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    Biochimie Approfondie TD 3

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    Alhassane Bah
    Ce document présente trois exercices portant sur la cinétique enzymatique. Le premier exercice concerne les cinétiques et vitesses initiales, le deuxième porte sur les courbes de saturation et leur représentation en doubles inverses, et le troisième détaille le calcul des paramètres cinétiques Vmax et KM à partir de la représentation graphique.

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    Exercice N°1

    : Cinétiques et vitesses initiales

    Exercice N°2

    Courbe de saturation et représentation des doubles inverses


    Question N°2
    Dans les 2
    cas, malgré les apparences, il s'agit de courbe de saturation (hyperboles) : vi = f([S]0).

    La gamme de concentrations de substrat étudiée (1 à 5 mM) n'est donc adaptée à aucune des 2
    enzymes :

    • pour E1, la gamme n'est pas assez grande ===> on ne détermine que les premiers
    points de la courbe de saturation.

    • pour E2, la gamme étudiée ne correspond qu'aux vi les plus élevées ===> il faut
    étudier des concentrations supplémentaires inférieures à 1 mM pour avoir le début de
    la courbe de saturation.
    • Par ailleurs : KME1 > KME2. En effet, pour [S]0 = 5 mM, E2 est saturée alors que l'on
    est au début de la courbe de saturation pour E1.
    • Vue l'allure de ces 2 courbes de saturation, est probable que : VMaxE1 > VMaxE2.

    Exercice N°3
    Les valeurs des paramètres cinétiques déterminées d'après la représentation des doubles
    inverses (figure ci-dessus) sont :

    • 1/VMax = 4,09 (unités D.O.)-1.min


    • -1/KM = -5,8 mg-1.tube

    Donc :

    • VMax = 0,24 unités D.O. min-1


    • KM = 0,17 mg.tube-1
    a) Calcul de VMax

    Une vitesse est la variation d'une concentration (et non d'une quantité) par unité de temps.

    La valeur du coefficient d'extinction pondéral donné pour le PNP est : ε1% = 1260 g-1.100
    mL.cm-1.
    Ce qui signifie qu'une solution de PNP à 1% a une absorbance de 1260 unités D.O., pour un
    trajet optique de 1 cm.

    Donc : 1% = 1g dans 100 mL ---> 1260 unités D.O.


    <==> 139 g dans 100 mL ---> 1260 x 139 unités D.O.
    <==> 139 g dans 1000 mL ---> (1260 x 139) / 10 unités D.O.
    <==> 1 mole de PNP par litre ---> 17514 unités D.O.

    On obtient ainsi la valeur du coefficient d'extinction molaire : εMPNP = 17514 M-1.cm-1


    On peut maintenant recalculer VMax à partir de cette valeur et de la loi de Beer-Lambert :

    VMax = 0,24 unités D.O. min-1 = 0,24/(17511 x 1) = 1,37 10-5 M.min-1 = 13,7 µM.min-1
    b) Calcul de KM

    La masse molaire dont il faut tenir compte est celle du SUBSTRAT, puisque l'on calcule
    KM !
    Par ailleurs, le volume réactionnel est de 10 mL.

    Donc : KM = 0,17 mg.tube-1 = 0,17 10-3 g dans 10 mL


    <==> KM = (0,17 10-3/371) moles dans 10 mL = ((0,17 10-3 x 1000) / (371 x 10)) moles
    dans 1L.

    KM = 45,8 µM
    Calcul de l'activité spécifique (A.S.)

    Expression de VMax :

    VMax = 13,7 µM.min-1 = 13,7 µmoles.min-1.L-1 = 13,7 unités.L-1

    Du fait de l'unité choisie pour la concentration, le volume est dans un premier temps 1 litre
    de milieu réactionnel. Or, la réaction s'effectue dans un volume réél de 10 mL.

    Donc : VMax = 0,137 unités dans 10 mL = 0,137 U.tube-1

    Expression de [E0]

    On met 0,2 mL de solution d'enzyme à une concentration initiale de 10 mg.mL-1 dans un


    volume total de 10 mL.

    Donc : [E0] = 0,2 (mL) x 10 (mg.mL-1) = 2 mg dans 10 mL = 2 mg.tube-1

    Les unités de VMax et de [E0] sont cohérentes et les valeurs tiennent compte du volume
    réactionnel réel.

    L'activité spécifique est donc : A.S. = VMax/[E0] = (0,137 unités.tube-1) / (2 mg.tube-1) =


    68,5 mU.mg-1
    Bon courage
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