Hématopoïèse normale et

leucémique
Dr Lucile Couronné

DES Hématologie
1 décembre 2020
 Plan

• Hématopoïèse normale : rappels

• Hématopoïèse normale : nouveaux concepts
• Hématopoïèse leucémique
• Hematopoïèse clonale et CHIP
• Hematopoïèse clonale et hémopathies lymphoïdes
Hématopoïèse normale : rappels
 Hématopoïèse
• Ensemble des mécanismes impliqués assurant la
production constante et régulée des diverses cellules
sanguines à partir de la cellule souche hématopoïétique
• A lieu dans la moelle osseuse
Cellules souches Progéniteurs Précurseurs Cellules matures

1012 cellules par jour

DIFFERENCIATION
PROLIFERATION
 Le système hématopoïétique en « chiffres »
Moelle osseuse Cellules souches

0,0001%

0,01%
Progéniteurs <1%
immatures
=> CSH et progéniteurs sont rares !

Progéniteurs déterminés
0,5 à 1%

99%

Cellules identifiables
morphologiquement

Myéloïdes Lymphoïdes
Hématopoïèse : lieu de production
Hematopoïèse primitive Hematopoïèse définitive

AGM
Hémangioblastes CSH Baron, Blood, 2012

Erythrocytes primitifs Cellules myéloïdes

Mégacaryocytes primitifs Cellules lymphoïdes
Macrophages primitifs

Moelle osseuse = site exclusif de l'hématopoïèse à la

naissance et pour toute la vie
(tous les os jusqu’à 4 ans, puis uniquement les os courts
et plats : sternum, côtes, bassin, crâne, vertèbres)
 Types de cellules souches
• Totipotentes :
Oeuf au stade de pré-compaction (= masse homogène de 4, 8 ou 16
blastomères)
Cellules trophoblastiques + cellules souches embryonnaires

• Pluripotentes = cellules souches embryonnaires (ES)

Masse cellulaire interne (morula / blastocyste) MCI

Cellules souches germinales + cellules souches des 3 feuillets

embryonnaires

• Multi/pauci/unipotentes = cellules souches somatiques ou adultes (AS)

Présentes chez l’embryon et dans les tissus adultes
Tout/partie des cellules issues d’un des trois feuillets embryonnaires
 TOTIPOTENTES

PLURIPOTENTES

MULTIPOTENTES

CELLULES MATURES

Cellule souche hématopoïétique

 Propriétés des CSH

• Définition fonctionnelle :
Auto-renouvellement (maintien du pool de CSH)
Différenciation en cellules spécialisées
Divisions symétriques et asymétriques

Eaves, Blood, 2015

 Niche hématopoïétique

CSH : cellule souche hématopoïétique

CSE : cellule souche endothéliale
CSM : cellule souche mésenchymateuse
MEC : matrice extracellulaire
CAR : CXCL12 abondant reticular cells

• Niche endostéale : maintien des CSH en quiescence, rétention et maintien

du pool
• Niche vasculaire : mobilisation des cellules souches de la niche endostéale
vers la circulation, prolifération et différenciation des CSH
 Régulation

• Facteurs intrinsèques (propres à la cellule) :

Facteurs de transcription
Régulateurs épigénétiques
• Facteurs extrinsèques (micro-environnement de la niche hématopoïétique) :
Interaction directes (cellules-cellules) : couples ligands / récepteurs,
molécules d’adhérence
Interactions indirectes : cytokines, chemokines, hormones, etc..
 Caractérisation des CSH
Caractérisation phénotypique

Progéniteur Progéniteur Précurseur

CSH
Immature Mature Différencié

Différenciation Différenciation Maturation

CD34+ CD34+ CD34+ CD34-

CD38- CD38- CD38+ CD38+
Lin- Lin- Lin± Lin+

Lin = ensemble de marqueurs de lignée (B, T, NK, granulo, mono, neutro, érythro,etc….)

N'expriment pas de marqueurs de cellules différenciées

Mais n'expriment aucun marqueur qui leur soit spécifique !
 Caractéristiques
Caractérisation fonctionnelle
Transplantations xénogéniques
CSH
(SRC= Scid Repopulating Cell)

Cultures à long terme

Progéniteurs immatures (LTC-IC= Long Term Culture-Initiating Cell)

Tests clonogéniques
Progéniteurs matures (CFC= Colony Forming Cell)

Cellules matures identifiables au microscope

 Caractéristiques
Caractérisation fonctionnelle
Transplantations xénogéniques
CSH
(SRC= Scid Repopulating Cell)

Cultures à long terme

Progéniteurs immatures (LTC-IC= Long Term Culture-Initiating Cell)

Tests clonogéniques
Progéniteurs matures (CFC= Colony Forming Cell)

Cellules matures identifiables au microscope

 Tests clonogéniques (CFC)

• Méthylcellulose + cytokines
• Milieu semi-solide => immobilisation : 1 colonie provient
d’une cellule
• Culture pendant 14 jours => colonies => mise en évidence
rétrospective de progéniteurs clonogéniques
 Caractéristiques
Caractérisation fonctionnelle
Transplantations xénogéniques
CSH
(SRC= Scid Repopulating Cell)

Cultures à long terme

Progéniteurs immatures (LTC-IC= Long Term Culture-Initiating Cell)

Tests clonogéniques
Progéniteurs matures (CFC= Colony Forming Cell)

Cellules matures identifiables au microscope

 Cultures à long terme (LTC-IC)

• Co-culture sur cellules stromales puis culture en milieu

semi-solide ave cytokines

Culture en milieu semi-

solide + cytokines
 Caractéristiques
Caractérisation fonctionnelle
Transplantations xénogéniques
CSH
(SRC= Scid Repopulating Cell)

Cultures à long terme

Progéniteurs immatures (LTC-IC= Long Term Culture-Initiating Cell)

Tests clonogéniques
Progéniteurs matures (CFC= Colony Forming Cell)

Cellules matures identifiables au microscope

 Transplantations xénogéniques (SRC)

• Utilisation de modèles de souris immunodéficientes (SCID, NOD-SCID, NSG…)

• Greffe et reconstitution à long terme de tous les lignages hématopoïétiques

10-16 semaines
 En résumé
Immédiat

2 sem

5-12 sem

3-4 mois

cellule souche hématopoïétique

progéniteur hématopoïétique
immature

progéniteur hématopoïétique
engagé

précurseur

cellule mature
Hématopoïèse : modèles de différenciation
1 Modèle classique

Haas, Cell Stem Cell, 2018

• Génération de progéniteurs multipotents (MPP)

• Restriction progressive du potentiel de différentiation avec embranchements
binaires
• Séparation précoce des lignages myéloïde et lymphoïde
• Possible voie directe à partir des HSC pour le lignage mégacaryocytaire
 Modèles alternatifs

2 3

Ceredig, Nat Reviews, 2009

• Progéniteur commun myéloïde et lymphoïde • Perte progressive du potentiel méga-érythro

puis du potentiel granulo-macrophages
• Silencing des gènes myéloïdes = pré-requis
pour l’engagement dans le lignage lymphoïde

Dans tous ces modèles :

• CSH = population homogène
• Chaque stade = état cellulaire stable et figé
Hématopoïèse : « potential » vs « cell fate »

• « Potential » : capacité des CSH à se différencier ou à

s’autorenouveller dans un contexte où elle sont
poussées à s’expandre (expériences de reconstitution
de greffe)

• « Cell fate » : comportement des CSH dans des

conditions physiologiques (approches non invasives in
situ)
Hématopoïèse normale :
nouveaux concepts
 Hématopoïèse : hétérogénéité des CSH
• Déterminants extrinsèques :
Microenvironnement médullaire / niche : cytokines, contact
cellules-cellules, propriétés biochimiques et biophysiques de la
niche (ex: rigidité de la matrice extracellulaire)
Signalisation paracrine et juxtacrine
• Déterminants intrinsèques :
Anomalies génétiques
Anomalies épigénétiques : modifications de la configuration /
accessibilité de la chromatine +++

Haas, Cell Stem Cell, 2018

• Etat cellulaire (cycle) : activité métabolique, transcriptionnelle, taille
de la cellule
Phase G0/ quiescence / faible production de ROS / protection
contre les dommages de l’ADN
Influence le biais de lignage ( « priming » lymphoïde)
• Divisions asymétriques : division asymétrique de certains facteurs
cellulaires qui déterminent le « destin » des HSC
• Stochasticité : transcrits et protéines issues de cellules « identiques »
peuvent beaucoup varier

Haas, Cell Stem Cell, 2018

• Hétérogénéité moléculaire et fonctionnelle des CSH :

Biais de différenciation : « myeloid », « lymphoid » ou

« megakaryocytic-biaised HSC » (barcoding in situ)

« Transcriptional lineage priming » : présence de profils

d’expression spécifiques de lignages (single cell RNA seq)

Biais fonctionnel : « transcriptional lineage priming » est

corrélé au biais fonctionnel de lignage (analyse fonctionnelle
en single cell)

Haas, Cell Stem Cell, 2018

 Hématopoïèse : nouveau modèle de
différentiation
• Les CSH ne « sautent » pas d’un état transcriptionnel stable à un
autre mais changent progressivement :
Perte progressive de la plasticité aboutissant à un engagement
dans la différentiation
Acquisition progressive de programmes transcriptionnels
spécifiques de lignées

• Etats transitoires et non stables / notion de continuum

• Possibilité de transition dans les 2 sens
* *

* : Conservent leur potentiel de multipotence Haas, Cell Stem Cell, 2018

 Conséquences sur l’hématopoïèse
pathologique

• Hétérogénéité des CSH :

Evolution vers une hémopathie (myéloïde ou
lymphoïde)
Phénomènes de résistance au traitement et de
rechute
Développement d’une hématopoïèse clonale avec
l’âge par l’accumulation d’anomalies génétiques

Haas, Cell Stem Cell, 2018

Hématopoïèse leucémique
• Hématopoïèse associée au développement des leucémies
• Dérive d’un petit contingent de cellules souches leucémiques
(LSCs)
• LSCs :
• Rares ++
• Population hétérogène de cellules leucémiques, provenant
de la transformation de CSH ou de cellules myéloïdes
progénitrices

Passégué, PNAS, 2003

Bonnet, BJH, 2005
Wang, Mol Ther, 2017
Löwenberg, Blood, 2017,
• Hétérogénéité phénotypique, génétique, épigénétique
et fonctionnelle
• Propriétés d’autorenouvellement, de quiescence
cellulaire et de chimiorésistance

• Quiescence => résistance aux traitements cytotoxiques

standards
• Ciblage thérapeutique difficile
• Phénotype aberrant : expression du CD123
(interleukin-3 receptor α) au sein du compartiment
CD34+/CD38-
=> anticorps monoclonal anti-CD123
• Propriété métaboliques différentes
(phosphorylation oxydative, activation of NF-κB…)
=> anti BCL2, inhibiteurs d’IDH2
• Propriétés épigénétiques différentes
• => inhibiteurs de BET, EZH2

Pollyea & Jordan, Blood, 2017

Hématopoïèse clonale et CHIP
 Hématopoïèse clonale : définition
Présence d’un clone (caractérisé par une ou plusieurs mutations
partagées) qui contribue de façon plus importante et
disproportionnée à la production des cellules sanguines matures

Steensma, Blood, 2015

• 10% des plus de 70 ans sont porteurs de mutations
pouvant prédisposer au développement d’hémopathies

Exome Exome

Jaiswal, NEJM, 2014 Genovese, NEJM, 2014

 Techniques de détection

Limites de détection (profondeur) :

• Exome : 0,07%
• Reséquençage ciblé : 0,0003%

Gibson & Steensma, Clin Cancer Res, 2018

• Reséquençage ciblé (seuil de VAF : 0,0003%)

• 20 patients avec échantillons disponibles à 10 ans d’intervalle (time
point 1 : range 51-65 ans, time point 2: 63-76 ans)

• À 60 ans, 95% présentaient des mutations dans des gènes associés aux
LAM (ex : TET2, DNMT3A, etc…) => hématopoïèse clonale (≠ CHIP)
Young, Nat commun, 2016
• WGS : couverture plus importante / pas uniquement ciblé sur séquences
codantes ou gènes candidats

VAF médiane : 0,17% Hématopoïèse clonale :

• Associée à un taux de mortalité plus
élevé et à un risque plus important
d’hémopathie
• Mais dans la majorité des cas, non
liée à une mutation dans un gène
candidat

Zink, Blood, 2017

 Mutations
Exome Reséquençage ciblé WGS

Jaiswal, NEJM, 2014 Young, Nat commun, 2016 Zink, Blood, 2017

• Une seule mutation dans la plupart des cas

• Mais accumulation de plusieurs mutations
avec l’âge

Jaiswal, NEJM, 2014 Arends, Leukemia, 2018

 Hématopoïèse clonale : physiopathologie
• Causes principales de stress mutagénique :
Chimiothérapie / Radiothérapie
Age
Consommation tabagique

• Pressions de sélection qui permettent l’expansion du clone

Aging-associated selective pressure Therapy-associated selective pressure

TET2, DNMT3A, ASXL1 TET2, DNMT3A, ASXL1

Immune-mediated clonal selection
TP53 PPM1D, ATM, CHEK2

TET2, DNMT3A, ASXL1

BCOR, BCORL1, PIGA Bowman, Cell Stem Cell, 2018
 Hématopoïèse clonale : origine cellulaire
• CSH ou progéniteur précoce

Mutations sont observées de manière durable et à

plusieurs timepoints (Young, Nat commun, 2016)

CHIP peut être observée en cas d’allogreffe de moelle

osseuse / CHIP issue du donneur

<40 >40 years

Gibson, Blood, 2017

Deep targeted sequencing

Expansion faible Expansion modérée Expansion forte

Pour la plupart des patients, l’expansion se fait entre HSC et CMP

Même clone 2 clones indépendants

Si plusieurs mutations, plusieurs scénarios possibles

Arends, Leukemia, 2018
Définition CHIP

Cut-off = 2%

Steensma, Blood, 2015

Plusieurs entités clinico-biologiques

Bejar, Leukemia, 2017

Steensma, Blood, 2015

Hématopoïèse clonale : variables cliniques

Coombs, Cell Stem Cell, 2017

 Hématopoïèse clonale : risque d’hémopathie
N=12380 N=17182 N=5649
72%: chimio ou Rx pour tumeur solide

CH-PD : CH with presumptive drivers

Genovese, NEJM, 2014 Jaiswal, NEJM, 2014 Coombs, Cell Stem Cell, 2017

• Risque de développer une hémopathie chez les patients porteurs de CH:

Risque relatif multiplié par 4 à 15
Risque absolu très faible : 0,5% à 1% par an / Identique au risque
de développer un myélome chez patients avec MGUS

• Quel type d’hémopathie ?

Myéloïde (MDS, LAM)
Lymphoïde ?
Steensma, Blood 2015
Hématopoïèse clonale et maladies non
hématologiques

Association CH et maladie cardiovasculaire

Bowman, Cell Stem Cell, 2018

CHIP et maladies cardio-vasculaires

(coronary heart disease)

Jaiswal, NEJM, 2014

• Risque de maladie coronarienne multiplié

par 1,9 (IC 95%: 1,4 à 2,7; p<0.001)
• Risque d’IDM précoce multiplié par 4 (IC
95%: 2,4 à 6,7; p<0.001)

Jaiswal, NEJM, 2017

 Modèles murins : CHIP et maladies cardio-
vasculaires
• Greffe de moelle de souris Tet2 -/- dans souris irradiées Ldlr -/-
• Régime riche en cholestérol

• Augmentation de la taille des lésions

d’athérosclérose en l’absence de Tet2

• Même résultats avec moelle Tet2 +/-

• Même résultats avec knock out Tet2 uniquement dans le compartiment myéloïde

• Expression augmentée des chimiokines CXC

=> recrutement de monocytes / macrophages
dans l’intima des artères
=> augmentation de l’athérosclérose
Jaiswal, NEJM, 2017
 Modèle de CHIP

En présence d’un régime riche en cholestérol

Expansion clonale des cellules Tet2 -/- Augmentation de la taille des plaques
dans tous les lignages d’athérosclérose

Fuster, Science, 2017

 Augmentation de l’expression de chimiokines et cytokines
pro-inflammatoires dans les macrophages Tet2 -/-

Augmentation de l’expression de l’IL1β par

modulation de l’inflammasome NLRP3

Effet de l’inhibiteur de l’inflammasome => protection contre la formation des

plaques d’athérosclérose chez les souris Tet2 -/-
Fuster, Science, 2017
 Hématopoïèse clonale et micro-environnement
• Altérations du micro-environnement tumoral
• Présence de mutations de CH dans le stroma de cancers du sein ou de la
vessie
• Accumulation de TILs au sein du microenvironnement tumoral (Kleppe, NPJ
Breast Cancer, 2015 ; Pan, Immunity, 2017)

Souris Tet2-/-
(compartiment myéloïde)
+ mélanome TAM Tet2-/-

Shift d’un programme immunosuppresseur à

un programme pro-inflammatoire

Augmentation des TIL

Réduction de la croissance tumorale

Pan, Immunity, 2017
 Hématopoïèse clonale : prise en charge
• Pas de consensus
• A surveiller comme les MGUS ?
• Mieux définir les groupes à risque d’évolution vers une hémopathie
• Quelle population screener ?
Population générale asymptomatique ?
A priori non : pas d’études, anxiété, pas de traitement efficace (Gibson & Steensma, Clin
Cancer Res, 2018)
Population ciblée ?
Après traitement cytotoxique ? Dans le contexte d’aplasie médullaire ?
• Si oui, comment ?
Quelle profondeur ? Quelle technologie ?
Quelles anomalies ? Gènes candidats vs tous les gènes ?
Quel seuil de VAF considérer ? 2% ? Moins ?
• La recherche d’une CH doit-elle faire partie du bilan systématique d’évaluation
du risque cardiovasculaire ?
• Si diagnostic de CHIP, intérêt des traitements anti-inflammatoires ou
hypolipémiants ?
Hématopoïèse clonale et
hémopathies lymphoïdes
 Atteinte de la CSH dans la LLC

• Moelle osseuse de patients atteints de LLC : proportion plus importante

de progéniteurs pro-B CD10+CD19+ (x5 par rapport aux sujets contrôles)
• Greffe dans souris NSG de CSH de patients atteints de LLC =>
développement de clones B CD5+ ou CD5-(≠ contrôles où la proporbon
de cellules B CD5+ est très faible (<1%))
• Xénogreffes sériées de CSH de patients avec LLC : maladie
transplantable avec à chaque passage, développement de clones B CD5+
et CD5-

Kikushige, Cancer Cell, 2011

• Présence de mutations acquises dans les progéniteurs multipotents
des patients atteints de LLC
(Damm, Cancer Discovery, 2014; Quijada-Álamo M, J Hematol Oncol, 2017)

CD19+
CD34+

Quijada-Álamo, J Hematol Oncol, 2017

 Atteinte de la CSH dans la leucémie à
tricholeucocytes

• Présence de la mut BRAFV600E dans

les cellules de HCL, CSH et Pro-B

• Greffe de CSH mutées d’un patient HCL dans souris NSG

Prise de greffe => autorenouvellement des CSH de HCL
Développement d’une maladie de type HCL

Chung, Sci Transl Med, 2014

 Atteinte de la CSH dans les lymphomes T
périphériques

• Mutations de TET2 et DNMT3A fréquentes dans les PTCL

• Présentes aussi dans les hémopathies myéloïdes (LMMC, SMP,
LAM) et dans les CHIP
• Observées dans les CSH chez les patients avec hémopathies
myéloïdes ou CHIP

Atteinte de la CSH dans les hémopathies lymphoïdes T matures

Quivoron, Couronné, Cancer Cell, 2011

Couronné, NEJM, 2012
Sakata-Yanigomoto, Nat Genet, 2014
Modèle d’oncogenèse multi-étapes

Fujisawa, J Clin Exp Hematop, 2017

Les mutations de TET2 sont observées dans les CSH de patients avec hémopathie lymphoïde T

Quivoron, Couronné, Cancer Cell, 2011

 DNMT3A

Les mutations de DNMT3A sont observées dans

les CSH de patients avec hémopathie lymphoïde T

Couronné, NEJM, 2012

Double pathologie : MDS et AITL Mutations de TET2 et DNMT3A surviennent

Ancêtre commun dans des CSH/progéniteurs précoces
Couronné, NEJM, 2012 Sakata-Yanigomoto, Nat Genet, 2014
 Conséquences sur la prise en charge

• Chimiothérapies de type CHOP / CHOEP => Survie à 5 ans ≈ 30%

• Autre stratégie thérapeutique ?

Thérapies ciblées
Greffe de moelle
Agent hypométhylants
IDH2 AITL
RHOA
CD28…

Lymphoma
stem cells?
TET2
DNMT3A ?

Adapté de Sato, Front Oncol, 2016

Nouvelles technologies
• Apport des nouvelles technologies pour la
compréhension de l’hématopoïèse

Dharampuriya, Curr Opin Cell Biol, 2017

CYTOF / Cytométrie de masse
Métaux rares conjugués à des anticorps

Possibilité de détecter 60
métaux différents
=60 marqueurs

Application à des échantillons complets ou à de l’unicellulaire

Nécessite de développer des algorithmes

d’analyse automatisés

Bendall, Trends Immunol, 2012

Algorithme
SPADE

Behbehani, Cancer Discovery, 2015

 Single-cell RNA-seq

Programme d’expression
génique

Quantité faible de transcrits

Amplification nécessaire +++ (jusqu’à 1 million)

Gene « drop out »: un gène est exprimé dans une cellule mais pas dans une autre

Biais

Correction / normalisation
Actuellement, analyse de 105 à 106 cellules en même temps

Svensson, Nat Protoc, 2018

 ATAC-seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing.

Accessibilité de la chromatine
Etat d’ouverture de la chromatine
Buenrostro, Nat Methods, 2013
 Méthodes de tagging
• In vitro : barcoding
1ère étape dans la préparation de la librairie
Permet lors de l’analyse de distinguer les cellules entre
elles (nécessaire dans les analyses par single cell)

Klein, Cell, 2015

• In vivo:
Barcoding ex-vivo puis réinjection des cellules
barcodées dans la souris (expériences de greffes) :
Intégration virale (lenti ou rétrovirus)
Transposons
CRISPR-CAS9

Glimm, Cell Stem Cell, 2011

Gerrtits, Blood, 2010
 Tagging in situ :
Système Polylox : barcoding

Pei, Nature, 2017

Transposons : site d’intégration unique et propre à chaque cellule

vv
v

v
Tags partagés si issus de la même cellule
v v
v

v Rodriguez-Fraticelli, Nature 2018