Université A.

Mira de Béjaia 20--/20--

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de SBE
Master II Biodiversité et Sécurité Alimentaire
TP de Cytogénétique
Mme DJAFRI-BOUALLAG L.

TP 1 : Présentation du matériel et préparation des solutions

Objectif du TP :

- Présenter le matériel du laboratoire qui sera utilisé en caryologie

- Préparer les solutions à utiliser dans les TPs de cytogénétique.

1/ Le matériel du laboratoire : Microscope, loupe binoculaire, balance, plaque chauffante,
bain marie, centrifugeuse, pipette, tubes à essai, boite de Pétri, étuve, portoirs,
éprouvette, Erlenmeyer, entonnoir, pinces et aiguilles fines.

2/ Préparation des solutions :

Matériel nécessaire :
Éprouvette de 10 ml ; tubes à essai, Erlenmeyer, entonnoir

Produits nécessaires :
Acide acétique glacial, Acide acétique, Chloroforme, Ethanol absolu, Acide chlorhydrique,
Carmin, Bleu de coton

Préparation du fixateur (qsp pour chaque étudiant):

Le fixateur utilisé est le Carnoy , (1V acide acétique glacial /3 V chloroforme / 6 V d’éthanol
absolu).

Pour préparer 10 ml du Carnoy;

Mettre 1 mL d’acide acétique glacial dans un tube à essai,

Ajouter 3mL de chloroforme
Ajouter 6 mL éthanol absolu.

Préparation de la solution d’hydrolyse (qsp pour tout le groupe) :

La solution d’hydrolyse utilisée est le HCl 1 N

Attention !!! Travailler sous la hotte

Pour préparer 1L du HCl 1N, il faut tenir compte de toutes les informations inscrites
sur le flacon de la solution mère du HCl fumant (concentré):

Informations sur le flacon de la solution mère :

Concentration en pourcentage massique : 37.5%
Densité : d=1.19
Poids moléculaire : 36.47 g/mole
Volume = 1L.
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Calcul de la normalité initiale (Ni)

Pour un acide fort comme le HCl la normalité égale à la molarité

Où

Et

Calcul de la masse de la solution du HCl dans la solution

On a:

donc

On a :

100g de la solution mère 37.5 g du HCl

1190g de la solution mère X g du HCl

5g

Donc il y’a 446.25 g de HCl dans le flacon de 1L

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La molarité du HCL est 12,23 mole/L

Donc

Pour préparer 1 L de HCl 1N

On applique

Le volume de la solution initiale à prélever est :

Dans un Erlenmeyer de 1L, verser 900mL d’eau distillée, ajouter 81.77 mL du HCl de la
solution mère puis compléter à 1000mL pour avoir 1L de HCl 1N.

Préparation du colorant pour l’analyse des mitoses et méioses (qsp pour tout le
groupe):
Le colorant utilisé est le carmin acétique 1%, pour le préparer il faut :

- 1g du carmin caryologique rouge ;

- 45 mL d’acide acétique ;

- 55 mL d’eau distillée.

Mettre tout les produits cités dans un Erlenmeyer, boucher l’Erlenmyer avec du papier
aluminium puis porter à ébullition pendant 10 minutes. Laisser refroidir et filtrer. La solution
est conservée dans un flacon en verre fumé hermétique.
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Préparation du colorant pour l’étude de la fertilité pollinique (qsp pour tout le

groupe):
Le colorant utilisé est le bleu de coton dans le lactophénol, pour le préparer il faut :

- 20 mL d’un mélange de cristaux de phénol (5g de phénol + 20 mL d’eau distillée),

- 20 mL d’acide lactique à 85%,

- 40 mL de glycérine,

- 20 mL d’eau distillée,

- 5 mL d’aniline bleue 1%
Bien mélanger puis conserver dans un flacon en verre fumé.
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TP : 2 La mitose
L’étude de la mitose ainsi que le dénombrement chromosomique peuvent se faire sur toute
cellule apte à se diviser (extrémités racinaires, cambium, apex caulinaires, ébauches de feuilles,
corolle, des boutons floraux, talles, ovules, étamines…etc).
La technique caryologique utilisée est la coloration au carmin acétique. Cette technique
nécessite plusieurs étapes :

Prétraitement :

Cette étape consiste à bloquer les divisions cellulaires au stade métaphase par l’emploi des
substances mitoclasiques comme la colchicine, la 8 hydroxyquinoline, α bromonaphtalène la
paradichlorobenzène, la coumarine b et l’eau glaciale. Ces substances inactivent la formation du
fuseau achromatique et bloquent ainsi la migration des chromosomes vers les pôles.
Des racines d’oignon de 1 à 1.5 cm de long sont placées dans un Becher contenant de l’eau
glaciale pendant 22 à 24 h.

Fixation :

Ces racines sont ensuite fixées pendant 20 mn dans un mélange Acide Acétique Glacial-
Chloroforme- Ethanol (1 : 3 : 6).

Coloration :

Les racines sont transférées dans le carmin acétique à 45 % et soumises pendant 20 mn à une
température de 60 °C au bain marie ou portées à ébullition sur une flamme de bec benzène (ou sur la
plaque chauffante) pendant quelques secondes.

Montage et observation :

Après coloration préparer une lame, poser dessus une racine à l'aide d'une pince. Ensuite
couper la pointe de cette racine par une lame de rasoir en tenant l'autre bout par la pince pour s'en
débarrasser. Couvrir d'une lamelle puis écraser délicatement par simple pression du doigt sur la
lamelle afin de dissocier les files de cellules. L’observation se fait au microscope photonique. Les
cellules en division sont repérées facilement au à l’aide d’un objectif de grossissement (G =10 ou G =
12,5). L’observation des chromosomes est obtenue par un grossissement supérieur, le plus souvent
avec le grossissement (G = 100).

Travail à faire
Recherchez les différents stades de la mitose sous le microscope et dessinez une étape de votre choix.
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TP n°3 : Réalisation d’un caryotype

Ce TP sera réalisé sous forme d’un TD
Le caryotype est une représentation standardisée des chromosomes d’une cellule observés en métaphase
mitotique au microscope. Les chromosomes sont photographiés et ordonnés par paires et classés selon leur taille,
la position relative du centromère (indice centromérique) et la présence éventuelle de constrictions secondaires.

Critères de classification

a- Longueur des chromosomes : dans un caryotype les chromosomes sont classés dans un ordre
décroissant de leur taille.

b- Position du centromère et indice centromérique : dans un caryotype si les chromosomes sont de

même taille, ils sont classés selon un IC décroissant

Schéma d’un chromosome métaphasique

Chromosome métacentrique (A): le centromère divise la chromatide en 2 bras égaux (il est en
position médiane) (IC= 0,5)
Chromosome submétacentrique (B): le centromère est situé entre les deux télomères dans les
proportions 1:4 et 3:4, à mi-chemin entre le chromosome métacentrique et acrocentrique
(0,25<IC<0,5)
Chromosome acrocentrique (C): le centromère divise la chromatide en 2 bras inégaux: un bras
court p, un bras long q (0<IC<0,25). Le chromosome C présente une constriction secondaire et un
satellite
Chromosome télocentrique (D): le centromère se confond avec le télomère (en fait il est très
proche du télomère, mais reste une région différente du télomère et le bras P est tellement réduit
qu'on ne l'observe pas) (IC ≈ 0).

c- la présence de constriction secondaire : dans un caryotype les chromosomes présentant des

constrictions secondaires sont classés à la fin.

Travail à faire : Réalisez les caryotypes correspondant aux plaques métaphasiques suivantes après avoir reporté
toutes les mesures dans un tableau.
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Plaque métaphasique n° 1
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Plaque métaphasique n° 2
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Plaque métaphasique n° 3
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TP 4 : La méiose
Ce TP sera réalisé en deux (2) séances

La méiose est une succession de deux divisions cellulaires chez les Eucaryotes : la division
réductionnelle et la division équationnelle. Elle permet le passage d’une (1) cellule mère à 2n
chromosomes à quatre cellules filles à n chromosomes qui sont à l’origine des cellules sexuelles
(gamètes ou spores). Elle assure ainsi le passage de la phase diploïde à la phase haploïde.

-La division réductionnelle ou méiose I permet la séparation des chromosomes homologues.

Prophase I : c’est la phase la plus longue au cours de laquelle le noyau volumineux de la cellule mère
est encore visible.

Métaphase I : les chromosomes homologues sont bien visibles et sont appariés sur la plaque
équatoriale formant des bivalents.

Anaphase I : les chromosomes homologues se séparent et migrent aux pôles apposés réduisant ainsi le
nombre chromosomique de 2n à n

Télophase I : les chromosomes atteignent les pôles et l’enveloppe nucléaire se reforme ;

- La division équationnelle ou méiose II permet la séparation des deux chromatides sœurs.

Prophase II : Le fuseau achromatique se reforme.

Métaphase II : Les chromosomes individualisés se positionnent sur la plaque équatoriale

Anaphase II : Le centromère de chaque chromosome se divise permettant la migration des deux

chromatides sœurs aux pôles.

Protocole expérimental

Des boutons floraux très jeunes sont prélevés et fixés immédiatement dans des tubes à essai
contenant un fixateur. Ensuite, ils sont placés dans un verre de montre contenant du carmin acétique
bouillant. Après 20 mn les anthères sont prélevées après dissection des fleurs et écrasées dans une
goutte d’acide acétique entre lame et lamelle.

Travail à faire
1ière séance : Recherchez les différents stades de la méiose sous le microscope et dessinez une étape de
votre choix.

2ième séance : Recherchez les différentes anomalies méiotiques sous le microscope et dessinez une de
votre choix.
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TP 6 : La fertilité pollinique

L’étude de la fertilité pollinique est réalisée sur des fleurs matures avant anthèse. La
technique utilisée est inspirée du protocole de Mertens and Hammersmith (1998) qui consiste
à réaliser une coloration au bleu de coton.

La préparation du pollen pour la coloration se fait comme suit :

 Disséquer les anthères sous la loupe dans une petite goutte d’eau afin de libérer le
pollen.

 Laisser sécher puis ajouter une goutte de colorant.

 Laisser colorer quelques minutes puis passer à l’observation au microscope entre lame
et lamelle.

 Compter entre 400-500 grains de pollen par fleur puis calculer le taux de fertilité
pollinique. La formule suivante permet de calculer le taux de fertilité.

 Les grains de pollen colorés uniformément d’un bleu foncé sont considérés comme
viables.

 Les grains de pollen de forme et de taille anormales, plasmolysés et non colorés

uniformément sont considérés comme non viables.

Taux de fertilité pollinique est calculé selon la formule suivante :

𝑵
𝑻𝑭(%) = x 100
(𝑵+𝑨𝑵)

Sachant que :
TF: taux de fertilité pollinique (en %).
N: nombres de grains de pollen normaux (fertiles).
AN: nombres de grain de pollen anormaux (stériles).

Travail à faire :

Evaluer la viabilité pollinique deux populations différentes puis faire une comparaison.
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TP 7 : Extraction d’ADN génomique de l’oignon

Matériel nécessaire

- Oignon
- Ethanol 90° (l’alcool précipite l’ADN)
- Liquide vaisselle (détergent, dissout les lipides membranaires et libère l’ADN))
- Solution de NaCl saturée (40g/100mL, NaCl précipite les protéines associées à
l’ADN)
- Vert de méthyle acétique (colorant spécifique de l’ADN)
- Mortier et pilon
- Tubes à essai et porte tubes
- Pipette
- Centrifugeuse
- Balance

Procédure à suivre

- Mélanger 5mL de solution salée avec 2mL de détergent dans un tube à essai
- Dans un mortier, broyer un oignon émincé à l’aide d’un pilon (broyage mécanique)
- Ajouter la solution détergent-eau salée et continuer à broyer
- Centrifuger à 5000t/mn après avoir équilibré les tubes
- Récupérer le surnageant contenant l’ADN dans un tube à essai
- Pour précipiter l’ADN, verser lentement sur les parois du tube penché environ
30mL (volume d’alcool à volume d’extrait).
- Récupérer la pelote blanchâtre d’ADN qui devient visible entre les deux liquides du
tube
- Colorer au vert de méthyle acétique.
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TD n° 2 de cytogénétique

Exercice 1 :

La framboise européenne (Rubus idaeus) possède 14 chromosomes. La mûre (Rubus caesius)

est un tétraploide avec 28 chromosomes avec 28 chromosomes. Les hybrides F1 entre ces
deux espèces sont stériles. Certains gamètes de la F1 n’ayant pas subi la réduction
chromatique sont fonctionnels en backcross. Déterminez le nombre de chromosomes et le
niveau de ploïdie pour chacun des cas suivants :
a/ F1
b/ backcross F1 X Rubus idaeus
c/ backcross F1 X Rubus caesius
d/ F1 dont le nombre de chromosomes a été double

Exercice 2 :

Soit une inversion péricentrique hétérozygote avec un chromosome dont l’ordre normal

(1234●5678) et (125●43678) où (●) est le centromère. Schématisez l’anaphase I après un

crossing-over dans la région 3-4.