Nama: Ressy Krisbella Mardiantik

Kelas: 2A Farmasi

NIM: E0016031

Mata Kuliah: FITOKIMIA II

Dosen Pengampu: Tutik Wuryandari, M.Farm.,Apt

SOAL!

1. Bagaimana cara mengisolasi suatu senyawa bahan alam dari suatu tanaman yang anda

pilih:

a. Cara pengambilan dan pengolahan bahan

b. Metode ekstraksi dan system pelarut

c. Metode dan cara pemisahan senyawa

d. Pemurnian senyawa

e. Analisis spektroskopi
Jawab:

a. Cara pengambilan dan pengolahan bahan

Pada jurnal Isolasi senyawa aktif Lignan dari buah lada hitam (Piper nigrum L)

dan daun sirih (Piper betle L) untuk cara pengambilan dan pengolahan bahannya

yaitu dengan bahan yang digunakan adalah buah lada hitam (Piper nigrum L.) yang

diperoleh dari Lampung dan daun sirih (Piper betle L.) yang diperoleh dari Subang.

Determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bandungense Sekolah Ilmu dan

Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung. Buah lada hitam dan daun sirih

dipisahkan dari pengotornya, kemudian digiling sehingga didapatkan serbuk

simplisia. Untuk pengolahannya yaitu dengan Ekstraksi dan pemantauan ekstrak

Serbuk simplisia buah lada hitam (Piper nigrum L.) dan daun sirih (Piper betle L.)

diekstraksi dengan cara panas yaitu ekstraksi sinambung menggunakan alat soxhlet

dengan pelarut metanol. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap putar

vakum pada suhu 35-40oC. Pemantauan ekstrak pekat metanol menggunakan metode

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan plat silika gel GF254 pra salut dan

pengembang n-heksana–etil asetat (2:1). Ekstrak metanol dan ekstrak diklorometana

dari kedua simplisia dipantau secara KLT. Hasil pemantauan ekstrak ini tidak

digunakan penampak bercak spesifik lignin, namun dilakukan penyemprotan dengan

asam sulfat 10% dalam methanol yang bertujuan untuk mengetahui berapa senyawa

yang terdapat dalam ekstrak. Bercak yang diduga senyawa lignan adalah bercak yang

memberikan warna gelap pada UV λ 254 nm dan UV λ 366 nm serta memberikan

warna ungu setelah disemprot dengan penampak bercak H2SO4 dan vanilin sulfat.

Ekstrak diklorometana dilanjutkan dengan kromato-grafi cair vakum (KCV). Dari

hasil pemantauan fraksinasi kedua terlihat bercak berwarna ungu pada fraksi ke-11

sampai fraksi ke-13 pada daun sirih, serta pada fraksi ke-8, 10, 13 pada buah lada.

Kemudian fraksi-fraksi ini dimurnikan menggunakan KLT prepatatif dengan fasa

diam silika gel GF254 menggunakan penyangga kaca dan pengembang Kromatogram

diamati di bawah sinar UV pada λ 254 nm dan 366 nm, serta digunakan penampak

bercak asam sulfat 10% dalam metanol.

Pada jurnal Aktivitas antioksidan Buah Kopi Hijau Merapi The Antioxidant

Activity of Green Coffee Cherries at Merapi untuk cara pengambilan bahannya

yaitu dengan bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah kopi hijau

yang dipanen pada bulan maret 2015 yang diperoleh dari perkebunan kopi Dusun

Petung Desa Kepuharjo, Cangkringan Sleman. Bahan pendukung yang digunakan

adalah vitamin C, DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) (sigma Aldrich), pelarut

kloroform, metanol, metanol 80%, etil asetat dan aquades. Bahan kimia yang

digunakan berderajat pro analisis E. Merck. Dan untuk cara pengolahannya yaitu

dengan cara Ekstrak dan fraksi dimana sejumlah simplisia buah kopi hijau dimaserasi

dengan pelarut kloroform dalam bejana selama 3x24 jam, setiap 1x24 jam pelarut

diganti dan dilakukan pengadukan sesering mungkin. Kemudian filtrat disaring dan

dipekatkan dengan vaccum rotary evaporatordan penangas air hingga diperoleh

ekstrak kloroform. Selanjutnya ekstrak kloroform dilarutkan di dalam pelarut metanol

80%.Ekstrak di vortex dan disonifikator. Filtrat dikeringkan dengan penangas air

hingga diperoleh partisi larut metanol 80%. Sisa endapan atau yang tidak larut

metanol 80% disebut residu.

Pada jurnal selanjutnya Isolasi Dan Identifikasi Flavonoid Dalam Daun Lamun

(Syringodium Isoetifolium) cara pengambilan bahan yang digunakan yaitu daun

Lamun yang diperoleh dari Pantai Molas dan Meras Kecamatan Bunaken, etanol
96%, aquades, n-butanol, asam asetat, metanol. Amoniak. Cara pengolahannya

Sebanyak 150 gram serbuk halus daun lamun dimasukan ke dalam 750 ml etanol 96

%, ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 5 hari, sambil dikocok.

Setelah itu sampel di uapkan dengan menggunakan rotary evaporator dan mendapat

ekstrak cair yang kemudian di water batch pada suhu 60º C. Ekstrak yang di isolasi

dengan menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif menggunakan fase diam G60

F254 dengan ukuran 20 cm x 20 cm dan fase gerak campuran n-butanol-asam asetat-

dan air (BAA) (4:1:5). Selanjutnya isolat diidentifikasi dengan menggunakan

spektrofotometer Ultra Violet –Visibel.

Pada jurnal Isolasi Senyawa Kumarin Dari Kulit Batang Kecapi (Sandoricum

Koetjape) Sebagai Antibakteri cara pengambilan bahan dan pengolahannya yaitu

daun kecapi biasa digunakan untuk obat infeksi kulit, menurunkan panas, diare dan

sakit kepala. Bubuk kulit kayu kecapi digunakan sebagai obat kurap dan antikanker.

Akarnya digunakan sebagai antiseptik, sakit pinggang serta untuk penguat tubuh

wanita setelah melahirkan (Nassaret al., 2011). Ekstrak kulit batangnya memiliki

aktifitas sitotoksik terhadap kanker yang menyebabkan leukemia pada manusia (Efdi

et al., 2012). Disamping itu, uji kandungan metabolit sekunder (fitokimia) yang telah

dilakukan peneliti sebelumnya bahwa pada kulit batang selain mengandung senyawa

triterpenoid juga terdapat flavonoid, fenolik dan kumarin (Aria, 2013). Mengingat

masih sedikitnya senyawa kumarin dari kulit batang tumbuhan kecapi yang

dilaporkan maka dalam penelitian ini dilakukan isolasi senyawa kumarin serta uji

aktifitas antibakteri terhadap ekstrak heksana, etil asetat dan metanol. Bahan-bahan

yang digunakan untuk uji fitokimia yaitu pereaksi Mayer untuk identifikasi alkaloid,

pereaksi Liebermann Burchard (asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat keluaran

PT. BRATACO) untuk identifikasi triterpenoid dan steroid, Sianidin test (bubuk
magnesium dan asam klorida pekat keluaran PT. BRATACO) untuk identifikasi

flavonoid, besi(III) kloridakeluaran PT. BRATACO untuk identifikasi fenolik,

ammonia keluaran PT. BRATACO, natrium hidroksida keluaran PT. BRATACO

untuk identifikasi kumarin. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengerjaan isolasi

adalah kulit batang kecapi, heksana, etil asetat dan metanol (ketiganya merupakan

pelarut teknis yang telah didistilasi) keluaran PT. BRATACO digunakan sebagai

pelarut saat maserasi dan eluen pada kromatografi kolom, akuades, plat KLT

(Kromatografi Lapis Tipis) merek Merck,silika gel 60 (0,063-0,200 mm) (70-230

mesh ASTM) merek Merck, sphadex LH20, kertas saring, aluminium voil, kertas

saring Whatman no. 1 berdiamater 6 mm dan media Nutrient Agar.

Pada jurnal Isolasi, Identifikasi, Dan Uji Sitoktoksik Senyawa Alkaloid Dari Daun

Johar yang diperlukan dalam penelitian ini yaitu daun Johar (Senna siamea)

diperoleh dari daerah Purworejo, Jawa Tengah, aquades, etanol 96% teknis, n-heksana

teknis, kloroform teknis, etil asetat teknis, plat KLT silika gel GF254 (Merck), plat

KLT Preparatif silika gel GF254 20x20 cm, tebal 2,0 mm (Merck), n-heksana p.a.

(Merck), etil asetat p.a. (Merck), asam asetat p.a. (Merck), kloroform p.a. (Merck),

metanol p.a. (Merck), asam klorida (Merck), natrium hidroksida (Merck), pereaksi

dragendorf, pereaksi Mayer. Pengolahannya Serbuk daun Johar sebanyak 1kg

dimaserasi dengan pelarut etanol 96% selama 10 x 24 jam. Ekstrak etanol diuap-kan

pada kondisi vakum sampai ekstrak pekat. Ekstrak pekat etanol dilarutkan dalam

methanol dan ditambahkan aquades de-ngan rasio 1:1 dan didiamkan selama se-

malam untuk memisahkan antara klorofil dengan filtrat. Simpilisa dan ekstrak yang

didapatkan dilakukan analisis penapisan fitokimia yang meliputi tanin, alkaloid, fla-

vonoid, kuinon, saponin, dan steroid/ tri-terpenoid.

b. Metode ekstraksi dan system pelarut

Metode ekstraksi dan system pelarut pada jurnal pertama yaitu dengan Ekstraksi dan

pemantauan ekstrak. Serbuk simplisia buah lada hitam (Piper nigrum L.) dan daun

sirih (Piper betle L.) diekstraksi dengan cara panas yaitu ekstraksi sinambung

menggunakan alat soxhlet dengan pelarut metanol. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan

dengan alat penguap putar vakum pada suhu 35-40oC. Pemantauan ekstrak pekat

metanol menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan plat

silika gel GF254 pra salut dan pengembang n-heksana–etil asetat (2:1) Ekstrak metanol

dan ekstrak diklorometana dari kedua simplisia dipantau secara KLT. Hasil

pemantauan ekstrak ini tidak digunakan penampak bercak spesifik lignin, namun

dilakukan penyemprotan dengan asam sulfat 10% dalam methanol yang bertujuan

untuk mengetahui berapa senyawa yang terdapat dalam ekstrak. Bercak yang diduga

senyawa lignan adalah bercak yang memberikan warna gelap pada UV λ 254 nm dan

UV λ 366 nm serta memberikan warna ungu setelah disemprot dengan penampak

bercak H2SO4 dan vanilin sulfat. Ekstrak diklorometana dilanjutkan dengan kromato-

grafi cair vakum (KCV). Dari hasil pemantauan fraksinasi kedua terlihat bercak

berwarna ungu pada fraksi ke-11 sampai fraksi ke-13 pada daun sirih, serta pada

fraksi ke-8, 10, 13 pada buah lada. Kemudian fraksi-fraksi ini dimurnikan

menggunakan KLT prepatatif dengan fasa diam silika gel GF254 menggunakan

penyangga kaca dan pengembang Kromatogram diamati di bawah sinar UV pada λ

254 nm dan 366 nm, serta digunakan penampak bercak asam sulfat 10% dalam

metanol.

Fraksinasi dan pemantauan fraksi Ekstrak pekat metanol ditambahkan campuran air-

diklorometana (1:1) dan dilakukan fraksinasi secara ekstraksi cair-cair (ECC). Fraksi
diklorometan diambil dan dipantau. Fraksi dipantau dengan cara Kromatografi Lapis

Tipis (KLT) menggunakan plat silika gel GF254 pralapis dan pengembang n-heksana-

etil asetat (1:1) untuk fraksi lada dan heksana-etil asetat (7:4) untuk fraksi sirih.

Kromatogram diamati di bawah sinar UV pada λ254 nm dan 366 nm, serta digunakan

penampak bercak asam sulfat 10% dalam metanol. Fraksinasi kedua dilakukan

terhadap fraksi pekat ECC menggunakan metode kromatograficair vakum (KCV)

menggunakan fase diam silika gel 60 H dan eluen berupa komposisi pelarut n-heksan-

diklorometana-metanol. Subfraksi yang diperoleh dipantau kembali secara KLT

dengan plat silika gel GF254 pralapis dan pengembang toluena-aseton (50:1) dan

toluena-aseton (25:7) untuk subfraksi lada. Serta pengembang toluena-aseton (7:3)

untuk subfaksi sirih. Kromato-gram diamati di bawah sinar UV pada λ 254 nm dan

366 nm, serta digunakan penampak bercak vanilin sulfat.

Pada jurnal yang kedua metode ektraksinya dengan caraekstraksi maserasi, yaitu

sejumlah simplisia buah kopi hijau dimaserasi dengan pelarut kloroform dalam bejana

selama 3x24 jam, setiap 1x24 jam pelarut diganti dan dilakukan pengadukan sesering

mungkin. Kemudian filtrat disaring dan dipekatkan dengan vaccum rotary

evaporatordan penangas air hingga diperoleh ekstrak kloroform. Selanjutnya ekstrak

kloroform dilarutkan di dalam pelarut metanol 80%.Ekstrak di vortex dan

disonifikator. Filtrat dikeringkan dengan penangas air hingga diperoleh partisi larut

metanol 80%. Sisa endapan atau yang tidak larut metanol 80% disebut residu.

Kemudian dengan uji Aktivitas penangkapan radikal DPPH Sejumlah 10 mg ekstrak

kloroform, larut metanol 80% dan endapan metanol 80% dilarutkan dengan 1ml

pelarut kloroform. Larutan ini digunakan sebagai larutan induk dan nantinya akan

dibuat seri kadar sesuai konsentrasi yang diinginkan. Kadar ekstrak kloroform yang

digunakan adalah 0,20mg/mL, 1,02mg/mL, 2,04mg/mL, 3,06mg/mL dan 4,08mg/mL.

Kadar larut metanol 80% yang digunakan adalah 0,21mg/mL, 1,03 mg/mL,

2,06mg/mL, 3,09mg/mL, dan 4,12mg/mL. Kadar endapan metanol 80% yang

digunakan adalah 0,20mg/mL,1,02mg/mL, 2,04mg/mL, 3,06mg/mL dan 4,08mg/mL.

Untuk uji kuantitatif digunakan pelarut berderajat pro analisis (p.a). Demikian juga

pembanding vitamin C dibuat dengan konsentrasi 1 mg/mL. Larutan ini digunakan

sebagai larutan induk dan nantinya akan dibuat seri kadar sesuai konsentrasi yang

diinginkan yaitu 1µg/mL, 2µg/mL, 2,5µg/mL, 3µg/mL, 3,5µg/mL, dan 4 µg/mL.

Sejumlah kurang lebih 15,8 mg serbuk DPPH dilarutkan dengan metanol dan divortex

untuk membantu kelarutan. Larutan kemudian dipindahkan kedalam labu takar lalu

metanol ditambahkan sampai 100,0 mL. Larutan disimpan dalam wadah gelap

berlapiskan aluminium foil dan disimpan pada suhu -40C. Masing masing sejumlah

ekstrak kloroform, larut metanol 80%, endapan metanol 80% dan vitamin C

direaksikan dengan 1,0 mL DPPH dan ditambah metanol sampai 5,0 mL pada labu

takar. Ekstrak diukur pada panjang gelombang maksimum DPPH.

Pada jurnal yang ketiga metode ekstraksi yang digunakan dan system pelarutnya yaitu

dengan metode maserasi. Metode eksraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah

metode maserasi yang disesuaikan dengan sifat fisika dan kimia dari senyawa yang

akan di ekstraksi yaitu flavonoid. Senyawa Flavonoid adalah golongan senyawa yang

tidak tahan panas dan mudah teroksidasi pada suhu tinggi. Pelarut yang digunakan

dalam penelitian ini adalah etanol 96% yang disesuaikan dengan kepolaran senyawa.

Sampel sebanyak 150 gram di maserasi dalam 750 ml etanol 96% dengan

perbandingan 1:5 selama 5 hari dan menghasilkan Ekstrak kental sebanyak 2,6 gram.

Setelah di ekstraksi sampel akan di isolasi dengan menggunakan metode

Kromatografi Lapis Tipis. Kromatografi Lapis Tipis merupakan suatu metode

pemisahan senyawa kimia berdasarkan perbedaan distribusi dua fase yaitu fasa diam
dan fasa gerak. Eluen yang digunakan n-butanol: asam asetat: air (4:1:5). Eluen yang

baik adalah eluen yang bisa memisakan senyawa dalam jumlah yang banyak dan di

tandai dengan munculnya noda (Harborne, 1987).

Pada jurnal selanjutnya yaitu dengan metode ekstraksi secara destilasi Sebanyak 900

gram serbuk kulit batang kecapi direndam dengan menggunakan pelarut heksana, etil

asetat dan metanol. Ekstrak yang didapatkan diuapkan dengan rotary evaporator

hingga didapatkan ekstrak pekat. Selanjutnya, masing-masing ekstrak dilakukan uji

antibakteri untuk menentukan ekstrak aktif. Uji aktifitas antibakteri mengunakan

metoda difusi cakram. Bakteri yang digunakan adalah bakteri gram negatif

Escherichia coli dan bakteri gram positif Staphylococcus aureus. Untuk ekstrak

ditimbang masing-masing 100 mg dan diencerkan dengan 50 mL pelarut (heksana,

etil asetat dan metanol) sehingga didapatkan konsentrasi 2000 mg/L dan dipipet 0,5

mL (2000 mg/L). Kontrol negatif menggunakan pelarut dari masing-masing ekstrak

sedangkan kontrol positif digunakan antibiotik amoxilin yang ditimbang 50 mg dan

dilarutkan dengan 50 mL aquades sehingga didapatkan konsentrasi 1000 mg/L. Media

Nutrient Agar yang telah dituang ke dalam cawan petri dan setelah padat diolesi

suspensi bakteri uji. Kertas saring cakram dicelupkan ke dalam masing-masing

sampel uji secara bersamaan selama 20 detik dan diletakkan pada cawan petri

tersebut. Uji aktifitas ditentukan setelah 24 jam inkubasi pada 37ºC. Diameter zona

hambat yang dihasilkan oleh sampel diukur. Ektraksi Sampel 900 gram dimaserasi

berkali-kali dengan menggunakan pelarut heksana, etil asetat dan metanol diperoleh

ekstrak pekat heksana 36.75 gram, etil asetat 37.57 gram dan metanol 36.83 gram.

Pada jurnal selanjutnya dilakukan ekstraksi dengan soxhletasi. Soxhletasi merupakan

cara ekstraksi yang dilakukan dalam sebuah alat yang disebut soxhlet dengan pelarut

polar berdasarkan titik didihnya. Pemilihan metode maserasi pada penelitian ini
dikarenakan senyawa katekin rentan terhadap panas sehingga tidak baik

menggunakan metode soxhlet. Hal ini didukung oleh penelitian Cheong dkk (2005)

bahwa konsentrasi senyawa katekin mengalami penurunan pada metode soxhlet

dibandingkan dengan metode maserasi [3]. Daun gambir yang telah dihaluskan

ditimbang sebanyak 50 gr dan dilarutkan pada pelarut (akuades, etanol 96%, etil

asetat 95%, dan etil asetat 95%:etanol 96% (1:1)) sebanyak 300 ml. Sampel kemudian

dipanaskan di dalam waterbath selama 60 menit. Setelah itu sampel didiamkan di

tempat gelap selama (1 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam). Kemudian disaring dan hasil

filtratnya di uji kadar katekin, kadar air, dan kadar abu [2]. Pelarut yang biasa

digunakan untuk ekstraksi diantaranya adalah metanol, etanol, etil asetat, aseton dan

asetonitril dengan air. Pemilihan pelarut pada proses ekstraksi dilakukan dengan

alasan karena pelarut mampu melarutkan senyawa yang akan diekstrak, mudah

dipisahkan dan dimurnikan kembali [1].

Pada jurnal selanjutnya menggunakan metode ektraksi menggunakan microwave.

Metode ekstraksi dengan microwave ini mempunyai keunggulan antara lain yaitu

waktu ekstraksi yang dibutuhkan lebih cepat, mudah dalam penggunaan alat, serta

penggunaan pelarut yang lebih sedikit [Veggi, et al, 2013].

Pada jurnal selanjutnya juga menggunakan metode ektraksi maserasi. metode

maserasi, yang mempunyai beberapa kelebihan antara lain alat yang digunakan

sederhana, hanya dibutuhkan bejana perendaman tetapi menghasilkan produk yang

baik, selain itu dengan teknik ini zat-zat yang tidak tahan panas tidak akan rusak

(Ningsih, 2016). Pada tahap ekstraksi sebanyak 457,5 gram serbuk simplisia herba

Patikan Kebo diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 75%

hingga diperoleh eksrak kental sebanyak 31,44 gram (rendemen ekstrak 6,87%).

Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini herba Patikan Kebo (Euphorbia hirta
 L.), etanol 75%, aquadest, HCl 2N, pereaksi dragendroff, pereaksi mayer, NaOH

10%, pereaksi Liberman-Buchard, Pb asetat, larutan AlCl3, larutan KOH 10%, FeCl3

5%, etil asetat, klorofom, methanol, n-Heksan, butanol, asam asetat glasial, H2SO4 10

%.

Pada jurnal selanjutnya dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi. Ekstrak etanol

diuap-kan pada kondisi vakum sampai ekstrak pekat. Ekstrak pekat etanol dilarutkan

dalam methanol dan ditambahkan aquades de-ngan rasio 1:1 dan didiamkan selama

se-malam untuk memisahkan antara klorofil dengan filtrat. Simpilisa dan ekstrak yang

didapatkan dilakukan analisis penapisan fitokimia yang meliputi tanin, alkaloid, fla-

vonoid, kuinon, saponin, dan steroid/ tri-terpenoid.

c. Metode dan pemisahan senyawa

Tanaman lamun merupakan kelompok tumbuhan berbunga, berdaun, berakar sejati

dan tumbuh pada kedalaman air laut yang dangkal. Tanaman lamun biasanya di

gunakan sebagai penangkap sedimen, digunakan sebagai kompos dan sebagai

antioksidan penggunaan mengenai tanaman lamun khususnya bagi manusia masih

perlu dilakukan. Melihat potensi dan kandungan kimia seperti yang terdapat pada

lamun seperti flavonoid. Maka sangatlah perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui

kandungan jenis flavonoid yang terdapat pada daun lamun. Untuk itu dilakukan

penelitian tentang isolasi dan identifikasi dalam daun lamun (Syringodium

isoetifolium) menggunakan Kromatografi lapis tipis dan Spektrofotometer UV-Vis.

Penelitian dilakukan dengan ekstraksi maserasi mengggunakan pelarut etanol 96%

p.a. Isolasi dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis silika GF 254 dengan eluen n-

butanol:asam asetat:air (BAA) (4:1:5). Isolasi menggunakan KLT memperoleh 2 spot,

yang pertama berwarna kuning dengan Rf 0,4 dan yang kedua berwarna merah

dengan Rf 0,8. Identifikasi senyawa flavonoid dengan menggunakan spektrofotometer

UV-Vis. Berdasarkan Hasil penelitian bahwa senyawa flavonoid yang terdapat pada

daun lamun di duga senyawa flavonoid golongan Khalkon. Metode dan pemisahan

senyawa dilakukan dengan Sebanyak 150 gram serbuk halus daun lamun dimasukan

ke dalam 750 ml etanol 96 %, ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 5

hari, sambil dikocok. Setelah itu sampel di uapkan dengan menggunakan rotary

evaporator dan mendapat ekstrak cair yang kemudian di water batch pada suhu 60º C.

Ekstrak yang di isolasi dengan menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif

menggunakan fase diam G60 F254 dengan ukuran 20 cm x 20 cm dan fase gerak

campuran n-butanol-asam asetat-dan air (BAA) (4:1:5). Selanjutnya isolat

diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometer Ultra Violet –Visibel.

Selanjutnya dilakukan isolasi dan pemisahan senyawa pada senyawa kumarin. Isolasi

senyawa kumarin telah dilakukan dari kulit batang tumbuhan kecapi

(Sandoricumkoetjape). Serbuk kulit batang kecapidiekstrak dengan metoda maserasi

menggunakan pelarut heksana, etil asetatdanmetanol. Pemurnian ekstrak dengan

kromatografi kolom dan identifikasi senyawa dilakukan dengan spektroskopi IR. Uji

aktifitas antibakteri terhadap ekstrak dilakukan dengan metoda difusi cakram.

Hasilnya menunjukkan aktifitas antibakteri ekstrak etil asetat lebih aktif dibandingkan

ekstrak heksana dan metanol dengan daerah hambatnya 19 mm (Escherichia coli) dan

12 mm (Staphylococcus aureus). Senyawa hasil isolasi berupa kristal jarum berwarna

putih yang diperoleh dari ekstrak etilasetat dengan titik leleh 194ºC - 195ºC. Dari data

spektroskopi IR menunjukkan senyawa ini memiliki gugus fungsihidroksil. Untuk

pemisahan senyawanya dilakukan Sebanyak 900 gram serbuk kulit batang kecapi

direndam dengan menggunakan pelarut heksana, etil asetat dan metanol. Ekstrak yang

didapatkan diuapkan dengan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak pekat.

Selanjutnya, masing-masing ekstrak dilakukan uji antibakteri untuk menentukan

ekstrak aktif. Uji aktifitas antibakteri mengunakan metoda difusi cakram. Bakteri

yang digunakan adalah bakteri gram negatif Escherichia coli dan bakteri gram positif

Staphylococcus aureus. Untuk ekstrak ditimbang masing-masing 100 mg dan

diencerkan dengan 50 mL pelarut (heksana, etil asetat dan metanol) sehingga

didapatkan konsentrasi 2000 mg/L dan dipipet 0,5 mL (2000 mg/L). Kontrol negatif

menggunakan pelarut dari masing-masing ekstrak sedangkan kontrol positif

digunakan antibiotik amoxilin yang ditimbang 50 mg dan dilarutkan dengan 50 mL

aquades sehingga didapatkan konsentrasi 1000 mg/L. Media Nutrient Agar yang telah

dituang ke dalam cawan petri dan setelah padat diolesi suspensi bakteri uji. Kertas

saring cakram dicelupkan ke dalam masing-masing sampel uji secara bersamaan

selama 20 detik dan diletakkan pada cawan petri tersebut. Uji aktifitas ditentukan

setelah 24 jam inkubasi pada 37ºC. Diameter zona hambat yang dihasilkan oleh

sampel diukur.

Pada jurnal selanjutnya dilakukan isolate dengan daun johar menggunakan metode

ekstraksi dengan pelarut etanol 96%. Ekstrak etanol dan serbuk daun Johar diuji

penapisan fitokimia. Ekstrak alkaloid dihasilkan dengan cara penggaraman melalui

penambahan HCl 2M sampai pH 3 dan diekstraksi dengan etil asetat, lapisan asam

yang didapatkan ditambah NH4OH hingga pH 9-10 dan diekstraksi dengan etil asetat.

Pemisahan alkaloid dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif menggunakan

fasa diam silika gel GF254 dan fasa gerak etil asetat:kloroform (8:2) dan uji

kemurniannya menggunakan metode KLT dengan berbagai eluen dan KLT dua

dimensi. Isolat alkaloid diuji aktivitas sitotoksisitas dengan metode BSLT (Brine

Shrimp Lethality Test), penentuan struktur molekul isolat alkaloid dengan metode

spektrometri UV-Vis, FT-IR dan LC-MS. Hasil penapisan fitokimia sampel

mengandung senyawa flavonoid, tanin, kuinon, saponin, dan alkaloid. Ekstrak

alkaloid diperoleh seberat 1,06 gram (0,645%). Identifikasi isolat alkaloid

menggunakan spektrometri UV-Vis menunjukan alkaloid termasuk golongan

isokuinolin dengan panjang gelombang 230 nm, 255 nm, dan 335 nm, analisis

menggunakan spektrometri FTIR menunjukan isolat alkaloid memiliki gugus fungsi

OH, CH3, C=C, C-N, C=O, C-O eter. Hasil LC-MS diperoleh berat molekul sampel

sebesar 214,25 g/mol. Berdasarkan hasil analisis diduga senyawa yang didapatkan

adalah senyawa cassiarin A. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak alkaloid menunjukkan

LC50 sebesar 18,383 ppm dapat disimpulkan ekstrak alkaloid bersifat sangat

sitotoksik. Isolasi Alkaloid: Fraksi yang berupa metanol–air dilakukan partisi

menggunakan n-heksan dan kloroform. Fraksi metanol-air yang didapatkan dila-

kukan penggaraman menggunakan HCl 2 M hingga pH 3 lalu ekstraksi dengan

pelarut etil asetat sehingga didapatkan lapisan asam, selanjutnya dilakukan

penambahan NH4OH hingga pH 9 kemudian diekstraksi menggunakan pelarut etil

asetat dan diuap-kan sehingga didapatkan ekstrak alkaloid. Ekstrak alkaloid dilakukan

pemisahan me-nggunakan KLT dengan fase diam berupa silika gel GF254 dan eluen

berupa etil asetat :kloroform dengan rasio 8:2. Noda yang ter-bentuk dilakukan uji

alkaloid dengan pe-reaksi Dragendorf. Noda positif alkaloid dilakukan pemisahan

menggunakan KLT Preparatif 20x20 cm dengan fase diam berupa silika gel GF254

dan eluen berupa etil asetat :kloroform dengan rasio 8:2.

Pada jurnal isolasi buah lada hitam dan daun sirih bertujuan untuk mengisolasi

senyawa lignan dari buah lada dan daun sirih. Serbuk simplisia dari daun sirih dan

buah lada hitam diekstraksi dengan ekstraksi sinambung menggunakan pelarut

metanol. Ekstrak difraksinasi dengan ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut air-

diklorometan (1:1) dan kromatografi cair vakum. Pemurnian dilakukan dengan

menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif. Isolat dikarakterisasi dengan

menggunakan kromatografi gas-spektroskopi massa (KG-SM). Dari buah lada hitam

telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi dua senyawa lignan berupa hinokinin dan

satu senyawa lignan lain yang memiliki ciri fragmen 135 dan 286 pada KG-SM.

Sedangkan daun sirih memberikan data kromatografi untuk golongan lignan tetapi

belum dapat dikonfirmasi dengan data KG-SM. Penapisan fitokimia dilakukan untuk

menentukan golongan kimia dari simplisia yang akan digunakan. Hasil penapisan

fitokimia menunjukkan bahwa daun sirih mengandung senyawa alkaloid, flavonoid,

kui-non, dan steroid-triterpenoid. Sedangkan pada buah lada menunjukkan adanya

golongan senyawa alkaloid, flavonoid. Ekstrak metanol dan ekstrak diklorometana

dari kedua simplisia dipantau secara KLT. Hasil pemantauan ekstrak ini tidak

digunakan penampak bercak spesifik lignin, namun dilakukan penyemprotan dengan

asam sulfat 10% dalam methanol yang bertujuan untuk mengetahui berapa senyawa

yang terdapat dalam ekstrak. Bercak yang diduga senyawa lignan adalah bercak yang

memberikan warna gelap pada UV λ 254 nm dan UV λ 366 nm serta memberikan

warna ungu setelah disemprot dengan penampak bercak H2SO4 dan vanilin sulfat.

Ekstrak diklorometana dilanjutkan dengan kromato-grafi cair vakum (KCV). Dari

hasil pemantauan fraksinasi kedua terlihat bercak berwarna ungu pada fraksi ke-11

sampai fraksi ke-13 pada daun sirih, serta pada fraksi ke-8, 10, 13 pada buah lada.

Kemudian fraksi-fraksi ini dimurnikan menggunakan KLT prepatatif dengan fasa

diam silika gel GF254 menggunakan penyangga kaca dan pengembang toluena-aseton

(50:1) untuk subfraksi lada, serta pengembang toluena-aseton (7:3) untuk subfraksi

sirih. Pada pita yang diinginkan dikerok dan dilarutkan ke dalam metanol kemudian

disaring. Diperoleh beberapa isolat yang siap untuk dikarakterisasi. Karakterisasi

isolat dilakukan menggunakan kromatografi gas-spekroskopi massa (KG-SM) varian

3900 Saturn 2000 dengan kolomkapiler VF-5ms 30m x 0,25mm ID. Dipilihnya
 metode KG-SM untuk karakterisasi senyawa lignan karena senyawa lignan memiliki

spektrum massa, m/z, yang khas yaitu fragmen massa, m/z, 135, 151, 165, 181. Dari

hasil karakterisasi, diperoleh subfraksi no. 10 buah lada diduga mengandung dua

senyawa lignan yaitu hinokinin yang memiliki spektrum massa khas dengan fragmen

(m/z) 135 dan 354, serta senyawa lignan dengan fragmen khas 135 dan 286.

d. Pemurnian senyawa

Pada jurnal isolasi senyawa aktif lignin dari buah lada hitam dan daun sirih,

pemurnian senyawa melalui subfraksi yang diperkirakan mengandung lignan

dimurnikan dengan KLT preparative menggunakan adsorben silika gel GF254 dengan

penyangga kaca dan pengembang toluena-aseton (50:1) untuk subfraksi lada dan

toluena-aseton (7:3) untuk subfraksi sirih. Pita hasil KLT preparatif yang diinginkan

dikerok, dilarutkan dalam metanol kemudian disaring.

Pemurnian senyawa pada jurnal selanjutnya yaitu Buah kopi yang diambil adalah

buah kopi yang berwarna hijau dari hasil limbah panen buah kopi. Ekstrak dibuat

dengan sejumlah buah kopi hijau yang diekstraksi menggunakan pelarut kloroform

metode maserasi. Pelarut kloroform digunakan untuk menarik senyawa senyawa yang

bersifat semipolar yatu spesies xanthin seperti kafein (Hostettmann K, 2000),

teobromin dan teofilin (Nardhini M, 2002;Kiyohara C, 1999), Sejumlah simplisia

buah kopi hijau dimaserasi dengan pelarut kloroform dalam bejana selama 3x24 jam,

setiap 1x24 jam pelarut diganti dan dilakukan pengadukan sesering mungkin.

Kemudian filtrat disaring dan dipekatkan dengan vaccum rotary evaporatordan

penangas air hingga diperoleh ekstrak kloroform. Selanjutnya ekstrak kloroform

dilarutkan di dalam pelarut metanol 80%.Ekstrak di vortex dan disonifikator. Filtrat

dikeringkan dengan penangas air hingga diperoleh partisi larut metanol 80%.

Pada jurnal selanjutnya pemurnian senyawa dilakukan dengan metode maserasi yang

terdapat pada pelarut etil asetat 95% dengan suhu maserasi 60OC dan waktu Maserasi

6 jam yaitu sebesar 87,14% dan kadar katekin terendah terdapat pada pelarut akuades

dengan suhu kamar maserasi dan waktu maserasi 1 jam yaitu sebesar 9,83%. Hal ini

sesuai dengan penelitian Sousa (2008) bahwa pemilihan pelarut yang terbaik pada

proses senyawa yang akan diekstrak yaitu pelarut yang mudah dipisahkan (menguap)

dan dimurnikan kembali [9]. Semakin tinggi suhu maserasi maka kecepatan

perpindahan masa dari solut ke solven akan semakin tinggi karena suhu

mempengaruhi nilai koefisien transfer masa dari suatu komponen. Pada jurnal

selanjutnya pemurnian senyawa Pemisahan senyawa-senyawa alka-loid dengan KLT

preparatif menggunakan eluen etil asetat:kloroform (8:2), sehinga menghasilkan pita-

pita dan yang positif alkaloid dikerok lalu dilarutkan dalam pelarut etil asetat,

kemudian dipisahkan dan dipe-roleh isolat alkaloid. Selanjutnya isolat alkaloid

dilakukan uji kemurnian dengan metode KLT me-nggunakan berbagai campuran

eluen dan KLT dua dimensi. Hasil KLT menunjukkan satu noda, diduga isolat

alkaloid telah murni. Hasil uji kemurnian dengan eluen (A) etil asetat : kloroform

(9:2), (B) etil asetat: etanol (8:2), dan (C) KLT dua dimensi dengan eluen (1) etil

asetat : kloroform (9:1), (2) etil asetat:etanol (9:1) pada lampu UV λ365 nm. Jurnal

selanjutnya dilakukan pemurnian senyawa dengan cara ekstraksi yaitu Serbuk daun

kulit kayu pinus sebanyak 1 gr dimasukkan ke dalam beaker glass, lalu ditambahkan

pelarut (aquadest;etanol). Proses ektraksi tanin dilakukan pada daya microwave

(100 W, 180 W, 300 W, 450 W dan 600 W) dengan waktu ekstraksi selama (1, 3, dan

5 menit). Hasil ekstraksi yang diperoleh disaring. Setelah itu dilakukan analisa kadar
 tanin total dalam ekstrak kulit kayu pinus menggunakan spektrofotometri UV-

Vis dan analisa FTIR pada larutan ekstrak tanin.

Jurnal selanjutnya yaitu untuk pemurnian senyawa dilakukan Ekstrak etil asetat

dilakukan pemurnian lebih lanjut dengan metoda kromatografi kolom. Ekstrak ini

dipilih karena mempunyai aktifitas antibakteri yang lebih aktif dibandingkan dengan

ekstrak lainnya. Hasil kromatografi kolom didapatkan sebanyak 517 vial dan

dilakukan penggabungan fraksi-fraksi berdasarkan pola noda dan Rf yang sama

sehingga didapatkan 9 fraksi (A – I). Fraksi H kemudian dilakukan rekromatografi

kolom dan dilakukan penggabungan fraksi berdasarkan pola noda Rf yang sama

sehingga didapatkan 4 fraksi.Fraksi H.3 diperoleh senyawa murni yang tandai dengan

adanya noda tunggal pada plat KLT. Adanya terlihat kontaminan dari hasil sphadex

LH20 maka dimurnikan kembali dengan menggunakan KLTpreparatif. Senyawa

murni yang didapatkan tersebut di KLT menggunakan berbagai perbandingan eluen.

Pada jurnal isolasi daun johar pemurnian senyawa Isolat alkaloid dilakukan uji

kemurnian dengan eluen etil asetat : kloroform (9:2), etil asetat: etanol (8:2), dan KLT

dua dimensi dengan eluen (1) etil asetat : kloroform (9:1), (2) etil asetat:etanol (9:1)

sehingga diperoleh isolat murni.

e. Analisis Spektroskopi

Metode spektroskopi inframerah merupakan suatu metode yang meliputi teknik

serapan (absorption), teknik emisi (emission), teknik fluoresensi (fluorescence).

Komponen medan listrik yang banyak berperan dalam spektroskopi umumnya hanya

komponen medan listrik seperti dalam fenomena transmisi, pemantulan, pembiasan,

dan penyerapan. Pada jurnal yang didapat Dari hasil pengujian titik leleh didapatkan

titik leleh senyawa ini 194°C - 195°C. Berdasarkan rentang nilai titik leleh < 2 maka
 dapat diindikasikan senyawa hasil isolasi telah murni.Hasil pengukuran spektroskopi

inframerah memperlihatkan beberapa pita serapan yang terlihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Spektrum Inframerah

Pada spektrum senyawa hasil isolasi yang didapatkan, hasil pengukuran spektroskopi

inframerah memperlihatkan beberapa pita serapan penting pada panjang gelombang

3339 cm-1, 2946 cm-1, 1702 cm-1, 1509 cm-1, 1446 cm-1 dan 1018 cm-1.Mengindikasi

beberapa pita serapan penting yaitu pita serapan -OH pada vibrasi regangan didaerah

3339 cm-1 yang didukung oleh pita serapan C-O di daerah 1018 cm-1. Pita serapan C-

H aromatik di daerah 2946 cm-1yang didukung oleh adanya serapan C=C di daerah

1446 cm-1. Inti benzen menyerap di daerah 1509-1446 cm-1. Sedangkan pita serapan

C=O karbonil di daerah 1702 cm-1.

Pada jurnal selanjutnya juga ada pengujian dengan menggunakan alat

spektrofotometer untuk mengetahui struktur dari senyawa alkaloid murni yang

didapatkan, maka isolat alkaloid dianalisis menggunakan spektro-fotometer UV-Vis,

FT-IR dan LC-MS. Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk

mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang

tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet.[1] Sebagian dari cahaya

tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.[2] Nilai absorbansi dari cahaya

yang dilserap sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet. Isolasi senyawa

alkaloid dilakukan dengan menambahkan HCl 2M pada ekstrak methanol-air sampai

suasana men-jadi asam, sehingga alkaloid akan mem-bentuk garam alkaloid. Garam

alkaloid ini kemudian diekstraksi menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan dua

lapisan. Lapisan atas adalah etil asetat yang me-ngikat senyawa selain alkaloid dan

lapisan bawah adalah lapisan asam dan alkaloid terikat pada lapisan ini. Untuk mem-

bebaskan alkaloid dari bentuk garamnya, maka ditambahkan ammonium hidroksida

sampai suasana menjadi basa, sehingga alkaloid akan terbentuk menjadi basa al-

kaloid kembali. Larutan ini kemudian dieks-traksi menggunakan etil asetat sehingga

akan terbentuk dua lapisan, lapisan etil asetat yang mengandung alkaloid dan lapi-san

basa yang mengandung air, pelarut etil asetat kemudian diuapkan sehingga dipe-roleh

ekstrak alkaloid. Untuk mengetahui ekstrak alkaloid yang didapatkan positif alkaloid

atau tidak maka ditambahkan pereaksi Dragendorff, terbentuknya enda-pan merah

bata berarti positif adanya alkaloid. Ekstrak alkaloid selanjutnya dianali-sis

menggunakan kromatografi lapis tipis dengan fasa diam silika gel 60 GF254 dan

eluen campuran eluen etil asetat:kloroform (8:2) untuk mengetahui jumlah

komponen-nya. Hasil KLT ada 4 noda yang terbentuk berwarna biru dengan nilai Rf1

(0,08), Rf2 (0,26), Rf3 (0,43), Rf4 (0,65), dan Rf5 (0,75). Hasil KLT, warna noda dan

nilai Rf, dapat dilihat pada gambar 1a. Hasil KLT setelah disemprot pereaksi

Dragendorf meng-hasilkan satu noda pada Rf (0,42) yang berwarna jingga, berarti
hanya satu noda yang positif alkaloid. Hasil KLT setelah disemprot pereaksi

Dragendorf dapat dilihat pada gambar 1b.

A B

Gambar 1. (A) Hasil KLT ekstrak alkaloid dengan eluen etil asetat : kloroform (8:2)

pada panjang gelombang 365 nm dan (B) KLT setelah disemprot perekasi Dragendorf

Pemisahan senyawa-senyawa alka-loid dengan KLT preparatif menggunakan eluen

etil asetat:kloroform (8:2), sehinga menghasilkan pita-pita dan yang positif alkaloid

dikerok lalu dilarutkan dalam pelarut etil asetat, kemudian dipisahkan dan dipe-roleh

isolat alkaloid.
Gambar 2. Hasil KLT preparative ekstrak alkaloid dengan eluen etil

asetat:kloroform (8:2) pada lampu UV λ 365 nm.

Selanjutnya isolat alkaloid dilakukan uji kemurnian dengan metode KLT me-

nggunakan berbagai campuran eluen dan KLT dua dimensi. Hasil KLT menunjukkan

satu noda, diduga isolat alkaloid telah murni. Isolat alkaloid murni kemudian di-

analisis dengan spektrofotometer UV-Vis di-dapatkan serapan pada panjang

gelombang 230 nm, 255 nm, 335 nm merupakan se-rapan dari ikatan rangkap

aromatik yang konjugasi dan diduga serapan alkaloid yang mempunyai kerangka

dasar isokuinolin, menurut jurnal alkaloid yang mengandung kerangka dasar

isokuinolin mempunyai pan-jang gelombang pada daerah 230 nm, 266 nm, 351 nm

[8]. Hasil analisis dengan spek-trofotometer UV-Vis dapat dilihat pada gambar 4.

Gambar 4. Spektra UV Vis isolat alkaloid daun Johar.

 DAFTAR PUSTAKA

Abdussalam, M., 2011, Isolasi dan Karakterisasi Struktur Kumarin Dari Fraksi Etil Asetat

Kulit Batang Kecapi (Sandoricum Koetjape) Serta Uji Antioksidan, UNAND.

Alam, Gemini, dan Abdul Rahim. 2007. Penuntun Praktikum Fitokimia. UIN Alauddin :

Makassar.

Ansel H. C, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi 4, Press UI, Jakarta, 1989.

Aria U. W., 2013, Isolasi Senyawa Triterpenoid dari Fraksi Aktif Kulit Batang Kecapi dan

Uji Bioaktifitas “Brine Shrimps Lethality Bioassay”, UNAND.

Almada PD (2009) Pengaruh Perubahan Proses Dekafeinasi Kopi dalam Reaktor Kolom

Tunggal Terhadap Mutu Kopi. Universitas Pertanian Bogor.

Ditjen POM Depkes RI, 2000, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Depkes RI, Jakarta,183–

184, 273-274.

Harbourne, J. B. 1987. Metode Fitokimia.Jilid II. Penerbit ITB : Bandung.

Harlis. 2010. Uji Aktivitas Anti Bakteri Ekstrak Patikan Kerbau (Euphorbia hirta L.)

Nardhini M, Cirillo E, S. C. (2002) ‘Absorption of Phenolic Acids in Humans After Coffee

Consumption’, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, pp. 573–574.

Markham, K. R. 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, Terjemahan oleh Kosasih

Padmawinata, ITB, Bandung.