Spettrometria Di Massa
Spettrometria Di Massa
Spettrometria Di Massa
SPETTROMETRIA DI
MASSA
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1
···
Perché la spettrometria di massa potrebbe
essere di interesse per voi?
La spettrometria di massa è una tecnica analitica potente usata per
identificare prodotti incogniti, per determinazioni quantitative di composti
noti e per chiarire le proprietà strutturali e chimiche delle molecole.
Tutto questo può essere effettuato con quantità di campione
estremamente limitate (in alcuni casi meno di un picogrammo, ossia di 10-12
grammi) a concentrazioni molto basse in miscele complesse (fino a una parte
per mille miliardi). La spettrometria di massa fornisce informazioni
attendibili per una grande varietà di persone che operano in campi diversi:
medici, magistrati, ingegneri addetti al controllo di processo, chimici,
astronomi e biologi, tanto per citare alcune categorie.
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2
⇒ Stabilire l’età e l’origine di campioni geochimici e archeologici.
⇒ Identificare e determinare quantitativamente i componenti di miscele
organiche complesse.
⇒ Effettuare analisi inorganiche multielementari con elevatissima
sensibilità.
1
“Radiazioni di elettricità positiva e loro applicazione nell’analisi chimica”.
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3
···
Cos’è uno spettrometro di massa?
Uno spettrometro di massa è uno strumento utilizzato per misurare la
massa di una molecola dopo che essa è stata ionizzata, ossia alla quale è stata
impartita una carica elettrica. Dato che le molecole sono entità estremamente
piccole, non è conveniente misurare ed esprimere la loro massa in
chilogrammi, o grammi, o libbre, o qualsiasi altra unità di misura in uso per il
mondo macroscopico. In effetti la massa di un atomo di idrogeno è
approssimativamente 1,66 x 10-24 grammi (la massa di una mole, o un
numero di Avogadro, di atomi di idrogeno è approssimativamente 1
grammo). Occorre quindi una unità di misura più conveniente per la massa
molecolare. Tale unità di misura è il dalton (abbreviato Da), ed è definito
come segue: 1 Da è 1/12 della massa di un atomo di carbonio, o meglio del
suo isotopo carbonio-12 (12C). Questa definizione consegue dalla
convenzione universalmente accettata che l’isotopo 12C ha una massa di 12
unità di massa esatte.
Come risulterà più chiaro nel seguito, uno spettrometro di massa in realtà
non misura direttamente la massa molecolare, ma il rapporto massa/carica
degli ioni che si formano dalla molecola in esame. La carica elettrica è una
proprietà quantizzata, che può esistere solo come multipli interi della carica
elementare, che è quella di un elettrone (negativa) o di un protone (positiva).
Analogamente a quanto sopra discusso per la massa, non è conveniente
esprimere la carica di uno ione in unità comunemente utilizzate per il mondo
macroscopico. L’unità più appropriata è proprio la carica elementare, quella
posseduta appunto da un elettrone (o da un protone). Per questo motivo la
carica di uno ione è espressa come il numero z di cariche elementari, e il
rapporto massa/carica è quindi espresso in termini di Da per unità elementare
di carica. La maggior parte degli ioni che si possono riscontrare in
spettrometria di massa possiede solo una carica (z=1) così che il loro valore
di m/z coincide numericamente con la massa molecolare (o meglio, ionica) in
Da. Gli spettrometristi di massa parlano spesso impropriamente di “massa di
uno ione” intendendo in realtà il suo rapporto massa/carica, ma occorre fare
molta attenzione in quanto questo modo di esprimersi è valido solo per gli
ioni monocarica.
Lo spettrometro di massa varia come dimensioni da una piccola scatola,
grande approssimativamente come un forno a microonde domestico, fino a
grandi strumenti di ricerca che occupano un intero laboratorio. Le differenti
parti di uno spettrometro di massa sono rappresentate nello schema a blocchi
riportato in figura 1.
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4
Figura 1.
Schema a blocchi di Ionizzazione Separazione Ioni Rivelazione Ioni
uno spettrometro di
massa
Sorgente Analizzatore Rivelatore
Pompa ad
Sistema alto vuoto Elaborazione Sistema di
di dei dati Elaborazione
Introduz.
Introduzione
del campione
Dati in
uscita
Spettro di massa
·····
5
···
Quali sono le caratteristiche di uno
spettro di massa?
44
Figura 2.
100
CO2+. +.
(M ) Spettro di
massa
dell’anidride
80
carbonica,
CO2. Si noti lo
ione
% Intensità Relativa
60
molecolare a
m/z 44.
40
+. +.
C+. O CO
20
16 28
12
0
0 10 20 30 40 50
m/z
In questo esempio tutti gli ioni hanno carica positiva (è possibile anche
generare e rivelare ioni negativi nello stesso modo). Nello spettro riportato in
figura 2 la molecola CO2 ionizzata (o ione molecolare) si trova a m/z 442. La
rottura di un legame carbonio-ossigeno, che porta alla formazione di mo-
nossido di carbonio ionizzato o di ossigeno atomico, produce i frammenti a
m/z 28 e 16; la perdita di due atomi di ossigeno neutri produce un ulteriore
frammento a m/z 12 per il carbonio. Lo ione molecolare viene indicato come
CO2+• (o in generale come M+•); i frammenti sono indicati come C+•, O+• e
CO+•, rispettivamente.
2
Lo ione è a singola carica e la “massa nominale” è 44 Da: carbonio = 12 e ossigeno = 16 (nel
calcolare la massa nominale, le masse atomiche vengono arrotondate all’intero più vicino).
·····
6
···
Come viene introdotto il campione nello
spettrometro di massa?
Figura 3.
La sorgente
ionica. Gli ioni
vengono generati
Collettore bombardando le
Elettroni
molecole
Lenti
Focalizz. gassose con un
fascio di elettroni
All’analizzatore ad alta energia.
Repulsore
Entrata
Campione
Filamento
·····
8
···
Come funziona l’analizzatore?
L’analizzatore utilizza metodi di dispersione o di filtro per separare gli
ioni sulla base del rapporto massa/carica o di una proprietà ad esso correlata.
Gli analizzatori più comunemente usati sono i settori magnetici ed elettrici, i
quadrupoli, le trappole ioniche (ion traps), gli spettrometri basati sulla
risonanza ionica ciclotronica in trasformata di Fourier (FT-ICR) e gli
analizzatori a tempo di volo (Time of Flight, TOF).
Figura 4.
Analizzatore a
settori
elettrostatico e
Analizzatore Magnete
magnetico in Elettrostatico
una
configurazione a
doppia
focalizzazione.
La fenditura
costituisce il
punto di
focalizzazione
sia direzionale
(magnetico) che
di energia Fenditura
(elettrostatico). Entrata ioni
Al rivelatore
·····
9
massa nominale, ma differente composizione chimica, come ad esempio
C2H4, N2 e CO a m/z 28. La cosiddetta “massa esatta”, più propriamente
“massa accurata” delle molecole C2H4, N2 e CO è, rispettivamente3, 28,0313,
28,0061 e 27,9949.
Figura 5.
Analizzatore a
quadrupolo. Gli
ioni con il
rapporto m/z
selezionato
passano
Al rivelatore attraverso
l’analizzatore per
essere rivelati,
mentre gli ioni
con un diverso
valore di m/z
Entrata
ioni sono raccolti
sulle barre o
sfuggono
passando tra di
esse.
3
La massa esatta degli isotopi più abbondanti di C, H, N e O è, rispettivamente, 12,000000,
1,007825, 14,003074 e 15,994915.
·····
10
Figura 6.
Spettrometro a
trappola ionica
quadrupolare. La Filamento
ionizzazione e la Elettrodo
separazione degli “coperchio”
ioni avvengono
nello spazio
compreso tra
l’elettrodo anulare
Elettrodo
e gli elettrodi anulare
“coperchio”. In
alternativa, gli ioni Entrata
possono essere campione
generati all’esterno Al rivelatore
Elettrodo
e quindi introdotti “coperchio”
nella trappola
attraverso una
apertura praticata
in un elettrodo
“coperchio”
Il dispositivo (figura 6) intrappola nello spazio tra gli elettrodi gli ioni
aventi un dato intervallo di rapporti massa/carica, determinato dai potenziali
applicati. Lo spettro di massa viene prodotto variando il potenziale RF in
modo da espellere sequenzialmente dalla trappola verso un rivelatore gli ioni
secondo un ordine di rapporto m/z crescente attraverso una apertura praticata
in un elettrodo “coperchio”.
Altri due tipi di analizzatori, sempre più diffusi nei laboratori di ricerca,
sono lo spettrometro di massa a risonanza ionica ciclotronica in trasformata
di Fourier (Fourier Transform Ion Ciclotron Resonance, FT-ICR) e lo
spettrometro di massa a tempo di volo (Time Of Flight, TOF). Le
caratteristiche particolari di questi due analizzatori li rendono specialmente
utili per lo sviluppo della spettrometria di massa in nuovi campi di
applicazione.
In uno spettrometro FT-ICR (figura 7) gli ioni vengono intrappolati
elettrostaticamente in una cella cubica posta all’interno di un campo
magnetico costante. L’applicazione di un impulso a radiofrequenza tra due
piastre della cella che fungono da trasmettitore (piastre di eccitazione) induce
un moto orbitale coerente. Gli ioni in moto orbitale generano un debole
segnale “immagine” che viene raccolto dalle piastre della cella che agiscono
come ricevitore (piastre di rivelazione). La frequenza del segnale generato da
un particolare ione è uguale alla sua frequenza orbitale che a sua volta è
inversamente correlata al suo rapporto m/z. L’intensità del segnale per una
data frequenza è proporzionale al numero di ioni aventi il corrispondente
valore di m/z. Il segnale totale viene amplificato e quindi scomposto nelle
varie componenti di frequenza generando così lo spettro di massa. Se la
·····
11
pressione all’interno della cella è molto bassa, ossia se viene mantenuto
un
Piastra di rivelazione Figura 7.
Piastra di
Spettrometro FT-
intrappolamento ICR. Gli ioni
vengono
intrappolati
all’interno di una
Piastra di eccitazione cella cubica sotto
Piastra di eccitazione l’influenza di
bassi potenziali e
di un campo
magnetico
costante; la
frequenza del
Campo segnale misurato
e o hν
magnetico alla piastra di
(ionizzazione interna)
rivelazione è
Piastra di rivelazione inversamente
proporzionale
(ionizzazione esterna) Piastra di alla massa dello
intrappolamento ione.
vuoto molto spinto, il moto orbitale degli ioni può essere mantenuto per
tempi relativamente lunghi e la frequenza misurata ripetutamente numerose
volte per ottenere una accuratezza molto elevata. Gli strumenti FT-ICR sono
in grado quindi di produrre spettri di massa con una altissima risoluzione.
Gli analizzatori a tempo di volo (figura 8) separano gli ioni in virtù del
tempo da essi impiegato per percorrere una certa distanza nota.
Estrazione ioni
Figura 8.
Nello
Rivelazione
ioni
spettrometro di
Sorgente massa a tempo
ionica
di volo, gli ioni
formatisi dal
campione
Ioni mediante un
raggio pulsato
Sonda arrivano al
portacampione rivelatore in
Tubo di volo ordine di
rapporto m/z.
·····
12
mv2/2, dove m è la massa dello ione e v la sua velocità, minore sarà la massa
dello ione, maggiore sarà la sua velocità. Il tempo impiegato per percorrere il
tubo di volo viene misurato in microsecondi, e questo tempo viene
trasformato nel valore di massa dello ione sulla base della relazione appena
descritta. Dato che per ogni “pacchetto” vengono rivelati tutti gli ioni che lo
compongono, gli spettrometri di massa TOF offrono elevata sensibilità come
anche elevata velocità di analisi. Essi sono in grado anche di fornire dati per
biomolecole dalla massa molto elevata.
% Intensità Relativa
frammento,
CH3+ oltre allo ione
40
15 M
+. molecolare a
m/z 58.
58
20 C 2H3+
27
0
0 10 20 30 40 50 60 70
m/z
Gli ioni frammento sono usati dagli spettrometristi di massa per stabilire
la struttura molecolare. La simbologia “+•” (come anche “-•” per gli ioni
negativi) indica uno ione radicale, ossia a elettroni dispari, in
contrapposizione con la simbologia “+” (o “-”), che indica invece uno ione a
elettroni pari. Questa simbologia può essere utile per capire i percorsi di
frammentazione. Ad esempio, la perdita di 15 unità di massa dallo ione
molecolare dell’acetone per dare uno ione a m/z 43 indica la presenza di un
gruppo metilico (CH3) nella molecola originale. Una successiva perdita di 28
unità per dare uno ione a m/z 15 corrisponde a una perdita di CO.
Assegnando simili perdite e disegnando una ragionevole struttura per gli ioni
risultanti è possibile ricostruire la struttura del composto originale. In altre
molecole, alcune perdite comunemente osservate sono 18 Da per l’acqua,
H2O; 17 Da per l’ammoniaca, NH3; e 77 Da per un gruppo fenile, C6H5.
Figura 10
Spettro di massa
in alta risoluzione
di una miscela di
ossido di
carbonio e azoto.
·····
14
Un’altra utile informazione per determinare la composizione molecolare
si ottiene dalla misurazione di masse accurate. Ogni isotopo di ogni elemento
(ad eccezione del carbonio al quale è stato assegnato il valore esatto
12,00000) ha una massa caratteristica, non intera. Misure di massa accurata
consentono la determinazione della composizione chimica.
Come illustrato nella figura 10, è possibile distinguere tra carbonio
monossido (CO, m/z 27,995) e l’azoto (N2, m/z 28,006) mediante misure di
massa accurata. Lo spettro riportato nella figura 10 è stato registrato su uno
strumento FT-ICR ad altissima risoluzione. Notare che, a differenza dei
semplici istogrammi utilizzati per gli spettri delle figure 2 e 9, lo spettro
riportato in figura 10 mostra un diagramma dei dati effettivamente acquisiti,
in cui i picchi sono delle gaussiane.
Ionizzazione chimica
In contrapposizione alla ionizzazione elettronica, la ionizzazione chimica
(CI) produce ioni attraverso un processo, relativamente blando, di
trasferimento di un protone. Le molecole di campione vengono esposte a un
forte eccesso di un gas reagente ionizzato. Il trasferimento di un protone a
una molecola M del campione da parte di un gas ionizzato, quale ad esempio
il metano nella forma CH5+, produce uno ione positivo [M+H]+. Ad esempio
lo spettro della efedrina in figura 11 praticamente non mostra alcuna traccia
dello ione molecolare a m/z 165 in condizioni di ionizzazione EI (fig. 11a),
mentre in condizioni di ionizzazione chimica (fig. 11b) si ottiene un picco
abbastanza intenso dovuto alla molecola protonata a m/z 166. Il frammento
osservabile a m/z 148 corrisponde alla perdita di acqua (18 unità di massa).
·····
15
In entrambi i casi è osservabile lo ione più intenso a m/z 58. Questo ione è
caratteristico di strutture in cui l’azoto amminico è sostituito con due o più
atomi di carbonio. Occorre comunque notare che i percorsi di
frammentazione di una molecola protonata [M+H]+ non necessariamente
sono gli stessi di uno ione molecolare M+• ottenuto per ionizzazione
elettronica.
100
58 Figura 11a.
OH H Spettro di massa
N
per ionizzazione
80 elettronica
dell’efedrina a 70
58 eV. Non si
60
osserva alcun
% Intensità Relativa
20
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
m/z
58
100 OH H
Figura 11 b.
N
Spettro di massa
148 per ionizzazione
80
chimica con
148
metano dell’e-
60
fedrina. Si
% Intensità Relativa
[M+H]+
osserva un
40
166 intenso picco a
m/z 166
attribuibile alla
20 molecola pro-
tonata.
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
m/z
·····
16
···
Tecniche di desorbimento
·····
17
avviene a pressione atmosferica entro un campo elettrico generato tra l’ago e
una lente di estrazione degli ioni.
Questi metodi di ionizzazione possono produrre diversi tipi di ioni, a
seconda dei parametri utilizzati e del tipo di campione. La formazione di ioni
molecolari positivi M+• e pseudo-molecolari [M+H]+ è accompagnata dalla
formazione di addotti con metalli alcalini, come [M+Na]+ e, particolarmente
nel caso della ionizzazione per elettronebulizzazione, da quella di ioni
multiprotonati (e quindi multicarica) come [M+nH]n+. L’estensione della
dissociazione delle specie molecolari (frammentazione) dipende a sua volta
dal metodo di ionizzazione utilizzato, dalle condizioni sperimentali e dal tipo
di sostanza in esame.
Figura 12.
[M+H]+ Spettro di massa
4 66.430 della sieroalbumina
bovina ottenuto su
un analizzatore a
tempo di volo
Intensità Ionica
3
usando un laser per
il desorbimento e la
2 ionizzazione della
[2M+H]+
molecola.
[M+2H]2+ 132.860
1 33.220 [3M+H]+
199.290
·····
18
Mentre venivano sviluppati i metodi di ionizzazione per desorbimento,
sorgeva una crescente esigenza di spettrometri di massa capaci di analizzare
ioni con rapporti m/z sempre maggiori. Dato che la ionizzazione per
elettronebulizzazione (electrospray) è in grado di porre numerose cariche (z),
di solito sotto forma di protoni, su grandi molecole adatte, quali ad esempio
le proteine, essa costituisce in questo senso un’eccezione.
L’elettronebulizzazione consente a uno spettrometro di massa con limite
superiore di peso molecolare anche non elevato, come 2.000-4.000 dalton, di
analizzare composti con peso molecolare assai più elevato. Lo spettro di
massa riportato in figura 13 è quello di una proteina, la mioglobina equina, di
peso molecolare 16950 Da. Questo spettro è stato ottenuto su uno
spettrometro di massa a quadrupolo con un limite di massa analizzabile solo
fino a 2400 Da, grazie al fatto che la ionizzazione electrospray è stata capace
di aggiungere da 10 a 22 protoni (cariche elementari, z=10-22) alla molecola
della proteina. I vari picchi presenti nello spettro risultano da differenti stati
di carica della stessa molecola, a causa di un diverso numero di protoni
presente sulla molecola stessa, e quindi osservabili a diversi valori m/z.
L’electrospray è in grado di ionizzare biomolecole aventi massa fino a oltre
1.000.000 Da. Operando una opportuna deconvoluzione dei diversi valori di
m/z ottenuti, è possibile determinare il peso molecolare della proteina con
notevole accuratezza, spesso fino a una parte per diecimila. Dato che
l’electrospray risulta anche particolarmente compatibile con tecniche di
separazione in fase liquida, questa tecnica è diventata un metodo di
larghissimo impiego nell’analisi farmaceutica e biologica.
dimensioni 50
13+
(nell’esempio lo
spettro della 40
20+
mioglobina
equina) porta alla 30
12+
formazione di
20
una serie di ioni 11+
multicarica a 10
10+
valori di m/z
relativamente 800 1000 1200 1400 1600
bassi. m/z, amu
·····
19
···
Come viene utilizzata la spettrometria di
massa con la gas-cromatografia,
la cromatografia liquida e altre tecniche di
separazione?
OCH3
LC/MS. OCH3
OCH3
40
20
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650
m/z
Figura 15.
Modi alternativi
intensità ioniche
Cromatogramma di di visualizzare i
Somma delle
z
m/
Intensità ionica
Cromatogramma
di un singolo ione
·····
22
molecole di interesse, quindi lo spettrometro di massa verrà predisposto
manualmente o mediante calcolatore per rivelare solo i suddetti ioni e la loro
abbondanza relativa, in modo che non ci sia spreco di tempo nella scansione
per misurare ioni a valori di m/z che non interessano. In molti casi la tecnica
di ionizzazione viene scelta in maniera tale da favorire la formazione di un
solo tipo di ioni, in modo da rendere massima la sensibilità mantenendo tutta
la corrente ionica su un singolo rapporto m/z.
Figura 16.
Analisi
quantitativa O
mediante 60
H3C F
spettrometria di N
massa del di-
metilderivato del
5-fluorouracile 40 O N
nel plasma.
CH3
Intensità Ionica
20
Campione
m/z 158
0
20
Standard 15N
m/z 160
0
0 5 10 15
Tempo di ritenzione, min.
In figura 16, vengono registrati solo i segnali relativi a m/z 158 e a m/z
160. Questa procedura è nota come “rivelazione di ioni selezionati” (Selected
Ion Monitoring, SIM) o “frammentografia di massa” ed è una situazione
completamente diversa da quella illustrata nella figura 15, dove i profili dei
singoli ioni vengono estratti da un da un insieme di spettri di massa completi.
Nella figura 16 è riportata l’analisi quantitativa mediante spettrometria di
massa del derivato dimetilico del 5-fluorouracile nel plasma. In questa analisi
il segnale della sostanza di interesse viene confrontato con quello di uno
standard di riferimento interno che viene aggiunto al campione. La traccia
superiore mostra il profilo SIM dello ione molecolare a m/z 158. Il picco
centrale è dovuto al composto di interesse. I due picchi meno intensi sono
attribuibili ad impurezze non note che hanno anch’esse ioni a m/z 158. La
·····
23
traccia inferiore è il profilo SIM della stessa molecola che contiene però con
due atomi di 15N al posto dei normali 14N. Dato che sono stati sostituiti
entrambi gli atomi di azoto, lo ione molecolare dello standard viene osservato
a m/z 160, 2 Da in più. Anche se il campione e lo standard hanno lo stesso
tempo di ritenzione, essi sono rivelati separatamente secondo la loro massa.
Lo standard interno può essere una sostanza chimicamente analoga al
campione in esame, o meglio ancora può essere la stessa molecola, ma
ottenuta per sintesi sostituendo un isotopo di uno degli elementi presenti,
come nell’esempio qui illustrato.
Figura 17.
Analisi di massa Nella
ioni precursore spettrometria di
massa/spettrome
tria di massa
Cella di (MS/MS) il primo
collisione analizzatore
seleziona ioni di
un particolare
valore m/z per la
successiva
Selezione
frammentazione;
ione
il secondo
Analisi di massa analizzatore
ioni prodotto produce lo
spettro di massa
dei frammenti
ottenuti.
4
Protozoi, rizopodi generalmente marini.
·····
25
···
Cos’è la spettrometria di massa elementare?
·····
26
Per qualsiasi richiesta è possibile rivolgersi direttamente a una delle persone
elencate di seguito.
Presidente:
Lorenza OPERTI, Dipartimento di Chimica Generale e Organica
Applicata, Corso Massimo D’Azeglio, 48, 10125 TORINO, Tel.
011-6707510, Fax 011-6707591, E-mail: [email protected].
Vice Presidente:
Francesco DE ANGELIS, Dipartimento di Chimica, Ingegneria Chimica
e Materiali, Via Assergi, 4, Coppito, 67010 L’AQUILA, Tel. 0862-433769,
Fax 0862-433753, E-mail: [email protected].
Segretario:
Roberta SERAGLIA, Istituto di Scienze e Tecnologie Molecolari del
CNR, Corso Stati Uniti, 4, Camin, 35020 PADOVA, Tel. 049-8295679, Fax
049-8295621, E-mail: [email protected].
Membri:
Achille CAPPIELLO, Istituto di Scienze Chimiche “Prof. Fabrizio
Bruner”, Piazza Rinascimento, 6, 61029 URBINO, Tel. 0722-4164, Fax
0722-2754, E-mail: [email protected].
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