Sécurité, RÈGLES À SUIVRE AU LABORATOIRE DE

BACTERIOLOGIE

I - DEFINITION
a)- Bacteriologie : « Bacterio» - bactérie « logie » - science, c’est la science qui étudie les

êtres vivants microscopiques ‘bactérie’.

b)- Germes : bacteries

c)- Colonie : ensemble de bactérie issu de la multiplication d’un seul germe.

d)- Souche : ensemble de germes ayant la même origine et définie par une caractéristique

qui leur est propre

Exemple: alors que de nombreuses souches d’Escherichia ne sont pas pathogènes,

Certaines sont réputées pour des cause des infections (urinaire notamment).

e)- Milieu de culture : C’est un ensemble de composés nutritifs, dissout dans l’eau qui

permettent le développement des germes. Exemple : le pain, les fruits, les légumes

constituent des milieux de culture pour certaines moisissures.

f)- Ensemencement : C’est la mise en développement des germes. En déposant sur un milieu

de culture.

g)- Repiquage : C’est le prélèvement et la transposition d’un groupe microbien d’un milieu de

culture dans un autre.

h)- Stérilisation : C’est l’opération qui consiste à détruire des germes on parle également

de désinfection, d’aseptisation.

II - Le matériel utilisé en bactériologie

Il répond aux exigences suivantes

1- Travailler dans une atmosphère stérile.

2 - Manipuler les germes avec des instruments appropriés.

3 - Fournir aux germes à étudier des conditions contrôlées de croissance (milieux de

culture, incubation etc... adéquats).

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Ce matériel comprend :
A - Place de travail :

a) - La paillasse : Son revêtement en carreaux de faïences lui confère une bonne

Résistance au feu. Elle est facilement nettoyable par des agents désinfectants tels que

l’eau de javel, l’alcool.

b) - Le bec bunsen: Sa flamme bleue procure une zone circulaire stérile de 15 à 20

cm de diamètre dans laquelle toutes les manipulations doivent s’effectuer.

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B - Les instruments d’ensemencement

L’ensemencement peut se faire à l’aide de :

a - pipette pasteur

b - pipette graduée a usage unique

Ces deux types de pipettes permettent d’ensemencer sur un quelconque milieu des germes

en suspension dans une solution, Alors que la première est stérilisable par 2 autoclavage

donc réutilisable, la seconde en plastique n’est utilisée qu’une seule fois puis jeté. Elle a

cependant l’avantage d’être graduée et permet de prélever un volume bien déterminé de

suspension de germe.

c - Anse à ensemencer:

Appelée aussi « manche pasteur, elle est usage simple car elle se stérilise par simple

flambage au bec bensun avant et après chaque prélèvement de germes .Elle est constituée

d’une manche en acier inoxydable surmonté d’un fil en platine ou en nickel chrome avec

lequel prélève des fragments de sur milieu de culture solide.

C- La verrerie :

Les milieux de culture peuvent être contenues dans des Erlenmeyers, des flacons a sérums,

des boites de pétrie, des tubes à essais .Ces derniers sont très utilisées pour les testes

biochimiques de même que les pipettes graduées en verre.

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D- Le microscope

Les microscopes et plus particulièrement les bactéries dont la taille est de l’ordre du

micron ne peuvent être observés que si l’on utilise un très fort grossissement. Celui-ci est

assuré par l’objectif 100° ou objectif à immersion .Pour ce type d’observation il faut :

- faire la mise au point avec les objectifs 10, 25,40 puis 63

- déposer une goutte d’huile à immersion la lamelle

- Après observation, nettoyer l’objectif 100 à de papier joseph imprégné d’alcool.

Le gros équipement

a - L’autoclave

C’est une grosse « cocotte minute » étanche dans la quelle un fond d’eau est porté à

ébullition puis soumis à une température de 121° C. Cette dernière maintenue pendant 20

mn permet une stérilisation parfaite du verrier et des milieux de culture.

Pourquoi faut-il une température supérieure à 100°C on sait que certaines spores résistent

à des températures inferieurs.

b - Le four à air chaud :

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Appelé aussi « Four pasteur », il permet de stériliser entre autre les boites de pétri que

l’on maintient en général à 180° C pendant l’heure.

c - Etuves ou incubateurs :

Ce sont des caissons dans lesquelles il est possible de régler finement la température pour

mettre à incuber, les cultures de germes à des températures bien précises.

d - Bain-marie

Il permet de maintenir en surfusion les milieux solides

IV Procédés de stérilisation
A/ Stérilisation par la chaleur

1/ Flambage : trois passages lents (à la flamme bleue du bec Bunsen) des objets à

stériliser (objets en verre et en métal).

2/ Stérilisation à air chaud : (Four Pasteur), Emballage du matériel à stériliser

dans le papier aluminium (objets en verre et en métal).

3/ Autoclavage : méthode de stérilisation la plus efficace (20 minutes à 120°C).

4/ Ébullition : 30 minutes à 100°C par ébullition.

5/ Pasteurisation : Le liquide est porté rapidement à 90°C pendant 30s, puis

refroidit brusquement à 10°C. Utilisée pour la Conservation des produits naturels.

6/ Tyndallisation : Chauffage à 70°-100°C à plusieurs reprises (1 heure tous les

jours pendant 3 jours) dans un bain marie. Utilisée pour des substances

thermolabiles.

B/ Stérilisation par filtration

1/ Filtration par membranes : membranes plastiques minces comportant des

millions de pores par cm2, très uniforme, varie de 0.22 à 0.45 μm et occupant

environ 80% du volume du filtre.

C/ Stérilisation chimique

1/ Antiseptiques : teinture d'iode, mercryl laurylé, permanganate de potassium,

eau oxygénée.

2/ Désinfectants : vapeurs (formol), liquides (eau de Javel, éthanol).

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3/ Antibiotiques : bactériostatiques et bactéricides.

D/ Action des radiations

1/ Hottes à flux laminaire : La lumière U.V,est la plus souvent utilisée (lampes

germicides ou stéri-lampes).

2/ Les rayons X ou y : sont utilisés pour la conservation des produits alimentaires.

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 Règles d’hygiène et de sécurité à respecter en TP de microbiologie

Consignes Justification

Avant les - Passer aux vestiaires (aménagés hors du laboratoire) Eviter la contamination microbienne
TP où vêtements de Ville et de travail sont séparés.
- Mettre une blouse en coton Lavable à 90°C, javellisable,
ininflammable, éviter les accidents
avec les acides et les bases

La boutonner. Protection efficace y compris des

Les manches doivent être longues pour protéger les avant-bras
avant-bras reposant sur la paillasse.
- Attacher les cheveux Danger du Bec Bunsen

- Enlever les bijoux Sensibles aux produits chimiques

et vecteurs de contaminations
- Fermer les portes et les fenêtres du laboratoire Courants d’air donc apport de
micro-organismes
- Se laver les mains avec un savon désinfectant. Les Destruction des micro-organismes
ongles doivent être courts
- Ne pas toucher aux flacons de produits chimiques Produits parfois dangereux
avant d’avoir été informé des précautions à prendre
- Procéder à un lavage minutieux des mains, avec Désinfection
brossage des ongles avant les manipulations, et avant Eviter la propagation des
toute sortie même momentanée de la salle de TP microorganismes
Pendant - Avoir un plan de travail net et bien organisé Travail plus sûr et plus facile
les TP
- Laisser au poste de travail que le matériel nécessaire Eviter l’encombrement
à la manipulation
- Eviter les gestes inutiles (disposer le matériel et les Eviter les accidents de travail
cultures de manière à travailler efficacement)
- Travail sous hotte microbiologique ou chimique Risque de microbes pathogènes et
des produits toxiques ou volatiles
- Travail assis bec bunsen allumé (flamme bleue) Meilleure position de manipulation
- Flamber, avant et après manipulations, les anses afin de dessécher les restes de culture
métalliques utilisées pour les prélèvements, en avant de porter l'extrémité dans la
commençant par chauffer la partie moyenne de flamme, ceci pour éviter
l'instrument toute projection.
- Eviter le contact des produits avec la peau, la Parfois très toxiques
bouche, les yeux
- Le pipetage à la bouche est interdit (utiliser les Risque d’absorption de micro-
poires d’aspiration ou les propipettes) organismes ou de produits chimiques

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 - Refermer les flacons de produits après utilisation Vapeurs parfois toxiques ; risque de
renversement
- Si des cultures sont renversées, nettoyer rapidement Désinfection du lieu de l’accident
le lieu de l’accident

- Après utilisation mettre lames, lamelles et pipettes à Destructions des micro-organismes

tremper dans de l’eau javellisée (1 verre à 12°
chlorométriques pour 2l d’eau)
- Etiqueter produits et préparations Pour ne pas les mélanger
- Ne pas porter les mains à la bouche
Eviter la contamination microbienne
- Ne pas toucher des objets personnels
et sa propagation
- Ne pas serrer la main des visiteurs
- Il est interdit de fumer, de boire et de manger Idem
- Il est interdit de téléphoner et même dans certains Organisation du laboratoire
cas de parler au personnel du laboratoire lors de
manipulations très délicates
Après les - Autoclaver les cultures à détruire avant de les jeter Parfois microbes pathogènes
TP
- Laver le matériel, (désinfecter si cela n’a pas déjà Destruction des micro-organismes
été fait par trempage dans l’eau javellisée) et ranger
- Laver le plan de travail puis le pulvériser d’eau Idem
javellisée et essuyer au papier absorbant
- Se laver les mains avec produits désinfectant et les Idem
essuyer avec une serviette à usage unique
- Laver la blouse (séparément du linge familial) à 90°CPour ne pas contaminer le linge
et la javelliser familial
Repasser à fer fort Destruction efficace des micro-
organismes
N.B : Tout matériel biologique (bactéries, champignons, levures, sang, liquides,…) doit être
considéré comme potentiellement dangereux.

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Pictogramme de sécurité:

Lire les pictogrammes

Ils renseignent rapidement sur les risques et les précautions à prendre.

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