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    La cintique enzymatique

    Page publie par Fafa


    Dtail sur le processus de publication
    Dernire mise jour : 2010-04-25

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    Cours Biochimie

    La cintique enzymatique

    Sommaire

    Dans ce cours :

    1. Dfinitions
    o

    1.1. Vitesse de raction

    1.2. Cintique enzymatique

    2. Effet de la concentration initiale de substrat sur la vitesse de raction

    3. Effet de la concentration d'enzyme sur la Vmax de la raction

    4. Notion d'activit enzymatique

    5. Facteurs influenant la vitesse de raction


    o

    5.1. Facteurs physiques

    5.1.1. La temprature

    5.1.2. Le pH

    5.2. Facteurs chimiques

    5.2.1. Facteurs chimiques activateurs

    5.2.1.1. Activateurs vrais

    5.2.1.2. Fixation covalente de groupements chimiques

    5.2.1.3. Activateurs de pro-enzymes

    5.2.2. Facteurs chimiques inhibiteurs

    5.2.2.1. Inhibiteur rversible comptitif

    5.2.2.2. Inhibiteur rversible non comptitif

    5.2.2.3. Inhibiteur rversible incomptitif

    1. Dfinitions
    Une protine enzymatique ne
    thermodynamiquement.

    rend

    pas

    possible

    une

    raction

    qui

    ne

    l'est

    pas

    1.1. Vitesse de raction


    On suit en fonction du temps:

    soit l'apparition du produit dans le milieu d'incubation,

    soit la disparition du substrat de ce milieu,

    soit la modification quantitative de l'tat du coenzyme de la raction.

    Pour les ractions rversibles, la vitesse de raction est :


    v = d[P]/dt = - d[s]/dt

    1.2. Cintique enzymatique


    On tudie :

    soit l'influence de la concentration en substrat sur la vitesse de raction,

    soit l'influence de la concentration en enzyme sur la vitesse de raction.

    2. Effet de la concentration initiale de substrat sur la vitesse


    de raction
    On tudie in vitro l'influence de [S] initiale, les autres paramtres restent constants.
    Les courbes obtenues refltent plusieurs points :

    Dans un premier temps, [P] varie linairement avec le temps. La vitesse de raction
    d[P]/dt est constante dfinissant la vitesse initiale Vo;

    Suite cette priode initiale, les courbes accdent progressivement un plateau, une
    valeur constante de [P] : l'quilibre final.

    Si l'on tudie les variations des diffrentes concentrations pour une seule concentration en
    substrat, on
    distingue
    3
    phases.
    Les concentrations en substrat (disparition progressive) et en produit (apparition
    progressive) varient toutes deux linairement en fonction du temps. Paralllement, la

    concentration
    On distingue donc :

    du complexe

    ES est

    une phase pr-stationnaire,

    une phase stationnaire o [ES] est une constante,

    une phase post-stationnaire o [P] atteint un plateau.

    constante.

    La vitesse de raction sera donc mesure pendant la phase stationnaire, quand [ES] est
    constante. Ceci nous permet d'ailleurs d'tablir que la concentration en substrat est grande
    par rapport la concentration en enzyme.
    L'tude des vitesses initiales obtenues diffrentes concentrations initiales en substrats
    permet d'tablir que la vitesse initiale crot selon [S] puis atteint un maximum.
    Ceci est galement observable sur un graphe reportant les vitesses initiales obtenues en
    fonction
    des
    concentrations
    en
    substrats.
    La courbe correspondante est une hyperbole. Elle prsente deux points intressants pour
    l'tude cintique : La Vmax (vitesse maximum de raction) et la KM. La KM est la
    concentration en substrat pour laquelle on obtient une vitesse = Vmax/2 . Elle s'exprime
    en molarit. Elle correspond l'inverse de l'affinit de l'enzyme pour son substrat.
    La vitesse est dtermine selon la formule :
    v = (Vmax.[S])/(KM + [S])
    Au cours de la raction chimique on a donc :
    E + S <--K1 ou K2--> ES <--K3 ou K4--> EP <--K5 ou K6--> E + P
    o Vo = K3.[ES], la formation du complexe enzyme-substrat est trs rapide. K3 et K4 sont
    petites devant les autres, l'tape de transformation de ES en EP est instantane. Il apparat
    donc que la transformation de ES en P est l'tape limitante. On peut donc simplifier selon le
    schma suivant :
    E + S <--K1 ou K2--> ES --K3--> E + P
    Quand la Vmax est atteinte, la totalit des enzymes prsents sont complexs avec les
    substrats: [ES] = [Et] et Vmax = K3.[Et]

    3. Effet de la concentration d'enzyme sur la Vmax de la


    raction
    On tudie in vitro l'influence de
    La vitesse est dtermine selon la formule

    la

    [E]

    sur

    la

    vitesse

    de

    la

    raction.

    v = (Vmax.[S])/(KM + [S])
    Pour des concentrations saturantes en substrat ([S] > 10.KM), la vitesse de raction est
    proportionnelle

    [Et].
    La Vmax est ainsi multiplie par deux lorsque la concentration en enzyme est double.
    La Vmax dpend donc de la concentration en enzyme du milieu.
    La KM est inchange, c'est une constante de la protine enzymatique. Pour obtenir ses
    valeurs prcises on transforme l'hyperbole obtenue prcdemment en une droite inverse selon

    la reprsentation
    de
    Cela se fait selon la formule suivante :

    Lineweaver

    et

    Burk.

    1/V = (KM/Vmax) x (1/[S]) + (1/Vmax)

    4. Notion d'activit enzymatique


    Il s'agit de dterminer la quantit d'enzyme prsente dans un milieu quel qu'il soit en
    mesurant la Vmax (avec concentration saturante en substrat). C'est ce qui dfinit l'activit
    enzymatique, la Vmax tant directement proportionnelle la quantit d'enzyme du milieu.
    Si le milieu contenant l'enzyme en question est un milieu complexe (non purifi), l'expression
    des
    rsultats
    se
    fera
    selon
    un
    systme
    d'unit
    arbitraire:
    1U.I = transformation d'une micromole de substrat par minute.
    Si le milieu est purifi et qu'on connait le poids molculaire de l'enzyme alors on peut
    dterminer le nombre de molcules d'enzymes. Le nombre de moles d'enzymes sera gal
    quantit de protine (en grammes) divise par le PM de l'enzyme (en grammes). C'est ce qui
    dfinit l'activit enzymatique molculaire : nombre de molcules de substrat transformes par
    minute et par mole d'enzyme.

    5. Facteurs influenant la vitesse de raction


    5.1. Facteurs physiques
    5.1.1. La temprature
    La loi d'Arrhnius dtermine l'influence de l'augmentation de temprature sur les ractions
    chimiques.(
    cf: fiche
    cintique
    chimique )
    Une augmentation de temprature va principalement se traduire par une augmentation
    des chocs
    molculaires
    efficaces.
    Pour une lvation de 10C, la vitesse d'une raction chimique est multiplie par 2.
    Les courbes concernant les enzymes ne correspondent pas tout fait aux courbes de la loi
    d'Arrhnius classique. En effet, pass la temprature optimale (pic graphique), on observe
    une baisse progressive de la vitesse de raction puis on arrive la temprature d'inactivation,
    temprature
    pour
    laquelle
    l'activit
    enzymatique
    est
    nulle.
    Cette courbe se divise donc en deux parties, avant et aprs le pic de la temprature optimale.
    La premire partie, courbe ascendante, correspond la loi d'Arrhnius. La seconde
    partie, courbe descendante, est le fait de la dnaturation de l'enzyme par sa thermolabilit
    (fraction protique).
    Chaque enzyme prsentera donc une temprature optimale et une temprature
    d'inactivation spcifiques. Par exemple, la maltase aura une activit optimale 35C et sera
    inactive 55C.
    Ainsi, pour le dosage d'activits enzymatiques on peut utiliser 3 tempratures: 25C, 30C,
    37C. C'est cette cernire temprature qui est le plus souvent utilise.
    5.1.2. Le pH
    On observe le mme phnomne: l'activit augmente, arrive un pic correspondant au pH
    optimum, puis dcrot. Cependant, la courbe ne dbute pas au 0 mais un pH dtermin. Il
    correspond au premier pH d'arrt (pH trop bas), le second pH d'arrt tant celui o il n'y a

    plus d'activit (pH trop lev). Le pH optimum peut-tre trs acide (2 par exemple pour la
    pepsine), basique (7,8 pour la trypsine), ou neutre.
    Au pH optimum, l'enzyme possde une charge totale MINIMALE

    5.2. Facteurs chimiques


    Ils peuvent tre minraux ou organiques et modifieront la vitesse de raction. Ils seront
    donc activateurs ou inhibiteurs.
    5.2.1. Facteurs chimiques activateurs

    5.2.1.1. Activateurs vrais


    Ce sont les ions mtalliques. On trouve trs frquemment ce type d'activateurs dans les
    ractions de l'organisme (cf catabolisme nergtique). Cet ion n'est donc pas li l'enzyme, il
    en est dissociable. Nanmoins, il est indispensable pour une raction correctement effectue,
    et
    on
    peut
    donc
    le
    considrer
    comme
    un
    second
    substrat.
    Par exemple, dans les ractions de phosphorylation catalyse par les kinases, le substrat est
    le complexe MgATP2- et le vritable produit est le MgADP1-.
    Il est galement possible d'observer des enzymes dont l'ion mtallique fait partie de la
    structure chimique. Dans ce cas, il n'est pas considr comme un activateur.

    5.2.1.2. Fixation covalente de groupements chimiques


    Ce type d'activation par fixation est relatif des enzymes existants sous deux formes : active
    et inactive. Cette activation se fera par addition ou perte d'un groupement phosphate.
    Les protines kinases fixeront ce groupement sur des rsidus Ser, Thr ou Tyr.
    Les protines
    phosphatases enlveront
    ce
    groupement.
    Ce systme d'activation/inhibition joue un rle prpondrant dans la rgulation du
    mtabolisme cellulaire.

    5.2.1.3. Activateurs de pro-enzymes


    Ce mcanisme irrversible comporte une premire tape de synthse d'un prcurseur
    inactif. Ce pro-enzyme inactif ou zymogne sera ensuite excrt dans le milieu extracellulaire
    et
    sera
    cliv
    pour
    donner
    l'enzyme
    actif.
    Par exemple, le trypsinogne synthtis par le pancras est excrt dans le tube digestif o il
    sera cliv et donc activ en trypsine (par le trypsinogne duodnal).
    5.2.2. Facteurs chimiques inhibiteurs
    Deux types se distinguent :

    inhibition rversible et

    inhibition irrversible, celle-ci sera par exemple ralise par un agent dnaturant.

    Il existe trois grands types d'inhibiteurs rversibles :

    inhibiteurs comptitifs,

    inhibiteurs non comptitifs,

    inhibiteurs incomptitifs.

    5.2.2.1. Inhibiteur rversible comptitif


    Il prsente gnralement une homologie structurale avec le substrat. Il entrera donc en
    rivalit avec lui pour occuper la place du substrat au niveau du site catalytique.
    La
    Vmax
    ne
    sera
    pas
    modifie.
    L'affinit est diminue donc la KM augmente.

    5.2.2.2. Inhibiteur rversible non comptitif


    Il n'y a pas de rivalit mais cohabitation. L'enzyme fixera la fois le substrat et l'inhibiteur.
    La
    Vmax
    est
    diminue.
    L'affinit et donc la KM ne sont pas modifies.

    5.2.2.3. Inhibiteur rversible incomptitif


    L'inhibiteur
    ne
    se
    fixe
    que
    sur
    La
    Vmax
    L'affinit est augmente donc la KM diminue.

    le
    est

    complexe

    enzyme-substrat.
    diminue.

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