L2 Sciences pour la Santé

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U.E. 3.01 Formation Générale – Méthodes Séparatives

TRAVAUX PRATIQUES
Méthodes Séparatives

2016/2017
Delphine BOUQUET, Delphine ONIDAS
1
 SOMMAIRE

Notation des TPs 3

Fiches techniques : consignes 4

Séparation et dosage des colorants alimentaires du sirop de menthe 5

Préparation 5

Colorants du sirop de menthe 7

Mode opératoire 8

Annexe 1 : Spectroscopie d’absorption 13

Annexe 2 : Spectres d’absorption et courbes d’étalonnage des colorants 15

Annexe 3 : Colorants alimentaires 18

Annexe 4 : Propriétés physico-chimiques de certains colorants 22

Séparation de composés colorés par électrophorèse et CCM 23

Préparation 23

Buts et présentation du TP 24

Mode opératoire 25

Annexe 5 : Quelques complexes colorés du fer 31

Annexe 6 : Indicateurs colorés 32

Annexe 7 : Colorants alimentaires 33

2
 Notation des TPs de Méthodes Séparatives

Préparation (notée sur 5; une note par TP)

Pour chaque TP de Méthodes Séparatives, une préparation est à rendre individuellement en
début de séance. Toute préparation non rendue sera sanctionnée.

Comportement (noté sur 3,5; une note par TP)

Compte-rendu (noté sur 10; une note par TP)

Un compte-rendu par binôme est à rendre à la fin de chaque séance de TP.
Le compte-rendu est sous la forme d’un cahier-réponse qui est fourni en début de séance.

Fiches techniques (notée sur 3 pour l’ensemble des deux TPs)

Les consignes et conseils pour rédiger vos 3 fiches techniques sont présentés à la page
suivante. Ces trois fiches portent sur :
- Préparation (rinçage) de la verrerie et vaisselle en solution aqueuse,
- Dilution d’une solution à l’aide d’une fiole jaugée,
- Colonne chromatographique.
Les fiches techniques sont à rendre individuellement à la fin de votre dernière séance de TP.

Bilan de la notation
Chaque TP est noté sur 18,5 points
Note finale sur 20 points : ½ (TPcolonne + TPélectrophorèse + fiches).

3
 Fiches techniques : consignes et conseils

En plus de vos préparations, compte-rendus et comportement en TP, vous serez aussi évalués
sur la rédaction de trois fiches techniques portant sur trois méthodes que vous utiliserez au
cours de vos TPs de Méthodes Séparatives. Des informations sur ces méthodes figurent dans
votre cours et dans tout votre fascicule de TP. De plus, vos enseignants de TP vous en
apporteront d’autres et vous confieront des trucs et astuces ainsi que les erreurs à éviter.
Il est recommandé de :
- commencer à rédiger vos fiches avant chaque séance de TP,
- compléter ces fiches le plus possible au cours de la séance de TP, en particulier lorsque
l’enseignant apporte diverses explications en début et en cours de séance.
Les trois fiches étant communes aux deux séances de TP, n’hésitez pas à les compléter
pendant la ou les semaines séparant vos deux séances de TP et à rajouter de nouvelles
informations lors de votre deuxième et dernière séance.

La rédaction de ces fiches techniques suivra le même modèle que celui utilisé pour rédiger
vos fiches techniques en TPs de Chimie organique.
Une fiche technique comprend : 1) un titre (fourni), 2) éventuellement un schéma (recopié à la
main ou collé), 3) éventuellement le principe physico-chimique, 4) le protocole, 5) les trucs et
astuces et 6) éventuellement les erreurs à éviter. Selon la technique que vous devez décrire, la
fiche ne contiendra pas obligatoirement ces six points. Une page recto (et une seule) est
demandée par technique.
Les trois techniques à décrire sont : 1) Préparation (rinçage) de la verrerie et vaisselle en
solution aqueuse, 2) Dilution d’une solution à l’aide d’une fiole jaugée et 3) Colonne
chromatographique.

La rédaction de ces fiches sera notée sur 3 points pour l’ensemble des deux TPs. Vous devez
rendre vos fiches techniques lors de votre dernière séance de TP et uniquement sous la
forme de 3 pages recto (un modèle de document à rendre sera mis en ligne sur Moodle 2).
Ces fiches vous seront rendues au second semestre. Vous pourrez les coller dans votre cahier
de laboratoire à la suite de celles rédigées en chimie organique.

Avant de rendre vos fiches, penser à inscrire sur la première page (ou au
verso du document) votre nom, prénom et numéro de groupe de TP.

4
 SEPARATION ET DOSAGE DES COLORANTS
ALIMENTAIRES DU SIROP DE MENTHE

Préparation à rendre en début de TP (1 par personne)

- répondez brièvement -

1. Remplir le tableau comparatif suivant sur les principes de la chromatographie d'adsorption

sur colonne préparative et de la chromatographie sur couche mince (CCM).

Colonne chromatographique CCM

Phase stationnaire

Phase mobile

Force d’entrainement

Force de rétention

Type d’utilisation/type
d’analyse

2. Après avoir lu l’annexe 1, analyser les spectres d’absorption des colorants E102 et E131
qui sont représentés sur l’annexe 2a, c’est-à-dire indiquer le nombre de pics et déterminer les
longueurs d’onde des maxima d’absorption. A quelle(s) longueur(s) d’onde allez-vous
effectuer vos mesures d’absorbance pour déterminer les concentrations respectives des
colorants E102 et E131 ?

3. En fixant le spectromètre d’absorption à la longueur d’onde adéquate, on a obtenu, après

soustraction du blanc, une absorbance de 0,8 pour une solution de tartrazine de concentration

5
C inconnue. A l’aide des courbes d’étalonnage 2b et 2c, déterminer la concentration en
tartrazine de cette solution. Expliciter votre méthode.

4. Après avoir lu l’annexe 3 (pages 18-21), donner la définition d’une DJA. Donner les DJA
des colorants E102 et E131. Calculer les DJA pour un adulte de 60 kg.

5. Sur la bouteille de sirop de menthe, il est marqué : «Diluer un volume de sirop dans 7
volumes d’eau». Trouver une formule simple reliant X et CE102 puis une formule simple
reliant Y et CE131 avec:
- X, la concentration en mg.L-1 de E102 contenu dans le sirop de menthe dilué,
- CE102, la concentration en mol.L-1 de E102 contenu dans le sirop commercial,
- Y, la concentration en mg.L-1 de E131 contenu dans le sirop de menthe dilué,
- CE131, la concentration en mol.L-1 de E131 contenu dans le sirop commercial,
Les masses molaires des colorants se trouvent en annexe 4.

6. A l’aide de vos réponses aux questions 4 et 5, déduire les expressions suivantes:

VE102 = a/ CE102,
VE131 = b/ CE131,

où :

- a et b sont des constantes à déterminer,

- VE102 est le volume de sirop dilué qu’un adulte de 60kg doit boire pour atteindre la DJA du
colorant E102 en L/j (Litre par jour),

-VE131 est le volume de sirop dilué qu’un adulte de 60kg doit boire pour atteindre la DJA du
colorant E131 en L/j.

Noter impérativement les deux expressions trouvées sur votre polycopié car vous en
aurez besoin durant le TP.

6
 Colorants du sirop de menthe

Afin de rendre les aliments plus appétissants et les boissons plus agréables à la vue, les
industriels ajoutent des colorants. Leur usage dans l’alimentation est réglementé. Chaque
colorant est affecté d’un numéro appartenant à la série E100, que l’on doit pouvoir lire sur
l’étiquette de l’emballage.

Le sirop de menthe verte est une solution aqueuse contenant des sucres, des extraits naturels
de menthe et deux colorants synthétiques (qui n'existent pas dans la nature):
- le jaune tartrazine: E 102
- le bleu patenté: E 131

Ces deux colorants sont très réglementés en

France et font l’objet de contrôle par les
autorités sanitaires.

Ces deux colorants sont des hétérocyles anioniques dont les formules développées sont
données ci-dessous:
SO3- SO3-
HO

SO3-
N OH
N
H 5C 2 + CH
O N N N N 2 5
O C 2H 5 C 2H 5

SO3-
Jaune de tartrazine (E102) Bleu patenté (E131)

Ces colorants sont séparables par chromatographie liquide d’adsorption à l’échelle

préparative. Cette technique est utilisée pour séparer des mélanges contenant de quelques
dizaines de milligrammes jusqu’à quelques grammes de produits.
En général, le mélange à séparer est dissous dans un minimum de bon solvant (si possible le
solvant d’élution). Cette solution est ensuite introduite à l’aide d’une pipette au sommet de la
colonne chromatographique remplie de silice (SiO2) puis est surmontée d'une fine couche de
sable. Lorsque toute la solution est adsorbée en tête de colonne, l’éluant est versé petit à petit,
provoquant la séparation des solutés sous formes de zones cylindriques. A la sortie de la
colonne, chaque soluté est recueilli en solution dans l’éluant et l’évaporation du solvant
(quand solvant organique !) à l’évaporateur rotatif permet de retrouver le ou les solutés purs.

7
 MODE OPERATOIRE

AVANT LE DEBUT DES MANIPULATIONS, SI NECESSAIRE, NETTOYER

VOTRE VERRERIE A L’EAU DISTILLEE PUIS LA SECHER AVEC UN SOPALIN
OU RINCER VOTRE VERRERIE AVEC LA SOLUTION ADEQUATE.

Important: Le volume de sirop de menthe nécessaire pour TOUT le TP (~ 1 mL) vous

sera distribué, par binôme, par votre enseignant.

Choix de l’éluant

Cette partie devra être effectuée durant les 3 lavages de la colonne chromatographique.

Le choix de l’éluant est déterminé par chromatographie sur couche mince (CCM).
• Effectuer 3 CCM du sirop de menthe avec 10 mL des trois éluants suivants: eau,
éthanol, mélange eau/éthanol (50/50). Pour le dépôt, on diluera 2 gouttes de sirop de
menthe avec 2 gouttes d’eau.
• Votre enseignant effectuera de son côté une autre série de CCM avec 3 autres éluants:
cyclohexane, acétate d’éthyle, mélange cyclohexane/acétate d’éthyle 50/50.

En se basant sur les résultats obtenus, justifier le choix des éluants dans le protocole de la
préparation de la colonne et celui de la séparation des deux colorants. Confirmer qu’il n’y a
bien que deux colorants dans le sirop étudié (à inclure dans le compte-rendu).

Pour la suite du TP, l’élution est effectuée avec de l’eau puis de l’éthanol. L’eau sert
également à la préparation de la colonne, constituée de silice comme phase stationnaire.

Préparation de la colonne chromatographique

• Assurez-vous que le robinet de la colonne préparative fonctionne bien, et qu’il est en

position fermée.

• Le remplissage de la colonne se fait en position verticale. Pour cela, prendre une

colonne vide équipée d’un fritté, ajouter un morceau de coton de verre, le tasser à
l’aide d’une baguette en verre. Ensuite, ajouter du sable (max 0,5 cm de hauteur) à
l’aide d’une spatule de façon à obtenir une surface plane. Verser environ 10 mL de
solvant d'élution en évitant de perturber la surface du sable. Laisser couler le solvant
dans un bécher de récupération. Refermer le robinet.

8
 • Peser dans un bécher environ 18 g de silice et y ajouter 50 mL d’eau. Homogénéiser
le contenu du bécher avec une spatule en téflon et le verser rapidement dans la
colonne le long de la spatule (Démonstration faite en TP par votre enseignant).

• Rincer les parois avec de l’eau à l’aide d’une pipette Pasteur plastique.

• Aider la silice à se tasser en tapotant légèrement sur la colonne pendant 3-4 minutes.

• Ouvrir le robinet et laisser couler le solvant de la colonne de telle façon que sa hauteur
au-dessus de la silice soit toujours d’au moins 1 cm. Surveiller la colonne pour qu'il
n'y ait pas de bulles d'air dans la masse de silice; sinon tapoter légèrement l'extérieur
de la colonne pour les faire remonter.

• Ajouter 20 mL d’eau distillée pour laver la silice (cela permet d’éliminer un produit
greffé sur la silice et qui absorbe en UV aux longueurs d’onde étudiées). Laisser
couler le solvant jusqu’à 1 cm de la silice et recommencer cette étape deux fois. Au
dernier ajout, vous commencerez à récupérer le solvant dans des tubes à essais (2
tubes suffiront). Ces tubes sont à garder pour la suite et seront numérotés 1 et 2.

• Veillez à toujours garder une couche de solvant au-dessus de la silice.

ATTENTION: à partir du moment où l’adsorbant est mouillé par le solvant de
migration, la colonne ne doit pas être portée à sec. Tout changement de solvant doit
s’effectuer juste avant que le niveau de celui-ci n’atteigne la surface supérieure de la
colonne.

Dépôt du sirop de menthe

Le sirop de menthe étant déjà une solution aqueuse, il n’est pas nécessaire de le diluer dans
l’éluant. La séparation s’effectuera sur un volume de 0,5 mL de sirop.

• Laisser couler le solvant de la colonne exactement jusqu'au niveau de la silice et, à

l'aide d'une pipette graduée, déposer 0,5 mL de sirop de façon homogène sur la silice
sans toucher les parois de la colonne. Attention à ne pas faire tomber la pipette dans
la colonne.

ATTENTION: le sirop de menthe est une solution visqueuse. Pipeter avec beaucoup de
précaution pour être certain de la quantité du dépôt. Si vous déposez plus que 0,5 mL,
noter absolument le volume déposé.

9
 • Ouvrir le robinet et laisser couler le solvant goutte à goutte jusqu’à adsorption du
sirop par la silice. Refermer immédiatement le robinet.

• Ajouter à l'aide d'une spatule, une couche uniforme de sable (quelques mm) sur la
silice en faisant désormais attention à ce que la colonne ainsi préparée ne soit jamais
portée à sec.

Séparation des deux colorants

• Commencer l'élution en ajoutant à l'aide d'une pipette Pasteur propre le solvant

d'élution de façon circulaire et uniforme par coulée le long des parois. Cela permet de
ne pas perturber la surface de la colonne (40 mL d’eau devrait suffire pour récupérer le
premier produit. Si ce n’est pas le cas, ajouter des fractions de 10 mL d’eau jusqu’à
obtention du colorant).

• Dès que le premier produit (bande jaune) arrive à quelques centimètres du bas de la
colonne, le recueillir dans des tubes à essai numérotés par fraction d'environ 5 mL
(maximum 3 à 4 tubes).

• Lorsque le premier produit est entièrement récupéré, éluer avec de l’éthanol pour
pouvoir collecter le deuxième produit (bande bleue). De la même façon, le produit sera
collecté dans des tubes à essai (pas plus de 3 à 4 tubes).

ATTENTION: tout changement de solvant doit s’effectuer juste avant que le niveau de
celui-ci n’atteigne la surface supérieure de la colonne.

• Rassembler les solutions identiques dans des fioles jaugées de 25 mL (une pour le
colorant jaune et une pour le colorant bleu) à l’aide d’un entonnoir à liquide. Puis
compléter les fioles jusqu’au trait de jauge avec l’éluant adéquat (une fiole est à
remplir avec de l’eau et l’autre avec de l’éthanol). Bien homogénéiser vos fioles (au
moins 10 fois).

Pour rappel, vous pouvez retrouver des vidéos sur la préparation de solutions sur
Moodle 2 (Licence 2, Semestre 1, UE 3-01 Méthodes Séparatives, Vidéos TP en solution
aqueuse).

10
Lavage de la colonne

Cette partie DOIT ETRE REALISEE AVEC VOTRE ENSEIGNANT.

• Lorsque la séparation est terminée, porter à sec la colonne au maximum en laissant
tout le solvant s'écouler dans un bécher. Votre enseignant ou un technicien videra la
silice dans le récipient de récupération sous la hotte. Enfin, la colonne est lavée à l’eau,
puis à l'acétone et sera séchée.

Remarque: le lavage à l'acétone permet d'éliminer les traces d'eau dans le fritté. La présence
d'eau à ce niveau pourrait nuire à une utilisation ultérieure de la colonne.

Analyse et dosage des deux colorants

a) L’analyse et le dosage des deux produits se fait par spectrophotométrie visible. Nous avons
réalisé les spectres du sirop de menthe et des colorants E102 et E131 (annexe 2a).
Dans un premier temps, il faut étudier ces spectres pour identifier si nous sommes bien en
présence des colorants indiqués sur la bouteille de sirop. Quelles sont les longueurs d’onde
caractéristiques que vous allez utiliser pour effectuer les mesures?

b) Vous allez calculer maintenant les concentrations des colorants par 2 méthodes:

Méthode 1:
Après avoir effectué la séparation par chromatographie sur colonne, mesurer l’absorbance
(voir procédure ci-dessous) des deux solutions contenues dans vos fioles de 25 mL aux
longueurs d’onde établies en a). Le spectromètre d’absorption sera utilisé en mode
photométrie (mode d’emploi du spectromètre disponible en salle TP).
• Remplir vos cuves au ¾ et nettoyer si nécessaire les faces externes à l’aide d’un
sopalin,
• A la longueur d’onde désirée, faîtes le «blanc» avec une cuve contenant le solvant
adéquat (= cuve de référence),
• Remplacer par la cuve contenant la solution d’intérêt et lire l’absorbance.

ATTENTION: le blanc pour le colorant jaune sera effectué avec la solution récupérée
dans le tube n°2. Le blanc pour le colorant bleu sera effectué avec de l’éthanol.

En déduire les concentrations des colorants E102 (notée C1E102) et E131 (notée C1E131) dans
le sirop de menthe commercial à l’aide des annexes 2b et 2c (rappel: dépôt initial de sirop de
0,5 mL).

11
Méthode 2:
Cette partie est à effectuer pendant la préparation de la colonne.
• Vous avez à votre disposition une solution (solution commune pour tous les binômes)
de sirop de menthe dans l’eau dont les détails de préparation (volume de sirop prélevé,
volume de la fiole jaugée) vous seront précisés le jour du TP.
• Mesurer les absorptions aux longueurs d’onde choisies précédemment en faisant le
blanc avec une cuve d’eau.

En déduire la concentration du colorant E102 (notée C2E102) et la concentration du colorant

E131 (notée C2E131) dans le sirop de menthe commercial (Attention à la dilution).

COMPTE-RENDU (voir cahier-réponse fourni en TP)

• En se basant sur les résultats obtenus par CCM, justifier le choix des éluants dans le
protocole de la préparation de la colonne et celui de la séparation des deux colorants.
Confirmer qu’il n’y a bien que deux colorants dans le sirop étudié.

• Analyser les spectres d’absorption du sirop de menthe, du E102 et du E131 en annexe 2a

(nombre de pics, longueurs d’onde max). Est-ce conforme à ce que l’on devait trouver?

• A l’aide de l’annexe 4, expliquer la migration des deux colorants dans la colonne de

chromatographie.

• Pour les méthodes 1 et 2: à partir des deux droites d’étalonnage (voir annexes 2b et 2c),
calculer la concentration des deux colorants dans vos fioles en mol.L-1 puis dans le sirop
de menthe commercial en mol.L-1.

• En comparant les concentrations avec séparation et sans séparation, en déduire le

rendement de l’étape de séparation par chromatographie. Commenter.

• Calculer combien de litres doit boire un adulte de 60 kg pour atteindre une des DJA des
colorants sachant que l’on dilue le sirop de menthe pour le boire: un volume de sirop pour
7 volumes d’eau. Est-ce physiologiquement possible?

12
 ANNEXE 1: Spectroscopie d’absorption

L’absorption de la lumière [ultraviolette (U.V.), visible ou infrarouge (I.R.)] par les solutés est
la base d’un grand nombre de méthodes d’analyses qualitatives et quantitatives, aussi bien en
chimie minérale qu’en chimie organique ou qu'en biochimie.
L’absorption d’un photon par une molécule donnée aboutit à porter l’un de ses électrons de
son état généralement de plus basse énergie (état fondamental E0) dans un état d’énergie
supérieure (E2): la molécule est alors excitée; elle peut revenir à l’état fondamental par
différentes voies de désexcitation. Les niveaux énergétiques de cette molécule étant
quantifiés, toutes les radiations ne sont pas absorbées; seules sont absorbées celles dont
l’énergie correspond exactement à la différence entre le niveau fondamental et les niveaux
excités de la molécule.

Définition des grandeurs utilisées

Soit un faisceau de lumière monochromatique (contenant des photons possédant tous la même
énergie, donc de même longueur d’onde), traversant une épaisseur l de solution contenant un
soluté à la concentration C. l
I0 I
Rayonnement Rayonnement
incident transmis (mesuré)

Nombre de photons à l’entrée Nombre de photons à la sortie

Solution absorbante
de concentration C

I0 est l’intensité lumineuse arrivant sur la solution. A la sortie de la solution, l’intensité

transmise I a une valeur inférieure à I0. On définit l’absorbance (A) de la solution ou la
densité optique (DO) comme étant le logarithme décimal du rapport de I0 sur I:
I0
A = DO = log
I

La loi de Beer-Lambert indique, qu’à une longueur d’onde λ fixée, l’absorbance est
proportionnelle à la concentration C du soluté (exprimée en mol.L-1) et à l’épaisseur l
(exprimée en cm) de la cuve:
Aλ = ελ x C x l

13
Le coefficient de proportionnalité ε est appelé le coefficient d’extinction molaire du soluté.
Il s’exprime en mol-1.L.cm-1 et il dépend:
- du soluté absorbant et du solvant,
- de la longueur d’onde,
- de la température.
La courbe représentant les variations de l'absorbance en fonction de la longueur d’onde est le
spectre d’absorption. En général, un spectre d’absorption UV-Visible se compose de
plusieurs pics et présente donc plusieurs maxima d’absorption avec des coefficients
d’extinction molaires différents.
Lorsque plusieurs espèces absorbantes sont présentes en solution et qu’elles ne donnent lieu à
aucune réaction chimique, l’absorbance du mélange est la somme des absorbances propres à
chaque constituant (propriété d'additivité de la loi de Beer-Lambert):

Atot = ∑ Ai = ∑ ε i λ × [ci ]× l
i i

Ecarts à la loi de Beer-Lambert

La loi de Beer-Lambert est une loi limite. Il faut toujours vérifier qu'elle est bien suivie par la
substance étudiée. Dans le cas de solutions trop concentrées ou bien trop diluées, cette loi peut
ne plus être vérifiée du fait de phénomènes annexes (formation d’agrégats, etc...).

14
ANNEXE 2a: Spectres d’absorption du sirop de menthe et des
colorants E102 et E131

15
 ANNEXE 2b: Courbe d’étalonnage du colorant E102

Droite d'étalonnage de la Tartrazine

y = 0.2544x
2.5 R2 = 0.9997

2
Absorbance

1.5

0.5

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-5 -1
Concentration (10 mol.L )

16
 ANNEXE 2c: Courbe d’étalonnage du colorant E131

Etalonnage du bleu patenté (dans EtOH) - courbe complète

2.5

2
Absorbance

1.5

0.5

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-5 -1
Concentration (10 mol.L )

Etalonnage du bleu patenté (dans EtOH) - partie linéaire

2.5

y = 1.0565x
2 2
R = 0.9989
Absorbance

1.5

0.5

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
-5 -1
Concentration (10 mol.L )

17
 ANNEXE 3 : LES COLORANTS ALIMENTAIRES

HISTORIQUE POURQUOI des COLORANTS ?

Jusqu'en 1850, les colorants alimentaires

provenaient :
.de végétaux comestibles (carotte [orange] ,
betterave [rouge] , peau de raisin noir [noir] ... ) . L'industriel sait que, dans une certaine mesure,
.d'extraits d'origine animale ou végétale non ses ventes seront affectées par l'aspect du produit. Par
habituellement consommés (acide carminique [rouge] exemple, le consommateur achètera plus volontiers une
provenant d'insectes, stigmate de crocus [safran] ... ) . tomate d'un beau rouge éclatant, plutôt qu'une tomate à
la peau tachetée de vert. Ceci est vrai même si le goût
.du résultat de la transformation de substances et la valeur nutritive ne sont pas modifiés par la couleur
naturelles (caramel [marron] ) . du fruit. De plus, le consommateur est habitué à ce que
La plupart des colorants naturels sont encore certaines denrées aient une couleur particulière. Par
utilisés aujourd'hui mais ont été largement supplantés exemple, le beurre est coloré artificiellement : il n'est
par les colorants synthétiques. jaune qu'en été ; en hiver, il est très pâle et les
En 1856, Perkin synthétise le premier industriels ajoutent, par habitude, un colorant jaune, le
colorant, la mauvéine, dérivé des hydrocarbures
β-carotène.
aromatiques contenus dans le goudron de houille. A la
D'un point de vue nutritionnel ou
fin du XIX° siècle, plus de 90 colorants sont utilisés
technologique, l'usage des colorants alimentaires n'est
dans l'industrie alimentaire.
généralement pas nécessaire. En fait, dans certains cas,
En 1906, la première législation concernant
les colorants sont utilisés pour abuser le consommateur
l'usage des colorants dans l'alimentation est votée aux
en donnant une fausse impression de qualité. Par
Etats-Unis. Ne sont autorisés que sept colorants. En
exemple, des colorants jaunes sont ajoutés aux gâteaux
effet , avant cette date , il n'existait aucune
ou aux pâtes pour suggérer une plus grande quantité
réglementation et certains produits étaient utilisés pour
d'oeufs qu'il n'y a réellement.
teindre aussi bien les vêtements que la nourriture .
L'ajout de colorant peut avoir parfois quelque
Depuis cette époque, des recherches ont révélé
utilité. Les caroténoïdes ne donnent pas seulement une
que nombre de colorants sont toxiques et peuvent être à
couleur attractive à la nourriture mais ils sont
l'origine d'anomalies à la naissance, de troubles
transformés par l'organisme en vitamine A1 intervenant
cardiaques ou de cancers.
dans le mécanisme de la vision. La tartrazine stabilise
La Communauté Européenne autorise onze
la vitamine C dans les boissons. Les couleurs sombres
colorants alimentaires synthétiques. Mais la législation
agissent comme un écran solaire en protégeant les
diffère d'un pays à l'autre.
vitamines et autres ingrédients sensibles à la photo
La plupart des colorants synthétiques sont des
dégradation.
colorants azoïques. Beaucoup de personnes les
soupçonnent d'être cancérigènes. Mais depuis 1960,
On a peut-être sérieusement diminué le risque
chaque colorant est soumis à des examens
entraîné par l'utilisation des colorants alimentaires en
toxicologiques permettant d'exclure tout risque pour la
n'autorisant dans l'industrie que l'emploi de colorants
santé du consommateur.
spécialement synthétisés ou extraits dans ce but, et :
Les colorants synthétiques ont des avantages
sur les colorants naturels. Beaucoup de ces derniers .dont la composition est connue et reproductible,
sont sensibles à la lumière, à l'oxygène ou à l'action des .dont l'innocuité a été établie,
bactéries. Donc, ils ne sont pas stables. Les colorants .qui ont un pouvoir colorant élevé permettant
synthétiques, plus stables, ont une durée de vie plus donc de réduire leur utilisation à de petites quantités,
longue, et donnent des couleurs plus intenses. Ils sont .qui sont chimiquement stables dans les denrées
ainsi utilisés en plus petite quantité et sont souvent auxquelles ils sont ajoutés.
moins onéreux que les colorants naturels.

Extraits de : Chimie des Couleurs et des Odeurs (Capon, Couilleau, Valette) Cultures et Techniques

18
 COLORANTS ALIMENTAIRES

OH Liste des additifs autorisés

NaO S Les conservateurs (série des E 200)
3 N 201 à 203 260 à 263
N 210 à 224 / 226 - 227 270 / 280 à 283
230 à 233 / 236 à 239 290
249 à 252
SO3Na
Les antioxygènes (Série des E 200 et E 300)
300 à 312 (sauf 305) 270 / 325 à 327 /
AZORUBINE E122 220 à 224 / 226 / 322 330 à 341 / 472
Les agents émulsifiants, stabilisants,
épaississants et gélifiants ( E300 / E400)
322 / 339 à 341 / 400 à 407 / 410 / 412 à 415 / 420 à
SO3 Na
422 / 440 / 450 / 460 / 461 / 463 à 466 / 470 à 475 /
477 / 481 à 483
OH Additifs avec numéros provisoires
N 234 / 296 / 350 à 353 / 442 / 500 / 501 / 503 / 504 / 509
NaO S N
3 / 520 / 530 / 535 / 536 / 541 / 551 / 553b / 554 / 570 /
N N
572 / 573 / 575 / 621 / 626 / 627 / 629 / 630 /
633 / 637 / 901 à 907 / 915 / 920
COONa

TARTRAZINE E102

CH 2CH 3 CH 2CH 3 Etiquette d'un produit alimentaire

INFORMATION QUALITE
CH 3CH 2 N +N CH CH La gamme des gélifiés Carrefour s'agrandit avec Super Crocodile.
2 3 Tu découvriras avec plaisir le bon goût fruité du citron, de la fraise ,
de l'orange et de l'ananas, et croqueras le sympathique crocodile.
INGREDIENTS : sirop de glucose - sucre - eau - gélatine -
- Acidifiant : acide citrique - arôme artificiel.
SO3
Colorants : E 102 - E 110 - E 124 - E 131 .
Agents d'enrobage : huile végétale et cire d'abeille.
HO
Ce produit fait l'objet de contrôles rigoureux à tous les stades de son
SO3 Ca+ élaboration.

BLEU PATENTE V E131

19
Couleur Code Nom usuel Origine Utilisation D.J.A. en mg
par kg de poids
jaune E 100 CURCUMINE ⊗ moutarde, bouillons, potages, produits laitiers admis sans
D.J.A.
jaune E 101 LACTOFLAVIN
E
⊗ produits laitiers, confiserie, pâtisserie,
biscuits, desserts
admis sans
D.J.A. ( c'est la
vitamine B2)
(RIBOFLAVINE)

jaune E 102 TARTRAZINE Δ pâtisserie, confiserie, glaces, boissons, sirops,

fruits confits, liqueurs, desserts, sels
7,5
effervescents
jaune E 104 JAUNE DE
QUINOLEÎNE
Δ confiserie, boissons, liqueurs (en mélange
avec E 131 pour l'obtention de verts vifs)
0,75
temporaire
orange E 110 JAUNE-
ORANGE S
Δ boissons, sirops, glaces, confiserie, pâtisserie,
desserts, denrées alimentaires conservées en 2,5
boîtes
rouge E 120 COCHENILLE apéritifs, charcuterie, produits laitiers admis sans
ACIDE D.J.A.
CARMINIQUE ⊗ (temporaire)
rouge E 122 AZORUBINE Δ confiserie, sirop, boissons, crevettes, sauces,
enveloppes de saucisses, produits carnés
2,0
(temporaire)
rouge E 123 AMARANTE en France caviar seulement ; confiserie, 0,75
boissons, caviar (reste de l'Europe) (temporaire)
rouge Z 124 ROUGE COCHE- confiserie, pâtisserie, biscuits, glaces, sirops, 0,15
NILLE A boissons, charcuterie, desserts
(temporaire)
PONCEAU 4R
rouge E 127 ERYTHROSINE Δ confiserie, fruits au sirop, fruits confits 2,5

bleu E 131 BLEU PATENTE

V
Δ confiserie, sirops, pâtisserie, glaces, liqueurs 2,5
(temporaire)
bleu E 132 INDIGOTINE pâtisserie, confiserie, glaces, fruits confits, 5,0
⊗ charcuterie
vert E 140 CHLORO- colorants très rarement utilisés en France admis
-PHYLLES sans D.J.A.
vert E 141 complexes colorants très rarement utilisés en France 15,0
cuivriques
CHLOROPHYL.
vert E 142 VERT ACIDE
BRILLANT
Δ fruits confits, sirops, confiserie, boissons
liqueurs
5,0
(temporaire)
brun E 150 CARAMEL vins, liqueurs, eaux de vie, bières, confiserie, sans limite
glaces, pâtisserie, bouillons, potages, produits supérieure
laitiers, boissons, charcuterie
brun E 150 CARAMEL idem 100
(procédé (temporaire)
ammoniacal)
noir E 151 NOIR
BRILLANT B.N.
Δ confiserie, glaces, crèmes glacées 0,75
(temporaire)

20
 Couleur Code Nom usuel Origine Utilisations habituelles en France D.J.A. en mg
par kg de
poids
noir E 153 CARBO
MEDICINALIS
⊗ confiserie admis
sans D.J.A.
VEGETALIS
Nuances E 160 CAROTENOÎDES potages, charcuterie, sauces, condiments, D.J.A.
produits laitiers, desserts diverses

diverses E 161 XANTOPHYLLES potages, charcuterie, sauces, condiments D.J.A.

diverses

E 162 ROUGE DE bouillons, potages, charcuterie, condiments, admis

BETTERAVES produits laitiers sans D.J.A.
(BETANINE)

E 163 ANTHOCYANES colorant très rarement utilisé admis

en France sans D.J.A.

Colorants E 170 CARBONATE DE colorant très rarement utilisé admis

CALCIUM en France sans D.J.A.
de E 171 BIOXYDE DE colorant très rarement utilisé admis
TITANE en France sans D.J.A.
surface E 172 OXYDES ET colorant très rarement utilisé
HYDROXYDES en France
DE FER
E 173 ALUMINIUM décors (confiserie et pâtisserie) admis
sans D.J.A.
E 174 ARGENT décors (confiserie et pâtisserie) admis
sans D.J.A.
E 175 OR décors (confiserie et pâtisserie) admis
sans D.J.A.
pour
certains
E 180 PIGMENT RUBIS Δ croûtes de fromages admis
sans D.J.A.
usages
seulement

E 102 : en étude pour ses éventuelles propriétés Colorants synthétiques :

allergisantes
colorant de synthèse identiques aux colorants
naturels
Colorants naturels :

constituants normaux des aliments

Δ colorants de synthèse sans correspondants
naturels
⊗ substances extraites de végétaux non alimentaires

colorant d'origine minérale

D.J.A. dose journalière admise : s'exprime en mg par kg de poids corporel

21
 ANNEXE 4: Propriétés physico-chimiques de certains colorants
alimentaires.

Dénomination Numéro λmax Masse molaire

-1
Solubilité dans l’eau Solubilité dans l’éthanol
(nm) (g.mol ) (g.L-1) (g.L-1)
Curcumine E100 426 368 Miscible sans limite -

Tartrazine E102 426 534 250 1

Jaune de
E104 411 477 75 <0,2
quinoléine

Jaune soleil E110 485 452 180 0,1

Bleu patenté E131 638 583 4 7

Indigotine E132 610 466 15 <0,1

22
 SEPARATION DE COMPOSES COLORES PAR
ELECTROPHORESE ET CCM

Préparation à rendre en début de TP (1 par personne)

1. Comment allez-vous procéder pour préparer la solution diluée de chlorure de sodium (soyez
précis)? Calculer la concentration de cette solution.

2. Soit les complexes [Fe(H2O)6]3+, [Fe(CN)6]3- et [Fe(SCN)]2+. Pour chaque complexe :

- écrire la réaction de formation globale,
- préciser le degré d’oxydation du métal au sein du complexe,
- donner son nom en respectant la nomenclature officielle.

3. Après avoir rappelé succinctement le principe de l’électrophorèse, remplissez le tableau

comparatif suivant.

Electrophorèse CCM

Principe de la séparation (ou

«séparation en fonction de»)

Rôle de la phase liquide

4. On effectue la séparation par électrophorèse de l’azorubine, de la tartrazine et du complexe

[Fe(SCN)]2+. A l’aide des données listées dans les annexes 5 et 7, quels résultats (sens de
migration, distance de migration) attendez-vous ? Expliciter votre raisonnement. Quel colorant
alimentaire migrera le plus loin ?

5. L’indicateur coloré hélianthine (annexe 6) est caractérisé par CCM avec l’éluant eau/éthanol
dans les proportions 90/10. Quelles interactions seraient susceptibles d’avoir lieu entre la phase
stationnaire et le composé ?
Une deuxième CCM est réalisée avec l’éluant eau/éthanol 70/30. Comment allez-vous préparer
10 mL de l’éluant eau/éthanol 70/30 ? Quel effet devrait avoir ce nouvel éluant sur la migration
de l’indicateur coloré ? Détailler votre raisonnement.

23
 Buts et présentation du TP

L’électrophorèse est, avec la chromatographie, une des principales techniques utilisées en

biologie pour séparer et caractériser des composés. Elle a certaines applications en chimie mais
est principalement utilisée en biochimie pour la séparation des protéines et des acides
nucléiques.

Le but de ce TP est double :

• vous familiariser avec l’électrophorèse d’un point de vue théorique (principe de
l’électrophorèse, critères de séparation des composés) et pratique (mise en œuvre
d’électrophorèse pour la séparation de composés chimiques «simples»; analyse et
interprétation de résultats),
• vous amener à proposer une interprétation cohérente de plusieurs résultats
expérimentaux obtenus, pour un même mélange, à l’aide de trois techniques de séparation
différentes.

Dans ce contexte, au cours du TP vous allez :

A- séparer et caractériser par électrophorèse et CCM un lot de quatre composés colorés connus.
B- déterminer la composition d’un mélange «inconnu», constitué à partir de votre lot de
composés colorés, en l’étudiant successivement par chromatographie sur colonne, CCM et
électrophorèse.
Pour cette dernière partie, il n’y a pas de bonnes ou de mauvaises réponses. C’est à vous
d’expliquer votre raisonnement en présentant clairement, étape par étape :
- les résultats obtenus,
- les conclusions que vous en avez tirées,
- les hypothèses que vous proposez.

24
 MODE OPERATOIRE
ATTENTION: Le plus grand soin sera apporté à la préparation de la solution
diluée. Avant toute manipulation, SI NECESSAIRE nettoyer votre verrerie à l’eau
distillée et la sécher à l’aide d’un sopalin OU rincer votre verrerie avec la solution
adéquate.

Vous avez à disposition par binôme :

- un lot de quatre composés colorés connus,
- un mélange «inconnu», constitué à partir de votre lot de composés colorés.

Noter le numéro de votre lot, le nom des 4 composés et le nom du mélange.

Veillez à ne pas mélanger et/ou intervertir les bouchons de vos 5 piluliers ni les capillaires.
Chaque capillaire est associé à un pilulier et est étiqueté en accord avec ce pilulier.

A- Analyse des quatre composés colorés par électrophorèse et

CCM

1- Electrophorèse
a- Préparation de la solution diluée de chlorure de sodium (NaCl)

Vous avez à disposition une solution mère de chlorure de sodium de concentration 10 g.L-1.
Prélever 20 mL de cette solution mère dans un bécher de 25 mL (penser à écrire sur vos
béchers ce qu’ils contiennent!). Ce volume vous permettra de rincer deux fois la pipette
avant de l’utiliser pour prélever la solution mère puis de préparer la solution diluée de NaCl.
Prélever 5 mL de la solution mère de NaCl à l’aide d’une pipette jaugée (préalablement
rincée) et l’introduire dans une fiole jaugée de 100 mL. Puis ajuster à 100 mL avec de l’eau
distillée et homogénéiser.
Pour rappel, vous pouvez retrouver des vidéos sur la préparation de solutions sur Moodle
2 (Licence 2, Semestre 1, UE 3-01 Méthodes Séparatives, Vidéos TP en solution aqueuse).

b- Préparation du cristallisoir

Verser dans un bécher de 25 mL, propre et sec, 10 à 15 mL de solution diluée de NaCl (penser
à écrire sur vos béchers ce qu’ils contiennent!). A l’aide de ce bécher, remplir précisément
10 mL de solution diluée de NaCl dans une éprouvette de 10 mL. Puis verser les 10 mL dans

25
un cristallisoir. Ne pas jeter le contenu du bécher de 25 mL ! Le reste (~85-90 mL) de la
solution diluée de NaCl va servir à remplir une cuve «commune» d’électrophorèse.

c- Préparation d’une cuve commune d’électrophorèse

Une même cuve d’électrophorèse va servir pour 3 binômes. Trois binômes vont donc mettre en
commun leurs solutions diluées de NaCl pour remplir les deux compartiments de la cuve
d’électrophorèse en suivant le protocole suivant :
- à côté de chaque cuve d’électrophorèse, vous avez à disposition, en commun pour 3 binômes,
un bécher de 100 mL et une éprouvette de 250 mL,
- verser dans le bécher de 100 mL, propre et sec, le contenu de la fiole de 100 mL. A l’aide de
ce bécher, remplir précisément l’éprouvette avec 130 mL de solution diluée de NaCl puis
verser dans un compartiment de la cuve à électrophorèse. La solution doit arriver au niveau
du trait et recouvrir le fil métallique.
- renouveler l’opération pour remplir le deuxième compartiment de la cuve à électrophorèse.

d- Dépôt sur papier Whatman et séparation par électrophorèse

Une démonstration de la préparation du papier Whatman, du dépôt des composés et de la
fixation du papier sera effectuée par l’enseignant.

Au crayon de papier, tracer dans le sens de la largeur un trait horizontal à mi-hauteur du papier
Whatman. A l’aide d’une pince, imbiber la feuille de papier Whatman de la solution diluée de
NaCl contenue dans le cristallisoir. Puis essorer le papier entre deux feuilles de papier
absorbant.
Laisser un papier absorbant sous le papier Whatman et déposer sur la ligne précédemment
tracée, chacun des quatre composés colorés (ATTENTION : utiliser un capillaire différent
pour CHAQUE composé !). Penser à noter dans le compte-rendu à quel composé correspond
chaque dépôt. Pour chaque expérience d’électrophorèse vous pourrez au maximum faire
quatre dépôts (bien les espacer).
Placer le papier Whatman sur le support à Electrophorèse et bloquer les extrémités. Placer le
support dans la cuve à électrophorèse (3 supports par cuve). Quand les trois supports sont en
place, fermer la cuve à l’aide du couvercle et noter les branchements de la cuve (quelle borne
est la positive et laquelle est la négative).
Préparer vos chronomètres, de quoi dessiner et prendre des notes puis prévenir l’enseignant
qui démarrera l’électrophorèse avec les conditions suivantes : tension 200V et intensité 400
mA.

26
Surveiller l’évolution de vos dépôts toutes les 5 min et noter vos observations (couleur, temps
de migration, sens de migration…..). Faîtes un croquis toutes les 10 minutes. Au bout de 45
minutes, demander à l’enseignant d’arrêter l’électrophorèse. Ne pas vider la cuve
d’électrophorèse, ni le cristallisoir; ils seront réutilisés dans la partie B du TP.

2- CCM

Pendant que vos quatre composés sont séparés par électrophorèse, effectuer successivement
deux CCMs de vos composés colorés avec 10 mL d’éluant. La première CCM sera réalisée
avec l’éluant eau/éthanol dans les proportions 90/10 et la seconde CCM avec l’éluant
eau/éthanol dans les proportions 80/20.
Quel éluant est le plus approprié pour séparer les quatre composés ?

B- Détermination de la composition d’un mélange

A partir des quatre composés de votre lot, différents mélanges ont été réalisés. Vous allez
analyser l’un d’entre eux et tenter de déterminer sa composition à l’aide de trois méthodes de
séparation. Il n’y a pas de bonnes ou de mauvaises réponses. C’est à vous de présenter
clairement, étape par étape, les résultats obtenus, les conclusions que vous en avez tirées et les
hypothèses que vous proposez.
Pour information, selon les mélanges il est possible que certains composés
réagissent/interagissent entre eux.

1- Séparation sur colonne chromatographique

Le but de cette colonne est une analyse qualitative et non quantitative. Il s’agit de séparer les
composés sur la colonne sans pour autant chercher à tous les récupérer en sortie de colonne.

a- Préparation de la colonne
Le remplissage de la colonne se fait en position verticale. Prendre une colonne vide équipée
d’un morceau de coton, la fixer à l’aide d’une pince (pince placée 1 cm au-dessus du coton) et
positionner un pilulier vide en dessous.
Peser dans un bécher de 25 mL, environ 800 mg de silice et y ajouter 10 mL d’eau.
Homogénéiser le contenu du bécher avec une spatule. A l’aide d’une pipette Pasteur en
plastique, prélever le mélange silice/eau et le déposer totalement dans la colonne. La silice va

27
se tasser. A partir de cet instant, ne plus utiliser la pipette ayant servi à l’ajout du mélange
silice/eau.
Rincer les parois de la colonne avec de l’eau (mouvements circulaires) à l’aide d’une pipette
Pasteur en plastique propre. Surveiller la colonne, elle ne doit jamais être portée à sec. Veillez à
toujours garder une couche de solvant au-dessus de la silice (remettre de l’eau si nécessaire).

b- Dépôt de l’échantillon
Laisser couler le solvant de la colonne exactement jusqu’au niveau de la silice. A l’aide d’une
pipette Pasteur en verre, équipée d’une poire à pipeter, déposer une goutte de mélange de
façon homogène sur la silice sans toucher les parois de la colonne. Ajouter à l’aide d’une petite
spatule, une fine couche uniforme de sable sur la silice en faisant désormais attention à ce que
la colonne ainsi préparée ne soit jamais portée à sec.

c- Elution
Commencer l’élution en ajoutant de l’eau, à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, de façon
circulaire et uniforme par coulée le long des parois. Ajouter de l’eau jusqu’à l’obtention du
(des) premier(s) produit(s) en sortie de colonne. Poursuivre l’élution à l’eau. Si les produits
«trainent» sur la silice ou restent en haut de colonne, poursuivre l’élution avec l’éluant
précédemment sélectionné en CCM à la manipe A2.
Noter la couleur et l’ordre de sortie des composés collectés en sortie de colonne. Si nécessaire,
noter la couleur des composés restés dans la colonne.
Quelle(s) proposition(s) pouvez-vous faire quand à la composition du mélange ?

2- Séparation par CCM

Pour affiner les résultats obtenus en B1 et/ou confirmer votre proposition de la composition du
mélange, vous pouvez réaliser au maximum deux CCMs.
Quel éluant allez-vous utiliser ? Quelle(s) CCM(s) allez-vous réaliser ? Pouvez-vous affiner ou
confirmer votre proposition quand à la composition du mélange ?

3- Séparation par Electrophorèse

Contrairement au point B2 (CCM), vous ne pourrez effectuer qu’une seule électrophorèse. Et

pour rappel, sur le papier Whatman vous pouvez au maximum faire quatre dépôts.
Réaliser une électrophorèse en suivant le même protocole qu’en A1d.
Quels dépôts avez-vous choisi d’effectuer pour affiner ou confirmer votre proposition en B2?

28
Vaisselle

A la fin de votre TP, nettoyer :

- votre verrerie à l’eau,
- les supports d’électrophorèse à l’eau et au savon,
- les capillaires : laisser le composé coloré s’écouler sur un papier absorbant puis nettoyer le
capillaire plusieurs fois à l’eau puis si besoin à l’éthanol. ATTENTION de ne pas enlever
l’étiquette du capillaire.

Compte-rendu (voir cahier-réponse fourni en TP)

A- Analyse des quatre composés colorés par électrophorèse et

CCM
A1- Electrophorèse

- Reporter les dessins effectués à 10, 20, 30 et 40 min (préciser bien à quel composé
correspond chaque dépôt). Faîtes le bilan de vos observations (couleur, sens de migration,
distance ou vitesse de migration). Comparer les résultats des quatre composés. Ces résultats
sont-ils en accord avec les données (charge, taille, couleur) listées dans les annexes 5, 6 et 7 ?
- Sachant que le papier Whatman a un pH basique, cela vous aide-t-il à interpréter le(s)
résultat(s) précédent(s) qui n’étai(en)t pas en accord avec les données des annexes ?

A2- CCM

a- Comment allez-vous préparer 10 mL de l’éluant eau/éthanol 90/10 ?

b- Dessiner les deux CCMs obtenues (préciser bien à quel composé correspond chaque
dépôt). Quel effet a eu l’augmentation de la proportion d’éthanol dans l’éluant sur la migration
d’un colorant ou d’un indicateur coloré ? Expliquer ce résultat.
c- En vous basant uniquement sur les résultats obtenus en CCM, parmi les deux éluants testés,
quel est le plus approprié pour séparer les quatre composés de votre lot (expliciter votre
raisonnement) ?
d- Calculer les rapports frontaux (Rf) des 4 composés pour la CCM réalisée avec l’éluant le
plus approprié.
e- Si ces quatre composés étaient séparés sur colonne de silice avec l’éluant que vous venez de
choisir et en vous basant uniquement sur les résultats obtenus en CCM, quel composé sortirait

29
en premier de la colonne ? Quel serait l’ordre de sortie des trois autres composés ? Expliciter
votre raisonnement.

B- Détermination de la composition d’un mélange

B1- Séparation sur colonne chromatographique

- A l’aide de vos résultats (couleur, ordre de sortie) obtenus par chromatographie sur colonne et
de votre réponse à la question A2e, quelle(s) conclusion(s) pouvez-vous en tirer ?
- Quelle(s) hypothèse(s) ou proposition(s), même partielle(s), pouvez-vous faire quand à la
composition du mélange ? Expliciter votre raisonnement.

B2- Séparation par CCM

- Quel éluant avez-vous choisi pour réaliser votre (ou vos deux) CCM(s) ? Pourquoi ?
- Quelle(s) CCM(s) avez-vous choisie(s) de réaliser ? Pourquoi ?
- Dessiner le résultat de cette (ou ces) CCM(s) (préciser bien à quoi correspond chaque
dépôt). Que pouvez-vous en conclure ?
- Pouvez-vous affiner ou confirmer votre proposition quand à la composition du mélange
(expliciter votre raisonnement) ?

B3- Séparation par Electrophorèse

- Quels dépôts avez-vous choisi d’effectuer pour affiner ou confirmer votre hypothèse
proposée en B2?
- Reporter les dessins effectués à 10, 20, 30 et 40 min (préciser bien à quoi correspond
chaque dépôt). Que pouvez-vous en conclure ?
- Quelle est la composition du mélange (expliciter votre raisonnement) ?

B4- Bilan
- Faîtes un résumé concis du raisonnement qui vous a permis de conclure quand à la
composition du mélange en précisant à chaque étape le rôle qu’a joué chaque technique de
séparation dans votre raisonnement.
- Dans votre cas, quelle(s) méthode(s) de séparation a (ont) été décisive(s) quand à la
détermination de la composition du mélange ?

30
 ANNEXE 5: Quelques complexes colorés du fer

Masse molaire
Complexe (g.mol-1) Couleur Utilisation

- Responsable de la «casse ferrique» du vin

[Fe(H2O)6]3+ 163,9 (= précipitation des composés phénoliques
3+ -
[Fe(H2O)6] ;3Cl 270,28 marron ou de l’acide phosphorique),
- Excellent hémostatique en usage externe.
[Fe(CN)6]3- 211,95 jaune pale - affaiblisseur d’image en photographie
[Fe(CN)6]3- ;3K+ 329,26 argentique.
rouge - permet de mettre en évidence la présence
2+
[Fe(SCN)] 114 sang d’ions ferriques.

31
 ANNEXE 6: Indicateurs colorés

Masse molaire
Composés Structure (g.mol-1) Remarques Utilisation
(contre-ions inclus)
Indicateur coloré redox Colorant du Curaçao,
Bleu de méthylène 284,4 forme oxydée : bleu Colorant histologique,
(chlorure de (319,85) forme réduite : incolore Médecine : teste la
méthylthioninium) perméabilité des tissus
Indicateur coloré de pH Test du rouge de méthyle :
Zone de virage : 4,4-6,2 relié à la voie fermentative
Rouge de méthyle 269,29 forme acide : rouge des acides mixtes chez
forme basique : jaune Streptococcus
Indicateur coloré de pH
Orangé de méthyle 305,35 forme acide : rose-rouge Indicateur de pH
(Hélianthine) (327,33) forme basique : jaune- Zone de virage : 3,1-4,4
orangé

Indicateur coloré de pH Dosage Albumine BCG

Vert de Bromocrésol 698 pKa = 4,9 basé sur la formation d’un
(forme acide (721) forme acide : jaune complexe coloré vert de
représentée ci-contre) forme basique : bleue bromocrésol/albumine

32
 ANNEXE 7: Colorants alimentaires

M (g.mol-1)
Composés Structure (contre-ions inclus) Remarques Utilisation
Structure voir pages 7 et 19 (Annexe 3) pour le repérage clinique de la
Bleu patenté V Monomère : [bleu ] − ;Na+ (582,67) monomère Solution couleur circulation lymphatique sous
E131 (1159,43) dimère bleue forme [bleu ] − ;Na+
Dimère : [bleu ] 22− ;Ca2+
Jaune de quinoléine dans fromage fondu, confitures,
E104 Couleur jaune spiritueux, produits
(mélange d’isomères 431,39 pour n= 2 pharmaceutiques et cosmétiques
avec n = 1, 2 et 3) (477,37) pour n= 2 n = 2 : majoritaire

Colorant alimentaire dans les

Rouge Ponceau 4R 535,5 sucreries
E124 (604,47) Couleur rouge Colorant dans les gels à
(Rouge cochenille A) électrophorèse

465,39 dans fromages fondus et dans

Tartrazine Structure avec 3 Na+ : voir Annexe 3 (p 19) (534,36) Couleur jaune vif produits sucrés, pharmaceutiques
E102 et cosmétiques
Azorubine 456,45 Couleur rouge dans produits sucrés,
E122 Structure avec 2 Na+ : voir Annexe 3 (p 19) (502,43) pharmaceutiques et cosmétiques

33