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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2011, 150(1-4), 19-30

ACTIVITÉ ANTIFONGIQUE D’EXTRAITS DE

CERATONIA SILIQUA SUR LA CROISSANCE
IN VITRO DE PENICILLIUM DIGITATUM (*)

Fatiha FADEL (1), Bouchra CHEBLI (1), Saida TAHROUCH (2),

Abdelaziz BENDDOU (1), Abdelhakim HATIMI (2)

Les feuilles, pulpe et graines de Ceratonia siliqua, ont été

extraites par divers solvants : éther de pétrole, hexane,
chloroforme, méthanol, méthanol 80 % et eau distillée. L’huile des
graines renferme essentiellement les acides linoléique (45,0),
oléique (33,7) et palmitique (14,8 %). Les différents extraits ont
été testés in vitro sur la croissance mycélienne de Penicillium
digitatum. Les extraits par le chloroforme, l’hexane et l’éther de
pétrole présentent une inhibition voisine. Les extraits à 25 mg/ml
méthanolique des feuilles (100 %) et aqueux des graines (88 %)
sont les plus efficaces.

(*) Manuscrit reçu le 08 mai 2010.

(1) Laboratoire de Génie des Procédés de l’Énergie et de l’Environnement, École
Nationale des Sciences Appliquées, Université Ibn Zohr, BP 1136/S Agadir,
Maroc. [email protected], [email protected], Bendou@ensa-
agadir.ac.ma
2) Laboratoire de Biotechnologie Végétale, Département de Biologie, Faculté des
Sciences, Université Ibn Zohr, BP 8106-Dahkla, Agadir, Maroc.
[email protected], [email protected]
 20

INTRODUCTION

La rareté des ressources en eau et la succession des années de

sécheresse inhibent le développement du secteur agricole au Maroc.
Cependant, parmi les ressources naturelles, les plantes médicinales et
aromatiques s’avèrent être un marché lucratif et générateur de revenus [10].
Le Caroubier est important socio-économiquement et adapté aux conditions
édapho-climatiques difficiles du sud Marocain. Il est connu par son activité
antibactérienne et cytotoxique [11].
La région du Souss-Massa-Drâa est une zone essentiellement rurale à
intense activité primeuriste. Son économie est basée sur plusieurs variétés
d'agrumes qui sont exposés aux attaques de champignons phytopathogènes,
notamment Penicillium digitatum. Pour prévenir et empêcher le
développement de ce champignon, seuls les fongicides chimiques sont
employés actuellement. Cependant, ces produits sont préjudiciables sur
l’environnement et la santé par la persistance de résidus sur les fruits [3],
l’apparition de formes résistantes [2] et l'accumulation de fongicides dans le
tissu adipeux humain [18]. Le consommateur exige de plus en plus des
aliments exempts de produits chimiques. D’où la nécessité de trouver des
méthodes alternatives. Dans ce contexte, les extraits de Ceratonia siliqua
pourraient contrôler Penicillium digitatum en post-récolte. Aussi l’effet
antifongique de C. siliqua a été testé en utilisant plusieurs solvants
d’extraction de différentes polarités.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Matériel végétal
Les feuilles et les fruits de Caroubiers adultes ont été récoltés sur une
dizaine d’arbres le matin en juillet 2007 à Taliouine, dans la province de
Taroudant, de la région de Souss-Massa-Drâa au Maroc. Ils ont été ensuite
séchés à l’ombre, à température ambiante et conservés à l’abri de l’humidité
et de la lumière jusqu’à leur utilisation en janvier 2008. Les fruits secs ont
été concassés manuellement pour séparer la pulpe des graines.
 21

Extractions
Les feuilles, la pulpe et les graines ont été broyées finement à
2000 tours/min dans un broyeur électrique IKA-Universalmühle M20. Les
poudres passées sur un tamis de 250 µm.
100 g de chaque partie ont été extraits avec quatre solvants (éther de
pétrole, hexane, chloroforme et méthanol) en utilisant un Soxhlet pendant
12 h à 40, 65, 60 et 64°C respectivement et à l’abri de la lumière. Les
extraits obtenus ont été concentrés à sec par évaporation rotative.
10 g de chaque partie additionnés de 100 ml de méthanol 80 % ont
subi une agitation magnétique de 15 min, une sonication de 15 min et une
filtration sur papier Wathman n°4 [19]. Le filtrat est concentré par
évaporation rotative jusqu’à élimination du méthanol.
10 g de chaque partie ont été suspendus dans 100 ml d’eau distillée
sous agitation magnétique pendant 18 h à température ambiante à l’abri de
la lumière. Les solutions ont ensuite été centrifugées 30 min à 5000 rpm
[16]. Le surnageant obtenu a été testé pour son activité antifongique.

Analyse de l’huile grasse des graines

Pour la détermination de la composition en acides gras, 1 µl d’extrait
éthéré des graines a été analysé à l’aide d’un chromatographe en phase
gazeuse Agilent 6890 avec détecteur FID. Les températures de l’injecteur,
du four pour colonne et du détecteur FID ont été respectivement 220, 175 et
220°C. La colonne capillaire utilisée, de type HP5 Innowax, a une longueur
de 30 mètres et un diamètre interne de 320 µm. L’expérience est répétée
trois fois avec une injection par extrait.

Test antifongique
L’activité antifongique des extraits a été testée in vitro sur
Penicillium digitatum, isolé à partir des fruits de clémentine infectés (Citrus
clementina hort. ex Tanaka) et identifié au laboratoire d’Ingénierie des
Procédés de l’Énergie et de l’Environnement de l’ENSA d’Agadir. Ce
champignon a été choisi pour les dégâts considérables qu’il cause aux fruits
d’agrumes en post-récolte dans la région de Souss-Massa-Drâa.
La technique utilisée est la méthode d'incorporation en milieu solide.
Les extraits des feuilles, pulpe et graines obtenus par Soxhlet puis
concentrés à sec par évaporation rotative ont été dissous dans une solution
aqueuse de 2 % de Tween 80. La dissolution a été incomplète pour l’extrait
méthanolique qui a été agité avant utilisation.
Au milieu PDA (gélose glucosée à l’extrait de pomme de terre),
stérilisé 20 min à 120°C, on a ajouté les extraits de manière à obtenir des
 22

concentrations finales de 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 1500 et 2000 ppm
pour les extraits par Soxhlet [5].
Pour l’extrait méthanolique à 80 %, le résidu aqueux après
élimination complète du méthanol par évaporation rotative est additionné
d’eau distillée de manière à correspondre à une solution mère à 10 g de
poudre / 100 ml d’eau distillée.
En ce qui concerne les extraits aqueux, le surnageant est considéré
comme correspondant à une solution mère à 10 g /100 ml d’eau distillée.
Une gamme de concentrations de 1 à 25 g/l des extraits
méthanoliques à 80 % et aqueux a été préparée à partir des solutions mères
et utilisée pour le test d’efficacité antifongique.
Le pourcentage d'inhibition de la croissance mycélienne du
champignon a été calculé en utilisant la formule suivante [13] :
PI = T − E x 100
T
T : diamètre moyen de la croissance du champignon sur milieu
témoin,
E : diamètre moyen de la croissance du champignon en présence de
l’extrait à tester.
15 ml de solution PDA active (milieu additionné d’extraits) ont été
coulés dans trois boites de Petri de 90 mm de diamètre par concentration et
par extrait avec trois répétitions.
L’analyse statistique a été effectuée en utilisant le test t pour
échantillons indépendants par groupe par le logiciel Statistica 6 au seuil de
0,05.

RÉSULTATS

Le rendement des graines du Caroubier en huile extraite à l’éther de

pétrole par Soxhlet est de 2,1 %. L’analyse par chromatographie en phase
gazeuse permet d’identifier douze acides gras (Tableau I, Figure 1).
L'acide linoléique est le principal acide gras (45,05 %), suivi par les
acides oléique (33,66), palmitique (14,84 %) et stéarique (3,5 %). Les autres
acides gras sont représentés par des pourcentages faibles (< 1 %). L’huile
contient 80,53 % d’acide gras insaturés dont 34,42 % de mono-insaturés,
46,11 % de polyinsaturés et 19 % d’acides gras saturés.
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Tableau I : Pourcentage des acides gras des graines du Caroubier de

Souss-Massa-Drâa.
Acide gras Pourcentage
myristique C14:0 0,09
pentadécanoïque C15:0 0,08
palmitique C16:0 14,84
palmitoléïque C16:1 0,36
margarique C17:0 0,12
heptadécénoïque C17:1 0,05
stéarique C18:0 3,50
oléïque C18:1 33,66
linoléïque C18:2 45,05
linolénique C18:3 1,06
arachidique C20:0 0,38
gondoïque C20:1 0,34

Fig. 1 : Chromatographe en phase gazeuse à 175°C constants de l’huile de

graines de Caroubier de Souss-Massa-Drâa.
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Les extraits par Soxhlet ont un effet inhibiteur sur la croissance

mycélienne de P. digitatum variable d’un organe à l’autre. Les extraits des
feuilles présentent le taux d’inhibition le plus important quel que soit le
solvant utilisé (Figure 2). Il atteint à 2000 ppm 36 % pour l’éther de pétrole
et l’hexane et 42 % pour le chloroforme. L’extrait des graines à 2000 ppm
arrive à 30,54 % pour l’éther de pétrole, 30,11 pour l’hexane et 35 % pour le
chloroforme. Les extraits de pulpe atteignent 26 % pour l’éther de pétrole,
25,5 pour l’hexane et 28 % pour le chloroforme. L’extrait méthanolique n’a
pas d’effet antifongique sur la croissance mycélienne de P. digitatum pour
tous les organes étudiés.

Fig. 2 : Pourcentage d’inhibition de la croissance mycélienne de

Penicillium digitatum en fonction de la concentration (ppm) des extraits en
utilisant comme solvant l’éther de pétrole, l’hexane, le chloroforme et le
méthanol.
 25

L’extrait par le méthanol à 80 % des feuilles inhibe significativement

la croissance mycélienne à partir de 3,125 mg/ml (Tableau II).
L’extrait par le méthanol à 80 % des feuilles donne une inhibition
totale à 25 mg/ml et d’environ 60 % à 3,125 mg/ml. Les extraits des graines
et de pulpe ne dépassent pas 60 % d’inhibition à 25 mg/ml.

Tableau II :
Pourcentage d’inhibition in vitro de la croissance mycélienne de
Penicillium digitatum par des extraits de feuille, graine et pulpe du
Caroubier à six concentrations.
mg/ml
Extrait Organe 1 1,563 3,125 6,25 12,5 25

feuilles 37,7a 43,5a 59,1a 76,5a 89,4a 100,0a

méthanolique à 80 % graines 30,6a 32,9a 35,3b 41,2b 43,5b 52,9b
pulpe 37,7a 38,8a 41,2b 44,1b 47,1b 55,3b
feuilles 23,5b 37,7b 49,8b 70,6a 75,3a 85,9a
aqueux graines 61,8a 65,1a 67,9a 71,4a 74,1a 88,2a
pulpe 60,0a 64,7a 67,1a 69,4a 70,9a 82,9a

Pour un même extrait et une même concentration, les colonnes dont les valeurs sont suivies
de la même lettre ne présentent pas de différence significative à 5 %.

L’extrait aqueux est significativement plus faible de 1 à 3,125 mg/ml

pour les feuilles et ne présente aucune différence significative entre les
organes à partir de 6,25 mg/ml (Tableau II).
L’extrait aqueux des feuilles ne présente un taux supérieur ou égal à
50 % qu’à partir de 3,125 mg/ml. Les extraits aqueux des graines et de la
pulpe du Caroubier présentent un pourcentage d’inhibition de la croissance
mycélienne supérieur à 60 % pour toutes les concentrations testées. À
25 mg/ml, l’inhibition dépasse 82 %.
 26

La différence est hautement significative entre les pourcentages

d’inhibition des extraits méthanolique à 80 % et aqueux pour un même
organe et une même concentration à partir de 6,25 mg/ml (Tableau III).
Tableau III :
Comparaison des effets inhibiteurs entre l’extraction aqueuse et
l’extraction par le méthanol 80 % sur la croissance mycélienne de
Penicillium digitatum.
mg/ml
1 1,563 3,125 6,25 12,5 25

Feuilles NS NS NS ** *** ***

Graines *** *** *** *** *** ***

Pulpe *** *** *** *** *** ***

Niveau de signification : NS = non significatif ; * = P<0,05 ; ** = P<0,01 ; *** = P<0,001

DISCUSSION ET CONCLUSION

Le rendement en huile des graines du Caroubier est de 2,1 %. Les

pourcentages en acides de l’huile du Caroubier de Souss-Massa-Drâa sont
en accord avec ceux trouvés par Aubin Dakia et al. [1] sur des graines de
Malaga en Espagne : linoléique (44,5 contre 45,0 %), oléique (34,4 contre
33,7 %), palmitique (16,2 contre 14,8 %), stéarique (3,4 contre 3,5 %). Une
composition relativement similaire a été trouvée dans les huiles de graines
de Caroubier de diverses origines [9,14]. Rendina et al. [17] ont trouvé que
les graines sont riches en acides gras insaturés (75,94 %) alors que la pulpe
du fruit présente autant d’acides gras saturés que d’insaturés. Les acides
gras les plus importants des feuilles et du tronc des jeunes arbres du
Caroubier sont les acides palmitique, stéarique, oléique, linoléique et
linolénique alors que l'acide arachidique a été détecté seulement dans l’huile
du tronc [7].
L’huile des graines du Caroubier a présenté 30,5 % d’inhibition de la
croissance mycélienne de Penicillium digitatum. Cette activité pourrait être
due à l’acide oléique. En effet, cet acide gras exerce une action fongistatique
 27

sur les dermatophytes tels Trichophyton rubrum et Epidermophyton

floccosum de 150 à 200 mg/ml [15].
L’extrait des feuilles par le méthanol 80 % a entrainé une inhibition
totale de la croissance mycélienne à 25 mg/ml. Cette inhibition dépasse
59 % à partir de 3,125 mg/ml. Ceci est probablement dû à la richesse des
feuilles du Caroubier en flavonoïdes (2,87 ± 1,02 mg/g de matière sèche)
[8,16].
Les extraits aqueux des graines et de pulpe du Caroubier ont un effet
inhibiteur important sur la croissance mycélienne de P. digitatum (>82 %) à
25 mg/ml. Ces organes sont riches en flavonoïdes et en saponines [8,16].
L’inhibition de la croissance mycélienne de P. digitatum peut être due à
l’effet combiné de ces métabolites secondaires. Les saponines peuvent
intervenir dans la défense des plantes contre les attaques fongiques [12,20].
Elles présentent un large spectre d’action en agissant sur la membrane des
champignons [20]. La toxicité des composés phénoliques envers les
champignons est basée sur l’inactivation des enzymes fongiques contenant
le groupement SH dans leur site actif [4,6].
Les extraits de Ceratonia siliqua sont des antifongiques naturels
efficaces qui pourraient être utilisés par l’industrie des fongicides.

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 30

ABSTRACT

Antifungal activity of extracts of Ceratonia siliqua on the in vitro

growth of Penicillium digitatum
Leaves, pulp and seeds of Ceratonia siliqua were extracted by
various solvents: petroleum ether, hexane, chloroform, methanol, methanol
80% and distilled water. The oil of seeds contained mainly linoleic (45.0%),
oleic (33.7%) and palmitic (14.8%) acids. The various extracts were tested
in vitro on the mycelial growth of Penicillium digitatum. Chloroform,
hexane and petroleum ether extracts presented a similar level of inhibition.
Extracts at 25 mg/ml of 80% methanolic leaf extract (100%) and aqueous
seed extract (88%) were the most effective.

Keywords: antifungal activity, Ceratonia siliqua, fatty acids, Penicillium

digitatum.

__________