Travaux Dirigés

TD n°1 Clonage d’un fragment PCR

Exercice 1 :

Un expérimentateur souhaite réaliser l’amplification d’un fragment d’ADN génomique

par la technique de PCR. Il voudrait ensuite cloner ce fragment dans un vecteur afin d’en
réaliser ultérieurement le séquençage. Le vecteur choisi comporte le site multiple de clonage
suivant :
BglII PstI BamHI SmaI EcoRI KpnI XhoI
AGATCTGCAGGATCCCGGGAATTCGGTACCCTCGAG

L’enzyme SmaI coupe le site CCCGGG en générant des extrémités franches. Peu
habitué à ces techniques, l’expérimentateur décide de suivre simultanément deux stratégies
pour mener à bien la première étape de son projet, c’est-à-dire l’amplification par PCR. Dans
la première, il utilise 2 oligonucléotides amorces de 21 nucléotides. L’un porte un fragment
d’ADNc dont il souhaite étudier le gène ; il est orienté de 5’ vers 3’ (oligo 1). L’autre porte la
séquence inverse complémentaire (orientée de 3’ vers 5’), d’un fragment du même ADNc,
située à 350 pb du précédent (oligo 2).
Dans la seconde stratégie, il utilise les mêmes oligonucléotides auxquels ont été
ajoutés, 10 nucléotides supplémentaires en position 5’. Ces nucléotides constituent un site de
restriction différent dans chacun des deux oligonucléotides. Le site BamHI est introduit an
amont de l’oligo 1 pour former l’oligo B1 et le site EcoRI en amont de l’oligo 2 (oligo E2).
La structure des amorces utilisées dans les deux expériences d’amplification est
schématisée en figure 4. Il est rappelé que les oligonucléotides synthétisés par voie chimique
ne sont pas phosphorylés à leur extrémité 5’.
Après la réaction de PCR, les produits sont analysés sur gel d’agarose. Dans les deux
expériences, on observe une seule bande, dont la taille est de 350 pb environ.
Le produit amplifié grâce aux amorces 1 et 2 est purifié, puis divisé en deux lots. L’un
est incubé avec la polynucléotides kinase et présence d’ATP (lot 12K) ; l’autre n’est soumis à
aucune activité phosphorylante (lot 12). Le résultat d’amplification par les oligo B1 et E2 est
soumis à une digestion par EcoRI et BamHI ; le produit de la réaction est purifié et constitue
le lot B1E2. Chacun de ces lots est ensuite introduit par ligation dans l’un des vecteurs.

Bam1
TCTAGGATCC
1
5’ 3’
3’ 5’
2
GAATTCATCT
Eco2

350 pb
Figure 4 : Position des oligonucléotides utilisés pour l’amplification par PCR
 Les vecteurs V et V’ sont préparés par l’action d’endonucléases de restriction
appropriées de façon à permettre l’insertion des produits de PCR. Le vecteur V est destiné à
recevoir le produit de PCR 12 ou 12K ; Le vecteur V’ recevra le fragment B1E2. Chaque
mélange réactionnel est ensuite scindé en 2 aliquots de volume égal. L’un est soumis à
l’action de la phosphatase alcaline (pour donner VPA et V’PA), l’autre non (V et V’). Les
réactions de ligation suivantes sont réalisées :

V+12 ; VPA+12 ; V+12K ; VPA+12K ; V’+B1E2 et V’PA+B1E2

Les produits de la ligation sont ensuite introduits dans les bactéries hôtes par électroporation.
Ces bactéries transformées sont finalement étalées sur une boîte de milieu nutritif contenant
un antibiotique afin de sélectionner les germes ayant incorporé le vecteur ou ses dérivés issus
de la ligation.
Le tableau I donne le résultat du dénombrement et l’analyse des colonies bactériennes
obtenues. L’analyse des colonies a été réalisée en digérant les plasmides extraits de ces
colonies par deux enzymes de restriction permettant de libérer un éventuel fragment inséré
dans le vecteur. Chaque ligation a été effectuée avec les mêmes quantités de vecteur et de
fragment de PCR.

Ligation Réactions de Nombre de colonies % colonies avec % de vecteur sans

ligation fragment de 350 pb insertion
1 V+12 10 000 <1 >99
2 VPA+12 0 - -
3 V+12K 10 000 3 97
4 VPA+12K 320 92 8
5 V’+B1E2 4 000 88 12
6 V’PA+B1E2 3 500 >99 <1

Interprétez l’ensemble des résultats en fonction des informations dont vous disposez en ce qui
concerne le fonctionnement de la ligase. Certaines questions suivantes peuvent vous guider
dans votre réponse

Pourquoi est-il inutile de faire agir la polynucléotide kinase sur le produit B1E2 ?

La polynucléotide kinase est une enzyme qui transfère le groupement phosphate γ de l’ATP
sur une fonction 5’ d’un ADN ou d’un ARN. Les oligonucléotides synthétisés par voie
chimique ne sont pas phosphorylés à leur extrémités 5’.
Quel que soit le type d’extrémité généré dans le cadre d’une digestion par des enzymes de
restriction, le clivage de l’ADN produit toujours des fragments dont les terminaisons
comportent des groupes d’hydroxyle-3’ et de phosphate-5’.
Le produit B1E2 est soumis à une digestion par EcoRI et BamHI. Les extrémités 5’ du produit
B1E2 seront donc phosphorylées. Il est donc inutile d’ajouter une étape phosphorylante avec
la polynucléotide kinase.

Par quelles endonucléases de restriction doit-on traiter le vecteur pour obtenir les produits V
et V’ ?

Le fragment 12 (lot 12K et lot 12) est obtenu par PCR et possède donc des extrémités
franches. Il faut donc que le vecteur V présente lui aussi des bouts francs au site d’insertion.
Seule l’enzyme SmaI génère de telles extrémités. Il faudra donc digérer le vecteur par SmaI
pour obtenir le produit V.
Après son amplification, le fragment B1E2 a été digéré par EcoRI et BamHI. Pour accepter le
fragment B1E2, le vecteur V’ devra subir une double digestion BamHI/EcoRI, dans son site
multiple de clonage.

Expliquez le résultat de la ligation 2.

Les phosphatases alcalines sont des hydrolases qui clivent une liaison phosphoester en
libérant un groupe hydroxyle et un phosphate.

Dans la ligation 2, le vecteur V a été soumis à l’action d’une phosphatase alcaline et est donc
déphosphorylé ; ses extrémités 5’ sont dépourvues de groupement phosphate. Le fragment de
PCR 12 (produit de PCR avec amorces synthétisées chimiquement et donc dépourvues de
groupement phosphate) ne possède pas non plus de groupement phosphate à ses extrémités.
La ligase catalyse une liaison phosphodiester (lien entre le phosphate d'un groupement
phosphate avec deux autres molécules via 2 liens ester ) entre deux segments d’ADN.
De par l’absence de groupement phosphate, aucune liaison covalente ne peut avoir lieu et
aucun plasmide circulaire ne peut être formé. Aucune colonie n’a pu se développer sur le
milieu sélectif puisqu’elles n’ont pas reçu le plasmide (portant la résistance à l’antibiotique
présent dans le milieu nutritif).

Quel peut-être selon vous l’intérêt du traitement du vecteur par la phosphatase alcaline ?

L’observation des résultats des ligations 1 et 4 montre que le fait de traiter le vecteur à la
phosphatase alcaline réduit considérablement le nombre de colonies (10000 vs 320) ; et
surtout augmente le pourcentage de colonies contenant le plasmide avec insert (3% vs 92%).

Dans le mélange de ligation contenant un vecteur linéarisé et un fragment à insérer, la

réaction la plus favorable est la fermeture du vecteur sur lui-même. Il s’agit en effet d’une
réaction monomoléculaire qui nécessite la formation de deux liaisons covalentes. Cette
réaction est considérée comme parasite par le manipulateur puisque son intérêt se trouve dans
la ligation du plasmide (V ou V’) avec l’insert (produit 12 ou B1E2).

La phosphatase alcaline hydrolyse les groupements phosphate présents aux extrémités 5’ du

vecteur digéré par la (SmaI) ou les (EcoRI/BamHI) enzymes de restrictions (vecteur V et V’
respectivement). Il rend ces extrémités incapables de se refermer sur elles-mêmes et d’établir
deux liaisons covalentes. La réaction « parasite » est donc théoriquement supprimée.

Les inserts obtenus après digestion enzymatique (B1E2 - ligation 5 et 6) ou ayant subi une
phosphorylation (12K- ligation 3 et 4) apporte deux extrémités phosphorylées et donc des
extrémités capables de former deux liaisons covalentes (sous l’action de la ligase).
Celles-ci suffisent à former un plasmide circulaire compétent pour être introduit et répliqué
dans la bactérie. En effet, même dans le cas où le vecteur a subi un traitement phosphatase
alcaline et est donc déphosphorylé (ligation 4 et 6) on observe des colonies.
Ce traitement offre-t-il le même intérêt dans le cas des vecteurs V et V’ ?
Dans le cas de la ligation 4 (vecteur VPA + insert 12K), il y a peu de colonies (320) car la
ligation de fragments à extrémités franches est peu efficace, mais la majorité des colonies
analysées (92%) contient le plasmide ayant intégré le fragment de PCR (12K) car la réaction
parasite a été supprimée (grâce au traitement du vecteur à la phosphatase alcaline). La ligation
3 (vecteur V + insert 12K), le vecteur n’est pas déphosphorylé et tend à se refermer sur lui-
même. On observe un grand nombre de colonies 10000 mais seulement 3% avec le plasmide
recombinant contenant 12K. Pour le vecteur V, le traitement à la phosphatase alcaline a donc
un effet bénéfique puisqu’il permet d’obtenir une plus forte proportion de bactérie avec le
fragment d’intérêt.

Dans le cas de la ligation 6 (vecteur V’PA + B1E2), l’effet de la phosphatase est faible. En
effet si on compare la ligation 5 (V’ + B1E2) et 6, le nombre total de bactérie est
approximativement le même (4000 vs 3500) avec un pourcentage de bactéries portant le
plasmide recombinant passant de 88 à >99%.

NB : Dans le cas de la ligation 5, parmi les 12% de bactéries avec vecteur sans insert, une
partie conséquente doit provenir de vecteur pas entièrement digérés.

Le vecteur V’ a été préparé par une double digestion (EcoRI/BamHI) générant deux
extrémités cohésives incompatibles entre elles : le vecteur ne se refermera sur lui-même que
très difficilement. La présence, dans le mélange réactionnel, d’un insert (B1E2) présentant des
extrémités compatibles avec celles du vecteur (digestion du produit de PCR avec les mêmes
enzymes EcoRI /BamHI), favorise encore la réaction d’insertion au détriment de la réaction
de recircularisation du vecteur V’.

Quels couples d’enzymes peuvent être utilisés pour l’analyse des plasmides extraits de chaque
colonie ?

Plusieurs couples d’enzymes peuvent être utilisés pourvu qu’ils permettent l’excision du
fragment potentiellement inséré.
Pour l’analyse des colonies issues des ligations 1 à 4 utilisant le vecteur V (linéarisé via
SmaI), on choisira une enzyme coupant en 5’ par rapport au site SmaI et une autre coupant en
3’ du site SmaI. Le site SmaI n’étant pas reconstitué lors du clonage.
Pour l’analyse des résultats des ligations 5 et 6, on pourra choisir les enzymes BamHI/EcoRI
dont les sites ont été reconstitués lors de la ligation.

Avant l’analyse des plasmides, il est possible d’évaluer l’efficacité de l’insertion du fragment
dans le vecteur. Pour cela, on compare le nombre de colonies obtenues avec la ligation au
nombre de colonies obtenues avec une ligation contrôle.

Quelle(s) ligation(s) contrôle(s) faut-il réaliser ?

Pour avoir une estimation de l’efficacité de la ligation, il suffit de réaliser deux ligations en
parallèle : l’une avec le vecteur, l’autre avec le mélange vecteur + insert. Le nombre de
colonies obtenues avec l’insert doit être très supérieur à celui obtenu avec le vecteur seul.
Quelle est la meilleure stratégie selon vous pour cloner un fragment de PCR ?

La réaction la plus rentable est la ligation 6. Elle donne le pourcentage le plus élevé de clones
positifs, ce qui nécessite l’analyse d’un nombre limité de colonies. Pour la PCR, l’utilisation
d’oligonucléotides de synthèse portant des sites pour des enzymes de restriction facilite le
clonage ultérieur par insertion orientée dans des vecteurs aux extrémités cohésives.

Exercice 2 :

Un expérimentateur souhaite insérer un fragment d’ADN contenant la séquence de la

-galactosidase dans un vecteur d’expression. Il dispose pour cela du vecteur dans lequel ce
fragment doit être inséré (plasmide 1), du vecteur portant la séquence de la -galactosidase
(plasmide 2) et d’un vecteur navette, couramment utilisé pour réaliser des clonages
intermédiaires (plasmide 3).
L’insertion dans le plasmide 1 doit obligatoirement avoir lieu dans le site SalI et l’orientation
indiqués sur la carte. Le site SalI doit être retrouvé entier en position 3’ de la -galactosidase.
Tous les sites utilisables sont indiqués sur les cartes représentées en figure 5. La succession de
sites du plasmide 3 constitue ce que l’on appelle le site multiple de clonage.

SalI

BamHI

Plasmide1 HindIII

EcoRI
XhoI

BamHI
-galactosidase
EcoRI
HindIII
Plasmide2

PstI XhoI EcoRI KpnI BamHI SmaI HindIII NarI SalI XbaI
CTGCAGCTCGAGAATTCGGTACCGGATCCCGGGAAGCTTGGCGCCGTCGACTCTAGA

Plasmide3

Figure 5 : Carte des vecteurs plasmidiques utilisés dans l’expérience de sous-

clonage.
Site de coupures des différentes enzymes :

BamHI : NarI
5’- G GATCC -3’ 5’- GG CGCC -3’
3’- CCTAG G -5’ 3’- CCGC GG -5’

EcoRI: PstI
5’- G AATTC -3’ 5’- CTGCA G -3’
3’- CTTAA G -5’ 3’- G ACGTC -5’

HindIII KpnI
5’- A AGCTT -3’ 5’- GGTAC C -3’
3’- TTCGA A -5’ 3’- C CATGG -5’

SalI SmaI
5’- G TCGAC -3’ 5’- CCC GGG -3’
3’- CAGCT G -5’ 3’- GGG CCC -5’

XhoI XbaI
5’- C TCGAG -3’ 5’- T CTAGA -3’
3’- GAGCT C -5’ 3’- AGATC T -5’

Le problème consiste à insérer, de façon orientée, le fragment d’ADN codant pour la β-

galactosidase dans le vecteur 1. L’insertion dans le vecteur 1 doit se faire obligatoirement au
niveau du site SalI. Ce site unique ne permet pas de choisir à priori l’orientation du fragment à
insérer. L’orientation devra alors être déterminée lors de l’analyse des plasmides. De
plus, le site SalI doit être retrouvé entier en position 3’ de la -galactosidase.

Aucun des sites proposé pour exciser le fragment à cloner (BamHI et HindIII ou EcoRI) n’est
compatible avec le site SalI, ce qui rend la ligation très difficile. Deux grandes stratégies sont
alors possibles.

Stratégie 1 :

La technique consiste à exciser le gène de la β-galactosidase par BamHI et EcoRI ou HindIII à

partir du plasmide 2 puis à remplir les extrémités ainsi générées de façon à obtenir des bouts
francs (traitement avec un ADN polymérase ou fragment de Klenow).

D’un autre côté, le plasmide 1 est linéarisé par SalI et subit également un traitement par une
ADN polymérase ou fragment de Klenow afin de créer des bouts francs et rendre ses
extrémités compatibles avec l’insert pour une ligation.
Comme vu dans l’exercice précédent, le clonage d’inserts à bouts francs fonctionne mais est
moins efficace que l’insertion de fragment à bouts cohésifs.
Le problème de cette stratégie est qu’elle ne permet pas de remplir une des exigences de
l’expérimentateur à savoir conserver le site SalI en aval du gène de la β-galactosidase (voir
schéma 1).

En effet, pour reconstituer un site SalI, il faudrait que l’insert apporte soit un C en position 5’
soit un G en position 3’.
Le schéma présentant la stratégie 1 a été réalisé en utilisant BamHI et EcoRI. La même
stratégie peut être réalisée avec le couple d’excision BamHI et HindIII et résultera également
en l’absence du site SalI.
Cependant une excision par HindIII suivi d’un traitement polymérase pour créer des bouts
francs et l’insertion du fragment dans le plasmide 1 (linéarisé SalI puis activité ADN
polymérase pour obtenir des bouts francs) permet de recréer le site HindIII.

Afin de vous aider à visualiser ce clonage, je vous conseille de recréer le même schéma que le
schéma 1 mais en utilisant le couple BamHI/HindIII comme enzymes d’excision.

Stratégie 2 :

La deuxième stratégie consiste à utiliser le plasmide intermédiaire 3. Le clonage dans ce

plasmide peut s’effectuer simplement de deux façons :
1- Excision par BamHI et EcoRI et insertion dans le vecteur 3 coupé par le même
couple d’enzymes (sites de restriction présents dans le site multiple de clonage du
plamside 3).
2- Idem avec le couple BamHI et HindIII.

Pour ressortir l’insert du plasmide 3 et le mettre dans le plasmide 1, il existe trois possibilités :

1- Utiliser deux enzymes qui encadrent le fragment cloné dans le plasmide 3 et

procéder comme ci-dessus afin de recréer des bouts francs avant ligation.
Attention ici il faut choisir un couple d’enzymes de façon à ne pas créer de site
SalI en 5’, mais en 3’ de la séquence de la β-galactosidase. Dans ce cas seule
l’insertion BamHI/HindIII dans le plasmide intermédiaire 3 suivi de l’excision par
l’enzyme NarI en 3’ et de n’importe quelle enzyme en 5’ permettent de remplir ces
conditions (Schéma 2).

2- Exciser le fragment de façon à emporter le site SalI présent dans le vecteur 3, pour
qu’il soit en 3’ de la séquence β-galactosidase. Pour cela choisir l’insertion
BamHI/HindIII et couper par XbaI et n’importe quelle enzyme en 5’. Ouvrir le
vecteur 1 avec SalI. Traiter l’insert et le vecteur avec le fragment de Klenow ou
une ADN polymérase pour obtenir des bouts francs et faites la ligation.

3- Mettre à profit que l’extrémité générée par XhoI est compatible avec celle générée
par SalI (voir ci-dessous en gras surligné), sans reformé aucun des deux sites.
Choisir alors l’insertion BamHI/HindIII et couper par XhoI et SalI. La ligation peut
se faire avec le plasmide 1 coupé par SalI ; et sera très efficace (deux extrémités
cohésives). Cette stratégie sera celle à privilégier car très efficace (2 bouts
cohésifs) et vous est représentée schéma 3.

SalI XhoI
5’- G TCGAC -3’ 5’- C TCGAG -3’
3’- CAGCT G -5’ 3’- GAGCT C -5’
Schéma 1 présentant la stratégie 1 avec l’excision
BamHI et EcoRI.
Schéma 2 présentant la stratégie 2 avec excision
BamHI et NarI du vecteur intermédiaire.

Première partie : Excision du plasmide 2et insertion

dans le vecteur intermédiaire 3 par BamHI/EcoRI
Schéma 2 présentant la stratégie 2 avec
excision BamHI et NarI du vecteur
intermédiaire.

Deuxième partie : Excision du plasmide 3 par

BamHI/NarI et intégration dans le plamside 1
par bouts francs. Recréation de du site SalI en
3’.
Schéma 3 : présentant la stratégie 2 avec l’excision
XhoI compatible avec SalI
Vérification de l’orientation dans les plasmides

La sélection des plasmides recombinants ayant intégré la séquence de la β-galactosidase dans

le sens désiré se fait par des tests de digestion. Pour cela on choisit une enzyme coupant à une
extrémité du fragment inséré et une enzyme (de préférence la même) coupant en un site connu
du vecteur. Les produits de digestion sont ensuite déposés sur gel d’agarose et séparés en
fonction de leur taille. Les profils de taille obtenus après migration permettent de discriminer
l’orientation des construits.

Une schématisation de l’expérience a été réalisé avec les construits obtenus à partir du cas à
privilégier (mettant à profit la compatibilité des extrémités XhoI/SalI) et une digestion par
BamHI (schéma 4).
Schéma 4 : stratégie de vérification de l’orientation
du gène de la β-galactosidase en utilisant BamHI.