MIB 3086 : Génétique microbienne

Objectif : La génétique microbienne a pour objet l’étude du génome

des micro-organismes (virus, bactéries et champignons
microscopiques).
Il s’agit d’étudier la structure et l’organisation des génomes de
chacune des catégories de microorganismes ; leurs variation
génotypiques, ainsi que l’expression et la régulation des gènes.
Profil : Etudiants des filières sciences biologiques ayant des bases
de microbiologie générale.

Programme
Structure des acides nucléiques,
Organisation des génomes microbiens (chromosomes; plasmides ;
éléments mobiles),
Mutations et mécanismes de réparation de l’ADN endommagé,
Transfert génétiques chez les bactéries,
Réplication des génomes microbiens (Chromosomes, génomes extra
chromosomiques, modèle du cercle roulant),
Expression génétique,
Modèles de régulation de l’expression des gènes chez les bactéries
et les virus.

Compétences attendues : être capable de décrire les éléments

mobiles et extrachromosomiques des génomes microbiens. Il doit
etre capable d’expliquer les mécanismes d’expression et de
régulation des gènes chez les procaryotes.

Mots clés : génome, bactéries, virus, plasmide, transposon et

intégrons

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CHAPITRE I : STRUCTURES ET PROPRIETES DES MONOMERES
DES ACIDES NUCLEIQUES

1-Composants des acides nucléiques

Les molécules biologiques qui contiennent l’information génétique sont
les acides nucléiques. Ils sont composés de molécules simples comme
l’acide phosphorique (PO4H3, fig.1a), des oses à 5 carbones (pentoses,
fig.1b) et des bases azotées (purines ou pyrimidines, fig.1c).

Phosphates

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Les Sucres

Les bases azotées

Bases puriques

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Bases pyrimidiques

Figure : Composants des Acides nucléiques

2- Nucléoside et Nucléotide
La liaison d’une base azotée avec un des sucres donne un nucléoside.
Un nucléoside est donc formé d’une base et d’un sucre liés par une
liaison N-osidique.
La liaison d’un nucléoside avec un phosphate se fait par une estérification
de la fonction alcool primaire (carbone n°5’) du sucre et une des trois
fonctions acides du phosphate. L’ester obtenu est un nucléotide. Un
nucléotide est donc formé d’une base azotée, liée par une liaison osidique
avec un sucre, lui-même lié par une liaison ester avec un phosphate.

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Les acides nucléiques sont formés par une polycondensation de
nucléotides AMP, CMP, GMP et UMP pour les acides ribonucléiques,
dAMP, dCMP, dGMP et dTMP pour les acides désoxyribonucléiques

Par convention un nucléotide porte le nom de la base constitutive et est

désigné par l’initiale de leur nom. Exemple l’Adénosine triphosphate
s’appelle par convention l’adénine symbole : A.

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Tableau : Nucléoside et Nucléotide.

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3-Hybridation des nucléotides

Lorsqu’un acide nucléique est en solution les molécules forment des

liaisons hydrogènes associant les nucléotides deux par deux, de sorte
qu’un nucléotide à adénine se lie avec un nucléotide à thymine (ou à
uracile dans un RNA, par deux liaisons hydrogènes et un nucléotide à
guanine avec un nucléotide à cytosine par 3 liaisons hydrogènes.

Figure : Hybridation des nucléotides

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CHAPITRE II STRUCTURE ET PROPRIETE DES ACIDES
NUCLEIQUES

Dans la nature il existe deux types d’acides nucléiques, l’acide

ribonucléique (ARN) et l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ce sont des
polymères de nucléotides, on les appelle par conséquent des
polynucléotides.
Pour former un acide nucléique, les nucléotides (GMP, AMP, TMP, CMP),
sont condensés les uns sur les autres avec des liaisons phospho-diester
entre le carbone 3’ d’un premier nucléotide et le carbone 5’ du nucléotide
suivant. De sorte que ces liaisons définissent un sens à la molécule : le
début étant le nucléotide dont le phosphate en 5’ ne serait lié à aucun
autre nucléotide et la fin correspond au nucléotide dont la fonction alcool
en 3’ n’est pas estérifiée. Cette séquence nucléotidique d’un acide
nucléique se nomme structure primaire.

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1-L’Acide ribonucléique L’ARN

Il se distingue de l’ADN par plusieurs caractères : Il contient le ribose à la

place du désoxyribose et l’uracile a la place de la thymine comme bases
azotées. Il s’agit de molécules monocaténaires formées d’une simple
chaine de nucléotides ou d’un seul brin nucléotidique. Certaines bases
peuvent établir entre elles des liaisons intramoléculaires formant ainsi une
structure secondaire (figure). On distingue plusieurs types d’ARN : les
ARN ribosomiques, les ARN de transfert, les petits ARN nucléaires
(SnRNA), les ARN messagers.

FIGURE : Structure secondaire du l’ARN

2- L’acide Désoxyribonucléique (L’ADN)

Structure primaire
Les molécules d’acide désoxyribonucléiques sont formées de deux
chaînes (molécule bicaténaire) appariées deux à deux sur toute la
longueur. Chacun des deux brins est orienté (5’→3’) dans le sens opposé

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à celui de l’autre brin (3’→5’). On dit qu’ils sont antiparallèles. Les bases
azotées sont tournées vers l’intérieur de la double hélice de façon à ce
que chacune s’hybride avec une base de l’autre brin (A avec T, C avec G,
etc..). On dit que les bases successives de chacun des brins sont
complémentaires. Les nucléotides sont maintenues appariées grâce à des
liaisons hydrogènes ; 2 liaisons entre A et T, et 3 liaisons entre G et C. La
chaleur peut dissocier les deux chaînes c’est la fusion, les deux chaînes
peuvent ensuite se réassocier si on abaisse la température. La
température de fusion d’un fragment d’ADN riche en paires G-C est plus
élevée que celle d’un fragment riche en AT.

FIGURE : Structure Primaire de L’ADN

Structure Secondaire
La structure secondaire du DNA est telle que les deux brins sont enroulés
l’un autour de l’autre (figure). La double hélice a un « pas » de 3,4 nm c’est
à dire qu’il y a environ 10 paires de nucléotides pour chaque tour d’hélice.

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FIGURE : LA DOUBLE HELICE D’ADN
3- Organisation du Matériel génétique bactérien

La composition génomique de nombreuses bactéries peut consister en

deux composantes, à savoir un chromosome qui porte des gènes pour
toutes les fonctions essentielles et leur régulation, et une composante
extra- chromosomique mais « autonome » : plasmide initialement identifié
pour réaliser les fonctions requises pour sa propre réplication, son
maintien et sa distribution.

3-1- Le chromosome bactérien

Il est constitué d'acide désoxyribonucléique (ADN) dont les
caractéristiques structurales sont bien connues. L'ADN bactérien est
circulaire (nucléoide) Contient entre 1 000 000 et 4 500 000 paires de
bases, 800 et 4300 gènes, 0.1% du génome humain ; il peut exister sous
trois formes (super-enroulée, relâchée, linéaire) objectivées par plusieurs
techniques telle l'ultracentrifugation, la microscopie électronique ou tout
simplement l'électrophorèse en gel d'agarose (fig.5). Les deux chaines ou
alpha hélices sont maintenues entre elles (A-T, C-G) par les deux ou trois
liaisons "hydrogène". Le chauffage permet leur séparation en brins
monocaténaires = fusion ou dénaturation. Cette séparation est réversible
(renaturation ou hybridation) selon le principe de la complémentarité des
bases (A-T, C-G). Lors de la séparation, il y a augmentation de la DO à
260 nm (effet hyper-chromique), et celle-ci est fonction du nombre de
paires GC. Il est possible de calculer un paramètre quantitatif (Tm). Ainsi

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la détermination du GC% est un critère taxonomique ou de classification
des bactéries qui peut être calculé selon l'espèce bactérienne (fig.6). Il
peut varier largement selon les groupes bactériens.

Figure : Profils plasmidiques de cellules traitées et de type sauvages.

Piste 1, 2, 3 - E. coli 212587 traitée par l'acridine orange (75μg / ml), piste
4, 5 - E. Coli 208366 traitée par le bromure d'éthidium (125 pg / ml), Piste
6 - E. coli 212587, piste 7 E. coli 208366 et piste 8 E. coli PDK-9 marqueur
de taille.
Le nucléoïde très condensé se trouve dans un pseudo compartiment qui
se caractérise par l'absence de ribosomes. Certains brins d'ADN
s’étendent vers l'extérieur dans le cytoplasme comme une «boule
de fils serrés. Ces extensions contiennent la majeure partie de l'ADN
transcriptionnellement actif. Le chromosome est apparu comme une
structure fortement repliée contenant presque tout l'ADN cellulaire,
certaines protéines et ARN naissant. Les images de microscopie
électronique du chromosome d’E. coli a révélé un noyau central à partir
duquel 12400 boucles indépendantes (domaines de surenroulement,
fig.7) ont été observées. La structure entière est apparue comme une
rosette ininterrompue. Cette organisation est sensible à la RNase,

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suggérant que l'ARN est impliqué dans le maintien de l'intégrité de la
structure de base (Tous les domaines possèdent le même niveau de
surenroulement).
Toutefois l’entaille de l’un des brins abolit le surenroulement dans ce
domaine particulier uniquement, en laissant le reste du chromosome non
affecté. Le chromosome est logé dans un petit espace à l'intérieur de la
cellule ce qui nécessite son repliement. Un nuage d'ADN enroulé est
généré au hasard avec un diamètre de 10 μm dans une bactérie, tel qu’E.
coli. Sa subdivision en plusieurs boucles indépendantes de 10 kb donne
un autre niveau de compactage. C’est le surenroulement négatif des
boucles par l’ADN topoisomérase qui réduit encore le diamètre du
chromosome replié. Celle-ci empêche les brins de s’entremêler.
Le DNA a besoin d’être protégé par des protéines lorsqu’il n’est pas utilisé
comme modèle pour l’expression des gènes ou la réplication. Cette
protection se fait chez les eucaryotes par enroulement
autour de protéines basiques (cationiques) capables de se lier avec le
DNA qui est un polyanion. Des octamères d’histones sont au centre de
particules qu’on trouve tous les 200 nucléotides et autour desquels le DNA
s’enroule. La structure évoque un « collier de perles ».

FIGURE : Le Nucléosome chez les eucaryotes

Des études récentes ont montré que les différentes régions de l’ADN
bactérien ne sont pas seulement interconnectés mais aussi organisé dans
l'espace par en un complexe de maintenance de la structure (SMC). Ce
SMC serre et maintient le chromosome dans un état compatible avec la

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réplication et la ségrégation de l'ADN. Cependant, un des plus important
composants pour la condensation de l'ADN bactérien est un groupe de
protéines, qui peuvent modifier sa forme (compactage) et influencent ainsi
sa transcription. Les NAP '' protéines associées au nucléoïde ''
Elles sont nombreuses et possèdent une activité de liaison à l'ADN et une
capacité à modifier la trajectoire de la molécule d'ADN dans la cellule par
pliage, emballage, ou pontage; mais aussi influent positivement ou
négativement sur la transcription.

Complexe de transcription polymérase au promoteur

H-NS
Fis
Complexe de l'ARN.

Figure : Représentation schématique d'un chromosome super-enroulé

avec les protéines associés au nucléoïde (NAP).
(i) Certaines ont une propriété de marquage du début et de la fin d'un
domaine chromosomique. Les protéines dotées d’activité de pontage
d'ADN sont les plus aptes à la réalisation d'une telle fonction. C’est le cas
de la H-NS (histone-like-nucleoid) protéine qui se lie à des régions riches
en A-T dans le génome de E. coli et Salmonella enterica, sur des sites
coïncidant avec les extrémités d’un domaine donné.
(ii) Fis: '' facteur de stimulation de l'inversion, est une protéine abondante
au début de la phase exponentielle de croissance, pour former des ponts
ADN-protéine-ADN. Les sites de liaison potentiels pour Fis, sont
constitués d'une séquence consensus, de 17 pb riches en AT. Fis se lie à
ces sites en tant qu’homodimère et (introduit) des coudes dans l'ADN. Ces

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protéines contribuent à de nombreuses activités cellulaires, tels que la
transcription, la réplication et la recombinaison.
(iii) HU, une autre classe de NAP, constituée de deux sous-unités HUα et
HUẞ. Les interactions HU-DNA ne sont pas spécifiques, mais la protéine
a une préférence pour les régions déformées de l'ADN, tels: les
repliements ou les jonctions à quatre voies. HU joue un rôle important
dans la recombinaison, la topologie de l'ADN et la gestion de l'expression
génique. Cette protéine interagit avec la topoisomérase I qui peut conduire
à une altération dans de superhelicité de l'ADN, et peut être impliqué à la
fois dans la structure du nucléoïde et l’expression des gènes. Elle forme
des multimères octamérique ayant le potentiel de former des filaments en
spirale autour desquels L'ADN est surenroulé négativement. Enfin, HU
contribue aussi à la flexibilité de l’ADN en courbant le duplex, pour faciliter
la formation de la boucle d'ADN.
(iv) Le facteur d'intégration de l'hôte (IHF), initialement identifié comme
cofacteur dans la recombinaison à site spécifique du phage ʎ. Cette
protéine est étroitement liée à HU du point de vue séquence d'acides
aminés, mais se lie à une séquence nucléotidique bien conservée. Sa
liaison au site introduit un demi-tour dans l'ADN, et aide dans le
remodelage de l'ADN à un niveau local. IHF influence la transcription
globale, la réplication du chromosome, et sert en tant qu'élément du site-
spécifique du système de recombinaison, affectant ainsi la transposition.
Le nucléoide compact occupe le centre de la cellule procaryote, avec les
ARN polymérases (RNAPs) sur sa périphérie, et les ribosomes refoulés
vers les bords où ils interagissent avec la membrane plasmique intérieure.
Le degré de condensation dépend également de la phase de croissance,
avec le plus haut niveau de compactage pendant une croissance rapide,
par rapport à une croissance sous des conditions limitantes. A l'état
primaire, RNAP sont concentrés dans les foyers de la transcription, alors
que sous croissance réduite elles sont réparties dans le chromosome.
Ceci suggère qu'une corrélation étroite existe entre la structure du
nucléoïde et l'organisation du génome. Cela se produit
par l'intermédiaire de la distribution de gènes hautement exprimés et dont
la transcription affecterait le surenroulement.

3-2- Les plasmides

Les bactéries contiennent souvent un ou plusieurs plasmides, qui sont des
molécules d’ADN extra-chromosomique. Ces plasmides peuvent conférer
certains avantages aux bactéries, comme la résistance à des antibiotiques
ou des métaux, ou pour la production d’antibiotiques, de pigments, ou peut
fournir des capacités cataboliques inhabituelles comme des facteurs de
virulence (toxines), fertilité, etc. Ils peuvent également induire des tumeurs

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végétales, et d'autres réponses symbiotiques et pathogènes chez les
plantes et les animaux.
Parfois, les bactéries peuvent partager les plasmides avec différentes
espèces bactériennes (transfert horizontal de gènes). Ces plasmides sont
dits conjugatifs (permettent la conjugaison), sont généralement grands et
ont en plus des gènes nécessaires pour la réplication autonome des
gènes de transfert d’ADN au receveur (ex : gènes du pilus sexuel : F).
Mais peuvent être non-conjugatifs (ne peuvent pas médier la
conjugaison), sont généralement plus petits et il leur manque un ou
plusieurs gènes nécessaires au transfert d’ADN.
Les Plasmides ont souvent été assimilés avec des organismes Ainsi, un
organisme '' est l'élément unitaire d'une lignée continue avec histoire de
l'évolution individuelle ''. Cette définition s’applique aussi pour les virus, et
certains transposons, qui appartiennent tous à une famille d'organismes
primitifs. La caractéristique commune entre ces unités est leur réplication,
leur maintenance et leur diffusion. Les plasmides se répliquent
indépendamment du chromosome. Les Plasmides ont ainsi joué un rôle
significatif dans l'évolution bactérienne ; en effet une cellule
contenant le plasmide peut avoir un avantage adaptatif sur celles sans
plasmide. Au cours des dernières années, leur signification a
considérablement augmenté en raison de leur application dans la
recherche en génie- génétique en tant que porteur de la molécule
étrangère (recombinant ADN). Une cellule bactérienne peut ou non
comporter un ou plusieurs copies d'un même type de plasmide ou des
plasmides différents.
La plupart des plasmides sont des fragments d'ADN fermés de manière
covalente circulaire (ccc), dont la taille varie de quelques milliers à des
centaines de milliers de paires de bases. Ceux-ci se trouvent dans une
cellule surenroulé négativement. Sont appelés épisomes. Le caractère
distinctif, la nature de réplication autonome suggère qu'un plasmide peut
être essentiellement assimilé à un réplicon et doit coder pour une partie
ou plusieurs fonctions requises pour sa réplication. Pour être
autonome, ils doivent avoir au moins une origine de réplication (Ori), un
site en cis, et code également pour des protéines spécifiques nécessaires
à la reconnaissance du site ori et l'initiation de la réplication. Le gène rep
porté par le plasmide, code une protéine (Rep) spécifique de l’initiation de
la réplication agissant en trans. Dans certains plasmides linéaires, comme
chez Borrelia burgdorferi, les extrémités peuvent porter
des séquences de télomères-like, ces extrémités de l'ADN peuvent être
répétées et peut même être jointe de manière covalente les unes aux
autres. De même, chez Streptomyces, les extrémités plasmidiques
peuvent être liées à une protéine.

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4-Éléments génétiques mobiles à l’intérieur d’une Bactérie

Transposon ou élément transposable

C’est une séquence d’ADN capable de se déplacer et de se multiplier de
manière autonome dans un génome et qui permet également au gène de
sauter d’une position chromosomique à une position plasmidique.

Intégrons
Ce sont des éléments génétiques retrouvés exclusivement chez les
bactéries Ils constituent un système naturel de capture, d'expression et de
dissémination des déterminants de résistances aux antibiotiques, le plus
souvent portés par des plasmides ou des transposons. C’est donc une
structure qui permet à des gènes de s’intégrer et de s’exprimer.
La présence d’un intégrons dans un transposon est un mécanisme
fréquent.

5- Matériel génétique viral

A la différence des génomes de toutes les cellules, qui sont composé

d'ADN, les génomes de virus peuvent être codée dans l'ADN ou l'ARN. Le
génome peut être simple ou double brin; comme il peut être linéaire,
circulaire, ou segmenté. Les virus simple brin peuvent être soit de sens
positif (+) (même polarité que la séquence nucléotidique de l’ARNm), sens
négatif (-), ou ambisens (un mélange des deux) génomes. Les Virus
varient en taille environ 3500 nucléotides (les bactériophages de la
famille Leviviridae, comme MS2 et Qb) à environ 1,2 million de pb (Nt
2.400.000), comme le Mimivirus: plus grand que le plus petit génome
bactérien (mycoplasme).

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