Isoelectroenfoque
O isoelectroenfoque[1] (IEF), tamén chamado electroenfoque, enfoque isoeléctrico ou focalización isoeléctrica[2], é unha técnica para separar diferentes moléculas polas diferenzas no seu punto isoeléctrico (pI).[3][4] É un tipo de electroforese en zona, xeralmente realizada a proteínas nun xel, que aproveita o feito de que a carga global que hai sobre a molécula de interese está en función do pH da rexión que a rodea.
Procedemento
[editar | editar a fonte]O IEF implica engadir unha solución de anfólito nuns xeles de gradiente de pH inmobilizado. Os xeles de gradiente de pH inmobilizado son unha matriz de xel de acrilamida copolimerizada co gradiente de pH, que ten como resultado gradientes completamente estables excepto nos valores de pH máis alcalinos (>12). O gradiente de pH inmobilizado obtense polo cambio continuo na proporción de inmobilinos, que son un ácido ou base débil definido polo seu valor de pK.
Unha proteína que está nunha rexión de pH inferior ao seu punto isoeléctrico (pI) estará cargada positivamente, polo que migrará cara ao cátodo (o eléctrodo cargado negativamente). Porén, a medida que migra a través dun gradiente no que se incrementa o pH, a carga global da proteína decrece ata que a proteína chega á rexión de pH que corresponde ao seu pI. Nese punto non ten carga neta e así a migración cesa (xa que non hai atracción eléctrica cara a ningún dos eléctrodos). Como resultado, as proteínas quedan enfocadas en bandas estacionarias nítidas con cada proteína posicionada no punto do gradiente de pH que corresponde ao seu pI. A técnica ten unha resolución extremadamente alta e as proteínas que se diferencian por unha soa carga quedan fraccionadas en bandas separadas.
As moléculas que van ser enfocadas son distribuídas sobre un medio que ten un gradiente de pH (normalmente creado por anfólitos alifáticos). Faise pasar unha correne eléctrica a través do medio, creando un ánodo "positivo" e un cátodo "negativo". As moléculas cargadas negativamente migran a través do gradiente de pH no medio cara ao extremo "positivo", mentres que as moléculas cargadas positivamente se moven cara ao extremo "negativo". A medida que unha partícula se move cara ao polo oposto á súa carga, móvese a través do gradiente de pH cambiante ata que chega a un punto no cal o pH chega ao punto isoeléctrico desa molécula. Nese punto a molécula xa non ten unha carga eléctrica neta (debido á protonación ou desprotonación de grupos funcionais asociados), polo que non avanza xa máis polo xel. O gradiente establécese antes de engadir as partículas de interese sometendo primeiro a electroforese unha solución de pequenas moléculas como polianfólitos con valores de pI variados.
O método aplícase especialmente no estudo de proteínas, que se separan baseándose no seu contido relativo de residuos de aminoácidos ácidos ou básicos, cuxo valor está representado polo pI. As proteínas son introducidas nun xel de gradiente de pH inmobilizado composto de poliacrilamida, amidón ou agarosa, no que se estableceu o gradiente de pH. Os xeles con grandes poros utilízanse xeralmente neste proceso para eliminar calquera efecto de "cribado", ou artefactos no pI causado por velocidades de migración diferentes para proteínas de diferentes tamaños. O isoelectroenfoque pode resolver proteínas que difiren no valor do pI en só o 0,01.[5] O isoelectroenfoque é o primeiro paso na electroforese en xel bidimensional, na cal as proteínas son separadas primeiramente polos seus valores de pI e despois voltas a separar polo seu peso molecular por medio dunha SDS-PAGE.
Células vivas
[editar | editar a fonte]Segundo algunhas opinións,[6][7] as céllas eucariotas vivas realizan un elecroenfoque de proteínas no seu interior para superar a limitación da velocidade de reacción metabólica por difusión de encimas e os seus reactivos, e para regular a velocidade de determinados procesos bioquímicos. Ao concentrar encimas de determinadas vía metabólicas en pequenas rexións do seu interior, a célula pode incrementar a velocidade de determinadas vías bioquímicas en varias ordes de magnitude. Modificando o punto isoeléctrico das moléculas dun encima por, por exemplo, fosforilación ou desfosforilación, a célula pode transferir moléculas do encima entre diferentes partes do seu interior, para activar ou desactivar procesos bioquímicos determinados.
Baseada nun chip microfluído
[editar | editar a fonte]A electroforese baseada en microchip é unha alternativa prometedora á electroforese capilar, xa que ten o potencial de proporcionar unha análise rápida de proteínas, unha integración directa con outras operacións de unidades microfluídas, unha detección de canle completa, uso de películas de nitrocelulosa, con tamaños de mostra máis pequenos e custos de fabricación menores.
Multi-unión
[editar | editar a fonte]O incremento da demanda de ferramentas para a separación de proteínas máis rápidas e doadas de usar acelerou a evolución da IEF cara ás separacións en solución. Neste contexto, desenvolveuse un sistema de IEF multi-unión (multi-junction) para realizar separacións de IEF rápidas e sen xel. O sistema de IEF multi-unión utiliza unha serie de recipientes cunha comunicación capilar a través de cada recipiente.[8] Parte do capilar de cada recipiente é substituído por unha membrana semipermeable. Os recipientes conteñen solucións tampón con diferentes valores de pH, para que se estableza un gradiente de pH dentro do capilar. A solución tampón en cada recipiente ten un contacto eléctrico cun divisor de voltaxe conectado a unha fonte de corrente de alta voltaxe, que creou un campo eléctrico ao longo do capilar. Cando se inxecta unha mostra (unha mestura de péptidos ou proteínas) no capilar, a presenza do campo eléctrrico e o gradiente de pH separa estas moléculas segundo os seus puntos isoeléctricos. O sistema de IEF multi-unión utilizouse para separar mesturas de péptidos trípticos para proteómica bidimensional[9] e proteínas do plasma sanguíneo de pacientes de enfermidade de Alzheimer para o descubrimento de biomarcadores.[8]
Notas
[editar | editar a fonte]- ↑ BUSCatermos isoelectroenfoque, que dá como referencia: Diccionario castellano-catalán-euskera-gallego de bioquímica clínica. Barcelona, SEQC, 1997
- ↑ BUSCatermos isoelectroenfoque
- ↑ Bjellqvist, Bengt; Ek, Kristina; Giorgio Righetti, Pier; Gianazza, Elisabetta; Görg, Angelika; Westermeier, Reiner; Postel, Wilhelm (1982). "Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: Principle, methodology and some applications". Journal of Biochemical and Biophysical Methods 6 (4): 317–339. ISSN 0165-022X. doi:10.1016/0165-022X(82)90013-6.
- ↑ Pier Giorgio Righetti (1 de abril de 2000). Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Application. Elsevier. ISBN 978-0-08-085880-7.
- ↑ Stryer, Lubert: "Biochemie", page 50. Spektrum Akademischer Verlag, 1996 (en alemán)
- ↑ Flegr J (1990). "Does a cell perform isoelectric focusing?" (PDF). BioSystems 24 (2): 127–133. PMID 2249006. doi:10.1016/0303-2647(90)90005-L.[Ligazón morta]
- ↑ Baskin E.F.; Bukshpan S; Zilberstein G V (2006). "pH-induced intracellular protein transport". Physical Biology 3 (2): 101–106. PMID 16829696. doi:10.1088/1478-3975/3/2/002.
- ↑ 8,0 8,1 Pirmoradian M.; Astorga-Wells, J., Zubarev, RA. (2015). "Multijunction Capillary Isoelectric Focusing Device Combined with Online Membrane-Assisted Buffer Exchanger Enables Isoelectric Point Fractionation of Intact Human Plasma Proteins for Biomarker Discovery.". Analytical Chemistry 87 (23): 11840–11846. PMID 26531800. doi:10.1021/acs.analchem.5b03344.
- ↑ Pirmoradian, M.; Zhang, B.; Chingin, K.; Astorga-Wells, J.; Zubarev R.A. (2014). "Membrane-assisted isoelectric focusing device as a micro-preparative fractionator for two dimensional shotgun proteomics". Analytical Chemistry 86 (12): 5728–5732. PMID 24824042. doi:10.1021/ac404180e.
