4.

La culture in vitro un outil des

biotechnologies

4.1. Définition et caractéristiques

Quelques espèces peuvent être multipliées à partir des feuilles : Sansevière ; Bégonia ; Kalanchoé ; Saintpaulia ;

Exemple 1: Peperomia

Exemple2: Crassulacées
Avantages et inconvénients de la multiplication végétative par rapport
à la voie sexuée (graines) :
- Avantages : obtention de plantes présentant toutes les mêmes caractéristiques : clones.
- Inconvénients : beaucoup d’espèces sont réfractaires à la multiplication végétative.

Tous les végétaux ne peuvent donc pas être multipliés par voie
végétative
- Pourquoi de nombreuses espèces sont-elles réfractaires aux techniques traditionnelles de
multiplication végétative ?
- Si on arrive à bouturer des tiges, pourquoi n’arrive-t-on pas à faire la même chose avec les
racines ?
- Pourquoi n’arrive-t-on pas à bouturer des petits morceaux de plantes ?
C’est pourquoi, devant ces problèmes les chercheurs se sont tournés
vers une autre technique : LA CULTURE IN VITRO.
 Qu'est-ce que la culture in vitro ?
Culture in vitro Définition et caractéristiques

Lorsque des cellules ou un groupe de cellules sont placées hors de leur

environnement normal qu'est la plante, et sont maintenues en vie, on parle de
mise en culture in vitro. Le terme in vitro rappelle le fait que ces cellules sont
entourées par du matériel de laboratoire qui était originellement en verre.

On qualifie d'in vitro toute exploration ou expérimentation biologique qui se fait

en dehors de l'organisme d’origine (dans des tubes, éprouvettes, etc.).

4
 4.2.Totipotence: fondement de la CIV
Les techniques de culture in vitro végétales utilisent la propriété
de totipotence des cellules végétales mise en évidence en 1902 par Haberlandt :
en théorie « il est possible de régénérer une plante entière à partir de
n'importe quelle cellule d'une plante donneuse ». Cette propriété s'exprime
dans la nature et est exploitée depuis la nuit des temps dans les phénomènes de
bouturage, drageonnage, marcottage etc.

Bouturage Drageonnage 5
Marcottage aérien
4.2. Fondement de la CIV: La totipotence végétale

Les cellules végétales, prélevées sur un organe quelconque d'une plante,

possèdent la capacité de régénérer un individu complet identique à la plante
mère. C'est la totipotence des cellules végétales.

Elle repose sur l'aptitude à la dédifférenciation : les cellules peuvent redevenir

des cellules simples, non spécialisées et se différencier ensuite pour donner à
nouveau les différents types de cellules spécialisées.

6
Rappels
Notions de différenciation et de dédifférenciation cellulaires

Plantes

Cellules méristématiques
Différenciation Cellules spécialisées

mitoses actives
petites isodiamétriques ,
pas de méats intercellulaires Mortes ou vivantes
- N/P élevé
Paroi primaire mince Fonction spécifique
Rappels
Notions de différenciation et de dédifférenciation cellulaires

- Méristème vient du mot grec «merismos» qui veut dire division ou «mérèse» qui est la
principale caractéristique des cellules méristématiques.
- Les cellules méristématiques qui se divisent sont appelées «initiales» et restent toute leur vie
méristématiques. (Divisions mitotiques)
- La division, par mitose, de l‘initiale donne naissance à une autre cellule méristématique appelée
«une dérivée». Cette dernière subit une «différenciation» pour former une cellule spécialisée
appelée à accomplir une fonction précise (conduction, protection,...).
- Chez les plantes, les méristèmes sont toujours présents et entrent régulièrement en activité
(périodiquement): on parle de croissance indéfinie chez les plantes.
Totipotence de la cellule végétale
 4.5. Applications de la CIV

- La multiplication massive de plantes saines et/ ou hybrides avec

éventuellement une production commerciale
- Garder des plants stériles
- Production rapidement d’un grand nombre de plantules dans un espace réduit,
- Création de nouvelles plantes (introduire un nouveau caractère ou supprimer un caractère
préexistant),
- Multiplication de plantes commerciales produisant peu ou pas de graines,
- Produire plus rapidement une large quantité de plantes et réduire les coûts de production,
- Conserver et multiplier des plantes rares ou difficiles à trouver dans le commerce,
- Conservation et multiplication d’espèces rares,
- Utilisation des biotechnologies végétales dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la
recherche fondamentale
10
 5. Fondements techniques de la culture in vitro
La technique in vitro est un mode de multiplication végétative artificielle des plantes. C‘est un ensemble de
méthodes faisant intervenir d'une part l'asepsie (stérilisation du matériel, désinfection des explants et d'autre
part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux de culture définis pour chaque type de plante,
température, lumière, humidité,...).

Conditions de
Asepsie
culture contrôlées

Culture in vitro
(CIV)

Stérilisation du matériel Milieux de culture

définis pour chaque
et désinfection des plante
explants Température, lumière,
humidité,…
• Ces méthodes s'appliquent à des organes ou des fragments d’organes : les
explants (explanta).
- graine immature, embryon, ovule, pollen,
- bourgeon terminal, bourgeon axillaire, (méristèmes préexistants)
- morceaux de tige, de feuille, de pétale de fleur, etc.

• L'explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin pour
survivre, se multiplier et éventuellement régénérer un nouvel individu, en
fait, tout ce que la plante mère peut fournir :
- par les racines : les éléments minéraux, l’eau ;
- par les feuilles et grâce à la photosynthèse : des sucres, des vitamines et
des acides aminés ;
- les hormones, pour orienter la formation des organes.
5.1. Déroulement de la culture in vitro

2. Milieux
synthétiques

1. Cultures
d' explants CIV 3. Conditions
stériles (asepsie)

4. Environnement
contrôlé et un
espace réduit
13
 Les explants peuvent être des parties d'organes ou des organes entiers,(tige, feuille,
1. Cultures racine, fleurs, etc.), des tissus, etc.
d' explants

J’aurai un
million de Et tous
descendants plus
en 1 an beaux que
moi!!

14
2. Milieux de
culture

Le milieu synthétique (sels minéraux, micro et macroéléments)

phytohormones (Auxines, cytokinines, gibbérellines etc.), vitamines, acides aminés; sucre
(saccharose, énergie); Gélifiant (agar) pour les milieux solides (Murashige et Skoog-MS-, Gambord,
Morrel, White etc.).

Le pH est ajusté le plus souvent entre 5 et 6. On modifie le milieu au cours des

différentes étapes de production, on doit utiliser un milieu neuf toutes les 3 ou 4
semaines en général.
15
 2. Milieux de culture

LES ÉLÉMENTS MINÉRAUX

Les macroéléments : interviennent en grande quantité. Il s'agit de 6 éléments présents à des
concentrations élevées tels que l’azote ( N), le calcium (Ca), le potassium (K), le soufre (S), le
magnésium (Mg) et le phosphore (P).
Les microéléments : Appelés parfois oligo-éléments, et bien qu'ils ne soient nécessaires à la plante
qu’en faibles concentrations, leur rôle est essentiel. Les principaux d'entre eux sont le fer (Fe), le
cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganèse (Mn), le molybdène (Mo), le bore (B) et le chlore (Cl), le
cobalt (Co), le nickel (Ni), etc...

16
LES ÉLÉMENTS ORGANIQUES

Les sucres

Dans le cas de tissus végétaux placés en culture in vitro, l'assimilation chlorophyllienne est nulle
ou insuffisante pour assurer la survie et le développement de l'explant. Dès lors, on ajoute des
sucres, le plus souvent du saccharose, aux milieux de culture pour fournir à l'explant une source
de carbone.

Les vitamines

L'emploi de diverses vitamines favorise fréquemment le développement des cultures in vitro:

elles appartiennent essentiellement au groupe B.

Les acides aminés

Il a parfois été observé que l'apport d'acides aminés favorisait la prolifération cellulaire.
LES RÉGULATEURS DE CROISSANCE

Appelés généralement hormones végétales ou phytohormones, ils

induisent les phénomènes de croissance et de néoformation des organes.
On trouve ces substances de croissance naturellement dans toutes les
plantes; cependant, on a pu synthétiser artificiellement des molécules
possédant les mêmes propriétés. Les hormones utilisées sont
principalement : - les auxines et les cytokinines,

Les hormones sont capables d’orienter les explants vers la formation de

nouveaux organes.

Les milieux ainsi constitués sont liquides. Il est nécessaire de les solidifier
par l’ajout d’un gélifiant pour éviter que les explants ne tombent au fond
des récipients (selon le choix).

Milieu Solide Milieu liquide

Composition de quelques milieu de culture * MS, Murashige et Skoog (1962); ER, Eriksson (1965); B5, Gamborg et al. (1968).

Composés MS *(mg/1) ER *(mg/1) B5 *(mg/1)

1. Macroéléments
NH4NO3 1650 1200 -
KNO3 1900 1900 2500
CaCl2 2H2O 440 440 150
MgSO4 .6H2O 370 370 250
KH2PO4 170 340 -
(NH4)2 S04 - - 134
NaH2PO4 - - 150
2. Fer
Na2EDTA 37.3 37.3 37.3
FeSO4. 7H2O 27.8 27.8 27.8
3. Microéléments
MnS04.4H2O 22.3 2.3 -
MnSO4.H2O - - 10.0
ZnSO4.4H2O 8.6 - 2.0
Zn versanate - 15 2.0
Na2MO42H2O 0.25 0.025 0.25
CuSO4.5H2O 0.025 0.0025 0.025
CoCl2.6H2O 0.025 0.0025 0.025
KI 0.83 - 0.75
H3BO3 . 6.2 0.63 3.0
4. Vitamines
Glycine 2.0 2.0
Nicotinic acid 0.5 05 1.0
Pyrodoxine-HCl 0.5 05 1.0
Thiamine-HCl 0.1 0.5 10.0
Saccharose (g) 30.0 40.0 20.0
pH 5.7 5.8 5.5
 3. Conditions Eviter la prolifération de microbes (bactéries et champignons) qui peuvent envahir
stériles (asepsie) le milieu et introduire des éléments inconnus (toxines) dans le milieu de culture.

Présence de matières Risque de prolifération

organiques dans le Nécessité de l’asepsie
de contaminants
milieu

Mise en culture Stérilisation des

milieux par Maintien de la propreté
dans des conditions
autoclavage ou du laboratoire
aseptiques
ultrafiltration

Contaminations fongique et bactérienne 20

 3. Conditions de culture

Réunir des conditions stériles:

Désinfection des explants

Stérilisation préalable du milieu de culture (autoclavage)

un environnement stérile obtenu par une hotte à flux laminaire

La stérilisation du matériel et des milieux se fait soit par:

Produits chimiques (éthanol, eau de javel, …)
Flamme
Chaleur + pression (autoclave)
Chaleur sèche fours ou étuves
Rayons UV
Ultrafiltration des solutions

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4. Environnement
contrôlé et un
espace réduit
6. Comportement d’un explant dans un milieu de CIV

23
24
Cal = amas de cellules végétales indifférenciées

25