeni o endogeni (che si
formano dal metabolismo ossidativo del carbonio). Gli alcoli vengono
ossidati in aldeidi e le aldeidi in acidi carbossilici
• adoperano NAD come accettore di equivalenti riduttivi

Enzimi solubili (frazione citosolica) presenti in vari tessuti ma in


particolare nel fegato

H 2O
H H H Aldeide
H
Alcool deidrogenasi
O deidrogenasi
O
H C C OH H C C H C C
H OH
H H NAD +
NADH H NAD+ NADH H
Etanolo Acetaldeide Acido acetico
Alcool deidrogenasi: catalizza l’ossidazione dell’etanolo in maniera
estremamente efficiente.
Accetta come substrato una grande varietà di alcoli

Reazione enzimatica: alcool primario → aldeide


alcool secondario → chetone

Gli alcoli secondari sono metabolizzati più lentamente di quelli primari.


Quelli terziari sono ossidati in maniera estremamente lenta o non sono
ossidati affatto.
b) aldeide e xantino ossidasi
• contengono FAD (nucleotide mitocondriale, Fe e Mo)
• ossidano una grande varietà di composti con la funzione
aldeidica ed eterociclici contenenti N

Le purine sono il substrato fisiologico della xantina ossidasi


Sono enzimi principalmente citosolici
L’aldeide ossidasi è concentrata principalmente nel fegato.
La xantino ossidasi ha una distribuzione più ampia, si trova nel fegato,
ma anche nell’intestino e nella ghiandola mammaria.

H H
O Aldeide ossidasi
O SH
H
SH
H
N Xantina ossidasi N
H C C H C C N N
OH

H OH N N HO N N

H H 6-mercaptopurina Acido 6-mercapturico

Acetaldeide Acido acetico


c) amino ossidasi

MONOAMINO OSSIDASI (MAO)


•enzimi flavinici
•principalmente coinvolte nel metabolismo di amine biogene (es.
catecolamine) biotrasformano anche amine esogene
•sono localizzate nella membrana mitocondriale e si trovano nel
fegato, nel cuore, nel sistema nervoso centrale e nel tessuto vascolare

Substrati dell’enzima presente nel fegato: amine primarie, secondarie


e terziarie che presentano N-metil gruppi

DIAMINO OSSIDASI
•principalmente coinvolte nel metabolismo di composti endogeni
(putrescina)
•ha come cofattore il piridossal fosfato (forma attiva
della vitamina B6, cofattore nella maggior parte degli enzimi) →
•non metabolizza amine secondiarie o terziarie
C8H10NO3PO3
•prodotti della reazione sono aldeidi
•enzima solubile (frazione citosolica) presente nel fegato ed in altri
tessuti
MAO

Ammoniaca

Reazione RCH NH RCH=N H


+ H 2O OH
- NH3
2 2 RCH RCHO
NH
2

Le diammino ossidasi catalizzano la stessa reazione nelle


sostanze provviste di 2 centri basici come

NH2
H
N
H2N (CH2)5 NH2 H2N (CH2)4 NH2
N

Istamina Cadaverina Putrescina

(prodotte per decarbossilazione rispettivamente dell’istidina, lisina e ornitina)


Principali catecolamine
Composti costituiti da un nucleo
benzenico che presenta 2 gruppi
Noradrenalina OH adiacenti e un’amina
contenente una catena laterale

Adrenalina

Dopamina

Isoprenalina
d) perossidasi
enzimi contenenti eme

Reazione: la riduzione dell H2O2 o di un altro idroperossido è accoppiata


all’ossidazione di un secondo substrato. Può portare tra l’altro alla
formazione di chinoni, di epossidi o alla N-dealchilazione
O
Substrati possono essere ad esempio:
amine aromatiche
fenoli
idrocarburi aromatici policiclici
O
p-chinone

Spesso i prodotti di queste reazioni sono composti elettrofili


particolarmente reattivi.

Processi metabolici di questo tipo sono la pricipale via di bioattivazione


degli xenobiotici in tessuti dove l’attività delle ossidasi a funzione
mista è limitata
Nei mammiferi sono presenti varie perossidasi:

Prostaglandina sintasi
•enzima più importante di questo gruppo per quanto riguarda la
capacità di trasformazione degli xenobiotici

•utilizza come donatore di ossigeno la prostaglandina G2


(idroperossido derivato dall’acido arachidonico)

•vasta distribuzione, particolarmente attiva nelle vescicole seminali,


nei reni, nei polmoni, nell’intestino, nella milza e nei vasi sanguigni

Lattoperossidasi
presente nelle ghiandole mammarie

Mieloperossidasi
che si trova nel midollo osseo, nei leucociti e nelle cellule di Kupffer
del fegato
d) riduttasi contenenti citocromo P-450

• riducono alcuni xenobiotici che posseggono potenziali ossidoriduttivi


particolarmente bassi ed in tessuti in cui siano prevalenti condizioni
anaerobiche
• l’ossigeno molecolare (O2) inibisce questi processi riduttivi
• il substrato (strettamente legato al citocromo P-450) riceve su sé
stesso gli elettroni forniti dalla NADPH-citocromo P-450 riduttasi
(normalmente destinati all’O2)
• enzimi localizzati nella frazione microsomiale

Substrati
• azo-derivati
• nitrocomposti
• N-ossidi
• epossidi
• idrocarburi alogenati (dealogenazione riduttiva)
Questa via di trasformazione può in alcuni casi portare alla formazione
di intermedi più tossici dei prodotti iniziali (bioattivazione)

Esempi

- dai nitrocomposti aromatici si possono formare dei derivati N-


idrossilati con azione cancerogena

- dagli idrocarburi alogenati per dealogenazione riduttiva si ha la


formazione di intermedi radicalici che attaccano il reticolo
endoplasmatico e favoriscono la perossidazione lipidica nelle cellule
metabolizzanti
+
Prontosil (è il primo sulfamidico Sulfanilamide 1,3,4-triaminobenzene
attivo nei confronti dei cocchi (antimicrobico)
patogeni ed altre specie batteriche)

NO2 NO2- NO NHOH NH2


e-

+ 2H+ + 2H+ + 2H+


+ H2O
+ 2e- +2e- +H2O

Nitrobenzene Nitrosobenzene N-Idrossianilina Anilina


(solvente o blando (cancerogeno, veleno,
ossidante) usato nella sintesi farmaci
e coloranti)

F Cl F Cl F Cl

F C C H F C C H F C C H + HBr

F Br F F H
Alotano 2-cloro-1,1,1-trifluoroetano +
(anestetico liquido volatile)
Ac. bromidrico
e) riduttasi varie
A carico degli enzimi citosolici e della microflora batterica intestinale

Enzimi citosolici
• aldeide riduttasi NADPH-dipendente presente nel citosol delle
cellule epatiche
• diaforasi

Sistemi enzimatici della microflora intestinale particolarmente attivi


nella biotrasformazione riduttiva degli xenobiotici operando in un
ambiente fondamentalmente anaerobico

Substrati
• azo-derivati
• nitrocomposti
• aldeidi
• chetoni
• N-ossidi
• composti insaturi
f) idrolasi varie

Enzimi
b) esterasi
c) amidasi
d) epossido idrolasi

Citosolici ma anche microsomiali e plasmatici

Substrati
• esteri
• amidi
• idrazidi
• carbammati
a) esterasi
Arilesterasi idrolizzano di preferenza gli esteri aromatici

Carbossilesterasi idrolizzano gli esteri alifatici

Acetilesterasi idrolizzano gli esteri dell’acido acetico

Colinesterasi idrolizzano gli esteri della colina

C’è un’ampia sovrapposizione di substrato fra le diverse categorie di esterasi


La scissione idrolitica libera i gruppi carbossilico e alcolico

Nei mammiferi l’insetticida malathion è di norma idrolizzato ad acido


dicarbossilico da una carbossilesterasi, mentre negli insetti subisce di
preferenza una desulfurazione ossidativa che gli conferisce una spiccata
azione acetilcolinesterasica
NH2
Arilesterasi NH2

+H2O
+ HO (CH2)2 N(C2H5)2

CO O (CH2)2 N(C2H5)2
COOH

Procaina Ac. p-aminobenzoico Dietilaminoetanolo


(anestetico locale)
a) amidasi

L’idrolisi delle amidi e delle idrazidi catalizzata dalle amidasi è più lenta di
quella degli esteri

La scissione idrolitica libera i gruppi carbossilico e aminico

NH2
Amidasi NH2

+H2O
+ H2N (CH2)2 N(C2H5)2

CO NH (CH2)2 N(C2H5)2

COOH

Procainamide Ac. p-aminobenzoico Dietilaminoetilamina


(antiaritmico)
c) epossido idrolasi
E’ un importante enzima detossificante presente nel reticolo
endoplasmatico di vari tessuti, probabilmente in stretto contatto con il
sistema del citocromo P-450

OH
O
OH

benz[a]pirene-4,5-epossido trans-benz[a]pirene-4,5-diidrodiolo

I trans-dioli sono meno reattivi e pertanto meno tossici degli epossidi


LA FASE
II
Molecole polari fornite dall’organismo, vengono coniugate a metaboliti
endogeni idrosolubili (zuccheri, polipeptidi, solfati, fosfati) utilizzando
come punto di aggancio i gruppi funzionali inseriti nella fase I

Vari enzimi controllati dal complesso P450 regolano questi processi:


GST (glutatione S-transferasi), EH (eposssido idrolasi), ST
(sulfotransferasi)

Varie trasformazioni: deaminazione, idrossilazione aciclica e


aromatica, dealchilazione ecc.

Questi processi hanno luogo nel citosol

In alcuni casi la fase I non avviene e le reazioni di fase II possono


utilizzare come substrato lo xenobiotico originale
Addizione alle sostanze esogene di molecole endogene,
generalmente polari, ampiamente disponibili nell’organismo

Le reazioni di questa fase sono biosintetiche perciò richiedono


energia biochimica.
Ciò è ottenuto attraverso la precedente attivazione del composto
endogeno ad intermedio “ricco di energia”
Esempi di detossificazione di organoclorurati e organofosfati negli
insetti

Deidroclorazione
DDT → DDE

Desolforazione
degli esteri
P=S → P=O con MFO

da Perry & Agosin, 1974 in Morris Rockstein, 1974


In alcuni casi i processi di fase I sono già di per se detossificanti, ma
talvolta ne possono derivare molecole più tossiche:

come nel caso della trasformazione del benzo(a)pirene nel mutagene


benzo(a)pirene diolo epossido
1) Coniugazione con acido glucuronico

Reazione della fase 2 più rilevante sia per diffusione e capacità


metabolica che per la varietà dei substrati endogeni ed esogeni
utilizzati

Enzima: uridin difosfato (UDP)-glucuronil transferasi

-descritte più isoforme con diversa specificità di substrato

- localizzato nel reticolo endoplasmatico (accesso diretto ai prodotti


della fase 1) di vari tessuti

- particolarmente abbondante nel fegato, ma presente anche nei reni,


nell’intestino, nella pelle, nel cervello e nella milza

- inducibile (efficaci: barbiturici ed il fumo di tabacco), consente il


trasferimento della forma attivata dell’acido glucuronico (acido uridin-
5’-difosfo-α-D-glucuronico) su atomi nucleofili come O, N, S ed in alcuni
casi C
Esempi di reazioni di coniugazione con acido glucuronico

uridin difosfato

(usato come disinfettante e come materia prima


nella produzione di coloranti, di farmaci e di polimeri)

(usato nella produzione di vernici, cancerogeno)

(usato nella produzione di coloranti,


cancerogeno)
I coniugati sono molto polari e vengono rapidamente escreti per via
renale o biliare in base al peso molecolare (<300 Dalton escreti con le
urine).
Il glucuronide secreto nell’intestino andrebbe incontro a completa
eliminazione fecale se non venisse idrolizzato da β-glucuronidasi della
microflora intestinale. Le β-glucuronidasi sono presenti in vari tessuti dei
mammiferi, ma sono particolarmente attive nella flora batterica
intestinale. Questa componente può essere quindi riassorbita ed andare
incontro ad un riciclo enteropatico. Il riassorbimento intestinale tuttavia
è solo parziale.
La coniugazione sebbene in generale sia un sistema detossificante, può
aumentare la tossicità degli xenobiotici verso organi specifici.

Esempio: azione cancerogena delle amine aromatiche sulla vescica. La


coniugazione con l’acido glucuronico porta infatti all’accumulo nella
vescica dei prodotti N-idrossilati delle amine. Questi composti sono
instabili a pH acido ed idrolizzandosi danno luogo a prodotti elettrofili
molto reattivi, responsabili dell’insorgenza dei tumori.
ESCREZIONE E
SECREZIONE
Il risultato del metabolismo di uno xenobiotico è un composto più polare
-più solubile in acqua
-più facile da eliminare attraverso l’escrezione

Vie principali di escrezione nei vertebrati terrestri


- reni urina
dominante per molecole con PM < 300

-fegato cistifellea bile tratto digerente feci


dominante per molecole con PM > 600

il coniugato (idrofilo) non viene riassorbito dall’intestino ma può


essere idrolizzato circolazione enteroepatica

PM intermedi: dipende dalla specie


Negli organismi terrestri
l’escrezione degli xenobiotici organici nella loro forma originale è
ridottissima

modalità principale: attraverso il metabolismo e l’aumento della polarità e


idrofilicità escrezione con feci, urine, altri prodotti di rifiuto

Nei pesci e altri organismi acquatici


l’escrezione degli xenobiotici organici nella loro forma
originale può essere importante tramite diffusione diretta verso
l’ambiente attraverso superficie del corpo, in particolare branchie)

Escrezione urina; urea; feci


Secrezione latte, sudore,saliva
Il bioaccumulo e la bioconcentrazione sono forme di sequestro

Si tratta di una strategia alternativa all’escrezione/secrezione per


ridurre l’esposizione agli inquinanti e consiste nella loro
immobilizzazione entro tessuti o organi particolari legandoli con
strutture molecolari che li immobilizzano

animali: grasso, denti, penne, unghie


piante: vacuoli, foglie, legno

Esempio di sequestratori molecolari: le MetalloTioneine

Proteine a basso pm (6000-10000 Da) ricche in cisteina (30%)


diffuse in tutti gli eucarioti;

forte affinità per molti metalli (Cu, Zn, Cd, Hg ecc.)


inducibili a seguito di esposizione a metalli
regolazione della concentrazione di metalli → sequestro
Metallotioneine

Induzione in Mytilus

Relazione con concentrazione


di Zn nel fegato
di Pleuronectes platessa 400 µ g/l
µg/g di MT epatiche

Giorni dopo l’esposizione


µg/g di Zn epatico
George & Langston, 1994
BIOACCUMULO
Accumulo di una sostanza nei tessuti di un organismo in seguito
all’assorbimento da qualsiasi sorgente ambientale

Fattore di bioaccumulo:

in condizioni di stato stazionario

Alcuni autori utilizzano il termine bioaccumulo per indicare


esclusivamente l’accumulo attraverso l’alimentazione
Esempio:
fattore di accumulo biota-sedimento

può essere normalizzato:la concentrazione viene espressa in funzione


della componente per cui la sostanza ha maggiore affinità
BIOCONCENTRAZIONE

Accumulo di una sostanza nei tessuti di un organismo acquatico in


seguito all’assorbimento dall’acqua
Fattore di bioconcentrazione:

in condizioni si stato stazionario

Alcuni autori utilizzano il termine bioconcentrazione per indicare


l’accumulo attraverso la respirazione
BIOMAGNIFICAZIONE
Aumento della concentrazione di una
sostanza lungo la catena alimentare
-Fenomeno ben documentato solo in
alcuni casi (DDT, PCB)
-In alcuni casi può essere apparente

-I predatori si alimentano
preferenzialmente sulle prede più
lente e deboli

- gli individui più lenti e deboli sono


quelli che sono stati più esposti alla
sostanza tossica e quindi hanno nei
loro tessuti una concentrazione
maggiore rispetto alla media della
popolazione
Assunzione attraverso il cibo

Fattore di bioamplificazione
(biomagnification factor) Esempi di BF nei bovini

Cb Composto BF
BF= Dieldrina 0.11-3.95
Cf Heptachlor0.16
Cloroidrocarb 0.30-2.70

dove
Cf concentrazione nel cibo
Cb concentrazione nel consumatore
SCOMPARSA DELLO SVASSO Flint & van der Bosch, 1981 in Begon et alii, 1990

Bioamplificazione del DDD nella


comunità del Clear Lake (California)
per combattere il dittero 0.02 ppm 1949-51
Chaoborus astiptocus

5.30 ppm

10.00 ppm

Diclorodifenildicloroetano

1500.00 ppm

1600.00 ppm

1954
Quantificazione di bioaccumulo e bioconcentrazione
Il bioaccumulo è la risultante di 2 processi:

assorbimento - eliminazione

Tubifex tubifex
Il modo più completo
di studiarlo:

esperimenti di
accumulo-depurazione
Bilancio regolazione (escrezione) - sequestro

Le due strategie di contenimento dell’ esposizione possono essere


variamente combinate nei differenti organismi
per diversi inquinanti

sequestro

Nei regolatori la concentrazione


delle sostanze inquinanti
è indipendente
dalla concentrazione nel mezzo

Nei sequestratori vi è una


relazione tra concentrazione
corporea e ambientale

regolazione
ELIMINAZIONE

L’eliminazione è la somma di tutti i processi che tendono a far diminuire


la concentrazione di una sostanza all’interno di un organismo, una
volta che sia stata assorbita
- metabolismo
- escrezione
- secrezione
Eliminazione di zinco da ostriche
Newman, 1995
Per studiare in modo quantitativo
l’eliminazione:
9) si pongono organismi che hanno
accumulato la sostanza in un ambiente
dove la sostanza sia assente
2) si osserva eliminazione in assenza
di assorbimento

spesso è la seconda fase di un


esperimento di accumulo-depurazione

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