LES MÉTHODES DE DOSAGE DES PRINCIPALES

VITAMINES HYDROSOLUBLES (1)

Jean Adrian

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Jean Adrian. LES MÉTHODES DE DOSAGE DES PRINCIPALES VITAMINES HYDROSOL-
UBLES (1). Annales de zootechnie, INRA/EDP Sciences, 1956, 5 (4), pp.295-334. �hal-00886658�

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 LES MÉTHODES DE DOSAGE DES PRINCIPALES
VITAMINES HYDROSOLUBLES (1)

PAR

Jean ADRIAN
Attaché de Recherches au C. N. R. S.
laboratoire de Biochimie de la Nutrition (Bellevue).

A. -
INTRODUCTION

Bien que de découverte souvent très récente, les vitamines hydro-

solubles ont suscité un grand nombre de méthodes de dosages, basées
sur des principes variés.
A cette abondance et à cette diversité on peut voir plusieurs raisons :
-
la recherche des résultats spécifiques a multiplié les méthodes
et les modalités opératoires ;
-
on ne cherche pas toujours le même résultat : tantôt on désire

doser une molécule chimique définie (industrie pharmaceutique), tantôt

on s’intéressera à l’efficacité vitaminique (dans le cas d’un aliment par

exemple) ;
-

enfin, la multiplicité des méthodes est avant tout redevable

des progrès que l’on a fait dans la connaissance biochimique des vita-
mines.
Cette connaissance s’est faite en 3 étapes principales, et à chacune
d’elles correspond un type de méthode de dosages :
a) la première étape a été marquée par la découverte des symptômes
cliniques d’avitaminoses et l’attribution de ces « maladies» à des carences
alimentaires.
A cette époque, on mesurait la valeur vitaminique des aliments
en recherchant leur efficacité à protéger les animaux (cobaye, souris, rat)
de l’avitaminose, ou, au contraire, à restaurer ces animaux après les avoir
carencés.
Les résultats de ces méthodes biologiques sont exprimés en unités mal
définies, et surtout chaque laboratoire possède ses Unités propres.
b) Ensuite les biochimistes ont découvert les molécules chimiques
des diverses vitamines, acide ascorbique, thiamine, riboflavine, etc.
On a pu alors doser ces molécules dans les aliments et les divers

)
1
( 6 à la Maison de la Chimie,
Cours-conférence donné le y mai 195 sous les auspices du Centre
de perfectionnement technique.
matériaux, et les résultats de ces méthodes chimz’ques sont exprimés en
milligrammes de thiamine, ou riboflavine, etc.
I,es résultats sont donc comparables d’un laboratoire à l’autre,
et les méthodes sont plus spécifiques.
c) P;nfin, récemment, il a été mis en évidence que l’efficacité vita-
minique d’un aliment était la résultante de l’activité d’un ou plusieurs
corps chimiques, les uns possédant une activité vitaminique plus ou
moins grande par rapport à la vitamine elle-même (famille B6 et acide
folique), les autres possédant des propriétés anti-vitaminiques (thia-
minase).
Parallèlement, se sontdéveloppées des .méthodes mic
obiologiques
y
de dosages vitaminiques, qui permettent de mesurer une efficacité bio-
logique à l’aide de souches bactériennes diverses.
Il existe ainsi actuellement 3 grands types de dosages vitaminiques :
biologique, chimique et microbiologique. Nous allons les passer succes-
sivement en revue, mais auparavant nous rappelons les principales carac-
téristiques physiques des vitamines hydrosolubles. Quelle que soit la
méthode adoptée, il faudra en effet se placer dans des conditions qui
respectent l’intégralité de la vitamine.
 B. -
LES MÉTHODES BIOLOGIQUES

Ce sont les méthodes les plus anciennes et en même temps celles qui
reflètent le mieux « l’efficacité vitaminique» d’un échantillon. Elles sont
basées sur la prévention ou la guérison d’un animal soumis à un régime
carencé.

1! Généralités

On utilise dans cette technique le Rat pris au sevrage ou le Poussin

d’un jour, c’est-à-dire des animaux n’ayant pas encore accumulé de
réserves vitaminiques propres. I,e dosage de l’acide ascorbique faisant
exception car il emploie des cobayes adultes. C’est la seule vitamine dont
on puisse réaliser des carences sur animaux adultes.

I,a méthode préventive ou « test de croissance » de l’animal demande

tout d’abord une courte prépériode pour enlever à l’animal ses surplus
vitaminiques. On obtient ce résultat en soumettant les Rats au régime
de carence pendant quelquesjours, ou les Poussins pendant une durée
plus courte.
Ace moment-là on constitue les lots expérimentaux avec le plus

grand soin possible en répartissant dans chaque lot un nombre égal

d’animaux du même sexe (mâle), provenant des mêmes mères, et de
poids égal avant et après la prépériode. Cette opération est très impor-
tante et conditionne l’exactitude du dosage.
Chaque lot doit contenir le même nombre d’animaux (de 8 à 12 ).
Une fois les lots ainsi établis, on fournit à certains lots des quantités
croissantes de vitamine pure qui permettent d’établir une courbe-étalon,
tandis que d’autres lots reçoivent des quantités connues de l’échantillon
à doser, et ceci à 2 ou 3 niveaux différents. Il convient que la substance
soit suffisamment riche en vitamine pour que les quantités à fournir
aux animaux ne représentent qu’un faible pourcentage de la ration.
De plus, on doit corriger la composition du régime de base en fonction
de la nature de l’échantillon : par exemple, si on désire connaître la valeur
vitaminique d’une poudre de viande on retranchera du régime de base
une quantité de caséine égale à la quantité de l’échantillon introduite
dans les lots expérimentaux : ainsi tous les lots seront au même niveau
azoté. Si on analyse des échantillons de céréales, on retranchera du régime
de base une partie du sucre, etc.
A titre d’exemple, on peut constituer les lots suivants pour le dosage
biologique d’une des vitamines B :
 Originellement la période expérimentale s’étendait sur q semaines
environ, puis on l’a ramenée à 15 ou même 10 jours. Quoiqu’il en soit,
à la fin de l’essai, on mesure les gains de poids des différents lots et en
intrapolant les augmentations pondérales des lots expérimentaux par
rapport à celles des lots constituant la courbe-étalon, on en déduit la

teneur vitaminique du produit analysé.

a méthode curative ou « test de restauration » des animaux ne com-
4
I
mence que lorsque les animaux sont en état de carence vitaminique

aiguë, c’est-à-dire quand les symptômes cliniques sont nettement appa-

rents. Dans ce cas, la prépériode est évidemment plus longue, surtout
pour le Rat (6 à 9 semaines). Les animaux sont répartis en lots comme pré-
cédemment, avec la même attention ; il faut ici que tous les lots présentent
le même tableau clinique.
Chaque lot reçoit un supplément vitaminique soit sous forme de
vitamine pure, soit sous forme de substance à analyser. Au bout de
quelques semaines on note le pourcentage d’animaux guéris dans les
différents lots. De là on bâtit une courbe-étalon et on calcule la teneur
vitaminique de l’échantillon.
Dans d’autres cas, on mesure le gain de poids des animaux pendant
la période de la restauration. Mais, en aucun cas, on ne peut se baser
sur la vitesse de restauration des animaux, qui, elle, n’est pas uniquement
fonction de la teneur de la ration en vitamine.
Du reste, la spécificité reste la difficulté majeure de ce type de dosage.
En effet, d’une part la ration de base doit être complète et équilibrée,
et d’autre part la composition de la ration (glucides, lipides) ou la nature
de l’échantillon ne doit pas influencer la réponse de l’animal. C’est ainsi
que la découverte des derniers membres du complexe B a pu jeter une
suspicion sur les résultats antérieurs des méthodes biologiques, car les
rations de base risquaient d’être partiellement déficie-ntes en facteurs
alors inconnus (la remarque est encore valable de nos jjours) ; par ailleurs,
dans le cas d’un dosage de niacine, par exemple, ni la ration, ni surtout
l’échantillon ne doivent renfermer de tryptophane, l’interrelation exis-
tant entre ces 2 métabolites faussant la réponse de l’animal.
On peut faire à ces méthodes un reproche d’ordre matériel, c’est
l’effort, le temps et les frais qu’elles nécessitent. Il est bien difficile de
les utiliser dans le travail courant.
 Ces méthodes biologiques n’en présentent pas moins des avantages
certains. Ce sont elles qui ont le plus de chances de fournir des résultats
valables pour l’Homme. De plus, elles mesurent l’efficacité vitaminique
« réelle », et
permettent de découvrir les facteurs d’épargne et les « indis-
» éventuelles existant dans certains aliments : en fait, elles
ponibilités
dosent la vitamine utilisable et non la vitamine totale.
Un autre avantage des techniques biologiques sur les méthodes
chimiques et microbiologiques est de pouvoir donner l’échantillon sous
sa forme naturelle, sans avoir besoin de libérer la vitamine par une hydro-

lyse chimique ou enzymatique. Cette hydrolyse est très souvent cause

de résultats erronés.
La composition de la ration est évidemment d’une importance capi-
tale. Pour la plupart des facteurs, on peut partir de cette ration ci dessous
complète et équilibrée en supprimant la vitamine à doser. Voici, à titre
indicatif, une ration de croissance pour le Rat, qui permet un gain de
poids journalier de
4 g.

Il faut signaler que pour les dernières vitamines B découvertes,

l’omission de la vitamine ne suffit pas à créer l’avitaminose. Dans le cas
de la carence du Rat en biotine, par exemple, il faut ajouter au régime
une antivitamine, l’avidine, qui bloque la biotine. C’est pourquoi la
ration comporte 20 p. 100 de blanc d’oeuf cru.
Dans d’autres cas, on additionne la ration de 2 p. ioo de sulfamides
ce qui inhibe les synthèses vitaminiques de la flore intestinale.
Pour le dosage de la vitamine Bi2, il faut que les mères des animaux
utilisés soient elles-mêmes limitées en cobalamines.
Pour les dosages en acide ascorbique, utilisant obligatoirement le
cobaye, la ration carencée est une ration naturelle privée de verdure ;
elle peut être à base de haricots, de levure et de beurre 6)12 ou composée
(
de flocons d’avoine et de poudre de lait chauffé à 120&dquo; ).
152
(
2° Dosage de la thiamine

Il existe de nombreuses méthodes biologiques de dosage de cette

vitamine. Elles sont spécifiques et ne demandent pas d’hydrolyse parti-
culière de l’échantillon ,6
3.
(
)
1 3
I,e régime peut être une ration synthétique privée de thiamine,
ou plus simplement une ration naturelle préalablement étuvée 3 heures

pour la priver de Bz. C’est ainsi que la méthode officielle britannique utilise
le mélange suivant, comme régime de base pour le Rat, après chauffage
convenable :

Cette vitamine peut être dosée biologiquement à l’aide du Pigeon,

du Poussin ou du Rat.

a) Pigeon.
On utilise la méthode préventive ou curative de la polynévrite du
pigeon ,
30
( , 39
32 , 8 , 88).
1 Dans la deuxième méthode, le test consiste
à observer le pourcentage d’oiseaux guéris ,
32 88).
(
b) Poussin.
Il existe une méthode basée sur « l’index de mortalité par polyné-
vrite », exprimé ainsi (8q.) :
durée de l’expérience en jours (
22 jours) nombre de jours de
-

survie.
Il est évident que plus le lot est riche en thiamine, plus la valeur
de cet index est faible.
c) Rat.
On peut utiliser une méthode préventive ou curative, ou encore la
mesure de la bradycardie.
I,a précision de la méthode préventive est de l’ordre du y si on donne
les échantillons à 3 niveaux différents au moins. La durée de l’essai est
passée de 8 semaines ) 149 à 4 semaines (
( z) et même à 10 jours (iq.5).
3
La prépériode se poursuit jusqu’au moment où la courbe de poids des
animaux devient stationnaire ( 3 semaines).
Dans la méthode curative la prépériode dure 2 mois environ (r 6).
5
On sait, par ailleurs, que le rythme cardiaque du Rat diminue au
cours de la carence Bi et revient à la normale avec un retour à un
qu’il
régime équilibré, et proportionnellement à la quantité de vitamine offerte
à l’animal.
Sur cette observation on a pu établir une méthode de dosage de
la thiamine (z) : après 3 semaines de carence on mesure le rythme car-
3
diaque des animaux à l’aide de l’électrocardiographe. On administre
alors des doses connues de vitamine pure ou de solution à titrer et 24 heures
après on mesure à nouveau la fréquence cardiaque. La différence entre
les 2 valeurs permet de calculer la dose de Bi administrée aux animaux.

3! Dosage de la ril!oFlavinc

On peut utiliser le Poussin (,) ou le Rat ,

83
37, 17 z8
( , 4 , 4!). Il est
2
préférable d’utiliser le Rat.
Depuis près de 25 ans la vitamine G est dosée par la méthode pré-
ventive chez le Rat, et a été nettement améliorée. Mais, comme pour
tous ces dosages, il est difficile d’avoir une réponse spécifique et il a
été montré que la composition de la ration et de l’échantillon pouvait
influencer la croissance de l’animal. C’est principalement la nature et
le taux des glucides et des lipides qui peuvent modifier la réponse de
l’animal (zo4).

0
4 Dosage (te l’aeide pantothénique
Ici plus, le, dosage n’est pas rigoureux en ce sens que l’on ren-
non

contre certain facteur d’épargne de l’acide pantothénique dans la

un

ration de base ou dans la nature des échantillons ) 35

( ; on dose plus une
efficacité pantothénique que la vitamine elle-même. Par contre, les
méthodes biologiques offrent sur les méthodes microbiologiques
- -

l’avantage de pouvoir doser des formes liées de l’acide pantothénique

sans hydrolyse préalable ,27 67).
(
Pour ce dosage il est possible d’utiliser le Rat (
, 5, 5
4 9 o2), mais
, I
la méthode préventive s’étale sur4 semaines, tandis que les dosages
sur Poussins, tout aussi satisfaisants, ne demandent que 10 jours (85).

5° Dosage de la niacine

Les dosages biologiques de la niacine présentent d’assez grosses

difficultés pour deux raisons : d’abord la plupart des animaux (Rat,
Poussin) synthétisent des quantités importantes de niacine et par suite
il est difficile d’obtenir des animaux carencés, d’autre part étant donné
les interrelations niacine-tryptophane il est impossible de doser des
échantillons contenant des protéines. Ainsi, ne peut-on appliquer la
méthode biologique qu’à des solutions pures de niacine.
Avec de tels échantillons il est possible de pratiquer la méthode
préventive chez des Poussins (
6), des Rats (6j, 95
2 ) ou de jeunes chiens 6)
17
(
sur qui on observe la prévention de la blacktongue.

0
(; Dosage de la vitamine B6

Le dosage biologique de cette vitamine est difficilement spécifique

car composition de la ration interfère avec la vitamine (
la , 3
9 8) ; mais
l’échantillon peut être fourni directement sans hydrolyse.
On peut employer le test de l’acrodynie (
66) chez le Rat, en sachant
1
que la production et la guérison de ce symptôme ne sont pas sous la

seule dépendance de la vitamine B6, et que son intensité varie avec les
saisons ,
14 6o, 151).
(
La meilleure technique est celle basée sur la croissance du Rat ,25
(
8, 142
2 , iq.). I,e régime de base peut être le suivant : sucre 75 g, fibrine
3
8 g, sels 4 g, huile de maïs 3 g et toutes les vitamines hormis B6.
1
On peut également doser la vitamine B6 sur le Poussin en pratiquant
la méthode préventive ) 142 ou curative ).
( II7
(
Si l’échantillon est mélangé à la ration du Rat ou du Poussin et
donné par conséquent en même temps que celle-ci, le pyridoxal et la
pyridoxamine présentent une activité de 25 p. 100 inférieure à celle de
la pyriroxine ; par contre si l’échantillon est donné !ey os d’une manière
séparée de la ration, ou s’il est sous forme d’une solution injectée intra-
péritonéalement, les 3 composés de la famille B6 offrent une activité com-
parable. L’activité du pyridoxal et de la pyridoxamine est fonction de
la forme sous laquelle ils sont administrés, et ceci explique que les dosages
biologiques peuvent donner des résultats plus faibles que les techniques
microbiologiques.
Il existe larve, Corcyra cephalonica St., dont la croissance est
une

proportionnelle à la quantité de B6 qu’elle reçoit ; on a utilisé cette pro-

priété à des fins analytiques. Dans ce cas les 3 formes de la vitamine
exercent une activité comparable ,140 141
( ).

0
7 Dosage de la hiotine

La méthode curative chez le Rat semble spécifique. Après 6 à 8 se-

maines de préparation les lots sont constitués et le dosage dure 4 semaines
au bout desquelles on enregistre les gains de poids.
On peut réaliser le même dosage à l’aide de Poussins ; dans ce cas
4 semaines).
la prépériode est plus courte (
Si l’on choisit le Rat, le régime de la prépériode doit contenir de
l’avidine, c’est-à-dire du blanc d’oeuf cru. Ceci n’est pas indispensable

dans le cas du Poussin ( , 66).

2
Pendant l’essai proprement dit, le blanc d’oeuf est remplacé par une
protéine dévitaminée, comme la caséine, sinon il bloquerait la biotine
ajoutée dans les différents lots.

no Dosage de la vitamine B12

I,a préparation des animaux est un peu spéciale : non seulement

pendant la prépériode les animaux (Rat ou Poussin) ne doivent pas
recevoir de vitamine Bi2, c’est-à-dire que la ration doit être entièrement
végétale, à base de soya la plupart du temps ),235 mais encore les mères
(
doivent-elles avoir été dans des conditions sous-optimales en ce qui
regarde ce facteur.
Pendant la prépériode, on peut accélérer la carence en ajoutant à
la ration de 0
6à0
, 1 p. 100 de thyroprotéine (i2
, ).
7
Dans les dosages à l’aide de Poussins l’essai dure 3 à4 semaines et
le test est le gain de poids ).135
(
Avec le Rat , 53 ioi) on enregistre également le taux de croissance
(
après une période de 2 à 4 semaines.

0
9 Dosage de J’acide ascorbique

Les méthodes biologiques dosent à la fois la forme oxydée et la

forme réduite de l’acide ascorbique.
Comme on le sait le Rat synthétise la vitamine C ce qui oblige à se
servir du Cobaye pour les études sur le scorbut.
Dans le dosage de la vitamine C on utilise donc des cobayes que l’on
choisit adultes (contrairement à ce qui se passe pour les membres du
complexe B il est possible de carencer un animal adulte en acide ascor-
bique) .
I,a méthode préventive, la première utilisée (i
o), consiste à recher-
5
cher la quantité minimum d’échantillon pour prévenir le scorbut. La
méthode curative s’applique à la restauration des animaux carencés
par une prépériode d’une quinzaine de jours. Dans les 2 cas le test est
la courbe pondérale des animaux.
Par ailleurs, une des manifestations du scorbut, toujours chez le
Cobaye, est utilisée à des fins analytiques. Cette avitaminose modifie
nettement l’histologie de la dent :
-

désorganisation des odontoblastes ;

-

structure irrégulière de la dentine ;

-

décalcification de la prédentine.
 On a échafaudé une méthode de dosage basée sur la prévention
des troubles scorbutiques de la dent ,
73 8
( ).
7
Il est également possible de mesurer l’intensité de la carence ascor-
bique en dosant la phosphatase alcaline du sang, dont le taux est pro-
portionnel à la quantité de vitamine chez l’animal ( 8).
5

C. -
LES MÉTHODES CHIMIQUES ET PHYSIQUES

Dans les méthodes biologiques, une difficulté majeure était d’être

assuré que ni la composition de la ration, ni la nature de l’échantillon
n’influaient sur la réponse de l’animal. Si ces soucis ne se retrouvent pas
dans les méthodes chimiques, celles-ci n’en sont pas pour autant plus
spécifiques a priori.
0 Généralités
1

Dans le cas présent, les principes des méthodes sont basées sur une
réaction -

la plupart du temps colorée -

de la molécule vitaminique ;
mais dans les échantillons il est rare que d’autres molécules, sans acti-
vité vitaminique, ne donnent pas la même réaction que la vitamine.
C’est ainsi que les méthodes fluorométriques de dosage de la thiamine
et de la riboflavine demandent la plupart du temps une purification de
l’extrait pour éliminer des substances à fluorescence parasite. De même
dans le dosage de la vitamine C, basé sur le pouvoir réducteur de l’acide
ascorbique, il convient d’éliminer ou d’inhiber les autres systèmes oxydo-
réducteurs de l’extrait.
C’est pourquoi, dans ces méthodes, ainsi que dans les techniques
microbiologiques, la préparation de l’extrait réclame des soins nombreux
et attentifs ; elle se passe en 2 temps : d’abord hydrolyse de la molécule
vitaminique (ce qui n’était pas utile dans les dosages sur animaux),
ensuite purification de l’extrait.
L’hydrolyse est simple et fonction des propriétés de la vitamine :
si elle est très résistante, comme l’acide nicotinique, la prise sera hydro-
lysée chimiquement à l’autoclave ; par contre, si la molécule est plus
fragile, telle la thiamine, l’échantillon subira une légère hydrolyse chi-
mique puis une digestion enzymatique appropriée, c’est-à-dire fonction
des liaisons dans lesquelles la molécule est incluse. A ce propos, on peut
citer la fonction des principaux enzymes utilisés :
-

enzymes protéolytiques : papaïne, pepsine ;

-

enzymes phosphorolytiques : takadiastase, mylase P, clarase,

polidase S.
- enzymes amylolytiques : clarase, takadiastase, mylase P.
 Ces enzymes sont des produits commerciaux, utilisés aussi bien
dans les méthodes chimiques que microbiologiques ; ils doivent être à la
fois chimiquement et bactériologiquement purs.
Après hydrolyse, l’extrait est purifié, soit par adsorption sur terres
ou charbons suivie d’une élution, soit par oxydation, ou autre traite-
ment chimique. Cette opération a pour but de séparer la vitamine des
autres corps pouvant donner la même réaction finale, ou de détruire
ces corps parasites.
Actuellement on peut employer la chromatographie comme méthode
de séparation et de purification de la vitamine à doser : il est possible
de travailler à l’aide de chromatogrammes sur papier. Une fois la vita-
mine isolée on pratique généralement à une réaction colorée (méthodes
chimiques) ou bien on soumet les fractions à un test de croissance de
microorganisme (méthodes microbiologiques) (io5 a).
En ce qui concerne le dosage chimique celui-ci se termine générale-
ment par le développement d’une substance colorée ou fluorescente
dont on mesure l’intensité à l’aide d’un appareil approprié ; on rapporte
la valeur de l’extrait à une courbe-étalon constituée avec une solution
pure de vitamine.
Enfin, il faut signaler que si l’acide ascorbique et les vitamines Bi
2 se dosent couramment par voie chimique, les autres vitamines B
et B
ne le sont qu’exceptionnellement. On préfère les méthodes microbiolo-

giques pour les membres plus récents du complexe B.

2° Dosage de la thiamine

La méthode la plus employée est celle qui consiste à doser un produit

d’oxydation de la thianime, la thiochrome. Ce corps émet une couleur
bleue en lumière ultra-violet.
La réaction a lieu en milieu fortement alcalin par l’action du ferri-
cyanure de potassium (6, i2o) ou du permanganate de potassium ). 79
(
Le thiochrome ainsi obtenu est recueilli dans de l’alcool isobutylique.
La sensibilité de cette méthode est de l’ordre de 1/100 de !.
Cette méthode exige l’hydrolyse des formes phosphorylées de la
thiamine, car le phosphate de thiamine donne un phosphate de thio-
chrome insoluble dans l’isobutanol.
On peut noter que le N-méthylnicotinamide perturbe la transfor-
mation de la thiamine en thiochrome, et que ce dérivé de l’acide nico-
tinique doit être éliminé par adsorption sur Permutit (mq. a).
En pratique, on commence l’hydrolyse de l’échantillon en milieu
H, 0
2
S0 1 N à ioo
, o ou à l’autoclave. Après refroidissement, on ajoute
à pH 4 5
, des enzymes phosphorolytiques et autres à raison de i/io du
poids sec de l’échantillon et on incube une nuit à 45°.
 A ce moment on purifie généralement l’extrait par adsorption sur
une colonne de Decalso (68), puis on élue à l’aide d’une solution de chlo-
rure de potassium. On pratique alors l’oxydation de la thiamine en ajou-

tant de la soude et l’oxydant, et enfin l’isobutanol une minute exactement

après la soude. On agite vigoureusement et on centrifuge : le thiochrome
passe dans la couche alcoolique.
On mesure la fluorescence du thiochrome, ou bien on peut effectuer
une lecture spectrophotométrique de ce dérivé (55 a).

Ce procédé subit quelques exceptions selon la nature de l’échantillon.

C’est ainsi que dans le cas du lait on commence par précipiter la caséine
par l’acide trichloracétique, avant de faire la digestion enzymatique.
Pour les dosages dans l’urine, il n’est pas nécessaire de pratiquer
d’hydrolyse, mais comme l’urine renferme des substances fluorescentes,
il est indispensable de pratiquer une purification. Cette opération a fait
l’objet de nombreuses études critiques et on y a apporté des solutions
diverses (8
, i2i, i3o).
0
Le sang offre également un cas particulier, en ce sens que l’hématine
favorise la destruction du thiochrome. Pour éviter ce phénomène on pro-
cède au traitement suivant 8) 11
( : hydrolyse rapide du sang en milieu
acétique, puis digestion enzymatique ordinaire. On traite ensuite par
l’acide trichloracétique.
Il existe évidemment de très nombreuses variations de cette tech-
nique et aussi d’autres principes de méthodes. En particulier, une méthode
de dosage pour le sang ) 23 est basée sur la réaction de la thiamine sur
(
une amine aromatique (p-aminoacétophénone) , ) qui donne un
107 122
(
produit coloré.

3! Dosage de la riboflavine

Il existe 2 principes chimiques permettant de mesurer fluorimétri-

quement la riboflavine : soit on dose directement la molécule de la ribo-
flavine, soit on dose un dérivé de cette vitamine qui est aussi fluorescent,
la lumiflavine.
Ce second procédé (5 ,8
4 , 129
2 , ) 34 consiste à irradier la riboflavine
z
en milieu alcalin pour obtenir la lumiflavine. On pratique une hydrolyse

acide, ensuite on photolyse la vitamine B 2 à pH 13 ou i 4 ; on acidifie

et on extrait la lumiflavine par le chloroforme. La solution chloroformique
est passée au fluorimètre.
Cette méthode de dosage est sujette à de très graves reproches car
on ne mesure parfois guère plus de la moitié de la riboflavine de l’extrait

sous forme de lumiflavine ). 103 La transformation de la riboflavine

(
en lumiflavine, apparaît rarement quantitative.
 C’est pourquoi, la méthode à recommander est le dosage de la fluo-
rescence de la riboflavine elle-même.
hydrolyse de l’échantillon se fait par voie chimique (C1H 0
/
1 1 N)
,
ou enzymatique (takadiastase et papaïne) ou par les deux moyens à la
fois 93
(
, ,
s
li 178).
La purification de l’extrait peut faire de diverses façons :
se
-
soit on avec du permanganate (
oxyde rapidement l’extrait 2 mi-
nutes) et on élimine le surplus avec de l’eau oxygénée )
3
(g. Ce traitement
peut créer une certaine fluorescence (8 ), et, en présence d’une forte
9
quantité de il
fer, peut se produire une oxydation de la riboflavine )99
( ;
-

soit on peut adsorber la riboflavine sur une terre, tel que le

Florisil et l’éluer ensuite par une solution acétique de pyridine , 29 4
( ,7
9 ).
2
Il semble préférable de faire ces 2 traitements à la suite en commen-
çant par l’oxydation de l’extrait ;
-

soit la séparation entre la riboflavine et les autres pigments peut

s’opérer par réduction avec l’hydrosulfite ou le chlorure stanneux , 71
(
6). Seule la riboflavine se réoxyde à l’air. Cette séparation se fait au
3
i
moment du titrage ;
-

soit après l’oxydation par le permanganate, on peut extraire la

riboflavine en la faisant passer dans un mélange pyridine-butanol. Pour
terminer on titre la solution de riboflavine dans un fluorimètre, et on
mesure la fluorescence verte de la riboflavine.
Il faut noter que pendant la purification de l’urine en vue du dosage
de la vitamine B , il apparaît des corps présentant des réactions analogues
2
à celles de la riboflavine.
Enfin, il existe d’autres méthodes chimiques de dosage de la vita-
mine B , notamment une microméthode fluorométrique )
2 22 et des
(
méthodes permettant de dissocier la riboflavine libre de la B 2 estérifiée
et de la B2 des nucléotides , 10 44, 54)!
(

0
4 Dosage de la niacine

Ce facteur est le dernier des membres du complexe B à être dosé

d’une manière habituelle par voie chimique. Il existe un grand nombre
de méthodes de dosage de la niacine. Cette vitamine étant un dérivé
de la pyridine, les méthodes de dosage seront des réactions colorées du
noyau pyridique.
La plus connue est celle basée sur la réaction de Ko!rriG ,
91 1
( )
2
8
condensation du bromure de cyanogène sur la pyridine, ce qui donne
un sel de pyridinium. Ce produit de condensation donne ensuite nais-
sance à un dérivé d’aldehyde glutaconique, qui est de couleur rouge
dans le cas de la vitamine PP. Cette coloration est due à l’action d’une
amine aromatique.
 Pour obtenir des résultats valables, il faut que toute l’amide soit
transformée en acide nicotinique pendant l’hydrolyse.
Par ailleurs, les conditions expérimentales du dosage, et notamment
le choix de l’amine aromatique, ont fait l’objet de nombreuses publications
dont les dernières en date sont celles de G
YORGY et coll. (6 ) et de PRI!D-
1
MANN et coll. (5).
2 En général, le choix de l’amine s’est porté sur la p-
amino acétophénone. La trigonelline ne donne pas la réaction de
ENIG (175).
O
K
Il existe de nombreuses autres méthodes chimiques de dosage de
la vitamine PP, nous n’en parlerons pas étant donné leur utilisation
limitée.

Dosage de la N’ méthylnicotinamide
Chez l’Homme, le Chien ou le Porc le principal métabolite urinaire
de la niacine est la N’ méthylnicotinamide. Chez les Mammifères on
rencontre de la trigonelline. Ces deux dérivés se dosent globalement
selon une technique de H q.). Elle consiste à traiter les méta-
UFF et coll. (
7
bolites de l’acide nicotinique par l’acétone en milieu alcalin. Il se déve-
loppe alors une fluorescence que l’on rapporte à celle d’une solution
connue de N’ méthylnicotinamide.
Il est conseillé de décolorer d’abord les urines sur du charbon actif
en milieu acétique, afin d’éliminer l’interférence de certains pigments
urinaires.
La trigonelline peut aussi se doser dans les urines de mammifères
(41, SI, 1
8).
3

5° Dosage de l’acide pantothénique

Cette vitamine ne dose pratiquement pas par voie chimique.

se

Les méthodes qu’on a proposées s’appliquent plutôt à des solutions

pures qu’à des extraits de nature complexe.
Les principes sur lesquels sont bâtis les dosages sont ou la libération
par hydrolyse chimique de l’alanine, et son dosage colorimétrique ,3g)
(
6
I 4
ou la libération de l’acide pantoïque et son dosage ( 8i) ; cette dernière
I
méthode ne différenciant pas l’acide pantothénique de sa moitié inactive,
la lactone.
Une méthode chromatographique vient d’être avancée : on sépare
cette vitamine par adsorption sur le Florisil et ensuite le sulfate de cuivre
donne une réaction colorée caractéristique ).
I7I
(
 0
6 Dosage de la vitamine B6

Comme dans le cas de la niacine, il existe de nombreuses méthodes

chimiques pour doser la vitamine B6, mais une se détache particulière-
ment : celle de GIBBS ( 6) utilisant le dichloro 2
5 -6 quinonechlorimide.
On peut faire à l’ensemble de ces méthodes le reproche d’avoir
été étudiées au moment où l’on ne connaissait que le chlorhydrate de
pyridoxine et non le pyridoxal et la pyridoxamine, et par suite ces tech-
niques rendent compte assez mal des 2 derniers membres de la famille
de la vitamine B6. Par ailleurs, malgré une certaine analogie de structure,
les réactions de dosage de la pyridoxine ne sont pas sensibles à la niacine
présente dans l’extrait (g6).
La réaction de l’adermine avec le dichloro 2 -6 quinone chlorimide
donne une coloration bleue 8) 14 qui permet de doser o,
( 5 v par ce. Une
solution alcool-butanol à pH 7 ,o permet d’éliminer certaines substances
interférantes.
Autrefois on déterminait un « blanc » avec un tampon de borate,
qui bloque la pyridoxine ; sur cette solution on fait agir le chlorimide
qui donne une coloration uniquement avec les substances parasites.
Parallèlement, si on fait agir le chlorimide sans tampon de borate, on
obtient la valeur de la pyridoxine plus celle des autres corps. Par dif-
férence, il en découle la teneur de l’extrait en pyridoxine.
Ce procédé est périmé aujourd’hui car on s’est aperçu que le pyridoxal
et la pyridoxamine réagissent avec le chlorimide même en présence de
borate ; c’est pourquoi le tampon de borate peut maintenant servir à
séparer la pyridoxine d’un côté, le pyridoxal et la pyridoxine d’un autre
côté.
En pratique, on commence par hydrolyser la vitamine avec de
l’acide sulfurique et ensuite avec de la takadiastase. A ce moment on
adsorbe la pyridoxine sur du Superfiltrol à pH 3 0 puis on élue par une
,
solution de dichloro 2 -6 quinone chlorimide dans le butanol ). II On
(
ajoute enfin une solution de véronal à pH 7,8 pour développer la colo-
ration (6).
1
Une variante fait réagir la pyridoxine dans le chlorimide dans l’iso-
butanol. On élimine les interférences (bases et sels) avec un tampon
vigoureux ammoniaque-chlorure d’ammonium. La coloration maximum
se produit en une minute. Dans ce cas, le pyridoxal et la pyridoxamine

réagissent faiblement par rapport à la pyridoxine 8). 10

(
Une méthode basée sur une réaction entre l’acide sulfanilique
diazoté et l’adermine dose un composé azoïque jaune-rouge ( ). I,’in-
7
6
1
convénient de la méthode est que la pyridoxine donne une coloration
rouge-orange, la pyridoxamine une coloration orange-rose et le pyridoxal
une coloration jaune brillante 6).
11 De plus, dans ce dosage, il faut éli-
(
miner tous les composés azotés : protéines, purines, pyrimidines, etc.
(i68). On peut adsorber la vitamine sur le Superfiltrol, et l’éluer ensuite
par l’alcool en milieu alcalin.

0
7 Dosage de l’acide folique
Cette vitamine peut se doser chimiquement de deux façons. La mé-
thode de HUTCHINGS et coll. ) 75 consiste à réduire l’acide folique par le
(
zinc en milieu chlorhydrique N/ , ce qui donne une ptéridine et une
2
amine aromatique, dosée colorimétriquement ). 20 On peut diminuer
(
l’interférence de certains corps par une réduction avec le chlorure stan-
) en remplacement du zinc.
neux (5
7
Une microméthode, basée sur l’oxydation de l’acide folique par le
permanganate en milieu alcalin, donne l’acide amino-2-hydroxyptéri-
4 carboxylique qui
dine- est dosé fluorométriquement après purification
sur le Florisil (r).

0
8 Dosage de la hiotine

A notre connaissance il n’existe pas de méthode chimique pour

doser la biotine.

9° Dosage de la vitamine 12
B
12 est dosée chimiquement d’une manière peu usitée.
I,a vitamine B
En photolysant de la vitamine Bi2 avec une lumière monochroma-
tique le groupe cyanogène de la molécule est libéré. On peut l’entraîner
par un courant d’air et ainsi le doser colorimétriquement à l’aide du
phosphate de chloramine T (ig).

0
10 Dosage de l’acide ascorbique
La méthode chimique est la seule technique couramment employée
pour le dosage de l’acide ascorbique. Ce corps réduit nombre de réactifs,
et pour la détermination quantitative de l’acide ascorbique on utilise
généralement son pouvoir de transformer un colorant en son leuco-
dérivé.
La technique la plus répandue consiste à observer la décoloration
du dichloro 2-6 phénolindophénol )173 qui est un colorant rouge ou
(
bleu selon le pH.
Il convient de prendre certaines précautions car le dichloro-2-6
phénol indiphénol peut oxyder des substances organiques très variées
, 43, 46, 55, 12
(7, 4
0 8, 1 ).
0
8
 En pratique, on extrait l’acide ascorbique de l’échantillon à l’aide
de l’acide trichloracétique, acétique, métaphosphorique, oxalique, etc.
Si l’on veut doser l’acide ascorbique total il faut passer l’extrait à
un courant de 2
SH en milieu acide pour réduire la forme déhydroascor-
’

bique.
Ensuite, on mesure au photomètre, toutes les 15 ou 30 secondes, la
décoloration d’une solution à 0025 p. ioo de dichloro 2
, -6 phénolindo-
phénol par action de l’extrait contenant l’acide ascorbique (io6, iog).
Une autre méthode d’éffectue à pH 3 ,o et, en présence, d’hyposulfite
on éclaire violemment la solution de bleu de méthylène contenant l’extrait
d’acide ascorbique.
On peut doser la acide ascorbique plus acide déhydroascor-
somme

bique par une réaction avec la dinitro-2-

4 phénylhydrazine, qui donne
) et dont on dose l’intensité au photo-
une osazone de couleur rouge (z
33
mètre.
Enfin, il est de doser chromatographiquement la vita-
possible
mine C papier
sur faisant
en un chromatogramme de la dinitro 2 4 phé-
-
nylhydrazone de l’acide ascorbique, que l’on dose colorimétriquement
après élution (117 a) ; une autre méthode chromatographique sépare
l’acide ascorbique de l’acide isoascorbique et d’autres substances pertur-
bantes (67 a).

D. -
LES MÉTHOI)ES 1IICROBIOLOGIQUES
Peu avant la dernière guerre S
CHOPPER et coll. ont montré
144
(
)
qu’un champignon mycelien, Phycomyces blakesleanus, avait une crois-
sance proportionnelle à la quantité de thiamine contenue dans son milieu
de croissance. Une telle observation, reproduite sur d’autres moisissures,
puis sur des bacilles, et pour tous les membres du complexe B, est à la
base de la technique microbiologique pour le dosage des vitamines B
et des acides aminés indispensables.
La vitamine C ne se dose pas microbiologiquement.

1 ! Généralités

Cette technique a pris remarquable, et qui semble dû à

un essor
deux sortes de raisons : les scientifiques, les autres matérielles.
unes

Lorsqu’il est apparu que l’efficacité vitaminique était due à la pré-

sence d’une vitamine et de corps à activité vitaminique, ainsi que d’éven-
tuelles antivitamines, les dosages chimiques se sont révélés dépassés.
Au contraire, la croissance d’un microorganisme présentait les mêmes
avantages que les anciennes méthodes sur animaux supérieurs en ce qui
concerne l’efficacité vitaminique des échantillons.
 Ces méthodes microbiologiques offrent l’avantage, sur les techniques
biologiques, d’être rigoureusement spécifiques, en ce sens qu’aucun des
membres du complexe B n’influence la pousse d’une souche se dévelop-
pant dans les conditions du dosage. Srr!r,!, et G TRON (i5
S ) ont pris des
9
tubes de courbe-étalon d’un dosage de B , contenant tous 0
2 1 y de ribo-
,
flavine, c’est-à-dire un point correspondant au début de la courbe. Ces
tubes, dosés au photomètre donnaient des valeurs se situant entre 0
52
,
,5 A ces tubes, les auteurs ont ajouté des doses croissantes de vita-
et 3
0
.
mines B diverses et ils ont mesuré la croissance de ces tubes au photo-
mètre, ce qui a donné les résultats suivants, mettant en évidence la
spécificité des dosages microbiologiques :

Par ailleurs, lorsque la technique microbiologique est utilisée pour

la détermination d’un des membres du complexe B, le dosage d’autres
vitamines ne demande pas un effort supplémentaire considérable, car
il est possible de se servir d’une même solution pour doser un grand
nombre de vitamines. C’est ainsi que l’on peut mener « de front » le dosage
des principaux membres du groupe B.
Cette technique comprend deux parties préparatoires : l’extrac-
tion de la vitamine et la composition du milieu de base.
L’extraction de la vitamine se fait par hydrolyse, d’une manière
souvent identique à l’hydrolyse effectuée pour un dosage chimique :
autoclavage poussé si on en a la possibilité, hydrolyse enzymatique si
la vitamine est sensible.
l,e volume de liquide de l’extrait doit être au minimum dans un rap-
port de 5 à i avec le poids de l’échantillon, et il est conseillé de suspendre
la prise dans dix fois son poids de liquide. 1 hydrolyse chimique a in-
/
térêt à être faite en milieu chlorhydrique plutôt que sulfurique, l’anion
4 présentant une toxicité possible pour le microorganisme.
S0
La purification de l’extrait est très simple en microbiologie : seules
les protéines et les lipides sont à éliminer : les premières sont extraites
par une filtration à pH 4 5 en fin d’hydrolyse, c’est-à-dire une fois la
,
vitamine libérée des liens protidiques dans lesquels elle peut être incluse ;
les lipides peuvent être éliminés grossièrement par un traitement à froid
à pH 4 , de préférence avec le mélange 2/3 éther sulfurique 1/3 éther de
pétrole. Cette opération se fait avant ou après l’hydrolyse.
 Cette double élimination des protéines et des lipides est rigoureuse-
ment indispensable. Nous n’en prendrons à témoin que le dosage de la
riboflavine effectué par L. casei s. Dans le cas d’échantillons riches en
protéines, l’élimination des matières azotées se traduit de la manière
suivante (179)
:

Dans ces chiffres on voit que la présence de protéines

quelques
dans l’extrait fournit des taux de riboflavine deux fois trop élevés. L’in-
fluence des lipides, parfois moins nette, représente également une cause
d’erreur très appréciable, ces chiffres le prouveront (8) :

On peut démontrer l’action de facteur de croissance des lipides en

ajoutant à des échantillons des acides gras variés : dans ce cas, la pousse
du lactobacille est généralement stimulée et on trouve des valeurs géné-
ralement comparables à celles obtenues sans extraction à l’éther. Néan-
moins il faut signaler que certains acides gras peuvent, selon leur con-
centration, jouer le rôle de facteur de croissance ou, au contraire, inhiber
partiellement la pousse microbienne. Par la double élimination des pro-
téines et des lipides de l’extrait on obtient alors une valeur qui corres-
pond spécifiquement à la teneur vitaminique de l’extrait. !n effet,
comme nous l’avons montré aucune vitamine B n’influe sur la croissance
d’une souche quand on se place dans les conditions requises pour l’ana-
lyse.
Ces conditions exigent notamment que le milieu de base apporte
tous les métabolites nécessaires ou utiles (indispensables ou accessoires)
à la croissance de la souche, et cela en quantités supérieures à la dose
minimum indispensable au développement. Il est évident que seul le
facteur faisant l’objet du dosage doit être totalement absent du milieu
de base.
 Ce milieu peut être ou naturel ou synthétique, cette alternative
étant fonction de notre propre connaissance des besoins nutritifs des
microorganismes. Dans le second cas, il n’y a aucune difficulté à composer
le milieu nutritif qui consiste en une liste de produits biochimiques
simples.
S’il s’agit d’un milieu naturel, on part toujours de substances com-
plexes (levure, peptone) dont on doit éliminer la vitamine que l’on veut
doser. Pour cefaire il existe des traitements propres à chaque cas qui
permettent de détruire spécifiquement tel ou tel facteur de ces milieux
naturels. Par exemple, pour le dosage de l’acide pantothénique on éli-
mine cette vitamine de la peptone par l’influence du pH alcalin à froid :
ceci probablement détruit d’autres facteurs sensibles aux bases. Mais
pour éliminer l’acide pantothénique de la levure on autoclave celle-ci
ce qui détruit des facteurs thermolabiles, dont l’acide pantothénique.

Au total, le seul facteur qui sera détruit à la fois dans la levure et la pep-
tone sera l’acide pantothénique. A titre indicatif, voici les milieux com-
plets pour deux lactobacilles très employés dans les dosages micro-
biologiques pour cent tubes :

On peut procéder de deux manières pour remplir les tubes, mais

il faut dans les deux cas que le tube renferme les mêmes quantités ab-
solues de milieu et de vitamine : la manière la plus simple est d’utiliser
des solutions étalons et des extraits suffisamment concentrés pour que
les quantités à utiliser ne dépassent pas o,
5 cc (pipettes au i/ioo de cc ) ;
on met ensuite 10 ce’ du milieu de base dilué selon les indications
ci-dessus.
Ensuite, on stérilise, on ensemence avec la souche adéquate, on
incube 24 h., ou, de 48 à 72 h. Dans le premier cas on titre néphélomé-
triquement, dans le second on dose l’acide
lactique formé dans les cul-
tures de Lactobacilles (avec Na OH N/io en présence de bleu de bro-
mothymol).
Comme dans les méthodes chimiques ou biologiques, chaque dosage
microbiologique comprend unecourbe-étalon. Ici elle est composée de
10 points et on prend 4 points croissants par extrait.
Les principales souches employées actuellement sont des bacilles,
bien que les premières méthodes aient utilisé des mycéliums.
Les souches doivent être définies avec rigueur et voici leur dénomi-
nation exacte avec la référence de l’American Type. Culture Collections
(Georgetown University Medical School, Washington DC).

0
2 Dosage de la thiamine

En marge des techniques microbiologiques courantes, on peut doser

la vitamine Bi en mesurant l’intensité fermentaire de Saccharomyces
cerevisiae (levure de boulangerie). En effet, le pouvoir de fermentation
de cette souche est lié à la quantité de thiamine présente dans le milieu
14 147).
(
6,
Il existe deux méthodes indirectes pour mesurer l’activité fermen-
taire de la levure de boulangerie : soit on peut doser l’alcool formé au
cours de la fermentation (JACQUOT et THIVOI,!!, 7 8), soit on mesure le
gaz carbonique dégagé (Y. , RMAND 7
A 8), en se servant d’un Warburg.
Quelle que soit la méthode adoptée, on constitue une courbe-étalon
avec des doses croissantes de thiamine pure, et pour chaque échantillon,
on prend plusieurs doses croissantes.
De plus, on traite une partie aliquote de l’extrait par une solution à
,6 p. ioo de sulfite acide, et on neutralise ensuite l’excès de sulfite par
0
la quantité exacte d’eau oxygénée nécessaire. Ce traitement a pour but
de pouvoir mesurer l’activité de substances interférentes parasites qui
augmente le taux de fermentation de la levure. I,e sulfite, en effet, dé-
truit spécifiquement la thiamine en la scindant en pyrimidine et en thia-
zole qui sont inactifs, mais il respecte les autres facteurs de l’échantillon.
Dans les fioles de Warburg l’incubation se poursuit généralement
pendant 3 h et on mesure les volumes gazeux produits. Pour obtenir la
teneur de l’extrait en thiamine, on déduit de la valeur de l’échantillon
total le chiffre obtenu avec l’extrait traité au sulfite et on rapporte à la
courbe-étalon le produit de la différence.
La méthode la plus courante pour le dosage de la thiamine ) 139
(
utilise le Lactobacillus lermenti 36.
Le milieu de base est semi-synthétique. L’incubation dure 1 8 h au
bout desquelles on titre la néphélométrie des tubes de culture. On peut
ainsi doser 5 ,o m y de thiamine.
Rappelons que la première méthode microbiologique a été créée
par F
P
O
H
SC
R E et JurrG ) 144 pour doser la thiamine à l’aide d’un Phyco-
(
myces se développant sur un milieu extrêmement simple.

L’extraction de la thiamine en vue de son dosage microbiologique

se fait généralement en deux temps : extraction chimique en milieu

sulfurique 0
1 N, puis digestion enzymatique (papaïne
, et clarase) à
pH 4,5. Filtration et pH 6,o environ.

0
3 Dosage de la riboflavine

Ce facteur se dose habituellement à l’aide de L. caséi8).

15 Le
(
milieu est un ensemble de produits naturels que l’on prive de ribofla-
vine :
-
la vitamine Bz est éliminée de la peptone par photolyse al-
caline.
-
elle est enlevée de la levure par traitement avec une solution
alcaline d’acétate basique de plomb dont on se débarrasse par un pas-
sage à SH,.
L’extraction de cette vitamine est sensiblement pareille que celle
de la thiamine : rapide autoclavage en milieu C1H 0 1 N, puis di-
,
gestion enzymatique (takadiastase et papaïne) à pH 4 ,5. Filtration et
neutralisation à pH 7,0.
La filtration à pH 4 5 est particulièrement recommandée dans ce
,
dosage ainsi que l’extraction ). Dans les
des lipides à ce même pH (
3
6
1
analyses d’urine, l’urée peut jouer le rôle d’inhibiteur, et 2
o mg par
tube est le taux maximum compatible avec la technique microbio-
logique (77).
Cette méthode avec L. casei permet de doser jusqu’à 5
o my par ce,
mais il est possible de déterminer des concentrations beaucoup plus
faibles de riboflavine en utilisant Leuconostoc mesenteroides (ATCC
) qui est sensible à 1
10100 0 m!! par ce d’extrait (
, 2).
9
 0
4 Dosage de la niacine

La méthode usuelle est celle de KR!HI, et coll. ( q.) basée sur la

9
croissance du L. arabinosus 17/5. Le milieu de base est entièrement
synthétique et ne pose pas de difficultés si les produits employés sont
suffisamment purs.
Cette méthode dose jusqu’à 50 m Y par ce. d’extrait.
La niacine est suffisamment résistante aux bases ou aux acides
pour être entièrement extraite par voie chimique à l’autoclave. Pour
beaucoup de types d’échantillons un traitement de 30 minutes à 120 0
en milieu ClH N donne un résultat comparable au même traitement en
milieu NaOH N.
On amène ensuite le pH à 4 5 on filtre et l’extrait est neutralisé.
,
Il est préférable de faire l’hydrolyse en milieu acide, la filtration à pH 4
55
,
s’en trouvant facilitée.
Il est également possible d’isoler l’acide nicotinique chromato-
graphiquement sur papier, et de faire à ce moment-là un test microbio-
logique pour mesurer la vitamine PP ( 8 a).
9

5° Dosage de l’acide pantothénique

Il existe deux techniques courantes pour doser ce facteur :
-
la première utilise L. a
abinosus 17/5 (6
y ,t5q.) dont le milieu est
9
synthétique,
-
la seconde emploie L. caséi F
II9
(
) dont le milieu est naturel.
L’acide pantothénique est enlevé de la peptone par traitement alcalin à
froid, on l’élimine de la levure en faisant alterner les autoclavages en
milieu alcalin et en milieu neutre.
Personnellement nous optons pour la deuxième technique qui s’est
révélée plus reproductible.
Ces deux méthodes offrent la même sensibilité : io m y par cc d’ex-
trait. On titre dans les deux cas l’acide lactique formé.
L’extraction de cette vitamine ne peut se faire en milieu acide ou
alcalin. Après un rapide autoclavage à pH légèrement acide, on pratique
une digestion enzymatique (mylase P) à pH 4 5 (
, 23 a). Ensuite filtration
et neutralisation de l’extrait.
Telle était l’hydrolyse classique jusqu’à ces dernières années. Depuis,
on a proposé des hydrolyses effectuées à l’aide d’enzymes variés , 115
(
8 a) ou l’autolyse ,
14 100 io
( ) comme procédés d’hydrolyse. Ces mo-
5
difications font apparaître des quantités plus ou moins importantes
d’acide pantothénique par rapport aux valeurs obtenues avec l’hydrolyse
par la mylase P.
 0
1; Dosage de la vitamine B(;

Une méthode utilisant une levure (Sacc7iavomyces carlsbergensis

ATCC ? 8) permet de doser les trois membres de la famille B6, la
422
pyridoxine, le pyridoxal et la pyridoxamine possédant une activité
égale vis-à-vis de cet organisme (
).
3
te milieu est beaucoup plus simple que ceux destinés aux lactobacilles.
On mesure la néphélométrie de ces cultures après 1 8 h d’incubation.
Une autre méthode permet de doser le pyridoxal et la pyridoxamine
123 en employant le Streptococcus faecalis R. (ATCC ? 8oq.
(
) ). La pyri-
3
doxine est sans activité pour cette souche. Ce microorganisme utilise
un milieu synthétique voisin de celui de L. arabinosus, et on titre la

néphélométrie des tubes après incubation. On peut également doser

le pyridoxal à l’aide de L. casei (i
6).
9
L’extraction de la vitamine B6 se fait généralement en milieu sul-
5 N pendant i h à l’autoclave. Si l’échantillon est un liquide
furique o,05
on ajuste son pH à 1 ,8- avec de l’acide sulfurique (
7
, ) ; il est également
3
possible d’extraire la pyridoxine par S0
4H 2 N
2 ).
2
6
1
(
On peut aussi utiliser un Neuropora sitophila pour le dosage de la
pyridoxine ( ), mais cette souche peut synthétiser la vitamine B6
2
6
1
à partir de certains éléments azotés (z6i).
Par ailleurs, pour S. y l
ca
g be et N. sitophila la thiamine est
ensis
un facteur de croissance ou un inhibiteur. Pour les dosages utilisant

S. y
l
ca
g be il faut que la concentration en thiamine soit supérieure
ensis,
à un seuil donné ) 125
( ; avec Neurospora on procède à une destruction
de la thiamine par un traitement au sulfite qui respecte la pyridoxine.

0
7 Dosage de l’acide folique
Deux méthodes microbiologiques classiques permettent la déter-
mination de l’acide ptéroylglutamique.
Une technique employant Streptococcus f aecalis R. fait appel à un
milieu synthétique ( ) dans lequel on a proposé d’ajouter les pu-
6, II2
3
rines afin d’obtenir une croissance maximum (i5 ).
7
Un autre procédé utilise L. casei et un milieu naturel ).131
(
Dans ce cas, on doit éliminer l’acide folique d’un hydrolysat de ca-
séine à l’aide de charbon actif. Cette méthode est la plus sensible : elle
détermine des concentrations de 0 1 m y par ce d’extrait.
,
Dans la première technique on mesure la néphélométrie des tubes,
dans la seconde on titre l’acide lactique formé.
L’extraction de l’acide folique est assez délicate car l’hydrolyse
demande une Bc conjugase. On en trouve dans des préparations de rein
de porc )15 ou de pancréas de poulet (
( 8).
9
La digestion enzymatique s’effectue selon le mode habituel.
 8°
’

Dosage de la biotine

Plusieurs méthodes permettent de doser ce facteur, mais une des

plus courantes utilise L. a
abinosus 1715 (
y ). On emploie un milieu
0
6
1
synthétique, et on dose ainsi des extraits ayant des concentrations de
0,2 my par ce.
Cette méthode est intéressante dans le dosage du blanc d’ceuf, car
abinosus ne peut pas utiliser la biotine combinée à l’avidine. L. casei,
L. a
y
au contraire, offre la particularité de pouvoir hydrolyser le complexe
biotine-avidine. Mais ce dernier microorganisme demande un milieu plus
complexe dont on est obligé de retirer la biotine par action de l’eau
oxygénée et par adsorption sur le charbon actif ). 153
(
Avec les deux méthodes le test est la titration de l’acide lactique.
L’extraction de la biotine est très simple dans le cas de l’oeuf, qui
demande seulement un autoclavage à l’eau. Dans l’immense majorité
des cas, il faut hydrolyser une heure à 1200 en milieu S0 4H 2 6N. On
élimine ensuite cet acide sous forme de sulfate de baryum (neutralisation
vers pH 5 ). On filtre et on neutralise l’extrait.
3
,

°
9 Dosage de la vitamine B12

Les techniques microbiologiques du dosage de la vitamine Bi2

sont très nombreuses et emploient diverses souches dont les plus fré-
quemment utilisées sont Lactobacillus Lactis Dorner (ATCC N° 8 ),
000
Lactobacillus Leichmannü (ATCC N° 31 ) et Escherichia coli II3/3
8 et 497 .
Les milieux sont généralement plus simples que ceux utilisés pour les
Lactobacilles ordinaires.
On titre généralement la néphélométrie obtenue après une vingtaine
d’heures d’incubation.
Une des dernières techniques est basée sur la croissance de Esche-
y 24 Elle étudie la composition du milieu et les conditions
ichia coli ).
(
d’incubation. En plus, elle envisage divers types d’extraction et retient
le suivant : ’,hydrolyse en milieu aqueux tamponné à pH 4 5 avec de
,
l’acétate de sodium et en protégeant la vitamine par addition de i mg de
cyanure de potassium par y de vitamine présente dans l’extrait.
omonas dose spécifiquement la vitamine B
Il faut noter que Och
y 12
et non les cobalamines comme Escherichia coli ). 50
(
Enfin, pour déceler les diverses vitamines B 12 et les dissocier
d’autres facteurs de croissance on peut faire appel à un procédé mixte
utilisant à la fois la chromatographie et la microbiologie : on mesure
microbiologiquement l’activité des vitamines Bi2 après les avoir isolées
chromatographiquement (65 a, 179
a, 1
18
a).
 E. -
RÉSULTATS COMPARATIFS ET CONCLUSIONS

Après avoir passé en revue les trois grands types de dosages vitami-
niques, les techniques biologiques, chimiques et microbiologiques, la
question qui se pose est de savoir dans quelle mesure des résultats obtenus
par des voies si différentes peuvent présenter entre eux une bonne con-
cordance. Certains auteurs se sont posés la question et ont analysé un
même échantillon à l’aide de techniques diverses. Nous allons donner le
fruit de leurs travaux dans les tableaux suivants.
Dans chacun d’eux nous avons calculé les valeurs relatives moyennes
en prenant a bitrairement une des techniques comme référence ; ceci
y
permet de mettre en lumière la similitude ou la divergence existant entre
les méthodes de dosages. Encore conviendra-t-il de remarquer que la nature
de l’échantillon peut intervenir dans le résultat d’une analyse vitaminique.
C’est pourquoi, s’il existe pour chaque vitamine un mode usuel d’extrac-
tion, celui-ci ne peut être considéré comme valable dans tous les cas.
Il y a notamment deux humeurs biologiques dont le dosage vitaminique
offre des difficultés particulières : le sang et l’urine. Ces deux liquides
exigent souvent une hydrolyse ou une purification particulières.
Les tableaux I et II mettent en lumière une très bonne concordance
entre les trois modes de dosages de la vitamine Bi.
Il faut noter que dans le tableau I les auteurs ont pris la précau-
tion de calculer la valeur du « blanc » dans la technique de fermentation
de la Levure.
Par ailleurs, dans ces deux tableaux concernant la thiamine, on
observe une bonne harmonie entre les techniques quel que soit le type
d’échantillon observé (céréales, levure, productions animales, etc.). En
conclusion, le dosage de la thiamine semble parfaitement au point, et les
diverses techniques fournissent des résultats dont les écarts sont de
l’ordre deio p. 100
.

Le tableau III illustre bien la difficulté rencontrée dans le dosage

urinaire de la riboflavine. En purifiant l’urine de plus en plus colonne
-

A à colonne C - les résultats baissent au fur et à mesure, pour finale-

ment coïncider avec ceux obtenus à l’aide de la technique microbio-
’

logique.
Les résultats du tableau IV fournissant les teneurs en riboflavine de
divers types d’échantillons montrent une concordance satisfaisante entre
les méthodes biologiques, microbiologiques et chimiques. Comme pour
la vitamine B, les écarts moyens sont de l’ordre de 10 p. 100
I .

Le tableau V fait apparaître une très forte différence entre les teneurs
en
niacine obtenues par voie microbiologique ou chimique ou par voie
biologique : les analyses faites à l’aide d’animaux supérieurs fournissant
des résultatsen moyenne deux fois plus élevés que ceux obtenus par les

autres techniques. Ces écarts confirment parfaitement l’influence du

tryptophane de l’échantillon comme facteur d’épargne de la niacine.
Ce tableau V ainsi que le suivant font ressortir une harmonie rela-
tivement bonne entre les méthodes chimiques et les techniques micro-
biologiques : l’écart moyen le plus élevé est de 2
o p. ioo. Dans le tableau V
les résultats chimiques sont plus élevés, et dans le tableau VI ce sont
les valeurs provenant de la microbiologie qui sont les plus fortes : les
deux méthodes fournissent des résultats qui se chevauchent.
Le tableau VII fait ressortir une certaine faiblesse des résultats
microbiologiques concernant l’acide pantothénique vis-à-vis des résultats
des dosages biologiques. Ceci est surtout vrai pour certains extraits de
levure (colonne B et D).
Par la suite, on a constaté qu’une extraction aqueuse ou à l’aide
d’enzymes comme la mylase P n’hydrolysait qu’une fraction seulement

de la vitamine, et c’est pourquoi on pratiqua des extractions avec des

phosphatases intestinales et des enzymes hépatiques ) 115 ou des poudres
(
147 a). Mais, selon
de reins traités à l’acétone ( les auteurs le bénéfice de
ce nouveau type d’extraction était plus ou moins grand : certains voyaient
les teneurs du foie augmenter de cinq fois )115 tandis que d’autres obte-
(
naient des résultats voisins (q8).
De même l’autolyse du foie a fourni des résultats élevés , 100 105
( )
ou non )177 par rapport à l’extraction à l’aide de la mylase P.
(
En réalité, il semble qu’un travail récent départage assez bien les
divergences concernant l’extraction et le dosage de l’acide pantothénique :
le tableau VIII accorde à l’extraction à l’aide de phosphatase et d’en-
zymes hépatiques une supériorité de l’ordre de 30 p. ioo par rapport à
l’hydrolyse effectuée par la mylase P.
e tableau IX confirme cet écart et montre une excellente coïnci-
4
I
dence entre la méthode biologique et la méthode microbiologique (ex-
traction avec le mélange enzymatique).
Enfin, le tableau X fait apparaître une très bonne concordance
entre les techniques chimique et bactériologique, mais ces chiffres portent
exclusivement sur des échantillons de céréales, et il serait intéressant
d’étendre la comparaison à d’autres catégories de substances biologiques
ou alimentaires.

En conclusion, il paraît sage de ramener à de justes proportions la

divergence signalée entre les divers modes d’extraction de l’acide panto-
thénique.
Nous n’avons pas trouvé de tableaux comparatifs présentant des
analyses en vitamines B6 et en biotine.
Le tableau XI permet de penser que le dosage de l’acide folique est
pratiquement au point car on ne relève pas de
grandes divergences entre
les résultats des méthodes chimique, microbiologique et biologique.
Il ne paraît pas que les choses en soient là en ce qui concerne le dosage
de la vitamine Bi2. I,
r,rE et coll. (io2 a), viennent de consacrer une étude
W
à la comparaison des méthodes biologiques et microbiologiques de dosage
de la vitamine . 12
B
Leurs résultats sont groupés dans les tableaux XII et XIII, ceux-ci
sont nettement différents l’un de l’autre : le premier donne des exemples
d’échantillons qui offrent les mêmes valeurs lorsqu’ils sont traités par la
technique biologique ou par la méthode microbiologique, tandis que dans
le tableau XIII apparaît une complète anarchie entre les deux techniques
analytiques. Il semble donc exister des cas d’espèces, mais, ce qui surprend
est que l’on trouve dans les deux tableaux des produits très voisins et
même identiques (farine de poisson). Par ailleurs toutes les méthodes
microbiologiques ne fournissent pas des résultats comparables, ce qui fait
conclure qu’à l’heure actuelle les techniques analytiques concernant la
vitamine B 12 ne sont pas encore satisfaisantes.
Par contre, étant donné l’ancienneté de la vitamine C et les très
nombreux travaux qu’elle a suscités, son dosage est parfaitement mis au
point. Le tableau XIV en donne une preuve si besoin est.
En résumé, pour les facteurs vitaminiques dont les modalités analy-
tiques sont actuellement bien étudiées, les différents modes de dosage
fournissent des résultats identiques à 10 p. 100 près environ.
Que doit-on penser d’une telle marge ?
Tout d’abord qu’il est et sera impossible de la réduire : il existera
toujours une imprécision de cet ordre entre des laboratoires différents et
appliquant chacun des méthodes plus oumoins modifiées dans leur
détail. Par conséquent, en considérant une imprécision de cet ordre de
grandeur, que peut-on attendre des résultats analytiques concernant les
vitamines hydrosolubles ?
 Il convient de distinguer ici deux sortes de travaux :
-
Dans un travail de physiologie, le but principal est la mise en
évidence d’une différence entre un lot témoin et des lots expérimentaux.
Dans ce cas, en choisissant une méthode analytique les risques d’entraîner
une erreur relative tout au long du travail ne sont pas très importants,
en ce sens que cette erreur se retrouvant partout, elle ne faussera pas les
conclusions que l’on tirera du travail.
-
Il n’en va plus de même dans un travail nutritionnel, où l’on
doit arriver à une valeur absolue. Il faut, par exemple, déterminer dans
quelle mesure une ration couvre les besoins vitaminiques d’un organisme
donné.
 Dans ce cas, il faut savoir
avec quelles difficultés sont déterminés les
besoins vitaminiques de l’Homme ou des animaux. Il est permis alors de
penser que l’imprécision de ces standards est égale ou supérieure à celle
des dosages vitaminiques.
C’est pourquoi, nous conclurons que lorsque les modalités analytiques
sont bien étudiées, la précision des dosages est suffisante en regard de la
notion des besoins vitaminiques.

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