Université Alger1/Faculté des Sciences/Département SNV Année : 2016-2017

  Module : Biologie Cellulaire

TD N° 6 : LA SEPARATION DES CONSTITUANTS CELLULAIRES

Objectifs :

 Décrire les techniques couramment utilisées pour séparer les différents types de cellules et organites ;
 Connaitre le principe et les types de la centrifugation.

Ces techniques consistent à séparer les constituants d’une cellule ou d’un organite et comportent deux étapes principales :
1. L’homogénéisation (ou broyage), qui implique la destruction de la membrane plasmique et donne un homogénat (extrait
acellulaire) ;
2. La séparation des organites par des centrifugations successives.

1. Homogénéisation
Elle a pour objectif de conduire à la destruction des cellules sans détérioration des organites. Le milieu de broyage doit
respecter des exigences ioniques, osmotiques et de pH, de façon à ce que les organites (en général des vésicules) ne subissent
pas de modification chimique ou de volume. Les méthodes d’homogénéisation sont de type :
- Mécanique (pistons, mixers) ;
- Physique (hautes pressions, ultrasons) ;
- Chimique : destruction des membranes par des détergents et des parois (cas des cellules végétales ou des bactéries) par des
enzymes appropriées tels que cellulases et lysozymes.

En fait, chaque type cellulaire nécessite des conditions de broyage particulières, mais une constante est que cette opération doit
être effectuée à basse température (0-4 °C), et le plus rapidement possible, pour minimiser les phénomènes de dégradations
chimiques liés à la libération d’enzymes à partir d’organites détériorés.

2. Séparation

2.1 La centrifugation
Le principe de la centrifugation consiste à soumettre un mélange à une force centrifuge importante, obtenue par rotation d’un
rotor dans une enceinte. Dans ces conditions, en fonction de leur taille et leur densité, les constituants sédimentent vers le fond
du tube à une certaine vitesse, proportionnelle à leur coefficient de sédimentation S (unité : le svedberg, du nom de son
inventeur).
Après cette opération, on obtient, au sein d’un tube à centrifuger, un culot (ou sédiment) et un surnageant contenant ce qui n’a
pas sédimenté.
NB : Les ultracentrifugeuses sont des machines très sophistiquées par rapport aux centrifugeuses classiques ; leurs rotors
peuvent tourner jusqu’à près de 80 000 tours par minute.

2.1.1 La centrifugation différentielle

Technique appliquée à la séparation des organites ayant des constantes de sédimentation notablement différentes et élevées.
C’est l’application de forces centrifuges d’intensités croissantes qui permet la séparation d’organites de tailles et/ou de densité
de plus en plus petites qui sédimentent au fond du tube sous forme d’un culot, au cours de centrifugations successives.

2.1.2 La centrifugation sur gradient de densité

Cette technique permet la séparation des organites cellulaires et même de petites molécules présentant de très faibles différences
dans leurs caractéristiques, et ce en fonction de leurs densité. Les particules de l’échantillon, déposé au sommet du tube contenant
un gradient d’une substance dense non ionique (comme le saccharose ou du glycerol), sont séparées en bandes selon leur vitesse
de sédimentation. Il existe 2 types de gradient : le gradient isopycnique et gradient isocinétique

a/Séparation isopycnique (sédimentation à équilibre)

Les molécules soumises à la centrifugation sur le gradient de chlorure de césium (CsCl) se sépareront selon leur densité. La
préparation à analyser est déposée sur le sommet du gradient, puis on centrifuge à équilibre. Chaque type de particule sédimentera
jusqu'à ce qu'elle atteigne la concentration correspondant à sa densité. Elle s'immobilisera alors à ce niveau.

b/Gradient isocinétique (de zone)

La centrifugation peut aussi être utilisée pour des fins analytiques, pour séparer des particules ou des molécules, selon leur taille.
Dans ce type d'applications, comme les particules sont homogènes, elles ont toutes la même densité, elles ne diffèrent que par
leur taille. Le gradient (saccharose ou CsCL) sert donc à faire en sorte que les particules lourdes sédimentent plus vite que les
plus légères, tout en n'atteignant jamais le fond du tube à centrifuger. On ne centrifuge donc pas à équilibre. Le gradient, dont la
concentration maximale est moins dense que les particules, ne sert qu'à ralentir la sédimentation. On arrête donc la sédimentation
quand les plus lourdes sont rendues vers le bas du tube à centrifuger et que le niveau désiré de séparation est obtenu.

1 
 
   1. Homogénéisation
2.1 La centrifugation
Piston
Cellule Accélération
Rotor à ongle mobile centrifugeuse
Bile de teflon Chambre en acier Culot Tube

Goder
Piston Centrifugation métallique
Cellule Chambre
pressurisée Valve à vis Avant centrifugation Après centrifugation

1. Fragment de tissu
2. Broyage mécanique au mixer

Homogénat Surnageant
Réfrigérateur Pompe à vide
3. Homogénat tissulaire Moteur Centrifugation
Culot
Noyau
Mitochondries Avant centrifugation Après centrifugation
Lysosomes
Microsomes
Ribosomes

2.1.1 Centrifugation différentielle 2.1.2 Centrifugation sur gradient de densité

Centrifugation Centrifugation à Centrifugation à Centrifugation à vitesse

Densité croissante de saccharose (g/cm3)

à basse vitesse vitesse moyenne vitesse élevée élevée, longue durée
10min/ 1000g 15min/ 1000g 1h/ 100 000g 1h/ 100 000g
Fraction
d’organites
Lysosomes
1,12 g/cm3
Mitochondrie
1,18 g/cm3

Peroxysomes
1,23 g/cm3
Homogénat Le culot contient : Le culot contient : Le culot contient : Le culot contient :
tissulaire centrifugé Les noyaux Les mitochondries Microsomes Ribosomes
Cytosquelette Les lysosomes Virus Avant Après
Les peroxysomes Macromolécules centrifugation centrifugation 2