Laboratoire de Bactériologie – Virologie ** Centre Hospitalier National d’Enfants Albert Royer

Mode opératoire de l’examen cytobactériologique des selles

Examen Cytobactériologique des selles

Recueil des selles et Mode opératoire à la paillasse

Plan du cours
1. Recueil des selles

1.1. Conditions du recueil

1.2. Matériels du recueil
1.3. Techniques du recueil
1.4. Transport – Conservation

2. Réception des selles au Laboratoire

2.1. Vérification du bulletin d’analyse

2.2. Enregistrement de l’échantillon

3. Technologie au Laboratoire : Premier jour de l’analyse

3.1. Examen macroscopique

3.2. Examen microscopique
3.3. Ensemencement
3.4. Choix des milieux à ensemencer en fonction de l’âge

4. Technologie au Laboratoire : Chronologie de la coproculture

4.1. Recherche de Salmonella – Shigella

4.2. Recherche d’Escherichia coli entéro-pathogène
4.3. Recherche de Vibrio cholerae
4.4. Recherche de Campylobacter jejuni
4.5. Recherche de virus des gastroentérites

5. Technologie au Laboratoire : Résultats – Interprétation

5.1. Interprétation des résultats

5.2. Validation – Saisie – Délivrance

6. Agents entéropathogènes souvent isolées

Professeur Moussa Fafa Cissé – Médecin Biologiste - Faculté de Médecine – Dakar 1

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1. Recueil des selles

1.1. Conditions du recueil
 Avant tout traitement antibiotique
 A tout moment de la journée et de la nuit
 Recueillir des selles fraîchement émises
1.2. Matériels du recueil
 Pot stérile à large ouverture avec cuillère fixée sur le couvercle
 Ecouvillons stériles en coton
 Papier buvard stérile
1.3. Techniques du recueil des selles
 Recueil physiologique des selles
- Malade défèque dans pot de chambre
- Recueillir 5g de selles fraîches grâce à une spatule ou un abaisse langue
- Placer ces 5g de selles dans le pot stérile
 Recueil des selles à l’aide d’un instrument
- Ecouvillonner le rectum chez le nouveau-né, le nourrisson
- Recueillir les selles sur papier buvard chez le cholérique
- Réaliser des biopsies rectales ou coliques lors d’endoscopies
Nota bene : ne prélever pas les selles émises dans la cuvette des WC
1.4. Transport – Conservation des selles
 Transport de l’échantillon de selles
- Immédiat au Laboratoire, dans un délai de 30’
- En cas de transport sur les longues distances et ou un long délai
. Mettre les selles dans une gélose molle : gélose de Cary Blair
. Mettre 5 à 10 gouttes de selles liquides sur papier buvard. Laisser sécher,
placer le papier buvard dans une enveloppe et l’adresser au Laboratoire.  
 Conservation de l’échantillon de selles
- Conservation en salle climatisée : délai de 1H sur la paillasse
- Conservation au réfrigérateur à +4°C : délai de 12H
- Conservation sur papier buvard : délai de 48 H
- Conservation en gélose de Cary Blair : délai de 72 H
2. Réception des selles au Laboratoire
2.1. Vérification du Bulletin d’analyse
 Identité du malade
- Prénoms – Nom
- Age
- Sexe
 Données d’hospitalisation
- Diagnostic clinique
- Service d’hospitalisation : Pavillon, n° du lit, n° du dossier ; Externe
- Date - Heure du recueil
 Prescripteur de l’analyse
- Prénoms – Nom

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- Qualification
- Cachet – Signature
2.2. Enregistrement de l’échantillon de selles
 Remplir correctement le registre des coprocultures
- Attribuer un numéro d’ordre à l’échantillon de selles
- Age
- Sexe
- Service d’hospitalisation : Pavillon, n° du lit, n° du dossier ; Externe
- Diagnostic clinique
- Nature du pus
- Date – Heure du recueil
- Date - de réception
- Prescripteur : Prénoms – Nom – Qualification
 Reporter le numéro d’ordre de l’échantillon sur le
- Bulletin d’analyse
- Matériels de recueil du pus
3. Technologie au Laboratoire : Premier jour de l’analyse
3.1. Examen macroscopique des selles
 Selles normales sont moulées, fermes ou molles
 Consistance des selles pathologiques
- Selles afécales «eau de riz»: choléra
- Selles glaireuses, sanguinolentes : dysenterie, amibiase, colibacillose …
- Selles liquides, ocres : typhoïde
3.2. Examen microscopique des selles
 Etat frais
- Rechercher des Leucocytes et des hématies : invasion de la muqueuse intestinale
- Rechercher des bactéries à mobilité polaire : suspecter Vibrio, Pseudomonas …
- Rechercher des KAOP : kyste, adulte, œuf de parasite
- Rechercher des levures
 Coloration de Gram : facultative
- Flore équilibrée = 70% de bactéries à Gram (-) et 30% de bactéries à Gram (+)
- Flore déséquilibrée = autres situations
3.3. Ensemencement = Coproculture
 Géloses sélectives pour l’isolement des bactéries
- Hektoen : H
- Eosin Methylen Blue : EMB
- Thiosulfate Citrate Bile Saccharose : TCBS
- Columbia au sang frais sélective : Campylosel
 Bouillons d’enrichissement
- Bouillon au Sélénite de sodium (BS) pour Salmonella
- Eau Peptonée Salée Alcaline (EPSA) pour Vibrio cholerae :
 Incuber les milieux
- à 37°C, en atmosphère aérobie : H, TCBS, EMB, BS, EPSA
- à 42°C, en atmosphère microaérophile : gélose Campylosel 

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3.4. Choix des milieux à ensemencer en fonction de l’âge

 Tout âge
- Ensemencer une gélose H
- Ensemencer une gélose TCBS
- Ensemencer une gélose Columbia au sang frais sélective (Campylosel)
- Ensemencer un bouillon BS
- Ensemencer un bouillon EPSA
 Enfant âgé de 0 à 18 mois
- Mêmes milieux que pour tout âge
- Compléter avec une gélose EMB
 Enfant âgé de 0 à 3 ans : Rotavirus, Adénovirus

4. Technologie au Laboratoire : Chronologie de la coproculture

4.1. Recherche des Salmonella – Shigella
 1er jour
- Ensemencer une gélose H
- Ensemencer un bouillon BS
. Incuber le BS pendant 3 à 6 heures à 37°C
. Puis repiquer une grosse goutte du bouillon BS sur une nouvelle gélose H
 2 ème jour
- Choisir 5 colonies lactose (-) sur H  colonies vertes
. 3 colonies lactose (-) et SH2 (+)  colonies vertes avec un centre noir
. 2 colonies lactose (-) et SH2 (-)  colonies totalement, vertes sans centre noir
- Repiquer chacune des 5 colonies
. En milieu urée-indole (UI) ; incuber 4H et noter la couleur des milieux UI
: Milieux UI restent jaune paille  bactérie uréase (-)
: Milieux UI virent au rouge  bactérie uréase (+)  jeter ces bactéries
. Repiquer les bactéries uréase (-) sur gélose de Kligler-Hajna (KH)
 3 ème jour
- Lecture de la mini galerie : KH et UI  
. Salmonella: U (-), I (-), L (-), SH2 (+) agglutination avec sérums anti Salmonella
. Shigella: U (-), I (-), L (-), SH2 (-)  agglutination  avec sérums anti Shigella
- Réaliser un antibiogramme lorsque l’agglutination est positive
- Refaire la même démarche avec la gélose H ensemencée à partir du BS le 2ème jour 
4.2. Recherche d’Escherichia coli entéro-pathogène : ECEP
 1er jour : ensemencer une gélose EMB
 2ème jour 
- Choisir 5 colonies à « reflet métallique » (violet)
- Agglutiner chacune d’elles avec les sérums anti ECEP
- A partir des agglutinations (+), ensemencer une mini galerie : KH, UI, CS
- Réaliser un antibiogramme en cas d’agglutination (+)
 3ème jour 
- Lire les caractères de la mini galerie : KH, UI, CS
- Lire l’antibiogramme

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4.3. Recherche de Vibrio cholerae

 1er jour
- Ensemencer une gélose TCBS
- Ensemencer un bouillon EPSA 
. Incuber le bouillon EPSA pendant 4H à 37°C
. Repiquer une grosse goutte du voile en surface sur un TCBS neuf
 2ème jour
- Choisir sur les TCBS 5 colonies saccharose (+)  colonies jaunes
. Ensemencer la moitié de chacune des 5 colonies sur galerie : KH, UI, CS, MH
. Agglutiner l’autre moitié avec le sérum polyvalent anti Vibrio
. Réaliser un antibiogramme si l’agglutination est (+)
- Rendre les résultats partiels au clinicien
 3ème jour
- Lecture les galeries (KH, UI, CS) et l’antibiogramme  
. Vibrio cholerae: L (-), SH2 (-), U (-), I (+), Saccharose (+)
. VPH: L (-), ONPG (-), SH2 (-), U (-), I (-), saccharose (-),
- Réaliser les tests complémentaires
. MH  recherche de l’oxydase : V. cholerae est oxydase (+)
. KH  réaliser le test à l’ONPG : V. cholerae est ONPG (+)
. MH : refaire l’agglutination avec les sérums polyvalents anti Vibrio O1 et O139
4.4. Recherche de Campylobacter jejuni
 1er jour
- Ensemencer une gélose Columbia au sang frais sélective (mélange de 3 AB)
- Incuber pendant 48H, à 42°C, en atmosphère microaérophile
 2ème jour
- Choisir 5 colonies plates, grisâtres
- Réaliser
. Etat frais : rechercher une mobilité polaire
. Coloration de Gram : bacille en forme de «S»
- Rechercher la catalase et l’oxydase : elles sont (+)
- Ensemencer chaque colonie suspecte sur une galerie : KH, UI, MH
 3ème jour
- Lire et interpréter la galerie
- Réaliser un antibiogramme
4.5. Recherche de virus des gastroentérites
 Centrifuger 1-2 grammes de selles
 Recueillir le surnageant
 Réaliser un test d’agglutination sur lame ou carte
 Virus recherchés : Rotavirus, Adénovirus
5. Technologie au Laboratoire : Résultats – Interprétation
5.1. Interprétation des résultats
 Présence de bactéries entéropathogènes spécifiques
- « Infection en cours » si le germe pousse en abondance sur la gélose d’isolement
- « Portage possible » si le germe est isolé uniquement après enrichissement

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 Absence de bactéries entéropathogènes spécifiques

- Infection peut être au début (peu de germes dans les selles)
- Prélèvement de mauvaise qualité (recueil, transport, conservation)
- Malade sous antibiotique 
- Diarrhée peut être d’origine virale ou parasitaire
5.2. Validation – Saisie – Délivrance des résultats
 Délai : 3-4 jours
 Il ne faut pas répondre « Coproculture négative
 Mais il faut dresser la liste des germes entéropathogènes recherchés
6. Agents entéropathogènes souvent isolés
 Bactéries
- Salmonella : Typhi, Paratyphi ….
- Shigella
- Vibrio cholerae
- E. coli entéro-pathogène : ECEP
- Campylobacter jejuni
- Pseudomonas aeruginosa
 Virus des gastroentérites
- Rotavirus
- Adenovirus
 Parasites
- Trichomonas intestinalis, Giardia intestinalis
- Entamoeba histolytica
- Ankylostome, Ascaris ….

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Rechercher de virus
Echantillon de selles
- Rotavirus
Premier jour - Adénovirus
- sang, pus,

Examen macroscopique Ensemencement Examen microscopique

- consistance, couleur - Hektoen - mobilité polaire
- TCBS - leucocytes, hématies
- EMB - parasites
- Columbia sang - Gram:équilibre flore
- BS
- EPSA
Deuxième jour

Vibrio cholerae Salmonella – Shigella Campylobacter jejuni

- Gélose TCBS - Gélose Hektoen - Gélose Columbia
.colonies jaunes .5 colonies incolores .colonies grises
.oxydase (+) . 3 SH2 (+) .oxydase (+)
.mobilité polaire . 2 SH2 (-) .catalase (+)
.agglutiner sérum .galerie : UI, KH .Gram: B (-) incurvé
.KH, UI, CS, ABG - BS  Hektoen - Galerie
EMB + ABG
- EPSA  TCBS
E. coli entéro-pathogène
- Gélose EMB
.5 colonies reflet métallique
.agglutiner avec sérums I-IV
.KH, CS, UI, ABG
Troisième jour

- Lecture galeries
.tests complémentaires
.interprétation
- Résultats
- validation
- saisie - délivrance

Schéma: Mode opératoire de la coproculture au Laboratoire

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