L’électrophorèse

SDS-Page

Présenté par:
AMRI Sahla
EL OUED Safa
 PLAN
• Introduction
• Principe
• Mode opératoire
• Exemple d’application
• conclusion
 Introduction
Dans le cadre de la pratique de la protéomique,
science qui étudie l'ensemble des protéines
d'une cellule, d'un organite, d'un tissu, d'un
organe ou d'un organisme à un moment
donné et sous des conditions données, ils
existent différentes techniques permettant
l’étude de la structure des protéomes. Parmi
lesquelles: l’électrophorèse SDS-PAGE.
 Principe
• L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en
présence de SDS est une technique
permettant la séparation des protéines sur un
support solide grâce à un champ électrique.
La dénaturation des protéines par le SDS
implique une séparation des protéines selon la
taille uniquement.
La particularité de la SDS-PAGE est de soumettre les
échantillons protéiques à un prétraitement
dénaturant.
Les protéines sont soumises à l’action de deux
composés :
 1/le β mercaptoéthanol :
C’est un composé qui exerce une action
dénaturante sur les protéines oligomériques
en rompant les ponts disulfures ce qui
désorganise leur structure
tridimensionnelle. Les sous unités des
protéines sont donc dissociées.
 2/le SDS (sodium dodécyl sulfate) :
• c’est un composé capable de venir se fixer sur la
périphérie des chaines de protéines tout en leur
conférant une charge négative.
• Ainsi les protéines recouvertes par le SDS
auront donc toutes une charge négative.
• Influencées ainsi par le SDS, elles migreront
donc toutes vers l’anode (+) : la charge réelle
des protéines n’est donc plus mise en jeu et
donc seule leur masse moléculaire influencera
leur migration.
 Mode opératoire

1-Extraction des protéines

 Extraction et purification des protéines
• But :
Isoler une ou des protéines d’un échantillon biologique
(tissus, cellules isolées, liquide physiologique) afin de la (ou
les) étudier (structure, taille, forme, fonction).
• Principe :
Toute technique d’extraction se base sur la lyse de la cellule
pour en extraire le contenu. Ceci peut se faire par un choc
osmotique ou action mécanique selon le type de l’échantillon
biologique traité. Ensuite, il faut éliminer les débris cellulaires
et purifier la ou les protéines recherchées.
 1. L’extraction des protéines :
Les techniques d’extraction diffèrent selon le type
de l’échantillon biologique à traiter :
*Milieu biologique liquide (plasma, lait, ...)  aucune
méthode d'extraction n'est nécessaire
*Tissu ou culture de cellules  certaines techniques
peuvent être utilisées:
 Choc osmotique : Incuber les cellules dans une
solution hypotonique. L’eau pénètre ensuite dans la
cellule afin de rétablir l’équilibre osmotique et finit
par causer une rupture de la membrane plasmique.
La sonication : faire détruire les cellules dans un
bain à ultrasons. Le sonicateur est introduit dans
la suspension de cellules et induit à vibrer
violement. Les vibrations sont des ondes
ultrasoniques, que lorsqu’elles sont additionnées
peuvent pulvériser les cellules.
• Il faut tenir le tube avec lequel on travaille dans
un bac à glace vu que le sonicateur génère
beaucoup de chaleur dans le matériel biologique.
Homogénéisateur de type Dounce : Le passage
des cellules dans l’espace extrêmement réduit
entre le piston et la paroi interne du tube cause
le bris des cellules.
Homogénéisateur de type Potter-Elvehjem :Le
"potter" ressemble à un Dounce motorisé; son
piston a souvent une tête de teflon et tourne
dans le cylindre contenant les cellules
resuspendues.
• Remarque : Pour les levures, les plantes et les
bactéries, ils existent différents enzymes tel
que le lysozyme (par exemple du blanc d’œuf
de poule) ou la lyticase de Streptococcus
aureus qui font partie des enzymes lytiques
permettant de détruire leur paroi cellulaire qui
protège la membrane plasmique. Cette
destruction est nécessaire avant toute action
mécanique d’extraction.
 La purification des protéines :

La purification peut être réalisée par:

Fractionnement par répartition entre phases :
L'échantillon est mélangé avec un solvant
polaire (solution tampon aqueuse) et un autre
apolaire (solvant organique, phénol,
chloroforme, …) qui ne sont pas miscibles. Les
protéines se répartissent entre les différentes
phases liquides selon leur solubilité respectives
dans chaque solvant. Après décantation, on
récupère la phase inférieure et/ou supérieure.
Fractionnement par précipitation différentielle :
La ou les protéines (d'intérêt ou au contraire
indésirables) sont précipitées en présence de
conditions particulières. Ainsi les euglobulines
(protéines solubles spéhariques) précipitent en
solution aqueuse en présence des sels à partir
d'une certaine concentration. Par exemple, les
immunoglobulines IgG précipitent en présence
de 30-60 % de sulfate d'ammonium. Outres la
nature et concentration des sels, la
température et le pH entrent en jeu.
Purification par déplétion :
Le principe consiste à éliminer des composés indésirables
par précipitation, absorption, affinité, …
Purification par interactions ioniques (chromatographie
échangeuse d'ions) :
Les protéines inter-réagissent avec un support, résine de
silice ou autre, fonctionnalisé par des groupements ioniques
positifs ou négatifs. Selon leur charge ionique, les protéines
seront non fixées, retenues faiblement ou fortement, et
donc séparées. Pour des purifications fines, ceci est réalisé
dans des colonnes avec un débit de tampon qui peut varier,
séparant ainsi les protéines selon un profil caractéristique.
On collecte au cours du temps des fractions.
Purification par affinité (chromatographie d'affinité) :
Le principe consiste à fixer de manière covalente un
ligand (sucres, nucléotides, peptides, …) sur un
support solide. Lorsqu’on met un mélange de
macromolécules en présence de ce support
fonctionnalisé, les macromolécules reconnaissant le
ligand. La fixation est sélective à la surface du
support, ce qui permet de séparer les molécules
entre elles ,après lavage , par élution avec un
tampon adéquat. On utilise notamment des
anticorps comme ligand spécifiques d'antigène que
l'on veut purifier, on parle donc d'immuno-affinité.
Mode opératoire

2-L’éléctrophoeèse
• La manipulation nécessite :
- une cuve à électrophorèse
-un générateur électrique,
- un gel de polyacrylamide (précoulé en cassette ou à
préparer) contenant des puits pour dépôt,
  -des solutions tampons adaptées au gel.
Les protéines, préalablement traitées en conditions
dénaturantes, sont tout d’abord condensées dans un gel de
concentration puis séparées dans un gel de séparation.
On prépare les échantillons et les protéines marqueurs de taille

Les analytes sont convenablement dilués dans un tampon de

charge concentré dit SB (par exemple du SB 2x ou 5x). Le
tampon SB apporte du glycérol à forte concentration ce qui
permettra de densifier le dépôt et lui permettra de "couler"
gentiment au fond d'un puits.
Le tampon SB apporte le SDS et le 2-mercaptoéthanol
nécessaires à l'obtention des micelles SDS-unités
polypeptidiques par traitement à 100°C.
Le tampon SB contient enfin un colorant de forte densité de
charge négative (en général du bleu de bromophénol) qui sera
utilisé comme marqueur de référence des migrations.
On traite quelques minutes au bain-marie bouillant et on peut
déposer.
La solution de protéines marqueurs de taille est traitée de la
Entre les 2 plaques de verre de
l’électrophorèse on a le gel de
polyacrylamide.
On coule en premier le
séparateur (en bleu sur le
schéma) contenant 6 à 15%
d’acrylamide.
Par-dessus ce gel séparateur,
on coule le gel concentrateur
ayant 5 à 8% d’acrylamide
C'est alors la phase de réalisation des dépôts, à l'aide de
pipettes mécaniques avec des pointes fines.
Voir la vidéo
Mise en route de
l’électrophorèse
-Après réalisation des
dépôts, fermer la cuve à
électrophorèse avec le
couvercle porte-électrodes.
S’assurer du bon
verrouillage du couvercle.
-Puis on met sous tension :
- on va voir alors les dépôts
se concentrer dans la zone
de concentration
puis on verra le colorant en progression dans le gel de
résolution au niveau d'une interface transparente interface
chlorure/glycinate
On laisse migrer un certain temps , le colorant marqueur est
là pour nous guider.
Récupération du gel
-Après la fin de la migration, ouvrir le couvercle, sortir le bloc support +
gel d’électrophorèse. Eliminer le tampon présent dans le compartiment
interne dans un récipient à déchets.
Le tampon présent dans la cuve principale doit être récupéré.
-Démonter les différentes fixations pour récupérer la cassette de gel.
-A ce stade, pour récupérer le gel, il faut séparer les deux plaques
plastiques au sein desquelles il a été coulé. On utilisera une spatule inox
pour faire levier entre les deux plaques.
Attention :
le gel est très fragile. Dès que les deux parties plastiques ont été
séparées, plonger la face en plastique sur laquelle le gel est encore
collé dans un bain d’eau distillée. Achever la séparation du gel sous
l’eau, progressivement par mouvements d’oscillations.
Coloration du gel
-Une fois le gel libéré des plaques en plastique, le transférer
dans un bac de coloration rempli d’une solution de bleu de
Coomasie (environ 100mL). Laisser colorer pendant 45
minutes.
-Après 45 minutes, vider la solution de coloration, rincer
abondamment les restes de
colorants à l’eau du réseau. Puis maintenir le gel sous un filet
d’eau jusqu’à transparisation complète du fond du gel.
 Analyse du gel
-Après transparisation, placer le gel sur une
boite de Pétri plastique de 12 x 12 cm.
-Mesurer la distance de migration pour les
différentes bandes obtenues :
-pour l’échantillon de référence,
-pour l’échantillon test,
-pour les différentes protéines du mélange
étalon.
. Exemple d’application : Caractérisation de l’actine -
protéine du tissu musculaire des poissons -

L’objectif de cette manipulation est de caractériser, chez un

poisson, une protéine du tissu musculaire, l’actine, qui est
impliquée dans les mécanismes de contraction musculaire.
Dans chaque variété de poissons, on retrouvera des formes
d’actine ayant des caractéristiques précises, permettant
ainsi de comparer des variétés entre-elles : on parle
d’identification variétale.
 Il est ainsi possible de comparer entre-elles les
protéines de différentes variétés d’une espèce en
comparant leurs masses moléculaires.
 CONCLUSION

• Grâce à la SDS-PAGE, il est possible de déterminer

assez finement la présence d’une protéine donnée dans
un échantillon protéique. Une protéine sera caractérisée
par une masse moléculaire donnée. Cependant, en
réponse au doute provoqué par l’apparition d’une seule
bande où on se demande est ce qu’elle correspond à une
protéine à deux sous-unités ou une seule sous-unité, il
vaut mieux passer à l’électrophorèse bidimensionnelle
pour affirmer les résultats déjà trouvés en électrophorèse
SDS-PAGE.